CN115541550A - 基于主成分分析的结构光照明显微成像方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于主成分分析的结构光照明显微成像方法，明利用基于主成分分析的“降维”工具将实际成像中与照明相量无关的嘈杂、干扰成分剔除，以提取照明参数主导的“第一主成分”，从根本上消除了影响照明参数精确估计的干扰项，从而以简单高效的方式精准识别亚像素精度的波矢量与初相位。此外，本发明使用一种双窗频域掩码算子进一步抑制干扰噪声，同时将主成分分析涉及的数据量降低近千倍，极大改善了照明参数估计的计算效率、准确性和稳定性。

Description

基于主成分分析的结构光照明显微成像方法

技术领域

本发明属于超分辨荧光显微成像技术领域，具体为一种基于主成分分析的结构光照明显微成像方法(structured illumination microscopy based on principalcomponent analysis，PCA-SIM)，用于实时活细胞超分辨观测。

背景技术

研究亚细胞尺度的精细生物结构和功能的动态变化过程对了解细胞命运决定机制、揭示生命现象本质以及探索重大疾病机理等有着至关重要的意义。近年来，受激发射损耗显微术(stimulated emission depletion，STED)、结构光照明显微术(structuredillumination microscopy，SIM)、单分子定位显微术(photoactivated localizationmicroscopy/stochastic optical reconstruction microscopy，PALM/STORM)等超分辨成像技术绕开了百余年来似乎一直被认为是无法突破的阿贝衍射极限，在纳米尺度至单分子水平可视化生物分子，以前所未有的时空分辨率探究活细胞结构和动态过程，成为生命科学研究中不可或缺的重要工具。2014年，瑞士皇家科学院将诺贝尔化学奖授予了超分辨荧光显微技术，再一次展现了该技术在人类发展历程中以及未来发展方向上的重要地位[Weiss,P.S.Nobel prizes for super-resolution imaging.(2014).]。

在众多超分辨成像技术中，SIM利用强度正弦调制的结构化照明在频域以空间混频的方式将样品高频信息编码至光学系统的探测通带内，从而实现突破阿贝衍射极限的约100nm横向分辨率的超分辨光学显微成像[Gustafsson,M.G.Surpassing the lateralresolution limit by a factor of two using structured illuminationmicroscopy.J.Microsc.198,82–87(2000).]。相比于PALM、STED等，SIM具有宽视场、快速成像、光漂白和光毒性弱以及对荧光染料的非特异性需求等独特优势，因此特别适合于对活细胞的长期动态超分辨成像[Li,D.et al.Extended-resolution structuredillumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics.Science 349,(2015).]。尽管有着诸多优势，SIM仍然受到一些技术上的挑战，其高质量超分辨图像的数值重建很大程度上依赖于对照明参数的精确估计，这些参数的微小误差会对重建结果产生重大影响，导致干扰定量的重建伪影[Müller,M.,

V.,Hennig,S.,Hübner,W.&Huser,T.Open-source image reconstruction of super-resolution structuredillumination microscopy data in ImageJ.Nat.Commun.7,1–6(2016).]。此外，“变化多端”的照明参数对实验环境极为敏感，除非严格保持成像条件稳定，否则需要在每帧超分辨图像重建前从获取的原始观测数据中进行逐帧的照明参数提取[Huang,X.et al.Fast,long-term,super-resolution imaging with Hessian structured illuminationmicroscopy.Nat.Biotechnol.36,451–459(2018).]。目前最广泛使用的基于迭代互相关(COR)的参数估计法通过实空间相位梯度形式的亚像素优化提取高精度的照明参数(波矢、初相位、调制度)[Gustafsson,M.G.L.et al.Three-Dimensional Resolution Doublingin Wide-Field Fluorescence Microscopy by StructuredIllumination.Biophys.J.94,4957–4970(2008).]。然而，COR的性能受到维持活细胞长期成像所需的低光漂白和光毒性的严苛成像条件所导致的低信噪比的影响，且复杂耗时的迭代优化过程大大降低了SIM的图像重建效率，对快速、实时、长时程、无伪影的活细胞动态超分辨成像构成了严峻挑战。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于主成分分析的结构光照明显微成像方法，为研究活细胞中纳米尺度的亚细胞结构特征、运动状态、相互作用及蛋白质功能提供了一种快速、实时、灵活、便捷、低光损伤的观测手段。

实现本发明目的的技术解决方案为：一种基于主成分分析的结构光照明显微成像方法，具体步骤为：

步骤1：采集结构光照明超分辨所需的样品原始照明图像；

步骤2：分离样品的三个频谱信息；

步骤3：通过双窗频域掩码掩码算子提取1级频谱的中心能量；

步骤4：获取照明向量因子；

步骤5：提取照明向量因子的主成分；

步骤6：从照明向量因子主成分中精确估计照明参数；

步骤7：进行频谱分离精确分离与超分辨图像重建。

优选地，采集结构光照明超分辨所需的样品原始照明图像的具体方法为：

通过结构光照明成像系统采集样品在三个不同照明方向上的三步相移正弦照明图像。

优选地，任一方向上的三步相移正弦照明图像具体为：

其中，D表示被采集的照明图像，下标n表示三步相移图像中的第几幅，n＝1或2或3，r代表图像空间坐标，

表示卷积运算，S为样品信息，P表示成像系统的点扩散函数，k_ex、

和m分别为照明参数的波矢、初相和调制深度，

表示相移步数。

优选地，样品的三个频谱信息包括0级和±1级频谱信息，分离样品的三个频谱信息的具体方法为：

步骤2.1：对步骤1中获取的照明图像进行傅里叶变换，变换后的频谱图像被表示为：

其中上标～表示原对象的傅里叶变换，k代表频率坐标，下标0和±1代表分离的样品频谱的级次，

表示照明图像D的频谱图，

分别表示无光学传递函数与照明参数成分的样品S的0级频谱、+1级频谱和-1级频谱，O代表系统的光学传递函数，j代表虚数符号，e为自然底数，k_ex、

分别为照明参数的波矢、初相；

步骤2.2：对步骤2.1获得的频谱图像进行线性组合并初步分离出样品的0级和±1级频谱信息：

令

C₀，C₁，C_-1分别为初步分离的样品0级和±1级频谱信息。

优选地，步骤3通过双窗频域掩码掩码算子提取1级频谱的中心能量，具体为：

步骤3.1：利用整像素的波矢量将样品+1级频谱移动至图像中心，被移动后的样品+1级频谱信息被表示为：

式中k_int表示整像素的波矢量，k_sub表示残余的亚像素的波矢量；

步骤3.2：利用双窗频域掩码算子提取被整像素移动后的+1级频谱的中心频谱信号，提取的+1级频谱中心能量被表示为：

式中，NaN表示无效点，k_x，min表示双窗频域掩码算子中信号窗在水平x方向上的左边界或下边界，k_y，min双窗频域掩码算子中信号窗在竖直y方向上的左边界或下边界，k_x，max表示双窗频域掩码算子中信号窗在水平x方向上的右边界或上边界，k_y，max表示双窗频域掩码算子中信号窗在竖直y方向上的右边界或上边界，R表示双窗频域掩码算子中空白窗在水平和竖直方向上的尺寸，k_x、k_y表示沿水平x或竖直y方向上的频率坐标。

优选地，步骤4获取照明向量因子的具体方法为：

对样品+1级中心频谱信息讲行逆傅里叶变换，并得到其e指数项：

式中，exp表示以e为底的指数函数，angle表示返回相位的函数，

表示傅里叶逆变换操作。

优选地，步骤5提取照明向量因子的主成分的具体方法为：

步骤5.1：对照明向量因子进行奇异值分解，分解后的照明向量因子表示为：

式中，U和V分别表示照明向量因子的左、右奇异矩阵，上标T表示矩阵的转置，Λ表示照明向量因子的特征值；

步骤5.2：提取照明向量因子的主成分，提取的主成分表示为：

式中，

代表第一行第一列的元素为1，其他元素为0的矩阵，k_x，min表示双窗频域掩码算子中信号窗在水平x方向上的左边界或下边界，k_y，min双窗频域掩码算子中信号窗在竖直y方向上的左边界或下边界，k_x，max表示双窗频域掩码算子中信号窗在水平x方向上的右边界或上边界，k_y，max表示双窗频域掩码算子中信号窗在竖直y方向上的右边界或上边界，R表示双窗频域掩码算子中空白窗在水平和竖直方向上的尺寸。

优选地，步骤6从照明向量因子主成分中估计照明参数的具体步骤为：

步骤6.1：对左奇异矩阵U的第一行元素进行相位展开，通过最小二乘法进行线性拟合，拟合出的斜率即为残余的亚像素波矢k_sub在水平方向上的分量；对右奇异矩阵V的第一列元素进行相位展开，通过最小二乘法进行线性拟合，拟合出的斜率即为残余的亚像素波矢k_sub在竖直方向上的分量；

步骤6.2：取照明向量因子主成分U(Λ·M₁)V^T在频率0处的相位获取初相位

步骤6.3：通过步骤6.1获取的亚像素波矢k_sub对样品+1级频谱进行亚像素平移，通过去卷积后的+1级频谱和0级频谱间的复线性回归以获取调制度m。

优选地，利用在步骤6中获取的照明参数将步骤2中初步分离的样品0级和±1级频谱信息进行分离与重组，对另外两个照明方向执行同样的操作，通过维纳反卷积重构出实时的超分辨图像，具体为：

式中，下标i表示频谱级次，i为0或+1或-1，下标d表示第几个照明分量，k_d，ex表示第d个照明方向的波矢量，

表示无光学传递函数与照明参数成分的第d个照明方向的i级频谱分量，w表示维纳常数。

本发明与现有技术相比，其显著优点为：本发明首次实现了在有外界干扰的复杂、低信噪比实验环境下对照明参数的快速自适应精准补偿和对活细胞精细结构的实时、高质量动态超分辨成像，为研究活细胞中纳米尺度的亚细胞结构特征、运动状态、相互作用及蛋白质功能提供了一种快速、实时、灵活、便捷、低光损伤的观测手段，有望促进新的生物现象的发现，为解决细胞生物学、癌症研究、发育生物学和神经科学问题开辟了新的可能性，对生命科学相关领域具有重大意义。

下面结合附图对本发明作进一步详细描述。

附图说明

图1为本发明的流程图。

图2为利用本发明和传统方法在不同信噪比下对HeLa细胞的实验结果。其中细胞核与α肌动蛋白分别由DAPI与FITC标记。a宽场图像和通过本发明获取的超分辨图像。原始图像通过60X1.42NA物镜获取。HeLa细胞的α肌动蛋白和细胞核分别由488nm和405nm激光所激发。b-d不同信噪比下的图a中方框区域的宽场图像与通过传统方法和本发明获得的超分辨图像。e不同信噪比下的宽场图像。f传统方法和本发明在不同信噪比下的超分辨率结果相对于图b中结果的结构相似性指数(structural similarity index measure，SSIM)。该实验独立重复30次。

图3为利用本发明在不同时间点对COS-7细胞线粒体的实时超分辨重建结果。其中线粒体通过MitoTracker^TMGreen FM标记。a,d宽场图像和本发明获得的超分辨图像。原始图像通过原始图像通过60X 1.42NA物镜获取。b,c图a中蓝色方框内区域在不同时间点的超分辨图像。e,f图d中蓝色和白色方框内区域在不同时间点的超分辨图像。

具体实施方式

一种基于主成分分析的结构光照明显微成像方法，利用基于主成分分析的“降维”工具将实际成像中与照明相量无关的嘈杂、干扰成分剔除，以提取照明参数主导的“第一主成分”，从根本上消除了影响照明参数精确估计的干扰项，从而以简单高效的方式精准识别亚像素精度的波矢量与初相位。此外使用一种双窗频域掩码算子进一步抑制干扰噪声，同时将主成分分析涉及的数据量降低近千倍，极大改善了照明参数估计的计算效率、准确性和稳定性。该发明方法的流程图如图1所示，具体步骤如下：

步骤1：通过结构光照明成像(structured illumination microscopy，SIM)系统采集样品在三个不同照明方向上的三步相移正弦照明图像，其中某个照明方向上的照明图像被表示为：

其中D表示被采集的照明图像，下标n表示三步相移图像中的第几幅，n＝1或2或3，r代表图像空间坐标，

表示卷积运算，S为样品信息，P表示成像系统的点扩散函数，k_ex、

和m分别为照明参数的波矢、初相和调制深度，

表示相移步数。

步骤2：由步骤1中的照明图像初步分离样品的0级和±1级频谱信息。具体步骤为：

步骤2.1：对步骤1中获取的照明图像进行傅里叶变换，变换后的频谱图像被表示为：

其中上标～表示原对象的傅里叶变换，k代表频率坐标，下标0和±1是分离的样品频谱的级次，

表示照明图像D的频谱图，

分别表示无光学传递函数与照明参数成分的样品S的0级频谱、+1级频谱和-1级频谱，O代表系统的光学传递函数，j代表虚数符号，e为自然底数

步骤2.2：对步骤2.1获得的频谱图像进行线性组合并初步分离出样品的0级和±1级频谱信息：

将上式等号左边的三个元素分别重写为

C₀，C₁，C_-1即为初步分离的样品0级和±1级频谱信息。

步骤3：利用一种双窗频域掩码算子提取样品+1级频谱的中心频谱信息，具体为：

步骤3.1：利用整像素的波矢量将步骤2中获取的样品+1级频谱移动至图像中心，被移动后的样品+1级频谱信息可以被表示为：

式中k_int表示整像素的波矢量，k_sub表示残余的亚像素的波矢量。

步骤3.2：利用一种双窗频域掩码算子提取被整像素移动后的+1级频谱的中心频谱信号，被处理后的样品+1级频谱可以被表示为：

式中NaN表示无效点，k_x，min、k_y，min表示双窗频域掩码算子中信号窗在水平x和竖直y方向上的左边界或下边界，k_x，max、k_y，max表示双窗频域掩码算子中信号窗在水平x和竖直y方向上的右边界或上边界，R表示双窗频域掩码算子中空白窗在水平和竖直方向上的尺寸，k_x、k_y表示沿水平x和竖直y方向上的频率坐标。。其中信号窗与空白窗的尺寸，即k_x，min、k_y，min、k_x，max、k_y，max、R的值由满足式N²P/(k_x(y)，max-k_x(y)，min+2R+1)²值最大时的取值获取(其中N表示完整频谱图像的尺寸，P表示信号窗中频谱幅值与全部频谱幅值之间的比值)。步骤3一定程度上去除了与照明参数无关的干扰信号，并将后续要处理的数据量降低近千倍，为高效、高精度的照明参数估计提供保障。

步骤4：通过步骤3中样品+1级频谱的中心频谱信息获取照明向量因子，具体为：

对在步骤3中获取的样品+1级中心频谱信息进行逆傅里叶变换，并得到其e指数项：

式中exp表示以e为底的指数函数，e为自然底数，angle表示返回相位的函数，

表示傅里叶逆变换操作。式(6)即为获取的照明向量因子。

步骤5：提取在步骤4中获取的照明向量因子的主成分，具体为：

步骤5.1：对在步骤4中获取的照明向量因子进行奇异值分解，分解后的照明向量因子可以被表示为：

式中U和V分别表示照明向量因子的左、右奇异矩阵，上标T表示矩阵的转置，Λ表示照明向量因子的特征值。

步骤5.2：提取照明向量因子的主成分，提取的主成分可以被表示为：

式中

代表第一行第一列的元素为1，其他元素为0的矩阵。步骤5将实际成像中与照明相量无关的嘈杂、干扰成分剔除，从根本上消除了影响照明参数精确估计的干扰项，赋予了参数估计极强的抗噪性。

步骤6：根据在步骤5中获取的照明向量因子主成分精准估计照明参数，具体为：

步骤6.1：对在步骤5中获取的左奇异矩阵U的第一行元素进行相位展开，然后通过最小二乘法进行线性拟合，拟合出的斜率即为残余的亚像素波矢k_sub在水平方向上的分量；同样对右奇异矩阵V的第一列元素进行相位展开，然后通过最小二乘法进行线性拟合，拟合出的斜率即为残余的亚像素波矢k_sub在竖直方向上的分量。

步骤6.2：取照明向量因子主成分U(Λ·M₁)V^T在频率0处的相位即可获取初相位

步骤6.3：通过步骤6.1获取的亚像素波矢k_sub对样品+1级频谱进行亚像素平移，然后通过去卷积后的+1级频谱和0级频谱间的复线性回归以获取调制度m：

式中上标*表示原对象的共轭。步骤6.1、6.2、6.3获取的亚像素波矢k_sub、初相位

及调制度m即为照明参数。步骤6非迭代的特性赋予了参数估计高效的处理速度。

步骤7：利用在步骤6中获取的照明参数将步骤2中初步分离的样品0级和±1级频谱信息进行精准分离与重组，对另外两个照明方向执行同样的操作，最终通过维纳反卷积重构出实时的超分辨图像：

式中下标i表示频谱级次，i为0或+1或-1，下标d表示第几个照明分量，k_d，ex表示第d个照明方向的波矢量，

表示无光学传递函数与照明参数成分的第d个照明方向的i级频谱分量，w表示维纳常数(通常由经验确定)。

高精度、非迭代重建、鲁棒的抗噪性和有限的计算复杂度使得本发明成为进行快速、长时程、无伪影活细胞超分辨成像的一种有前途的方法，并首次实现了在有外界干扰的复杂、低信噪比实验环境下对照明参数的快速自适应精准补偿和对活细胞精细结构的实时、高质量动态超分辨成像。

实施例

为测试本发明的可行性和实时性，首先利用本发明所述方法(structuredillumination microscopy based on principal component analysis，PCA-SIM)对不同信噪比下的固定HeLa细胞样片进行超分辨重建。从图2可看出，随着信噪比的降低或随着施加高斯噪声功率(单位：dBW)的增加，由传统迭代互相关参数估计法(cross-correlationapproach，COR)获取的超分辨图像中出现了明显的结构失真和对比度不均衡的现象(图2a-2e)。相比之下，本发明所述方法有效地抑制了这些图像伪影并重建出与常规信噪比下相当的高质量超分辨结果。不同信噪比下的定量化数据表明，本发明在嘈杂的噪声条件下表现出较强的鲁棒性(图2f)。就速度而言，本发明的计算速度较传统互相关法快出近20倍。本实施例证明了本发明在精度、效率、抗噪性方面的综合优势，以及在弱激发条件下应用于长期活细胞成像的潜力。

本发明的一个重要应用是在复杂或恶劣的操作环境下实时地观测亚细胞结构的动态过程。为了验证这一点，利用本发明实时观测了活体COS-7细胞的线粒体动态小管事件(mitochondrial dynamic tubulation，MDT)。如图3a-3b，从线粒体中迅速延伸的细长且高度动态的MDT小管与其他线粒体发生融合并形成它们之前的膜桥，期间发生了某些物质的转移(图3b白色虚线圈所标记区域)，随后MDT小管逐渐增厚并趋于稳定，最终构成线粒体网络。这些实验现象对研究线粒体网络的形成以及线粒体功能(如线粒体DNA完整性、细胞凋亡等)的维持有着重要意义。本实施例充分证明了本发明在探究活细胞结构和动态过程中所发挥出的优点。

Claims (9)

1.一种基于主成分分析的结构光照明显微成像方法，其特征在于，具体步骤为：

步骤1：采集结构光照明超分辨所需的样品原始照明图像；

步骤2：分离样品的三个频谱信息；

步骤3：通过双窗频域掩码掩码算子提取1级频谱的中心能量；

步骤4：获取照明向量因子；

步骤5：提取照明向量因子的主成分；

步骤6：从照明向量因子主成分中精确估计照明参数；

步骤7：进行频谱分离精确分离与超分辨图像重建。

2.根据权利要求1所述的基于主成分分析的结构光照明显微成像方法，其特征在于，采集结构光照明超分辨所需的样品原始照明图像的具体方法为：

通过结构光照明成像系统采集样品在三个不同照明方向上的三步相移正弦照明图像。

3.根据权利要求2所述的基于主成分分析的结构光照明显微成像方法，其特征在于，任一方向上的三步相移正弦照明图像具体为：

其中，D表示被采集的照明图像，下标n表示三步相移图像中的第几幅，n＝1或2或3，r代表图像空间坐标，

表示卷积运算，S为样品信息，P表示成像系统的点扩散函数，k_ex、

和m分别为照明参数的波矢、初相和调制深度，

表示相移步数。

4.根据权利要求1所述的基于主成分分析的结构光照明显微成像方法，其特征在于，样品的三个频谱信息包括0级和±1级频谱信息，分离样品的三个频谱信息的具体方法为：

步骤2.1：对步骤1中获取的照明图像进行傅里叶变换，变换后的频谱图像被表示为：

其中上标～表示原对象的傅里叶变换，k代表频率坐标，下标0和±1代表分离的样品频谱的级次，

表示照明图像D的频谱图，

分别表示无光学传递函数与照明参数成分的样品S的0级频谱、﹢1级频谱和-1级频谱，O代表系统的光学传递函数，j代表虚数符号，e为自然底数，k_ex、

分别为照明参数的波矢、初相；

步骤2.2：对步骤2.1获得的频谱图像进行线性组合并初步分离出样品的0级和±1级频谱信息：

令

C₀，C₁，C_-1分别为初步分离的样品0级和±1级频谱信息。

5.根据权利要求1所述的基于主成分分析的结构光照明显微成像方法，其特征在于，步骤3通过双窗频域掩码掩码算子提取1级频谱的中心能量，具体为：

步骤3.1：利用整像素的波矢量将样品﹢1级频谱移动至图像中心，被移动后的样品﹢1级频谱信息被表示为：

式中k_int表示整像素的波矢量，k_sub表示残余的亚像素的波矢量；

步骤3.2：利用双窗频域掩码算子提取被整像素移动后的﹢1级频谱的中心频谱信号，提取的﹢1级频谱中心能量被表示为：

式中，NaN表示无效点，k_x,min表示双窗频域掩码算子中信号窗在水平x方向上的左边界或下边界，k_y,min双窗频域掩码算子中信号窗在竖直y方向上的左边界或下边界，k_x,max表示双窗频域掩码算子中信号窗在水平x方向上的右边界或上边界，k_y,max表示双窗频域掩码算子中信号窗在竖直y方向上的右边界或上边界，R表示双窗频域掩码算子中空白窗在水平和竖直方向上的尺寸，k_x、k_y表示沿水平x或竖直y方向上的频率坐标。

6.根据权利要求1所述的基于主成分分析的结构光照明显微成像方法，其特征在于，步骤4获取照明向量因子的具体方法为：

对样品﹢1级中心频谱信息进行逆傅里叶变换，并得到其e指数项：

式中，exp表示以e为底的指数函数，angle表示返回相位的函数，

表示傅里叶逆变换操作。

7.根据权利要求1所述的基于主成分分析的结构光照明显微成像方法，其特征在于，步骤5提取照明向量因子的主成分的具体方法为：

步骤5.1：对照明向量因子进行奇异值分解，分解后的照明向量因子表示为：

式中，U和V分别表示照明向量因子的左、右奇异矩阵，上标T表示矩阵的转置，Λ表示照明向量因子的特征值；

步骤5.2：提取照明向量因子的主成分，提取的主成分表示为：

式中，

代表第一行第一列的元素为1，其他元素为0的矩阵，k_x,min表示双窗频域掩码算子中信号窗在水平x方向上的左边界或下边界，k_y,min双窗频域掩码算子中信号窗在竖直y方向上的左边界或下边界，k_x,max表示双窗频域掩码算子中信号窗在水平x方向上的右边界或上边界，k_y,max表示双窗频域掩码算子中信号窗在竖直y方向上的右边界或上边界，R表示双窗频域掩码算子中空白窗在水平和竖直方向上的尺寸。

8.根据权利要求7所述的基于主成分分析的结构光照明显微成像方法，其特征在于，步骤6从照明向量因子主成分中估计照明参数的具体步骤为：

步骤6.1：对左奇异矩阵U的第一行元素进行相位展开，通过最小二乘法进行线性拟合，拟合出的斜率即为残余的亚像素波矢k_sub在水平方向上的分量；对右奇异矩阵V的第一列元素进行相位展开，通过最小二乘法进行线性拟合，拟合出的斜率即为残余的亚像素波矢k_sub在竖直方向上的分量；

步骤6.2：取照明向量因子主成分U(Λ·M₁)V^T在频率0处的相位获取初相位

步骤6.3：通过步骤6.1获取的亚像素波矢k_sub对样品﹢1级频谱进行亚像素平移，通过去卷积后的﹢1级频谱和0级频谱间的复线性回归以获取调制度m。

9.根据权利要求1所述的基于主成分分析的结构光照明显微成像方法，其特征在于，利用在步骤6中获取的照明参数将步骤2中初步分离的样品0级和±1级频谱信息进行分离与重组，对另外两个照明方向执行同样的操作，通过维纳反卷积重构出实时的超分辨图像，具体为：

式中，下标i表示频谱级次，i为0或+1或-1，下标d表示第几个照明分量，k_d,ex表示第d个照明方向的波矢量，

表示无光学传递函数与照明参数成分的第d个照明方向的i级频谱分量，w表示维纳常数。

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