CN112816449B - 一种双波长双尺度纳米药物活体成像系统及时序控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双波长双尺度纳米药物活体成像系统，包括照明单元、显微成像单元和PC上位机，显微成像单元包括组织成像子模块和靶细胞成像子模块，照明单元用于发射第一激发光和/或第二激发光，组织成像子模块获取第一激发光或第二激发光得到纳米药物的介观分布图像，靶细胞成像子模块获取第一激发光和第二激发光得到纳米药物在细胞层面的微观分布图像。可以在同一活体小动物体内获取介观水平纳米药物主要代谢器官的分布及损伤以及微观水平监测纳米药物在靶细胞内的分布及转运特性的同步信息；上位机使用时序精确控制，降低不同时间、不同动物测量的随机误差，阐明纳米药物在小动物体内的转运机制。本发明还公开了一种上述成像系统的时序控制方法。
Description
技术领域
本发明涉及纳米药物荧光显微成像，具体是涉及一种双波长双尺度纳米药物活体成像系统及其时序控制方法。
背景技术
与传统药物相比，纳米药物具有血浆半衰期长、清除率低、靶向输药至病变组织等优点，能够有效提高药物的治疗效果并降低毒副作用。与此同时，跨膜机制的改变，可以增加药物对生物膜的透过性，有利于药物组织吸收及细胞内药效的发挥，进而改善耐药性疾病的疗效，纳米药物以其特有的优势成为当今药物研究的热点。
然而，纳米药物的成药性，如有效性、安全性、质量可控性一直是限制其向临床转化的瓶颈问题，与大量的基础研究相比，只有极少量的纳米药物最终进入临床使用，根本原因是缺乏临床前深入的基础研究及系统的成药性评价。目前，经典的药代动力学研究是考察药物在体内的吸收、分布、代谢、排泄的宏观过程，通过测定血浆药物浓度，计算生物利用度，判断药物的吸收速度与程度，进而判断药物的药代动力学性质的优劣。然而，纳米药物的药物代谢动力学研究不仅与其血浆药物浓度相关，更与其代谢器官富集及组织损伤、靶细胞内药物的转运、结合、代谢、排泄息息相关。基于血浆药物浓度的传统药代动力学并不能准确考察靶器官、靶组织以及靶细胞内的有效药物浓度，进而有效的预测药物疗效。因此，研究纳米药物靶组织、靶细胞的动力学特性，特别是在活体靶细胞内的药代动力学特性显得尤其重要，不仅揭示药物作用的根本原因，还可较准确地预测药物的疗效。故迫切需要将传统的药代动力学研究从“宏观”的血浆药物浓度深入到“微观”的靶细胞、亚细胞层面，探讨影响细胞内药物转运的因素，能更好地预测和改善药物的疗效和毒副作用，推动纳米药物的临床转化速度。
荧光显微技术通过同时检测不同的荧光标记对象来分析细胞的不同组分，突出细胞环境内的特异结构，对活细胞药代动力学研究具有极其重要的意义。尽管各种活体成像系统(CT/SPECT/US/MRI/PET等)可以显示纳米药物更多地聚集于病变组织、器官处，但其空间分辨率往往是毫米级别，远远不能满足活体内细胞成像的需求，也无法评价主要代谢器官的损伤情况。各种光学显微技术(激光共聚焦显微成像、双光子显微成像等)虽然具有非常好的分辨率，可以微观监测细胞结构乃至亚细胞结构的特征，但通常只用于离体的细胞或组织观测，不能实现活体动物靶细胞内纳米药物转运特性的研究。
发明内容
发明目的：针对以上缺点，本发明提供一种观测活体动物组织、靶细胞内纳米药物转运特性的双波长双尺度纳米药物活体成像系统。
本发明还提供上述双波长双尺度纳米药物活体成像系统的时序控制方法。
技术方案：为解决上述问题，本发明采用一种双波长双尺度纳米药物活体成像系统，包括照明单元和显微成像单元，还包括上位机，所述显微成像单元包括组织成像子模块和靶细胞成像子模块，照明单元用于发射第一激发光和/或第二激发光，组织成像子模块获取第一激发光或第二激发光得到纳米药物的介观分布图像，靶细胞成像子模块获取第一激发光和第二激发光得到纳米药物在细胞层面的微观分布图像，上位机控制照明单位周期性发射第一激发光和/或第二激发光以及控制组织成像子模块和靶细胞成像子模块的图像采集。
进一步的，照明单元包括第一激发器、第二激发器、第一激发光快门、第二激发光快门、反光镜、第一双色镜、半波片、分光棱镜，第一激发器发射所述第一激发光，第一激发光用以激发对应纳米壳和细胞膜荧光染料，第一激发光依次经过反光镜、第一双色镜、半波片和分光棱镜；
第二激发器发射所述第二激发光，第二激发光用以激发对应纳米药物荧光染料，第二激发光依次经过第一双色镜、半波片、分光棱镜；第一激发光和/或第二激发光通过半波片和分光棱镜按任意比例分配给组织成像子模块和靶细胞成像子模块；
上位机周期性控制第一激发光快门和第二激发光快门的开关。
进一步的，所述组织成像子模块包括第一透镜、第一光纤、第二透镜、第三透镜、滤光片转换轮、第四透镜、EMCCD，所述第一透镜将第一激发光或第二激发光耦合到第一光纤，所述第一光纤将第一激发光或第二激发光传输至荧光样品处激发第一荧光信号，所述第二透镜用于将第一荧光信号收集并依次传输到第一光纤、第三透镜，所述第三透镜用于显微放大第一荧光信号，并将放大的第一荧光信号传输至滤光片转换轮，所述滤光片转换轮用于对接收的第一荧光信号进行过滤，然后依次传输到第四透镜和EMCCD，所述EMCCD对第一荧光信号进行成像；上位机控制滤光片转换轮转换到对应第一荧光信号波长的高通滤光片，上位机控制EMCCD的采集时间。
进一步的，所述第一光纤包括导光光纤和传像光纤，所述导光光纤设置于传像光纤外圈并环形排列，所述导光光纤用于传输第一激发光或第二激发光，所述传像光纤用于传输第一荧光信号。
进一步的，所述靶细胞成像子模块包括第二双色镜、空间滤波系统、二维扫描振镜、4F系统、第三物镜、第二光纤、第二光纤探头部分、第三双色镜、第一滤光片、第一光电倍增管PMT、第四双色镜、第二滤光片、第二光电倍增管PMT、第三滤光片、第三光电倍增管PMT；
所述第二双色镜用于反射第一激发光和第二激发光，并将第一激发光和第二激发光的融合光传输至空间滤波系统；所述空间滤波系统用于阻挡融合光以外的杂散光，得到滤波光，并将滤波光传输至二维扫描振镜；所述二维扫描振镜用于对滤波光进行光束扫描，得到扫描光，并将扫描光传输至4F系统；所述4F系统用于调整扫描光的光束大小，并将调整后的扫描光传输至第三物镜；所述第三物镜用于将调整后的扫描光耦合进第二光纤；所述第二光纤用于将调整后的扫描光传输至第二光纤探头部分；所述第二光纤探头部分用于将扫描光传输至荧光样品处激发得到的第二荧光信号，并将第二荧光信号反向依次传输至所述第二光纤、第三物镜、4F系统、二维扫描振镜、空间滤波系统、第二双色镜、第三双色镜、第四双色镜；
所述第三双色镜将第二荧光信号分离得到第三荧光信号，并将第三荧光信号反射依次进入第一滤光片、第一光电倍增管PMT得到纳米壳靶细胞成像图；所述第四双色镜将第二荧光信号分离得到第四荧光信号和第五荧光信号，第四双色镜将第四荧光信号反射依次进入第二滤光片、第二光电倍增管PMT得到靶细胞膜成像图；第四双色镜将第五荧光信号透射依次进入第三滤光片、第三光电倍增管PMT得到纳米药物靶细胞成像图；
上位机控制二维扫描振镜扫描，且控制第一光电倍增管PMT、第二光电倍增管PMT和第三光电倍增管PMT的采集时间。
进一步的，所述空间滤波系统包括第一物镜、针孔和第二物镜，所述融合光依次经过第一物镜、针孔和第二物镜。
进一步的，所述4F系统包括扫描透镜和管镜，所述扫描光依次经过扫描透镜和管镜。
进一步的，所述第二光纤探头部分包括微小透镜和GRIN Lens透镜，所述微小透镜用于将所述扫描光耦合传输至GRIN Lens透镜，所述GRIN Lens透镜用于进一步压缩扫描光，然后将压缩的扫描光传输至荧光样品，并接收激发的第二荧光信号。
一种上述纳米药物活体成像系统的时序控制方法，包括以下步骤：
步骤1：准备荧光样品；
步骤2：设置采样频率、以及设置显微成像单元动作时间；
步骤3：打开第一激发光快门，关闭第二激发光快门，同时滤光片转换轮转换到对应标记纳米壳荧光信号波长的高通滤光片，采集EMCCD对荧光样品组织中纳米壳的荧光显微成像；
步骤4：达到纳米壳组织成像采集时间后，关闭第一激发光快门，打开第二激发光快门，同时滤光片转换轮转换到对应标记纳米药物荧光信号波长的高通滤光片，采集EMCCD对荧光样品组织中纳米药物的荧光显微成像；
步骤5：达到纳米药物组织成像采集时间后，同时打开第一激发光快门和第二激发光快门，采集第一光电倍增管PMT对荧光样品靶细胞中纳米壳的荧光显微成像，采集第二光电倍增管PMT对荧光样品靶细胞中细胞膜的荧光显微成像和采集第三光电倍增管PMT对荧光样品靶细胞中纳米药物的荧光显微成像；
步骤6：达到纳米壳、纳米药物和细胞膜的靶细胞成像采集时间后，即完成一个采样周期的检测后，根据设置的采样频率重复步骤3至步骤5。
有益效果：本发明相对于现有技术，其显著优点是可以在同一活体小动物体内获取介观水平纳米药物主要代谢器官的分布及损伤以及微观水平监测纳米药物在靶细胞内的分布及转运特性的同步信息；上位机使用时序精确控制，实现介观、微观两个尺度下荧光信号的分时采集，实现活体小动物代谢器官内纳米药物、纳米壳荧光染料的分时成像以及细胞分辨率下纳米壳、纳米药物和细胞膜三种荧光染料的实时成像，降低不同时间、不同动物测量的随机误差，系统阐明纳米药物在小动物体内的转运机制。
附图说明
图1是为本发明的系统结构示意图；
图2是本发明中第一光纤和第二透镜连接的结构示意图；
图3是本发明中第二光纤及第二光纤探头连接的结构示意图；
图4是本发明荧光样本成像时序示意图；
图5是本发明上位机控制各单元动作的时序示意图。
具体实施方式
如图1所示，本实施例中的一种双波长双尺度纳米药物活体成像系统，包括照明单元、显微成像单元和PC上位机，所述显微成像单元包括组织成像子模块和靶细胞成像子模块，照明单元用于发射第一激发光和/或第二激发光，组织成像子模块获取第一激发光或第二激发光得到纳米药物的介观分布图像，靶细胞成像子模块获取第一激发光和第二激发光得到纳米药物在细胞层面的微观分布图像，上位机控制照明单位周期性发射第一激发光和/或第二激发光以及控制组织成像子模块和靶细胞成像子模块的图像采集。
照明单元包括第一激发器1、第二激发器2、第一激发光快门3、第二激发光快门4、反光镜5、第一双色镜6、半波片7、分光棱镜8，第一激发器1发射第一激发光，第一激发光用以激发对应纳米壳和细胞膜荧光染料，第一激发光依次经过反光镜5、第一双色镜6、半波片7和分光棱镜8；
第二激发器2发射第二激发光，第二激发光用以激发对应纳米药物荧光染料，第二激发光依次经过第一双色镜6、半波片7、分光棱镜8；
第一激发光和/或第二激发光通过半波片7和分光棱镜8按任意比例分配给组织成像子模块和靶细胞成像子模块；第一激发器1和第二激发器2保持常开，第一激发器1和第二激发器2分别设置第一激发光快门3和第二激发光快门4，PC上位机控制第一激发光快门3和第二激发光快门4的开关状态。
组织成像子模块从介观组织层面以图像形式实时观察药物在组织中的分布情况，组织成像子模块包括第一透镜9、第一光纤10、第二透镜11、第三透镜12、滤光片转换轮13、第四透镜14、EMCCD 15，第一光纤10包括导光光纤101和传像光纤102，导光光纤101设置于传像光纤102外圈并环形排列，如图2所示，在本实施例中，第一光纤10包括200根直径30μm激发光导光光纤101和30000根4μm传像光纤102，，激发光导光光纤101外圈环形排列，使目标范围内激光照射均匀，获取的荧光图像无偏差。传像束和导光束隔离，可防止激发光对荧光图像的干扰。
第一透镜9将第一激发光或第二激发光耦合到第一光纤10中的导光光纤101，导光光纤101将第一激发光或第二激发光传输至荧光样品处在组织上均匀照射，激发出第一荧光信号(纳米壳荧光信号或者纳米药物荧光信号)，第一荧光信号经过第二透镜11收集并返回依次传输到第一光纤10的传像光纤102、第三透镜12，第三透镜12用于显微放大第一荧光信号，并将放大的第一荧光信号传输至滤光片转换轮13，滤光片转换轮13根据PC上位机的控制对应第一荧光信号波长的高通滤光片，对接收的第一荧光信号进行过滤，过滤后的第一荧光信号依次传输到第四透镜14和EMCCD15，EMCCD15对第一荧光信号进行成像，PC上位机控制EMCCD15的采集时间。PC上位机将EMCCD 15分时采集的纳米壳荧光图像、纳米药物荧光图像加伪彩并融合，从介观尺度分析纳米药物在代谢器官内的富集、分布、泄露及组织损伤情况。
靶细胞成像子模块从微观细胞层面进行靶组织区域的高分辨显微成像，靶细胞成像子模块包括第二双色镜16、空间滤波系统、二维扫描振镜20、4F系统、第三物镜23、第二光纤24、第二光纤24探头部分、第三双色镜27、第一滤光片28、第一光电倍增管PMT29、第四双色镜30、第二滤光片31、第二光电倍增管PMT32、第三滤光片33、第三光电倍增管PMT34；空间滤波系统包括第一物镜17、针孔18和第二物镜19，用于阻挡成像焦平面以外的散射光和其他杂质光，提高成像分辨率和对比度；4F系统包括扫描透镜21和管镜22，4F系统主要有两个作用：一是完成激光的扩束，二是完成激光的中继；如图3所示，第二光纤24探头部分包括微小透镜25和GRIN Lens透镜26，在本实施例中，第二光纤24探头部分长4mm，微小透镜25数值孔径NA＝0.42，GRIN Lens透镜26物方数值孔径NA＝0.8，像方数值孔径NA＝0.18，放大倍数为4.65，在水中工作距离为80μm。
靶细胞成像子模块工作时，第一激发光快门3和第二激发光快门4全部打开，第二双色镜16反射第一激发光和第二激发光，并将第一激发光和第二激发光的融合光传输至空间滤波系统；融合光依次经过第一物镜17、针孔18和第二物镜19，空间滤波系统阻挡融合光以外的杂散光，得到滤波光，并将滤波光传输至二维扫描振镜20；二维扫描振镜20根据PC上位机的控制对滤波光进行光束扫描，得到扫描光；扫描光传输至4F系统，依次经过扫描透镜21和管镜22，调整扫描光的光束大小；调整后的扫描光传输至第三物镜23，第三物镜23将调整后的扫描光耦合进第二光纤24；通过第二光纤24的扫描光到达第二光纤24探头部分；扫描光经过微小透镜25耦合传输至GRIN Lens透镜26，GRIN Lens透镜26进一步压缩扫描光的光斑，然后将压缩的扫描光传输至荧光样品实现对深层组织样品中的荧光染料的扫描激发，得到的第二荧光信号，激发的第二荧光信号通过GRIN Lens透镜26收集返回，依次传输至所述第二光纤24、第三物镜23、4F系统、二维扫描振镜20、空间滤波系统、第二双色镜16、第三双色镜27、第四双色镜30；
第三双色镜27将第二荧光信号分离得到第三荧光信号(纳米壳荧光信号)，并将第三荧光信号反射进入第一滤光片28和第一光电倍增管PMT29组成的探测光路，得到纳米壳靶细胞成像图；第四双色镜30将第二荧光信号分离得到第四荧光信号(细胞膜荧光信号)和第五荧光信号(纳米药物荧光信号)，第四双色镜30将第四荧光信号反射依次进入第二滤光片31、第二光电倍增管PMT32得到靶细胞膜成像图；第四双色镜30将第五荧光信号透射依次进入第三滤光片33、第三光电倍增管PMT34得到纳米药物靶细胞成像图；荧光信号经过滤光片滤掉非荧光信号的干扰光，最后经过光电倍增管PMT光电转换后，将光电信号导入PC上位机实现高分辨荧光信号的获取。
上位机控制第一光电倍增管PMT29、第二光电倍增管PMT32和第三光电倍增管PMT34的采集时间。PC上位机通过控制二维扫描振镜20进行激光扫描并获取第一光电倍增管PMT 29收集的纳米壳荧光信号、第二光电倍增管PMT 32收集的细胞膜荧光信号以及第三光电倍增管PMT 34收集的纳米药物荧光信号，通过实时监测纳米药物的分布荧光图像、纳米壳的分布荧光图和细胞膜的分布图，可以从微观尺度有效地研究纳米药物的跨膜过程、纳米药物的泄露及控制释放过程。
如图4所示，一种上述双波长双尺度纳米药物活体成像系统的时序控制方法，包括以下步骤：
步骤1：准备荧光样品；将荧光染料标记的纳米壳、纳米药物以及细胞膜染料注射到动物体内，待动物代谢一段时间后开始监测荧光信号；
步骤2：设置采样频率得到采样周期、以及设置一个采样周期中显微成像PC上位机控制的各单元图像动作时间；
步骤3：一个采样周期中，如图5所示，第一激发器1和第二激发器2保持常开(长方形表示常开，否则关闭)，首先组织成像子模块工作，先打开第一激发光快门3，关闭第二激发光快门4，同时滤光片转换轮13转换到对应标记纳米壳荧光信号波长的高通滤光片，采集EMCCD15对荧光样品组织中纳米壳的荧光显微成像，根据设置的动作时间，对纳米壳组织成像进行采集，图中对应的长方形表示其开始采集，宽度表示其采集时间；
步骤4：达到纳米壳组织成像采集时间后，关闭第一激发光快门3，打开第二激发光快门4，同时滤光片转换轮13转换到对应标记纳米药物荧光信号波长的高通滤光片，采集EMCCD15对荧光样品组织中纳米药物的荧光显微成像；滤光片转换轮13通过USB接口与上位机相连，上位机控制其旋转和停止的位置，图中对应的长方形表示其通过纳米壳染料发出的荧光，对应的三角形表示其通过纳米药物染料发出的荧光；
步骤5：达到纳米药物组织成像采集时间后，同时打开第一激发光快门3和第二激发光快门4，二维扫描振镜20开始扫描，二维扫描振镜20控制激发光实现样品的点扫描，三个光电倍增管PMT实现焦平面各点荧光信号的获取，采集第一光电倍增管PMT29对荧光样品靶细胞中纳米壳的荧光显微成像，采集第二光电倍增管PMT32对荧光样品靶细胞中细胞膜的荧光显微成像和采集第三光电倍增管PMT34对荧光样品靶细胞中纳米药物的荧光显微成像；
步骤6：达到纳米壳、纳米药物和细胞膜的靶细胞成像采集时间后，即完成一个采样周期的检测后，根据设置的采样频率等待进行下一个采样周期重复步骤3至步骤5。本系统设计的时序控制方法，使两个尺度的子模块对不同的荧光样本有序地探测，为后期荧光数据的正确处理提供了保证，是系统软件的控制核心，是分析纳米药物药效的基础。
Claims (5)
1.一种双波长双尺度纳米药物活体成像系统的时序控制方法，其特征在于，双波长双尺度纳米药物活体成像系统包括照明单元和显微成像单元，还包括上位机，所述显微成像单元包括组织成像子模块和靶细胞成像子模块，照明单元用于发射第一激发光和/或第二激发光，组织成像子模块获取第一激发光或第二激发光得到纳米药物的介观分布图像，靶细胞成像子模块获取第一激发光和第二激发光得到纳米药物在细胞层面的微观分布图像，上位机控制照明单位周期性发射第一激发光和/或第二激发光以及控制组织成像子模块和靶细胞成像子模块的图像采集；照明单元包括第一激发器（1）、第二激发器（2）、第一激发光快门（3）、第二激发光快门（4）、反光镜（5）、第一双色镜（6）、半波片（7）、分光棱镜（8），第一激发器（1）发射所述第一激发光，第一激发光用以激发对应纳米壳和细胞膜荧光染料，第一激发光依次经过反光镜（5）、第一双色镜（6）、半波片（7）和分光棱镜（8）；
第二激发器（2）发射所述第二激发光，第二激发光用以激发对应纳米药物荧光染料，第二激发光依次经过第一双色镜（6）、半波片（7）、分光棱镜（8）； 第一激发光和/或第二激发光通过半波片（7）和分光棱镜（8）按任意比例分配给组织成像子模块和靶细胞成像子模块；
上位机周期性控制第一激发光快门（3）和第二激发光快门（4）的开关；所述组织成像子模块包括第一透镜（9）、第一光纤（10）、第二透镜（11）、第三透镜（12）、滤光片转换轮（13）、第四透镜（14）、EMCCD （15），所述第一透镜（9）将第一激发光或第二激发光耦合到第一光纤（10），所述第一光纤（10）将第一激发光或第二激发光传输至荧光样品处激发第一荧光信号，所述第二透镜（11）用于将第一荧光信号收集并依次传输到第一光纤（10）、第三透镜（12），所述第三透镜（12）用于显微放大第一荧光信号，并将放大的第一荧光信号传输至滤光片转换轮（13），所述滤光片转换轮（13）用于对接收的第一荧光信号进行过滤，然后依次传输到第四透镜（14）和EMCCD（15），所述EMCCD（15）对第一荧光信号进行成像；上位机控制滤光片转换轮（13）转换到对应第一荧光信号波长的高通滤光片，上位机控制EMCCD（15）的采集时间；
所述靶细胞成像子模块包括第二双色镜（16）、空间滤波系统、二维扫描振镜（20）、4F系统、第三物镜（23）、第二光纤（24）、第二光纤（24）探头部分、第三双色镜（27）、第一滤光片（28）、第一光电倍增管PMT（29）、第四双色镜（30）、第二滤光片（31）、第二光电倍增管PMT（32）、第三滤光片（33）、第三光电倍增管PMT（34）；
所述第二双色镜（16）用于反射第一激发光和第二激发光，并将第一激发光和第二激发光的融合光传输至空间滤波系统；所述空间滤波系统用于阻挡融合光以外的杂散光，得到滤波光，并将滤波光传输至二维扫描振镜（20）；所述二维扫描振镜（20）用于对滤波光进行光束扫描，得到扫描光，并将扫描光传输至4F系统；所述4F系统用于调整扫描光的光束大小，并将调整后的扫描光传输至第三物镜（23）；所述第三物镜（23）用于将调整后的扫描光耦合进第二光纤（24）；所述第二光纤（24）用于将调整后的扫描光传输至第二光纤（24）探头部分；所述第二光纤（24）探头部分用于将扫描光传输至荧光样品处激发得到的第二荧光信号，并将第二荧光信号反向依次传输至所述第二光纤（24）、第三物镜（23）、4F系统、二维扫描振镜（20）、空间滤波系统、第二双色镜（16）、第三双色镜（27）、第四双色镜（30）；
所述第三双色镜（27）将第二荧光信号分离得到第三荧光信号，并将第三荧光信号反射依次进入第一滤光片（28）、第一光电倍增管PMT（29）得到纳米壳靶细胞成像图；所述第四双色镜（30）将第二荧光信号分离得到第四荧光信号和第五荧光信号，第四双色镜（30）将第四荧光信号反射依次进入第二滤光片（31）、第二光电倍增管PMT（32）得到靶细胞膜成像图；第四双色镜（30）将第五荧光信号透射依次进入第三滤光片（33）、第三光电倍增管PMT（34）得到纳米药物靶细胞成像图；
上位机控制二维扫描振镜（20）扫描，且控制第一光电倍增管PMT（29）、第二光电倍增管PMT（32）和第三光电倍增管PMT（34）的采集时间；
时序控制方法包括以下步骤：
步骤1：准备荧光样品；
步骤2：设置采样频率、以及设置显微成像单元动作时间；
步骤3：打开第一激发光快门（3），关闭第二激发光快门（4），同时滤光片转换轮（13）转换到对应标记纳米壳荧光信号波长的高通滤光片，采集EMCCD（15）对荧光样品组织中纳米壳的荧光显微成像；
步骤4：达到纳米壳组织成像采集时间后，关闭第一激发光快门（3），打开第二激发光快门（4），同时滤光片转换轮（13）转换到对应标记纳米药物荧光信号波长的高通滤光片，采集EMCCD（15）对荧光样品组织中纳米药物的荧光显微成像；
步骤5：达到纳米药物组织成像采集时间后，同时打开第一激发光快门（3）和第二激发光快门（4），采集第一光电倍增管PMT（29）对荧光样品靶细胞中纳米壳的荧光显微成像，采集第二光电倍增管PMT（32）对荧光样品靶细胞中细胞膜荧光显微成像和采集第三光电倍增管PMT（34）对荧光样品靶细胞中纳米药物的荧光显微成像；
步骤6：达到纳米壳、纳米药物和细胞膜的靶细胞成像采集时间后，即完成一个采样周期的检测后，根据设置的采样频率重复步骤3至步骤5。
2.根据权利要求1所述的双波长双尺度纳米药物活体成像系统的时序控制方法，其特征在于，所述第一光纤（10）包括导光光纤（101）和传像光纤（102），所述导光光纤（101）设置于传像光纤（102）外圈并环形排列，所述导光光纤（101）用于传输第一激发光或第二激发光，所述传像光纤（102）用于传输第一荧光信号。
3.根据权利要求1所述的双波长双尺度纳米药物活体成像系统的时序控制方法，其特征在于，所述空间滤波系统包括第一物镜（17）、针孔（18）和第二物镜（19），所述融合光依次经过第一物镜（17）、针孔（18）和第二物镜（19）。
4.根据权利要求1所述的双波长双尺度纳米药物活体成像系统的时序控制方法，其特征在于，所述4F系统包括扫描透镜（21）和管镜（22），所述扫描光依次经过扫描透镜（21）和管镜（22）。
5.根据权利要求1所述的双波长双尺度纳米药物活体成像系统的时序控制方法，其特征在于，所述第二光纤（24）探头部分包括微小透镜（25）和GRIN Lens透镜（26），所述微小透镜（25）用于将所述扫描光耦合传输至GRIN Lens透镜（26），所述GRIN Lens透镜（26）用于进一步压缩扫描光，然后将压缩的扫描光传输至荧光样品，并接收激发的第二荧光信号。
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