CN114895450B - 基于二次谐波的超分辨显微成像系统及成像方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于二次谐波的超分辨显微成像系统及成像方法，系统包括信号采集装置及成像处理终端，信号采集装置包括：脉冲激光器、半波片、格兰激光棱镜、螺旋相位板、角反射器、分束器、双色镜、振镜、扫描透镜、显微镜、三维移动平台及光电倍增管。上述的成像系统，脉冲激发光通过格兰激光棱镜后分离为第一激光及第二激光，螺旋相位板将第一激光的波前由高斯型转换成环形并进行光程调整，将环形激光及第二激光合束为组合光束，组合光束中两束激光的焦平面在空间上重合并聚焦照射样品，样品受激产生二次谐波信号进行放大处理得到谐波放大信号并输出至成像处理终端，成像处理终端处理得到样品图像，简化了成像设备并提高了成像分辨率。

Description

基于二次谐波的超分辨显微成像系统及成像方法

技术领域

本发明涉及光学显微镜成像的技术领域，尤其涉及一种基于二次谐波的超分辨显微成像系统及成像方法。

背景技术

非线性光学描述了光与物质相互作用中入射场与产生的对应场极化的非线性关系，是物理光学最基本的基础学科分支之一，在激光技术、显微成像、材料科学以及量子光学等方向都有重要的意义。二次谐波成像是近年来发展迅速的一种光学成像技术，是一种生物结构检测和耐久追踪标记的新工具。二次谐波成像采用二阶非线性光学原理，光子在生物样品中只发生非线性散射，不涉及光化学过程，具有三维高分辨率，不需要荧光标记和对生物样品损伤小等特点，避免了荧光探针在标记和成像过程中遇到的许多固有缺点，是一种理想的活体成像方法，因此在生物医学研究中具有广阔的应用前景。二次谐波成像与双光子荧光成像的原理类似，区别在于谐波成像是光波倍频的过程，实际上不吸收光子的能量，也不产生荧光，而是发射出一个波长恰好为激发波长一半的出射光。这使得二次谐波成像系统与双光子成像系统基本兼容，只需要采用不同的滤波器过滤出二次谐波信号即可。但是，二次谐波成像技术仍然受光学衍射的限制，无法清晰辨别尺寸在200nm以下的生物体结构，因此限制了其在亚细胞结构中的应用。

为了突破光学衍射极限，超分辨成像技术应运而生。近几十年，基于不同原理的超分辨成像方法被陆续提出，如受激辐射损耗(Stimulated emission depletion,STED)显微镜、结构光照明显微镜(Structured illumination microscopy,SIM)和单分子定位显微镜(Single-molecule localization microscopy,SMLM)等。但是，上述技术都是基于荧光“开/关”态的超分辨成像原理，不仅需要具有特殊光物理化学特性的荧光探针，而且在追求超分辨率极限时会产生一系列新的问题，比如高的激光功率、低的成像速度、复杂的成像系统和昂贵的实验成本等，导致成像成本高、成像效率低。此外，现有技术方法中的二次谐波成像技术存在成像效率不高的问题。

发明内容

本发明实施例提供了一种基于二次谐波的超分辨显微成像系统及成像方法，旨在解决现有技术方法中的二次谐波成像技术所存在的成像分辨率不高的问题。

第一方面，本发明实施例提供了一种基于二次谐波的超分辨显微成像系统，其中，所述系统包括信号采集装置及成像处理终端，所述信号采集装置包括：脉冲激光器、半波片、格兰激光棱镜、螺旋相位板、角反射器、分束器、双色镜、振镜、扫描透镜、显微镜、三维移动平台及光电倍增管；所述脉冲激光器的下游依次设置所述半波片及所述格兰激光棱镜，所述格兰激光棱镜与所述分束器之间形成第一光路及第二光路，所述第一光路中设有所述螺旋相位板及所述角反射器；所述半波片用于对所述脉冲激光器产生的脉冲激发光进行偏振方向调节，所述格兰激光棱镜用于对进行偏振方向调节后的脉冲激发光进行分离，得到偏振方向不同的两束激光；所述两束激光分别经所述第一光路及所述第二光路传输至所述分束器，所述分束器对两束激光进行合束；所述螺旋相位板用于将激光的波前由高斯型转换成环形；所述角反射器用于对第一光路中传输的环形激光的光程进行调整，以调节第二光路中高斯型激光和第一光路中环形激光之间的脉冲间隔；所述分束器的下游设置所述双色镜，所述双色镜对来自所述分束器的激光进行透射并依次经所述振镜、所述扫描透镜、所述显微镜传输至所述三维移动平台中放置的样品；所述双色镜同时对所述三维移动平台中样品受激发产生的二谐波信号反射至所述光电倍增管；所述振镜用于对激发光进行同步扫描以实现对样品的面阵成像；所述扫描透镜用于收集面阵扫描的激光光束；所述显微镜用于聚焦光束照射所述三维移动平台中放置的样品并同时收集所述样品受激发产生的二次谐波信号；所述三维移动平台用于驱动所述样品进行三维移动；所述光电倍增管用于对所述双色镜反射的二谐波信号进行放大处理得到谐波放大信号；所述光电倍增管与所述成像处理终端进行电连接以输出谐波放大信号至所述成像处理终端，所述脉冲激光器与所述成像处理终端进行电连接以输出脉冲同步信号至所述程序处理终端；所述成像处理终端用于对所述谐波放大信号及所述脉冲同步信号进行处理得到样品图像。

第二方面，本发明实施例还提供了一种基于二次谐波的超分辨显微成像方法，其中，所述方法应用于上述第一方面的基于二次谐波的超分辨显微成像系统，所述方法包括：

开启所述脉冲激光器产生脉冲激发光经所述半波片调节偏振方向并经所述格兰激光棱镜分离得到第一激光及第二激光；所述第二激光为高斯型激光；

所述第一激光经所述第一光路传输，由所述第一光路中的螺旋相位板将所述第一激光的波前由高斯型转换成环形得到环形激光后通过所述角反射器进行光程调整；

所述分束器对所述环形激光及经所述第二光路传输的高斯型激光进行合束形成组合光束；

所述组合光束依次经过所述双色镜透射、所述振镜反射、所述扫描透镜透射及所述显微镜透射聚焦后照射所述样品；根据实时成像的样品图像调整所述扫描透镜及所述显微镜以进行光斑调节，使所述组合光束的环形激光及高斯型激光的焦平面在空间上重合；

所述样品被所述组合光束照射，受激发产生的二次谐波信号经所述显微镜透射、所述扫描透镜透射、所述振镜反射及所述双色镜反射后输入至所述光电倍增管；

所述光电倍增管对所述二次谐波信号进行放大处理，得到谐波放大信号后输出至所述成像处理终端；

所述成像处理终端获取所述谐波放大信号及所述脉冲激发光的脉冲同步信号进行处理得到样品图像。

第三方面，本发明实施例还提供了一种基于二次谐波的超分辨显微成像方法，其中，所述方法应用于上述第一方面的基于二次谐波的超分辨显微成像系统中的成像处理终端，所述方法包括：

根据所述脉冲同步信号确定对应的激光脉冲周期；

根据所述激光脉冲周期对所述谐波放大信号进行通道分离，得到第一通道对应的高斯点扩展函数图像及第二通道对应的环形点扩展函数图像；

从所述高斯点扩展函数图像中减去所述环形点扩展函数图像的二次谐波信号光子得到样品图像，所述样品图像为压缩所述高斯点扩展函数图像实现超分辨成像的图像。

本发明实施例提供了一种基于二次谐波的超分辨显微成像系统及成像方法，系统包括信号采集装置及成像处理终端，信号采集装置包括：脉冲激光器、半波片、格兰激光棱镜、螺旋相位板、角反射器、分束器、双色镜、振镜、扫描透镜、显微镜、三维移动平台及光电倍增管。上述的基于二次谐波的超分辨显微成像系统，通过脉冲激光器产生脉冲激发光经半波片调节偏振方向并经格兰激光棱镜分离得到第一激光及第二激光，螺旋相位板将第一激光的波前由高斯型转换成环形并通过角反射器进行光程调整，分束器对环形激光及第二激光进行合束形成组合光束，组合光束中的环形激光及高斯型激光的焦平面在空间上重合并聚焦后照射样品，样品受激发产生二次谐波信号输入光电倍增管，光电倍增管对二次谐波信号进行放大处理得到谐波放大信号输出至成像处理终端，成像处理终端处理得到样品图像，简化了成像设备，并大幅提升了二次谐波成像的分辨率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的基于二次谐波的超分辨显微成像系统的结构示意图；

图2为本发明实施例提供的基于二次谐波的超分辨显微成像系统的效果示意图；

图3为本发明实施例提供的基于二次谐波的超分辨显微成像方法的流程示意图；

图4为本发明实施例提供的基于二次谐波的超分辨显微成像方法的另一流程示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

应当理解，当在本说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”和“包含”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。

还应当理解，在本发明说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的而并不意在限制本发明。如在本发明说明书和所附权利要求书中所使用的那样，除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一”、“一个”及“该”意在包括复数形式。

还应当进一步理解，在本发明说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。

在本实施例中，请参阅图1，图1为本发明实施例提供的基于二次谐波的超分辨显微成像系统的结构示意图。如图所示，本发明实施例提供了一种基于二次谐波的超分辨显微成像系统，所述系统包括信号采集装置及成像处理终端20，所述信号采集装置包括：脉冲激光器101、半波片102、格兰激光棱镜103、螺旋相位板104、角反射器105、分束器106、双色镜107、振镜108、扫描透镜109、显微镜110、三维移动平台120及光电倍增管121；所述脉冲激光器101的下游依次设置所述半波片102及所述格兰激光棱镜103，所述格兰激光棱镜103与所述分束器106之间形成第一光路及第二光路，所述第一光路中设有所述螺旋相位板104及所述角反射器105；所述半波片102用于对所述脉冲激光器101产生的脉冲激发光进行偏振方向调节，所述格兰激光棱镜103用于对进行偏振方向调节后的脉冲激发光进行分离，得到偏振方向不同的两束激光；所述两束激光分别经所述第一光路及所述第二光路传输至所述分束器106，所述分束器106对两束激光进行合束；所述螺旋相位板104用于将激光的波前由高斯型转换成环形；所述角反射器105用于对第一光路中传输的环形激光的光程进行调整，以调节第二光路中高斯型激光和第一光路中环形激光之间的脉冲间隔。

其中，脉冲激光器(Pulsed laser)101所产生的脉冲激发光的波长为600-1300nm，可根据实际使用情况对脉冲激发光的波长进行调节，以使波长与所需成像的样品相适配。半波片(Half-wave plate,HWP)102用于调节激光的偏振方向，格兰激光棱镜(Glan-laserpolarizer,GLP)103用于分离不同偏振方向的激光得到第一激光及第二激光，螺旋相位板(Vortex phase plate,VPP)104用于将激光的波前由高斯型转换成环形。角反射器(Retroreflector,RR)105的位置可进行调节，通过调节角反射器105的位置可改变第一光路中环形激发光斑的光程，从而在在时间上控制高斯型激光(第二激光)和环形激光(第一激光)之间的脉冲间隔，环形激发光斑的光程可被延长或缩短。分束器(Beam splitter,BS)106用于对激光进行合束。信号采集装置中还设置有多个反射镜(Mirror,M)122，反射镜122用于对激光进行反射以改变激光的传输方向，在本申请实施例中，第二光路中设有一个反射镜122，螺旋相位板104与角反射器105之间设有一个反射镜122。

所述分束器106的下游设置所述双色镜107，所述双色镜107对来自所述分束器106的激光进行透射并依次经所述振镜108、所述扫描透镜109、所述显微镜110传输至所述三维移动平台120中放置样品；所述双色镜107同时对所述三维移动平台120中样品受激发产生的二谐波信号反射至所述光电倍增管121；所述振镜108用于对激发光进行同步扫描以实现对样品的面阵成像；所述扫描透镜109用于收集面阵扫描的激光光束；所述显微镜110用于聚集光束照射所述三维移动平台120中放置样品并同时收集所述样品受激发产生的二次谐波信号；所述三维移动平台120用于驱动所述样品进行三维移动；所述光电倍增管121用于对所述双色镜107反射的二谐波信号进行放大处理得到谐波放大信号。

其中，双色镜(Dichroic mirror,DM)107用于透射脉冲激发光并反射二次谐波信号，振镜(Scanner)108用于对脉冲激发光进行同步扫描，实现对样品的面阵成像，扫描透镜(Scan lens,SL)109用于收集面阵扫描的激光光束。显微镜110用于对脉冲激发光进行聚焦，聚焦的激发光照射样品从而产生二次谐波信号；可通过三维移动平台120驱动样品沿水平方向进行二维移动，以调整激发光对样品进行聚焦照射的区域，还可通过三维移动平台120驱动样品沿Z轴方向进行竖直移动，以使激发光聚焦的焦点准确照射于样品上。具体的，分束器106与双色镜107之间还设有一个反光镜122。

所述光电倍增管121与所述成像处理终端20进行电连接以输出谐波放大信号至所述成像处理终端20，所述脉冲激光器101与所述成像处理终端20进行电连接以输出脉冲同步信号至所述成像处理终端20；所述成像处理终端20用于对所述谐波放大信号及所述脉冲同步信号进行处理得到样品图像。

在更具体的实施例中，所述显微镜110包括管镜111、物镜113及设置于所述管镜111与所述物镜113之间的四分之一玻片112，所述管镜111与所述物镜113组合以将激光光束聚焦到焦平面照射所述样品，所述四分之一玻片112将线偏振激光光转换成右旋圆偏振光。具体的，物镜113可用于放大，物镜113的放大倍数可以进行调节，可选用8倍、10倍、20倍、50倍、100倍或200倍物镜进行放大处理。

在更具体的实施例中，所述光电倍增管121与所述双色镜107之间还设有滤光片123。可通过滤光片123对二次谐波信号进行滤波处理，以滤除其他杂散光、提高二次谐波信号的信噪比，从而进一步增强最终所得到的样品图像的清晰度。

在更具体的实施例中，所述成像处理终端20包括相连接的时间相关单光子计数器21及处理终端22；所述时间相关单光子计数器21与所述脉冲激光器101进行电连接；所述时间相关单光子计数器21用于接收二次谐波信号并对所述二次谐波信号的时空信息进行测量及记录，将得到的二次谐波信号的时空信息及脉冲同步信号传输至处理终端22；所述处理终端22用于获取脉冲同步信号及测量得到的二次谐波信号的时空信息并进行数据处理以得到样品图像。

具体的，时间相关单光子计数器(Time-correlated single photon counting,TSCPC)21用于对二次谐波信号中光子在时间分布及空间分布上进行计数，从而实现对二次谐波信号进行测量并得到对应的时空信息。处理终端22可以是安装数据处理软件以对脉冲同步信号及测量得到的二次谐波信号的时空信息进行数据处理得到样品图像的终端设备，如台式电脑或笔记本电脑等。

在更具体的实施例中，通过所述角反射器105调整所述第一光路中环形激光的光程，以使所述环形激光与所述第二激光之间的脉冲间隔为0.4-0.6个激光脉冲周期，所述激光脉冲周期为所述脉冲激发光的脉冲周期。其中，所述激光脉冲周期为20-120MHz。

请参阅图3，图3为本发明实施例提供的基于二次谐波的超分辨显微成像方法的方法流程示意图，其中，该显微成像方法应用于上述的基于二次谐波的超分辨显微成像系统，如图3所示，所述方法包括步骤S110-S170。

S110、开启所述脉冲激光器产生脉冲激发光经所述半波片调节偏振方向并经所述格兰激光棱镜分离得到第一激光及第二激光；所述第二激光为高斯型激光。

工作时，打开脉冲激光器产生脉冲激发光，其中，所述飞秒激光器产生的飞秒脉冲型激发光的波长为600-1300nm。

S120、所述第一激光经所述第一光路传输，由所述第一光路中的螺旋相位板将所述第一激光的波前由高斯型转换成环形得到环形激光后通过角反射器进行光程调整。

通过移动角反射器调节高斯激光和环形激光之间的脉冲间隔，将脉冲间隔调节至约半个激光脉冲周期，例如将脉冲间隔调节为0.4-0.6个激光脉冲周期。

S130、所述分束器对所述环形激光及经所述第二光路传输的高斯型激光进行合束形成组合光束。

S140、所述组合光束依次经过所述双色镜透射、所述振镜反射、所述扫描透镜透射及所述显微镜透射聚焦后照射所述样品；根据实时成像的样品图像调整所述扫描透镜及所述显微镜以进行光斑调节，使所述组合光束的环形激光及高斯型激光的焦平面在空间上重合。

通过实时成像得到的样品图像进行光斑调节，使高斯激光和环形激光的焦平面在空间上精准重合。

S150、所述样品被所述组合光束照射，受激发产生的二次谐波信号经所述显微镜透射、所述扫描透镜透射、所述振镜反射及所述双色镜反射后输入至所述光电倍增管。

样品被激光照射后产生二次谐波信号，信号被同一物镜收集后原路返回，被双色镜反射后经过滤光片后到达光电倍增管。

S160、所述光电倍增管对所述二次谐波信号进行放大处理，得到谐波放大信号后输出至所述成像处理终端。

S170、所述成像处理终端获取所述谐波放大信号及所述脉冲激发光的脉冲同步信号进行处理得到样品图像。

本发明利用荧光寿命成像技术的时间分辨探测能力，通过时间相关单光子计数器获取二次谐波信号光子的时空信息。

请参阅图4，图4为本发明实施例提供的基于二次谐波的超分辨显微成像方法的方法流程示意图，其中，该显微成像方法应用于上述的基于二次谐波的超分辨显微成像系统中的成像处理终端，如图4所示，所述方法包括步骤S210-S230。

S210、根据所述脉冲同步信号确定对应的激光脉冲周期。

例如，在具体实施例中，可输出激光脉冲周期为80MHz的脉冲激发光，并调节角反射器使高斯和环形激光脉冲的脉冲间隔为激光脉冲周期的一半。

S220、根据所述激光脉冲周期对所述谐波放大信号进行通道分离，得到第一通道对应的高斯点扩展函数图像及第二通道对应的环形点扩展函数图像。

当激光照射样品后立即发出二次谐波信号，因此时间相关单光子计数器采集两束激光脉冲后产生的二次谐波信号光子，也即成像处理终端需对两束激光脉冲后产生的二次谐波信号中的光子进行分析，利用荧光寿命成像技术对样品进行二次谐波成像，对采集到的数据进行时间通道分离。其中，所述第一通道为一个所述激光脉冲周期内脉冲间隔时间对应的时间通道；所述第二通道为所述激光脉冲周期内剩余时间对应的时间通道；所述脉冲间隔时间为所述环形激光与所述第二激光之间脉冲间隔的时长。例如，当脉冲间隔为激光脉冲周期的一半时，则第一通道对应的时长即为半个激光脉冲周期，第二通道对应的时长也为半个激光脉冲周期；提取前半个脉冲周期内的二次谐波信号光子组成高斯点扩展函数图像，剩余的二次谐波信号光子组成环形点扩展函数图像，获取高斯点扩展函数图像及环形点扩展函数图像的具体过程如图2所示，其中S1即为获取到的高斯点扩展函数图像，S2即为获取到的环形点扩展函数图像，当激光脉冲周期为80MHz时，两幅图像之间的时间差为纳秒量级，相当于实时记录了高斯光斑和环形光斑的空间位置信息。

S230、从所述高斯点扩展函数图像中减去所述环形点扩展函数图像的二次谐波信号光子得到样品图像，所述样品图像为压缩所述高斯点扩展函数图像实现超分辨成像的图像。

对两幅图像中每一像素的强度值进行空间调制，具体的，可从高斯点扩展函数图像中减去环形点扩展函数图像的二次谐波信号光子，从而得到样品图像，通过压缩高斯点扩展函数图像实现超分辨成像。例如，如图2所示，R1＝S1-S2，则R1即为最终获取到的样品图像。

在一具体的实施例中，步骤S220之后还包括步骤：将预置的权重因子与所述环形点扩展函数图像相乘以对图像进行强度增强得到增强图像；从所述高斯点扩展函数图像中减去所述增强图像的二次谐波信号光子得到样品图像，所述样品图像为压缩所述高斯点扩展函数图像实现超分辨成像的图像。

在另一实施例中，还可对上述步骤S230进行替换，为进一步提高图像的分辨率，还可引入权重因子(β)对环形点扩展函数图像进行强度增强，通过空间调制增加对高斯点扩展函数图像中高斯光斑周围发光区域的抑制效果，去除衍射受限的低频信号和背景噪音，进一步提升分辨率。例如，如图2所示，S3＝β×S2，R2＝S1-S3，R2即为最终获取到的样品图像。

因此，本发明提出的基于时间分辨探测的二次谐波成像系统可以在单波长激光下实现无标记超分辨成像，不仅能够保持被观测样品自身原有的生物特性，还可以最大程度地保障获取图像信息的真实性和有效性。通过这一技术实现超分辨率下的二次谐波成像，有利于一些疾病的早期诊断和术后治疗监测，为生物医学领域的研究提供强有力的技术支撑。

在本发明实施例所提供了一种基于二次谐波的超分辨显微成像系统及成像方法，系统包括信号采集装置及成像处理终端，信号采集装置包括：脉冲激光器、半波片、格兰激光棱镜、螺旋相位板、角反射器、分束器、双色镜、振镜、扫描透镜、显微镜、三维移动平台及光电倍增管。上述的基于二次谐波的超分辨显微成像系统，通过脉冲激光器产生脉冲激发光经半波片调节偏振方向并经格兰激光棱镜分离得到第一激光及第二激光，螺旋相位板将第一激光的波前由高斯型转换成环形并通过角反射器进行光程调整，分束器对环形激光及第二激光进行合束形成组合光束，组合光束中的环形激光及高斯型激光的焦平面在空间上重合并聚焦后照射样品，样品受激发产生二次谐波信号输入光电倍增管，光电倍增管对二次谐波信号进行放大处理得到谐波放大信号输出至成像处理终端，成像处理终端处理得到样品图像，简化了成像设备，并大幅提升了二次谐波成像的分辨率。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种基于二次谐波的超分辨显微成像系统，其特征在于，所述系统包括信号采集装置及成像处理终端，所述信号采集装置包括：脉冲激光器、半波片、格兰激光棱镜、螺旋相位板、角反射器、分束器、双色镜、振镜、扫描透镜、显微镜、三维移动平台及光电倍增管；

所述脉冲激光器的下游依次设置所述半波片及所述格兰激光棱镜，所述格兰激光棱镜与所述分束器之间形成第一光路及第二光路，所述第一光路中设有所述螺旋相位板及所述角反射器；所述半波片用于对所述脉冲激光器产生的脉冲激发光进行偏振方向调节，所述格兰激光棱镜用于对进行偏振方向调节后的脉冲激发光进行分离，得到偏振方向不同的两束激光，即为第一激光及第二激光，所述第二激光为高斯型激光；所述两束激光分别经所述第一光路及所述第二光路传输至所述分束器，所述分束器对两束激光进行合束；所述螺旋相位板用于将激光的波前由高斯型转换成环形；所述角反射器用于对第一光路中传输的环形激光的光程进行调整，以调节第二光路中高斯型激光和第一光路中环形激光之间的脉冲间隔；

所述分束器的下游设置所述双色镜，所述双色镜对来自所述分束器的激光进行透射并依次经所述振镜、所述扫描透镜、所述显微镜传输至所述三维移动平台中放置的样品；所述双色镜同时对所述三维移动平台中样品受激发产生的二谐波信号反射至所述光电倍增管；

所述振镜用于对激发光进行同步扫描以实现对样品的面阵成像；所述扫描透镜用于收集面阵扫描的激光光束；所述显微镜用于聚焦光束照射所述三维移动平台中放置的样品并同时收集所述样品受激发产生的二次谐波信号；所述三维移动平台用于驱动所述样品进行三维移动；所述光电倍增管用于对所述双色镜反射的二谐波信号进行放大处理得到谐波放大信号；

所述光电倍增管与所述成像处理终端进行电连接以输出谐波放大信号至所述成像处理终端，所述脉冲激光器与所述成像处理终端进行电连接以输出脉冲同步信号至所述成像处理终端；所述成像处理终端用于对所述谐波放大信号及所述脉冲同步信号进行处理得到样品图像；

所述成像处理终端包括相连接的时间相关单光子计数器及处理终端；所述时间相关单光子计数器与所述脉冲激光器进行电连接；

所述时间相关单光子计数器用于接收二次谐波信号并对所述二次谐波信号的时空信息进行测量及记录，将得到的二次谐波信号的时空信息及脉冲同步信号传输至成像处理终端；

所述成像处理终端用于获取脉冲同步信号及测量得到的二次谐波信号的时空信息并进行数据处理以得到样品图像；

通过所述角反射器调整所述第一光路中环形激光的光程，以使所述环形激光与所述第二激光之间的脉冲间隔为0.4-0.6个激光脉冲周期，所述激光脉冲周期为所述脉冲激发光的脉冲周期。

2.根据权利要求1所述的基于二次谐波的超分辨显微成像系统，其特征在于，所述显微镜包括管镜、物镜及设置于所述管镜与所述物镜之间的四分之一玻片，所述管镜与所述物镜组合以将激光光束聚焦到焦平面照射所述样品，所述四分之一玻片将线偏振激光转换成右旋圆偏振光。

3.根据权利要求1所述的基于二次谐波的超分辨显微成像系统，其特征在于，所述光电倍增管与所述双色镜之间还设有滤光片。

4.根据权利要求1所述的基于二次谐波的超分辨显微成像系统，其特征在于，所述激光脉冲周期为20-120MHz。

5.一种基于二次谐波的超分辨显微成像方法，其特征在于，所述方法应用于如权利要求1-4任一项所述的基于二次谐波的超分辨显微成像系统，所述方法包括：

开启所述脉冲激光器产生脉冲激发光经所述半波片调节偏振方向并经所述格兰激光棱镜分离得到第一激光及第二激光；所述第二激光为高斯型激光；

所述第一激光经所述第一光路传输，由所述第一光路中的螺旋相位板将所述第一激光的波前由高斯型转换成环形得到环形激光后通过所述角反射器进行光程调整；

所述分束器对所述环形激光及经所述第二光路传输的高斯型激光进行合束形成组合光束；

所述组合光束依次经过所述双色镜透射、所述振镜反射、所述扫描透镜透射及所述显微镜透射聚焦后照射所述样品；根据实时成像的样品图像调整所述扫描透镜及所述显微镜以进行光斑调节，使所述组合光束的环形激光及高斯型激光的焦平面在空间上重合；

所述样品被所述组合光束照射，受激发产生的二次谐波信号经所述显微镜透射、所述扫描透镜透射、所述振镜反射及所述双色镜反射后输入至所述光电倍增管；

所述光电倍增管对所述二次谐波信号进行放大处理，得到谐波放大信号后输出至所述成像处理终端；

所述成像处理终端获取所述谐波放大信号及所述脉冲激发光的脉冲同步信号进行处理得到样品图像。

6.一种基于二次谐波的超分辨显微成像方法，其特征在于，所述方法应用于如权利要求1-4任一项所述的基于二次谐波的超分辨显微成像系统中的成像处理终端，所述方法包括：

根据所述脉冲同步信号确定对应的激光脉冲周期；

根据所述激光脉冲周期对所述谐波放大信号进行通道分离，得到第一通道对应的高斯点扩展函数图像及第二通道对应的环形点扩展函数图像；

从所述高斯点扩展函数图像中减去所述环形点扩展函数图像的二次谐波信号光子得到样品图像，所述样品图像为压缩所述高斯点扩展函数图像实现超分辨成像的图像。

7.根据权利要求6所述的基于二次谐波的超分辨显微成像方法，其特征在于，所述根据所述激光脉冲周期对所述谐波放大信号进行通道分离，得到第一通道对应的高斯点扩展函数图像及第二通道对应的环形点扩展函数图像之后，还包括：

将预置的权重因子与所述环形点扩展函数图像相乘以对图像进行强度增强得到增强图像；

从所述高斯点扩展函数图像中减去所述增强图像的二次谐波信号光子得到样品图像，所述样品图像为压缩所述高斯点扩展函数图像实现超分辨成像的图像。

8.根据权利要求6或7所述的基于二次谐波的超分辨显微成像方法，其特征在于，所述第一通道为一个所述激光脉冲周期内脉冲间隔时间对应的时间通道；所述第二通道为所述激光脉冲周期内剩余时间对应的时间通道；所述脉冲间隔时间为所述环形激光与所述第二激光之间脉冲间隔的时长。

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