CN108333151B - 一种基于飞秒脉冲整形的超分辨显微成像系统及成像方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于飞秒脉冲整形的超分辨显微成像系统及成像方法。本发明采用计算机控制系统控制脉冲整形系统对不同频率组分的光进行相位、强度和偏振调制，使飞秒脉冲激光成为强度、偏振及频率与时间相关的整形脉冲作为激发光；采用这种激发光激发样品时，样品中包含的性质和种类不同的粒子对于激发光的响应不同，从而引起信号光的响应强度发生相对变化；当脉冲调制发生改变，信号光图像即发生改变；计算机控制系统通过图形处理算法对多张信号光图像进行分析处理，从而获得样品的超分辨率图像；本发明克服了现有技术中各种方法的缺点，具有普适性、光路简单以及宽场观察与高效率的优点。

Description

一种基于飞秒脉冲整形的超分辨显微成像系统及成像方法

技术领域

本发明涉及显微镜技术，具体涉及一种基于飞秒脉冲整形的超分辨显微成像系统及其成像方法。

背景技术

超分辨显微成像技术在活体生物组织成像、材料表征等领域有着重要的影响。其中受激辐射损耗显微技术(STED)、随机光学重构显微技术(STORM)、光学波动超分辨成像技术(SOFI)等是利用了荧光分子的不同特性，通过调制或采集获得荧光分子的不同发光情况而实现超分辨成像的显微技术。相较于其他成像方法，原理较为简单、可以进行活体组织超分辨成像、空间分辨率高等优势，在生物医学、纳米材料、光储存领域中有着非常巨大的应用。

受激辐射损耗显微技术是通过一束激发光与一束包裹在激发光外的圆环形损耗光，使得每次只让圆环中心圆斑区域被激发，进而通过扫描得到整体的超分辨图像。随机光学重构显微技术，是利用荧光分子的光开关现象，每一次照亮若干不相邻的分子，通过激活、漂白等循环过程实现超分辨成像。光学波动超分辨成像技术是利用了量子点荧光分子的自发闪烁特性，得到不同时间的不同分子的明暗情况来得到超分辨结果。

近年来，基于这些方法的超分辨显微技术可达到的分辨精度以及扫描速度在逐渐被提升，但系统复杂度以及普适性还有欠缺。以上STED、STORM等已广泛使用的系统基于单点扫描的成像技术，光学及扫描系统复杂；新近出现的SOFI等技术基于宽场成像，但SOFI技术需要利用发光粒子的自发闪烁，普适性欠缺。如果总结一下这些技术的共性，可以发现他们都是基于对于粒子发光的控制。STED、STORM技术是对粒子发光的深度控制，只允许孤立的单个粒子发光；SOFI等允许多粒子同时发光，通过闪烁来自发调节粒子间的光强变化，但这种调制较弱也不可控。因此，如果有一种方法，能够对单粒子发光进行主动控制，并且对于不同粒子具有普适性，同时具有宽场范围内实现多粒子同步发光及宽场观察能力，又能简化系统的设计，那么这种方法无疑将大大推进超分辨显微技术的发展。

样品的多粒子、整形脉冲主动调制：任何超分辨显微成像系统都是基于对研究对象内粒子发光的起伏进行的。但是目前没有一种方法是对粒子进行多粒子、多维度主动调控。例如，STED，STORM方法属于主动调控，但是基于单粒子发光，没有实现多粒子激发控制；SOFI方法属于多粒子，但属于自发发光，没有多维度，主动控制；还有一些方法利用改变的偏振光激发粒子，可以激发多粒子，但是没有实现整形脉冲调制，从而无法利用粒子的复杂能级体系，其普适性受到限制。

发明内容

针对以上现有超分辨显微技术存在的缺陷，本发明提出了一种全新的基于飞秒脉冲整形的超分辨成像方法，利用飞秒脉冲整形系统对激光脉冲进行调制，形成整形飞秒脉冲，从而主动控制粒子的发光情况，进而通过算法获得超分辨图像。

本发明的一个目的在于提出一种基于飞秒脉冲整形的超分辨显微成像系统。

本发明的基于飞秒脉冲整形的超分辨显微成像系统包括：飞秒脉冲激发光光源、脉冲整形系统、分光镜、物镜、样品调节台、信号收集系统和计算机控制系统；其中，飞秒脉冲激发光光源产生飞秒脉冲激光，为宽频光，包括了多个不同频率组分的光；脉冲整形系统通过将不同频率组分的光进行相位调制，将飞秒脉冲激光变为强度、偏振和频率随时间改变的一组整形脉冲，作为激发光；激发光经分光镜后，由物镜聚焦，照射在样品调节台表面的样品上，激发样品产生荧光、散射光以及光学非线性响应产生的光，作为信号光；样品中包含的粒子具有不同的性质和种类，不同的性质和种类的粒子对于每一组整形脉冲分别具有不同的特定的响应，从而通过改变整形脉冲的具体形式，主动控制粒子发出信号光的相对响应强度；信号光通过物镜收集，经分光镜后由信号收集系统采集；信号收集系统连接至计算机控制系统；脉冲整形系统连接至计算机控制系统；计算机控制系统控制脉冲整形系统改变对不同频率组分的光的相位调制，形成一组改变的整形脉冲；样品中包含的粒子由于种类和性质的不同，对于激发光的响应不同，对改变的整形脉冲的响应改变有所差别，从而通过改变整形脉冲的形式改变粒子间的相对响应强度；脉冲整形系统每改变一次整形脉冲的形式，粒子的相对响应强度就发生一次改变，从而得到一张发生改变的样品的信号光图像；获得多张样品的信号光图像，计算机控制系统通过图形处理算法分析多张信号光图像，从而获得样品的超分辨率图像。

进一步，本发明还包括激发光扩束准直系统，设置在脉冲整形系统与分光镜之间，激发光经激发光扩束准直系统进行扩束和准直。

还包括滤波片，设置在样品调节台与信号收集系统之间，滤波片将从样品反射回来的激发光过滤掉。

还包括信号光聚焦透镜，设置在样品调节台与信号收集系统之间，信号光经信号光聚焦透镜后聚焦。

样品中粒子的种类为有机分子、有机分子聚集体、有机纳米粒子、半导体纳米粒子、金属纳米粒子以及纳米结构中的一种或多种；样品中粒子的性质是指粒子的形状、结构、取向和微区环境。

光学非线性响应产生的光是指经由拉曼、倍频、合频、差频或自相位调制等光学非线性过程产生的光。

脉冲整形系统其主要工作原理是通过对宽频谱飞秒脉冲中的各个频率成分加以相位、偏振及强度调制，使这些频率重新叠加后构成本发明所需的整形脉冲。这一系统采用飞秒脉冲光调制器作为核心元件，具有多种形式，如透射式及反射式液晶空间光调制器、声光调制器、变形镜和微机电系统等。这些元件通过与外部光学元件组合，实现脉冲调制功能。以脉冲整形系统采用透射式液晶空间光调制器为例：透射式液晶空间光调制器包括第一和第二反射式光栅、第一和第二柱面凸透镜和液晶空间光调制器；其中，飞秒脉冲激发光光源产生的飞秒脉冲激光，经第一反射式光栅，不同频率组分的光在空间上分开；经第一柱面凸透镜后，不同频率组分的光在空间上形成分开的平行光束；不同频率组分的光相应地入射到液晶空间光调制器上的不同区域；计算机控制系统在液晶空间光调制器上不同的区域独立地加载相位，从而对不同频率组分的光进行相位调制；相位调制后的不同频率组分的光，依次经第二柱面凸透镜和第二反射式光栅后，重新汇聚成一束光，作为激发光。

本发明的另一个目的在于提供一种基于飞秒脉冲整形的超分辨成像方法。

本发明的基于飞秒脉冲整形的超分辨成像方法，包括以下步骤：

1)飞秒脉冲激发光光源产生飞秒脉冲激光，为宽频光，包括了多个不同频率组分的光；

2)脉冲整形系统通过将不同频率组分的光进行相位调制，将飞秒脉冲激光变为强度、偏振和频率随时间改变的一组整形脉冲，作为激发光；

3)激发光经分光镜后，由物镜聚焦，照射在样品调节台表面的样品上，激发样品产生荧光、散射光以及光学非线性响应产生的光，作为信号光；

4)样品中包含的粒子具有不同的性质和种类，不同的性质和种类的粒子对于每一组整形脉冲分别具有不同的特定的响应，从而通过改变整形脉冲的具体形式，主动控制粒子发出信号光的相对响应强度；

5)信号光通过物镜收集，经分光镜后由信号收集系统采集；

6)计算机控制系统控制脉冲整形系统改变对不同频率组分的光的相位调制，形成一组改变的整形脉冲；样品中包含的粒子由于种类和性质的不同，对于激发光的响应不同，对改变的整形脉冲的响应改变有所差别，从而通过改变整形脉冲的形式改变粒子间的相对响应强度；脉冲整形系统每改变一次整形脉冲的形式，粒子的相对响应强度就发生一次改变，从而得到一张发生改变的样品的信号光图像；

7)重复步骤6)，获得多张样品的信号光图像；

8)计算机控制系统通过图形处理算法分析多张信号光图像，从而获得样品的超分辨率图像。

在步骤8)中，计算机控制系统通过图形处理算法分析多张信号光图像，从而获得样品的超分辨率图像，具体包括以下步骤：

a)分别对每一张信号光图像进行计算，得到此信号光图像的超分辨定位结果；

b)将多张信号光图像的超分辨定位结果通过统计与叠加，获得最终的样品的超分辨图像。

计算机控制系统采集的图像为时间序列图像，因此可以实现时间分辨。在超分辨图像运算过程中，如果仅采用少数图像运算并统计，可以获得较高的时间分辨率；反之，如果想获得较高的定位精度，则可以采用较多帧图像实现，同时时间分辨能力降低。因此该方法可以在超分辨精度与时间分辨能力方面灵活选择。

本发明的优点：

本发明采用计算机控制系统控制脉冲整形系统对不同频率组分的光进行相位、强度和偏振调制，使飞秒脉冲激光成为强度、偏振及频率与时间相关的整形脉冲作为激发光；采用这种激发光激发样品时，样品中包含的性质和种类不同的粒子对于激发光的响应不同，从而引起信号光的响应强度发生相对变化；当脉冲调制发生改变，信号光图像即发生改变；计算机控制系统分析通过图形处理算法对多张信号光图像进行分析处理，从而获得样品的超分辨率图像；本发明克服了现有技术中各种方法的缺点，具有普适性、光路简单以及宽场观察与高效率的优点。

普适性：该方法基于粒子对整形脉冲的响应实现。这种经过脉冲整形获得的整形脉冲在各个科学领域具有普遍应用，有大量科学文献可以参考，这是由于利用整形脉冲调控光与物质相互作用是一种普适方法。

光路简单：仅需在显微镜外部的光源输入光路上插入普遍使用的脉冲整形系统，不改变显微镜激发光的原输入方式，无需对显微镜系统进行改造。

宽场观察与高效率：整形脉冲可以同步激发一定观察区域内的所有粒子，并通过改变整形脉冲来改变粒子间的相对响应；图像的记录也采用宽场观察与记录，具有高效率的优点。

附图说明

图1为本发明的基于飞秒脉冲整形的超分辨显微成像系统的实施例一的示意图；

图2为本发明的基于飞秒脉冲整形的超分辨显微成像系统的实施例二的示意图；

图3为本发明的基于飞秒脉冲整形的超分辨显微成像系统的脉冲整形系统的一个实施例的示意图；

图4为根据本发明的基于飞秒脉冲整形的超分辨显微成像方法对金纳米棒颗粒在随机调制情况下的不同发光情况的信号光图像，其中(a)～(d)分别为不同组的整形脉冲产生的信号光图像。

具体实施方式

下面结合附图，通过具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例一

如图1所示，本实施例的基于飞秒脉冲整形的超分辨显微成像系统包括：飞秒脉冲激发光光源1、脉冲整形系统2、分光镜4、物镜5、样品调节台6、信号收集系统10和计算机控制系统11；其中，飞秒脉冲激发光光源1产生飞秒脉冲激光，为宽频光，包括了多个不同频率组分的光；脉冲整形系统2通过将不同频率组分的光进行相位调制，将飞秒脉冲激光变为强度、偏振和频率随时间改变的一组整形脉冲，作为激发光；激发光经分光镜4后，由物镜5聚焦，照射在样品调节台6表面的样品上，激发样品产生荧光、散射光以及光学非线性响应产生的光，作为信号光；样品中包含的粒子具有不同的性质和种类，不同的性质和种类的粒子对于每一组整形脉冲分别具有不同的特定的响应，从而通过改变整形脉冲的具体形式，主动控制粒子发出信号光的相对响应强度；信号光通过物镜5收集，经分光镜4后，再经反射镜8反射由信号收集系统10采集；信号收集系统10连接至计算机控制系统11；脉冲整形系统2连接至计算机控制系统11。

实施例二

如图2所示，本实施例的基于飞秒脉冲整形的超分辨显微成像系统包括：飞秒脉冲激发光光源1、脉冲整形系统2、激发光扩束准直系统3、分光镜4、物镜5、样品调节台6、滤波片7、反射镜8、信号光聚焦透9、信号收集系统10和计算机控制系统11；其中，飞秒脉冲激发光光源1产生飞秒脉冲激光，为宽频光，包括了多个不同频率组分的光；脉冲整形系统2通过将不同频率组分的光进行相位调制，将飞秒脉冲激光变为强度、偏振和频率随时间改变的一组整形脉冲，作为激发光；激发光经激发光扩束准直系统3进行扩束和准直，经分光镜4反射后，由物镜5聚焦，照射在样品调节台6表面的样品上，激发样品产生荧光、散射光以及光学非线性响应产生的光，作为信号光；样品中包含的粒子具有不同的性质和种类，不同的性质和种类的粒子对于每一组整形脉冲分别具有不同的特定的响应，从而通过改变整形脉冲的具体形式，主动控制粒子发出信号光的相对响应强度；荧光通过物镜5聚焦后，经分光镜4透射后，由滤波片7将从样品反射回来的激发光过滤掉，经反射镜8反射后经信号光聚焦透镜9聚焦，再由信号收集系统10收集；信号收集系统10连接至计算机控制系统11；脉冲整形系统2连接至计算机控制系统11。激发光扩束准直系统3包括凸透镜31和凹透镜32。

如图3所示，脉冲整形系统2采用透射式液晶空间光调制器，包括：第一和第二反射式光栅21和25，第一和第二柱面凸透镜22和24，以及液晶空间光调制器23；其中，飞秒脉冲激发光光源产生的飞秒脉冲激光，经第一反射式光栅21，不同频率组分的光在空间上分开；经第一柱面凸透镜22后，不同频率组分的光在空间上形成分开的平行光束；不同频率组分的光相应地入射到液晶空间光调制器23上的不同区域；计算机控制系统在液晶空间光调制器23上不同的区域独立地加载相位，从而对不同频率组分的光进行相位调制；相位调制后的不同频率组分的光，依次经第二柱面凸透镜24和第二反射式光栅25后，重新汇聚成一束光，作为激发光。

在本实施例中，样品采用金纳米棒。计算机控制系统控制脉冲整形系统改变对不同频率组分的光的相位调制，从而激发光中不同频率组分的光的相位发生变化，由于整形脉冲作用，使得金纳米棒发出的相对响应强度有涨落；脉冲整形系统每改变一次相位调制，计算机控制系统得到一张样品的信号光图像，脉冲整形系统多次改变对不同频率组分的光的相位调制，在整个观测时间内连续采集图像，直至所观测的过程结束，从而得到多张样品的信号光图像，如图4所示，图4为其中的四组不同的整形脉冲产生的信号光图像；选取100张信号光图像，计算机控制系统通过图形处理算法分析这100张信号光图像，从而获得样品的超分辨率图像。分别对每一张信号光图像进行计算，得到每一张信号光图像的超分辨定位结果；将这100张信号光图像的超分辨定位结果通过统计与叠加，获得最终的金纳米棒的超分辨图像。

最后需要注意的是，公布实施例的目的在于帮助进一步理解本发明，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附的权利要求的精神和范围内，各种替换和修改都是可能的。因此，本发明不应局限于实施例所公开的内容，本发明要求保护的范围以权利要求书界定的范围为准。

Claims (6)

1.一种基于飞秒脉冲整形的超分辨显微成像系统，其特征在于，所述成像系统包括：飞秒脉冲激发光光源、脉冲整形系统、分光镜、物镜、样品调节台、信号收集系统和计算机控制系统；其中，所述飞秒脉冲激发光光源产生飞秒脉冲激光，为宽频光，包括了多个不同频率组分的光；所述脉冲整形系统通过将不同频率组分的光进行相位调制，将飞秒脉冲激光变为强度、偏振和频率随时间改变的一组整形脉冲，作为激发光；激发光经分光镜后，由物镜聚焦，照射在样品调节台表面的样品上，激发样品产生荧光、散射光以及光学非线性响应产生的光，作为信号光；样品中包含的粒子具有不同的性质和种类，不同的性质和种类的粒子对于每一组整形脉冲分别具有不同的特定的响应，从而通过改变整形脉冲的具体形式，主动控制粒子发出信号光的相对响应强度；信号光通过物镜收集，经分光镜后由信号收集系统采集；信号收集系统连接至计算机控制系统；脉冲整形系统连接至计算机控制系统；计算机控制系统控制脉冲整形系统改变对不同频率组分的光的相位调制，形成一组改变的整形脉冲；样品中包含的粒子由于种类和性质的不同，对于激发光的响应不同，对改变的整形脉冲的响应改变有所差别，从而通过改变整形脉冲的形式改变粒子间的相对响应强度；脉冲整形系统每改变一次整形脉冲的形式，粒子的相对响应强度就发生一次改变，从而得到一张发生改变的样品的信号光图像；获得多张样品的信号光图像，计算机控制系统通过图形处理算法分析多张信号光图像，从而获得样品的超分辨率图像；还包括激发光扩束准直系统，所述激发光扩束准直系统设置在脉冲整形系统与分光镜之间，激发光经激发光扩束准直系统进行扩束和准直。

2.如权利要求1所述的成像系统，其特征在于，还包括滤波片，所述滤波片设置在样品调节台与信号收集系统之间，滤波片将从样品反射回来的激发光过滤掉。

3.如权利要求1所述的成像系统，其特征在于，还包括信号光聚焦透镜，所述信号光聚焦透镜设置在样品调节台与信号收集系统之间，信号光经信号光聚焦透镜后聚焦。

4.如权利要求1所述的成像系统，其特征在于，所述脉冲整形系统采用透射式或反射式液晶空间光调制器、声光调制器、变形镜和微机电系统中的一种。

5.一种基于飞秒脉冲整形的超分辨成像方法，其特征在于，所述成像方法包括以下步骤：

1)飞秒脉冲激发光光源产生飞秒脉冲激光，为宽频光，包括了多个不同频率组分的光；

2)脉冲整形系统通过将不同频率组分的光进行相位调制，将飞秒脉冲激光变为强度、偏振和频率随时间改变的一组整形脉冲，作为激发光；

3)激发光经分光镜后，由物镜聚焦，照射在样品调节台表面的样品上，激发样品产生荧光、散射光以及光学非线性响应产生的光，作为信号光；

4)样品中包含的粒子具有不同的性质和种类，不同的性质和种类的粒子对于每一组整形脉冲分别具有不同的特定的响应，从而通过改变整形脉冲的具体形式，主动控制粒子发出信号光的相对响应强度；

5)信号光通过物镜收集，经分光镜后由信号收集系统采集；

6)计算机控制系统控制脉冲整形系统改变对不同频率组分的光的相位调制，形成一组改变的整形脉冲；样品中包含的粒子由于种类和性质的不同，对于激发光的响应不同，对改变的整形脉冲的响应改变有所差别，从而通过改变整形脉冲的形式改变粒子间的相对响应强度；脉冲整形系统每改变一次整形脉冲的形式，粒子的相对响应强度就发生一次改变，从而得到一张发生改变的样品的信号光图像；

7)重复步骤6)，获得多张样品的信号光图像；

8)计算机控制系统通过图形处理算法分析多张信号光图像，从而获得样品的超分辨率图像。

6.如权利要求5所述的成像方法，其特征在于，在步骤8)中，计算机控制系统通过图形处理算法分析多张信号光图像，从而获得样品的超分辨率图像，具体包括以下步骤：

a)分别对每一张信号光图像进行计算，得到此信号光图像的超分辨定位结果；

b)将多张信号光图像的超分辨定位结果通过统计与叠加，获得最终的样品的超分辨图像。

Images