CN110954524A - 一种非线性结构光超分辨显微成像装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种非线性结构光超分辨显微成像装置及方法，通过按照预设调制函数将激光调制成光强随时间按正弦次幂函数变化的非线性激发光，并使用调制后的非线性激发光对待成像样品进行扫描激发，采集待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光信号对应的非正弦荧光结构光图像，并提取荧光结构光图像的频率分量；根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组，重构出所述待成像样品的超分辨率图像。本实施例的方法不需要对荧光饱和激发和高功率的附加STED光就可以实现比线性结构光双光子超分辨显微镜更高的分辨率成像，分辨率比衍射极限提高3倍甚至更高，因此可以满足几十纳米甚至更高的双光子荧光成像需求，提高双光子荧光图像分辨率。

Description

一种非线性结构光超分辨显微成像装置及方法

技术领域

本发明涉及光学显微成像技术领域，尤其涉及的是一种非线性结构光超分辨显微成像装置及方法。

背景技术

随着生命科学的发展，科学家对生物显微成像技术的要求越来越高。经过几百年的发展，现在的光学显微成像技术不断完善，且出现了许多有特殊功能的显微成像技术。近几十年来，激光扫描共聚焦显微镜的出现使得这一古老科学焕发出了新的活力。特别是随着超短脉冲激光技术的发展，多光子激发扫描显微成像技术已成为生命科学研究领域的重要手段之一。但是，光学显微技术因存在衍射极限，成像分辨率会受到限制，无法满足人们对更细微结构的观察和研究的需要。

针对这个问题，人们提出了各种超分辨成像技术：光激活定位显微镜(photo-activation localization microscopy,PALM)，随机光学重构显镜(stochastic opticalreconstruction microscopy,STORM)，以及受激发射损耗(stimulated emissiondepletion,STED)技术、结构光照明显微镜(structured illumination microscopy,SIM)技术。PLAM,STORM,STED方法分辨率都可以达到10nm，但PLAM，STORM需要获取几千张rawimages，成像速度受限，通常只能用于固定细胞，到目前为止仍难以对生物活细胞实时探测成像。STED成像对活细胞的光毒性和光损伤比较严重，且高功率STED光在实现荧光擦除的同时也加剧了荧光分子的光漂白，限制了STED在活细胞成像中的应用。除此之外，PLAM,STORM,STED成像方法需使用相应特殊的染料，限制了成像技术的使用范围。SIM成像技术可以做到活细胞成像，但线性SIM成像分辨率在衍射极限基础上只能提高两倍(约100nm)。

最近人们提出的双光子的扫描结构光显微技术(2P-SPIM)虽然利用了双光子激发的非线性效应，但是目前的2P-SPIM均采用正弦强度分布荧光信号重构超分辨率图像，即要么控制时间调制频率ω_t大于系统传递函数截止频率

(ω_t取决于EOM和扫描速度)；要么控制调制图案为正弦开方形式而避免谐波的产生，其分辨率仅能比衍射极限提高2倍，无法实现更高分辨率，更不能认为设定分辨率大小。

因此，现有技术中的非线性超分辨显微技术均存在成像分辨率会受到限制的问题，有待于进一步的改进。

发明内容

鉴于上述现有技术中的不足之处，本发明提供了一种非线性结构光超分辨显微成像装置及方法，克服现有2P-SIM超分辨显微技术的成像分辨率受到限制，不能满足人们对几十纳米甚至更高分辨率的双光子荧光超分辨率图像获取的需求问题。

第一方面，本实施例公开了一种非线性结构光超分辨显微成像装置，其中，包括：

激光器，用于产生激光；

强度调制器，用于根据预设调制函数将激光调制成强度随时间按正弦次幂函数变化的非线性激发光；

扫描器，用于控制调制后的所述激发光对待成像样品进行扫描激发；

探测器，用于采集待成像样品在所述激发光扫描激发后产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组；其中，所述荧光结构光图像组包括：多个荧光结构光图像；各个荧光结构光图像对应的激发光图案的取向和相位不同；

计算终端，用于提取各个所述荧光结构光图像中的频率分量，并且对其中对应激发光图案为同一取向和不同相位的频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组，重构出所述待成像样品的超分辨率图像。

其中，所述强度调制器、扫描器、探测器和计算终端连接。

可选的，所述扫描器与所述探测器之间设置有第一透镜、管镜、滤光片和分束镜，

所述第一透镜的后焦面与所述管镜的前焦面重合；

从所述扫描器发出的出射光束经过第一透镜和所述管镜后，入射到所述滤光片上；

所述滤光片过滤出所述激发光，并将过滤出的所述激发光入射到所述分束镜上。

可选的，所述分束镜与所述待成像样品之间设置有物镜；

所述分束镜将所述滤光片传入的激发光反射到所述物镜；

所述物镜将入射的所述激发光汇聚到所述待成像样品上。

可选的，所述分束镜与所述探测器之间设置有发射滤光片和第二透镜；

所述发射滤光片对从所述分束镜透射出的光束进行过滤，得到过滤后的所述待成像样品成像面扫描激发出的荧光信号；

所述第二透镜，用于接收所述发射滤光片透射的荧光信号，并将所述荧光信号聚焦成像到所述探测器上。

可选的，所述预设调制函数为：

其中，I_ex(r)为待成像样品成像面上的激发光的光强，r代表待成像样品成像面上的任一位置，ω_t为时间调制频率，

为初始相位，γ为光学效应的阶数，n为任意正整数。

第二方面，本实施例还公开了一种非线性结构光超分辨显微成像方法，其中，包括：

按照预设调制函数将激光调制成光强随时间按正弦次幂函数变化的非线性激发光，并使用调制后的非线性激发光对待成像样品进行扫描激发；

采集待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组；其中，所述荧光结构光图像组包括：多个荧光结构光图像；各个荧光结构光图像对应的激发光图案的取向和相位不同；

提取各个所述荧光结构光图像中的频率分量，并且对其中对应的激发光图案为同一取向和不同相位的频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组，重构出所述待成像样品的超分辨率图像。

可选的，所述采集待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组的步骤包括：

通过改变所述预设调制函数的周期和相位，获取到不同取向和不同相位的荧光结构光图像，得到所述荧光结构光图像组。

可选的，所述使用调制后的非线性激光对待成像样品进行扫描激发的步骤包括：

沿所述待成像样品纵向进行逐点扫描，当一个纵向扫描完成后，再沿所述待成像样品横向进行步进扫描一次，重复执行上述逐点扫描和横向步进扫描的步骤，直至所述待成像样品扫描完成。

可选的，所述采集待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组的步骤包括：

所述探测器逐点采集记录所述待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组。

可选的，所述根据各个荧光结构光图像的频率分量的叠加重构得到待成像样品的超分辨率图像的步骤包括：

对叠加出的频率分量的叠加值组进行傅里叶逆变换，得到重构出的荧光信号的超分辨率图像。

与现有技术相比，本发明实施例具有以下优点：

本实施例中通过按照预设调制函数对激光进行调制，将激光调制成光强随时间按正弦次幂函数变化的非线性激发光，并使用调制后的非线性激发光对待成像样品进行扫描激发，并获取待成像样品受扫描激发后产生的荧光结构光图像，将荧光结构光图像分离出的处于同一方向上的包含高次谐波的所有频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组重构出所述待成像样品的超分辨率图像，且幂指数n可以任意设定，n越大，分辨率越高，特别的，当n＝1和γ＝1(对应单光子荧光效应)时，该发明技术退化为单光子线性结构光显微技术，其分辨率约为100nm；当n＝2和γ＝1(对应单光子荧光效应)时，该发明技术对应为单光子非线性结构光显微技术，其分辨率约为74nm；当n＝1和γ＝2(对应双光子荧光效应)时，该发明技术对应为双光子荧光线性结构光显微技术，其分辨率越为100nm；当n＝2和γ＝2(对应双光子荧光效应)时，该发明技术对应为双光子荧光非线性结构光显微技术，其分辨率越为74nm；等等。而且本发明技术同样使用于非荧光过程，如二次谐波散射、拉曼散射等过程。因此本实施例的方法不需要对荧光饱和激发和高功率的STED附加光便可以实现双光子显微超分辨成像，更重的是可以通过改变调制函数的幂指数n达到任意分辨率，利用非正弦荧光结构光使其分辨率比衍射极限提高3倍甚至更高，可以实现几十纳米甚至更高分辨率的双光子荧光结构光成像。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例中一种非线性结构光超分辨显微成像装置的结构示意图；

图2是本发明实施例中所述的非线性结构光超分辨显微成像方法的步骤流程图；

图3是本发明实施例中当n＝2且γ＝2时激发光条纹结构光图案的强度分布曲线；

图4是本发明实施例中激发光条纹结构光图案；

图5是本发明实施例中当γ＝2时不同n值的点扩展函数曲线。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

由于现有技术中的双光子扫描结构光照明显微技术为了实现超分辨成像必须避免双光子非线性效应产生的荧光图案的谐波(该谐波导致荧光强度非正弦分布)，以获得正弦分布荧光结构光图案，利用等幅正弦条纹结构光重构算法重构超分辨图像，最终分辨率最多提高2倍衍射极限，即约二分之一波长(约120纳米)，因此无法满足几十纳米的超分辨率图像成像的需要。为了实现几十纳米甚至更高的分辨率的双光子结构光成像，本实施例公开了一种非线性结构光超分辨显微成像装置及方法，实现了非饱和激发条件下双光子扫描结构光超分辨显微成像，达到分辨率3倍衍射极限的提高，甚至更高，即74nm的分辨率，进一步提高了成像的分辨率，满足几十纳米甚至更高的分辨率的双光子结构光成像的要求。

实施例1

本实施例公开了一种非线性结构光超分辨显微成像装置，如图1所示，包括：

激光器1，用于产生激光；

强度调制器2，用于将激光调制成强度随时间按正弦次幂函数变化的非线性激发光；所述强度调制器2为电光调制器或声光调制器。

扫描器3，用于控制所述激发光对待成像样品9进行扫描。

探测器12，用于采集待成像样品9在激发光扫描后产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组；其中，所述荧光结构光图像组包括：多个荧光结构光图像；各个荧光结构光图像对应的激发光图案的取向和相位不同；

计算终端13，用于提取各个所述荧光结构光图像中的频率分量，并对其中对应同一取向和不同相位的频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组，重构出所述待成像样品9的超分辨率图像；

其中，所述强度调制器2、扫描器3、探测器12和计算终端13连接。所述强度调制器2为电光调制器或声光调制器。

所述强度调制器2，扫描器3，探测器12与计算终端13连接。计算终端13控制强度调制器2改变调制函数，以使透过的激光调制成光强随时间按正弦函数变化的激发光，以及控制所述扫描器3的扫描速度和范围，所述计算终端13还用于控制所述探测器12逐点采集荧光信号。

所述扫描器3与所述探测器12之间的光路中还设置有第一透镜4、管镜5、滤光片6和分束镜7，所述待成像样品9与所述分束镜7之间的光路中还设置有物镜8；所述第一透镜4的后焦面与所述管镜5的前焦面重合；所述滤光片6和分束镜7分别用于对激发光进行过滤和反射。

所述扫描器3出射的扫描光线经过第一透镜4后，入射到所述管镜5内，经过所述管镜5发出平行光入射到所述滤光片6，所述滤光片6过滤出激发光，并将过滤出的所述激发光入射到所述分束镜7，所述分束镜7反射所述激发光，同时透射出荧光信号。

经过管镜5后出射平行光，分别透过滤光片6，分束镜7反射后经物镜8聚焦到待成像样品9的成像面上。其中，滤光片6滤除激发光以外的光噪声，分束镜7反射激发光透射荧光信号。对激发光束来说，位于管镜5前焦面的扫描焦点与待成像样品9的成像面上扫描焦点共轭，在扫描器3扫描时，待成像样品9上的扫描点沿待成像样品9纵向进行逐点扫描，荧光物质在激发光点的作用下产生双光子激发效应，并产生荧光。对待成像样品9纵向的逐点扫描结束后，待成像样品9横向进行步进扫描即调整激发光阵列点在待成像样品9横向的位置。循环执行上述逐点扫描和步进扫描，直至完成对待成像样品9成像区域的扫描。

所述分束镜7与所述探测器12之间的光路中还设置有发射滤光片10和第二透镜11；

所述发射滤光片10接收从所述分束镜7透射的光信号，反射所述光信号中的激发光，透射出所述光信号中的荧光信号；

所述第二透镜11，用于接收所述发射滤光片透射的荧光信号，并将所述荧光信号聚焦到所述探测器12上。

在一种实施方式中，分束镜7设于所述探测器12与待成像样品9之间，分束镜7，分束镜7接收滤光片6过滤后的激发光，并将所述激发光反射到所述物镜8，所述物镜8将所述激发光汇聚后出射到待成像样品9上。

所述分束镜7与探测器12之间的光路上依次设置有发射滤光片10、第二透镜11，待成像样品9的成像面反射出的信号光，依次经过分束镜7、发射滤光片10和第二透镜11，被探测器12接收。发射滤光片10为带通滤光片，对激发光高反，只允许荧光信号通过。

在一种实施方式中，使用所述电光调制器按照预设调制函数对激光进行调制，所述预设调制函数为：

其中，I_ex(r)为待成像样品成像面上的激发光的光强，r代表待成像样品成像面上的任一位置，ω_t为时间调制频率，

为初始相位，γ为光学效应的阶数，n为任意正整数。

使用调制后激光对待成像样品成像面进行扫描激发，所述待成像样品受到激发光的扫描激发后，激发出的信号光强度与激发光的强度存在如下关系：

其中，A为常系数。

例如，若所述信号光为双光子荧光，γ＝2，则信号光强度

结合图3所示。若信号光为三光子荧光，γ＝3，则信号光强度

通过调节调制函数的相位，获取到的不同取向、同一个取向不同相位的荧光结构光图像后，对荧光结构光图像中荧光信号的频率分量进行分离，并对分离出的各个频率分量进行复位，并将复位后的各个频率分量整合，得到处于同一方向上的频率分量的叠加值组，并对叠加出的频率分量的叠加值组进行傅里叶逆变换，得到待成像样品的超分辨图像。

实施例2

在上述装置的前提下，本发明还公开了一种非线性结构光超分辨显微成像的方法，如图2所示，所述方法包括：

步骤S1、按照预设调制函数将激光调制成光强随时间按正弦次幂函数变化的非线性激发光，并使用调制后的非线性激发光对待成像样品进行扫描激发。

本步骤中首先使用激光器发射出激光，在一种实施方式中，所述激光器可以选择使用飞秒激光器，该激光可以用于实现荧光物质双光子激发；也可以选用488nm激光器，该激光可以用于实现荧光物质单光子激发。

本实施例中利用强度调制器以预设调制函数对激光进行调节，使得调制出的激光的强度随时间按正弦次幂函数周期性变化，其中，所述强度调制器为电光调制器或声光调制器。

在一种实施方式中，所述预设调制函数为：

其中，I_ex(r)为待成像样品接收到的激发光的光强，r代表待成像样品成像面上的任一位置，ω_t为时间调制频率，

为初始相位，γ为光学效应的阶数，n为任意正整数。

具体的，所述扫描器将激发光对待成像样品进行扫描的步骤包括：

沿所述待成像样品纵向进行逐点扫描，当一个纵向扫描完成后，再沿所述待成像样品横向进行步进扫描一步，重复执行上述逐点扫描和横向逐步扫描的步骤，直至所述待成像样品扫描完成。

在进行扫描控制时，使用扫描器控制激发光对待成像样品进行扫描，激发出荧光信号，所述荧光信号为非正弦结构光，并且所述扫描器控制激发光沿着待成像样品纵向逐点扫描，当扫描到一个纵向的底端后，再沿待成像样品的横向进行步进扫描一步，依次重复执行上述纵向逐点扫描和横向步进扫描的步骤，直至扫描完整个待成像样品，从而使得整个待成像样品均激发出荧光信号。可以想到的是，也可以采用横向逐点扫描，纵向步进扫描的方式进行待成像样品的扫描。

步骤S2、采集待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组；其中，所述荧光结构光图像组包括：多个荧光结构光图像；各个荧光结构光图像对应的激发光图案的取向和相位不同。

由于在待成像样品的内部分布有荧光物质，当激发光扫描待成像样品时，所述待成像样品内荧光物质在激发光点的作用下产生双光子激发效应，并产生荧光信号。激发光点激发待成像样品，产生双光子荧光信号，并且扫描器扫描完整个待成像样品后，得到整个待成像样品激发出的荧光信号。

结合图1所示，各个光束经扫描器3沿待成像样品纵向进行逐点扫描，沿样品纵向的一行扫描结束后，扫描器3步进扫描即沿样品横向移至下一位置，进行下一纵向位置的逐点扫描，即第二行扫描，如此循环，即可实现对整个待成像样品的扫描，获取整个待成像样品激发出的荧光信号。探测器12在扫描开始时同步逐点记录荧光信号，在整个待成像样品的扫描完成时荧光信号记录也完成，即记录一幅图像，并存储在计算终端13中。

上述步骤中所述计算记录出的图像为非正弦的荧光结构光图像，如图4所示，该非正弦的荧光结构光图像中含有频率信息，通过改变调制函数的周期和相位即可获得不同取向相位相同和取向相同但相位不同的荧光结构光图像组。所述荧光结构光图像组中含有多个荧光结构光图像，且各个荧光结构光可以具有相同取向，但对应的激发图案的相位不同，或者对应不同取向，但是对应的激光图案的相位相同。

步骤S3、提取各个所述荧光结构光图像中的频率分量，并且对其中对应同一取向和不同相位的频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组，重构出所述待成像样品的超分辨率图像。

通过上述步骤S2获取到的不同取向、同一个取向不同相位的荧光结构光图像后，对荧光结构光图像中荧光信号的频率分量进行分离，并对分离出的各个频率分量进行复位，并将复位后的各个频率分量整合，得到处于同一方向上的频率分量的叠加值组，并进行逆傅立叶变换，得到待成像样品的超分辨图像。

进一步的，所述根据各个荧光结构光图像的频率分量的叠加重构得到待成像样品的超分辨率图像的步骤包括：

对叠加出的频率值组所对应的荧光图像进行傅里叶逆变换，得到重构出的荧光信号的超分辨率图像。

具体的，光源1发出锁模脉冲激光，经强度调制器2对激发光进行强度调制，调制函数为

其中，I_ex(r)为样品成像面上激发光强，r代表样品面上的任意位置，ω_t为时间调制频率，

为初始相位，γ为光学效应的阶数，n为任意正整数。

对调制函数简进行简化，为简化令

简化后的调制函数为：

则调制后的激发光强度满足

通过调制相位和周期得到不同的激发光条纹图案，例如：结合图4所示，为相位差在2π/5时的激发光条纹图案。

由扫描器3进行逐行扫描，扫描器3出射光束经第一透镜4和管镜5后，由激发滤光片6阻挡激发光以外的背景光，再由分束镜7反射到物镜8，由物镜8聚焦激发待成像样品9发射信号光。

进一步的，信号光强度与激发光强度存在非线性关系，对于任意γ阶非线性效应，信号光强度可以概括为

由物镜8收集，经分束镜7到达发射滤光片10，发射滤光片10阻挡背景光透过信号光，并由第二透镜11汇聚到探测器12，由探测器12记录。

由于强度调制、光束扫描和探测同步进行，最终，扫描完一幅图像，探测器逐点连续记录形成一幅信号光结构图案，再通过改变调制函数相位，重复上述过程，可以获得不同取向、不同相位的信号光结构图案，一般一种结构图案取向下，需要获得至少在相位

m＝1,2,…,2n+1.n＝1,2,3…，时的结构图案，再利用WS重构算法重构出该取向的超分辨图像。

为了获得各个方向的超分辨图像，理论上应该实现每个方向下的上述超分辨图像。实际上，通常实现三个方向(彼此相差120度)的超分辨图像即可。例如：30度、150度和270度三个方向，因此，通过改变调制函数的周期和初始相位，即可获得不同取向的信号光图案，然后再分别获取不同取向的上述不同相位

的信号光结构图案，利用WS重构算法重构出对应取向的超分辨图像，最终将各方向的超分辨图像合成为一幅超分辨图像。

具体的，获取到不同取向不同相位的信号光图案后，进一步合成一幅超分辨图像的详细算法步骤如下：

假设激发的结构光为：

则发射的信号光为：

经过光学系统之后，被探测器逐点记录并形成的强度图像的傅立叶变化为

通过获取

m＝1,2,…,2n+1下的信号光结构图像，就可以解出所有频率信息：

将上述频率分量中处于同一个取向且不同相位的各个频率分量先进行分离，再将分离后的各个频率分量复位，然后将复位分离的频率分量相叠加，最后将各个取向得到的频率分量的叠加值做逆傅立叶变换，即可得到所述待成像样品在一个取向上的超分辨的图像。

进一步，改变强度调制器2的调制函数，使待成像样品上正弦照明光的方向转动(也即旋转激发光图案的取向)，重复上述操作，即可提高样品另一个方向上的分辨率。以此类推，即可提高该待成像样品平面内各个方向扫描区域的成像分辨率。最后将各方向的频谱线性相加并进行逆傅立叶变换重构出最终的超分辨图像，最高分辩率比衍射极限提高约3倍甚至更高。

本实施例利用扫描高次谐波结构光提取待成像样品的高频信息，通过扫描重构摩尔条纹重构待成像样品的超分辨率图像，WS算法专门是广义结构光超分辨重构算法，不但适用于非线性结构光超分辨率图像重构，也适用于线性结构光和饱和激发结构光的超分辨率图像重构。

值得注意的是，本发明实施例所提供的图像重构算法不仅适合于结构光照明的双光子荧光超分辨显微成像，还适合于单光子荧光超分辨显微成像，也适合于二次谐波结构光超分辨显微成像，并且同样的原理也适合于多光子和高次谐波结构光超分辨成像。同时，也适用于宽场结构光照明的双光子荧光超分辨显微成像。

本发明实施所提供的所述方法，根据本发明实施方式提供的方法，通过将激光调制成光强随时间按正弦次幂函数周期性变化的激发光，并使用调制后的激发光对待成像样品进行扫描激发；采集待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光信号对应的非正弦荧光结构光图像；分别获取激发光处于不同相位时，荧光结构光图像中荧光信号对应的包括高次谐波的所有频率分量，并将处于同一方向上的频率分量进行叠加，根据叠加出的各个方向上的频率值组，重构出的各个方向上荧光信号的超分辨率图像。本实施例中采用同一个方向上荧光信号的频率分量进行叠加，获取到不同方向上的荧光信号的频率分量的叠加值组，并根据各个荧光信号频率分量的叠加值组得到待成像样品的超分辨率图像，且幂指数n可以任意设定，n越大，分辨率越高，特别的，当n＝1和γ＝1(对应单光子荧光效应)时，该发明技术退化为单光子线性结构光显微技术，其分辨率约为100nm；当n＝2和γ＝1(对应单光子荧光效应)时，该发明技术对应为单光子非线性结构光显微技术，其分辨率约为74nm；当n＝1和γ＝2(对应双光子荧光效应)时，该发明技术对应为双光子荧光线性结构光显微技术，其分辨率越为100nm；当n＝2和γ＝2(对应双光子荧光效应)时，该发明技术对应为双光子荧光非线性结构光显微技术，其分辨率为74nm等等。

结合图5所示，将本实施例所提供的图像重构算法模拟了宽场荧光显微、线性SIM、双光子荧光SIM、三光子荧光SIM和四光子荧光SIM的点扩展函数，其分辨率分别达到210nm、112nm、74nm、53nm和43nm，理论上，调制函数的幂指数n足够大，我们的专利技术能够达到无限小分辨率能力。

本发明技术同样适用于非荧光过程，如二次谐波散射、拉曼散射等过程。因此本实施例的方法不需要对荧光饱和激发和附加的高功率的STED光便可以实现双光子显微超分辨成像，更重的是可以通过改变调制函数的幂指数n达到任意分辨率，利用非正弦荧光结构光使其分辨率比衍射极限提高3倍甚至更高，可以实现几十纳米甚至更高分辨率的双光子荧光结构光成像。

本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的发明后，将容易想到本发明的其它实施方案。本发明旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本公开未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由权利要求指出。

应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种非线性结构光超分辨显微成像装置，其特征在于，包括：

激光器，用于产生激光；

强度调制器，用于根据预设调制函数将激光调制成强度随时间按正弦次幂函数变化的非线性激发光；

扫描器，用于控制调制后的所述激发光对待成像样品进行扫描激发；

探测器，用于采集待成像样品在所述激发光扫描激发后产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组；其中，所述荧光结构光图像组包括：多个荧光结构光图像；各个荧光结构光图像对应的激发光图案的取向和相位不同；

计算终端，用于提取各个所述荧光结构光图像中的频率分量，并且对其中对应激发光图案为同一取向和不同相位的频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组，重构出所述待成像样品的超分辨率图像。

其中，所述强度调制器、扫描器、探测器和计算终端连接。

2.根据权利要求1所述的非线性结构光超分辨显微成像装置，其特征在于，所述扫描器与所述探测器之间设置有第一透镜、管镜、滤光片和分束镜，

所述第一透镜的后焦面与所述管镜的前焦面重合；

从所述扫描器发出的出射光束经过第一透镜和所述管镜后，入射到所述滤光片上；

所述滤光片过滤出所述激发光，并将过滤出的所述激发光入射到所述分束镜上。

3.根据权利要求2所述的非线性结构光超分辨显微成像装置，其特征在于，所述分束镜与所述待成像样品之间设置有物镜；

所述分束镜将所述滤光片传入的激发光反射到所述物镜；

所述物镜将入射的所述激发光汇聚到所述待成像样品上。

4.根据权利要求2所述的非线性结构光超分辨显微成像装置，其特征在于，所述分束镜与所述探测器之间设置有发射滤光片和第二透镜；

所述发射滤光片对从所述分束镜透射出的光束进行过滤，得到过滤后的荧光信号；

所述第二透镜，用于接收所述发射滤光片透射的荧光信号，并将所述荧光信号聚焦成像到所述探测器上。

5.根据权利要求1-4任一项所述的非线性结构光超分辨显微成像装置，其特征在于，所述预设调制函数为：

其中，I_ex(r)为待成像样品成像面上的激发光的光强，r代表待成像样品成像面上的任一位置，ω_t为时间调制频率，

为初始相位，γ为光学效应的阶数，n为任意正整数。

6.一种非线性结构光超分辨显微成像方法，其特征在于，包括：

按照预设调制函数将激光调制成光强随时间按正弦次幂函数变化的非线性激发光，并使用调制后的非线性激发光对待成像样品进行扫描激发；

采集待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组；其中，所述荧光结构光图像组包括：多个荧光结构光图像；各个荧光结构光图像对应的激发光图案的取向和相位不同；

提取各个所述荧光结构光图像中的频率分量，并且对其中对应的激发光图案为同一取向和不同相位的频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组，重构出所述待成像样品的超分辨率图像。

7.根据权利要求6所述的非线性结构光超分辨显微成像的方法，其特征在于，所述采集待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组的步骤包括：

通过改变所述预设调制函数的周期和相位，获取到不同取向和不同相位的荧光结构光图像，得到所述荧光结构光图像组。

8.根据权利要求6所述的非线性结构光超分辨显微成像的方法，其特征在于，所述使用调制后的非线性激光对待成像样品进行扫描激发的步骤包括：

沿所述待成像样品纵向进行逐点扫描，当一个纵向扫描完成后，再沿所述待成像样品横向进行步进扫描一次，重复执行上述逐点扫描和横向步进扫描的步骤，直至所述待成像样品扫描完成。

9.根据权利要求6所述的非线性结构光超分辨显微成像的方法，其特征在于，所述采集待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组的步骤包括：

所述探测器逐点采集记录所述待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组。

10.根据权利要求6所述的非线性结构光超分辨显微成像的方法，其特征在于，所述根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组，重构出所述待成像样品的超分辨率图像的步骤包括：

对叠加出的频率分量的叠加值组进行傅里叶逆变换，得到重构出的荧光信号的超分辨率图像。

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