CN109187459B - 一种自适应扫描宽视场高通量层析显微成像方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种自适应扫描宽视场高通量层析成像方法及装置，属于显微成像技术领域。本方法利用超短脉冲激光，通过时空聚焦与扫描相结合的方法，将样品的目标成像区域划分为若干个子区域，采用时分复用方法将各子区域进行快速自适应扫描，并进行同步数据采集，将采集的各子区域的显微图像重建及数据处理后得到一个扫描周期内的目标扫描区域三维空间信息，最后通过三维空间扫描与延时扫描获取样品(x,y,z,t)四维信息。本发明装置包括超短脉冲激光光源及光束变换系统、结合时空聚焦技术的子区域扫描系统、光学显微及滤波系统、同步显微成像系统及图像重建与数据处理系统。本发明具有宽视场、高通量、低激发功率、高信噪比等优点。

Description

一种自适应扫描宽视场高通量层析显微成像方法及装置

技术领域

本发明涉及一种自适应扫描宽视场高通量层析显微成像方法及装置，属于显微成像技术领域。

背景技术

系统生物学研究，尤其是生物动态过程研究，通常需要进行大尺度、高时空分辨率的观测。例如，在脑科学中，为了研究神经冲动在神经网络中的传递和变换(如跨脑区的神经活动等)；在免疫学、肿瘤学中，为了研究免疫细胞或肿瘤细胞的转移或迁徙等，均需要进行大尺度、高分辨率、高速、高通量的在体原位观测。

然而商用显微镜系统的物镜存在着大视场与高分辨率之间的固有矛盾。为此，人们最近提出了几种中尺度物镜(Mesoscope)的新型设计，将物镜视场提高到亚厘米级水平。但遗憾的是，限于所采用的显微成像方案，这些宽视场显微系统并未实现高分辨率、高速、高通量成像。原因在于：为了满足活体散射组织成像的迫切需求，现有的宽视场显微系统大多基于激光扫描共聚焦技术，以利用其具备层析能力且一定程度上可克服散射的优势，但对于点扫描方式，提升成像速度及数据通量均受到极大挑战。例如，在基于中尺度透镜的双光子宽视场显微成像中(eLife 5,e14472(2016))，尽管该显微系统视场直径宽达5毫米，但是由于采用点扫描成像技术，该系统的数据通量仅为10.66M像素/秒，完整视场的成像帧率为0.7帧/秒，这显然无法发挥宽视场高分辨显微系统的优势。

因此，如何在确保具备三维层析、深穿透能力的同时，突破点扫描成像技术在速度及数据通量方面的局限成为当前的一大挑战。最近，人们提出了一种宽视场层析成像方法——时空聚焦技术，即在时域、空域两个维度对激发光脉冲进行聚焦，从而实现宽场层析激发。具体方法是，首先采用色散器件对光脉冲在时间上展宽，使不同频率的光能量分散开，之后通过准直透镜和物镜将展宽的光脉冲重新在聚焦面上会聚，从而实现基于非线性光学效应的宽场层析激发。与多光子点扫描技术不同，时空聚焦显微实现了一定面积区域的并行激发，从而提高了成像速度及数据通量，且保留了层析能力。

但是对于宽视场层析成像，所需激发功率通常过高，甚至远远超过生物组织的安全激发功率(约为200mW@920nm)。目前采用时空聚焦技术，已报道的最大面激发区域约为0.1mm²，所采用的激发器输出功率为4W(Optical Express 20(8),8939(2012))。

对于超宽视场层析成像，随着激发区域面积的增大，所需的激发光功率呈二次指数增长。具体解释如下：采用时空聚焦技术对面积分别为A₁、A₂(A₁>A₂)的区域进行双光子激发，采用相同的激光脉冲参数及聚焦条件的情况下，欲保证相同的激发效率，所需激发光功率的比值为(A₁/A₂)²。以上述目前报道的最大宽视场层析激发案例做参考，欲实现直径5mm视场的并行激发，所需激光功率将远远大于生物组织的安全激发功率。这无疑对超宽视场层析成像技术提出了一大挑战。

此外，在实际的宽视场层析成像中，有时目标成像区域并非涵盖全视场，而是视场中离散的几个子区域。而常规技术通常对视场中的全部信息进行层析成像，此时无疑浪费了有限的数据通量。

因此，目前需要本领域技术人员迫切解决的一个技术问题就是：如何能够创新地提出一种有效措施，以解决现有技术中存在的不足。

发明内容

本发明的目的是为了克服已有技术的不足之处，提出一种自适应扫描宽视场高通量层析显微成像方法及装置，本发明克服了在增大成像视场时需要极大增加激发光功率的挑战，并可实现数据通量的有效利用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提出的一种自适应扫描宽视场高通量层析显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)参数设定：设定沿样品横向、纵向和轴向分别为x轴、y轴和z轴，并设定沿x轴、y轴和z轴的扫描路径，设定沿时间维度方向为t轴；设定样品内的目标扫描区域XYZ，根据所述目标扫描区域的大小设定扫描周期和扫描总时长；

2)利用超短脉冲激光光源产生超短脉冲激光；

3)在一个扫描周期开始时刻，通过时空聚焦方法引入角色散并通过扫描引入可变偏转角，经光学显微后在空间及时间两个维度进行聚焦，形成N个相应面积的层析聚焦区并激发荧光信号，一个所述层析聚焦区记为一个子区域，得到各个子区域的三维信息(x_i,y_i,,z_i)，i＝1,2,…N；

4)通过非线性光学效应在步骤3)中产生的荧光信号经由显微物镜收集后反向传输，再次经过所述光学显微后由滤波片滤除反向传输的激发光；然后由面阵探测器进行荧光信号采集，得到各子区域显微图像，其中，通过时分复用方法使所述面阵探测器的探测周期与步骤3)所用时间同步；

5)根据预设的扫描路径同步改变扫描的偏转角和改变聚焦的深度，直至扫描遍历所述目标扫描区域XYZ，完成不同深度荧光信号的获取，则一次三维扫描完成；其中，对各个子区域的扫描方式采用连续子区域逐个扫描或任意离散子区域随机扫描；

6)将经步骤5)获得的所有子区域显微图像分别进行图像校正，对校正后的子区域显微图像进行图像重建与数据处理，得到当前扫描周期下目标扫描区域的三维空间信息(x,y,z)，当前扫描周期结束；

7)根据设定的扫描周期重复步骤3)～步骤6)进行延时三维显微成像，获得(x,y,z,t)四维时空信息，直至达到设定的扫描总时长，完成宽视场高通量层析显微成像。

本发明还提出一种根据上述自适应扫描宽视场高通量层析显微成像方法的装置，其特征在于，该装置包括：超短脉冲激光光源及光束变换系统、基于时空聚焦的子区域扫描系统、光学显微及滤波系统、同步显微成像系统、以及图像重建与数据处理系统；其中，

所述超短脉冲激光光源及光束变换系统，超短脉冲激光光源用于提供产生非线性光学信号的激发脉冲光，光束变换系统用于调整所述激发脉冲光光束尺寸；

所述基于时空聚焦的子区域扫描系统，置于所述光束变换系统之后，包括透镜、光学衍射元件、若干个光学扫描元件以及位于若干个光学扫描元件之间使各光学扫描元件光学共轭的透镜组，且所述光学衍射元件及光学扫描元件分别置于所述透镜的物方焦面与像方焦面；通过所述光学衍射元件产生的时空色散作用引入激发脉冲光束的角色散；通过所述光学扫描元件引入不同方向的可变偏转角并形成与各偏转角对应的子区域，同时激发荧光信号；

所述光学显微及滤波系统，包括光学显微系统和滤波系统；所述光学显微系统置于所述光学扫描元件之后，该光学显微系统包括透镜组和显微物镜，由该透镜组连接所述光学扫描元件及所述显微物镜后入瞳面，并构成4f系统，用于激发光束的色散引入和重聚焦、并探测荧光信号；所述滤波系统包括多个滤波片，置于荧光信号的探测光路中，用于滤除入射的激发光信号；

所述同步显微成像系统，置于所述荧光信号的探测光路的末端，包括透镜和成像器件，用于荧光信号的采集；

所述图像重建与数据处理系统，与所述基于时空聚焦的子区域扫描系统中的各光学扫描元件和所述同步显微成像系统中的成像器件相连，用于对成像器件采集到的各子区域扫描图像进行全局图像拼接，并通过时分复用方法控制成像器件获取的随时间变化的荧光引起的探测器上的电信号与各子区域扫描信号总时长同步。

与现有技术相比，本发明具有显著优势：通过结合时空聚焦技术，根据目标成像区域的需要，采用时分复用(Time Division Multiplexing,TDM)方法将各子区域进行快速自适应扫描(包含逐个扫描或随机扫描)，在获得超宽视场层析能力的同时，降低了所需激光的功率水平。具体解释如下：欲使用相同的激发光功率P对面积为A的宽视场进行层析成像(其他条件相同)，(1)采用本发明提出的技术，每次仅激发面积为a子区域(假设A/a＝N,N为整数)，并通过扫描元件在各子区域间快速逐个扫描，所产生的非线性信号(此处以双光子荧光信号为例)正比于(P/(A/N))²＝(P/A)²×N²；(2)采用常规的时空聚焦技术进行全视场并行成像时，产生的非线性信号正比于(P/A)²×N。可见，采用结合时空聚焦技术的子区域快速扫描方案，可确保高激发效率，所获得的信号为常规全视场成像的N倍。在激光器输出功率受限时，本发明所公开方法的优势将更为显著。另一角度讲，在产生同等信号水平的前提下，采用本发明提出的技术所需激发光功率为常规技术的1/N，可有效地降低光损伤。

此外，通过采用同步显微成像方案，将信号获取与子区域扫描同步，可以仅在各子区域的激发时间窗口进行信息采集，提高了成像的信噪比。

最后，采用结合时空聚焦技术的子区域自适应扫描系统既可以实现连续子区域逐个扫描，实现超宽视场层析成像；又可以实现任意离散子区域随机扫描，通过仅对感兴趣的目标子区域进行高速成像，提高了成像帧率，有效利用了数据通量。

附图说明

图1是本发明所述的自适应扫描宽视场层析显微成像装置的结构示意图。

图2是本发明所得显微成像结果与现有技技术所得显微成像结果的对比图，其中，a为现有技术的显微成像结果，b为本发明采用连续扫描方式得到的显微成像结果，c为本发明采用随机扫描方式得到的显微成像结果。

图3是本发明实施实例1的自适应扫描宽视场层析显微成像装置结构示意图。

图4是本发明实施实例2的自适应扫描宽视场层析显微成像装置结构示意图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细的说明。

本发明提出的一种自适应扫描宽视场层析显微成像方法，该方法包括以下步骤：

1)参数设定：设定沿样品横向、纵向和轴向分别为x轴、y轴和z轴并设定沿x轴、y轴和z轴的扫描路径，设定沿时间维度方向为t轴；设定样品内的目标扫描区域XYZ，根据目标扫描区域的大小设定扫描周期和扫描总时长；

2)利用超短脉冲激光光源产生超短脉冲激光；

3)在一个扫描周期开始时刻，通过时空聚焦方法引入角色散并通过扫描引入可变偏转角，经光学显微后在空间及时间两个维度进行聚焦，形成N个相应面积的层析聚焦区并激发荧光信号，一个层析聚焦区记为一个子区域，得到各个子区域的三维信息(x_i,y_i,,z_i)，i＝1,2,…N；

4)通过非线性光学效应在步骤3)中产生的荧光信号经由显微物镜收集后反向传输，再次经过光学显微后由滤波片滤除反向传输的激发光，由面阵探测器进行荧光信号采集，得到各子区域显微图像，其中，通过时分复用方法使面阵探测器的探测周期与步骤3)所用时间同步(例如面阵探测器的探测周期等于步骤3所用时间)；

5)根据预设的扫描路径同步改变扫描的偏转角和改变聚焦的深度，直至扫描遍历XYZ目标区域，完成不同深度荧光信号的获取，则一次三维扫描完成；其中，对各个子区域的扫描方式采用连续子区域逐个扫描或任意离散子区域随机扫描；

6)将经步骤5)获得的所有子区域显微图像分别进行图像校正(包括图像亮度、均匀度等的调整)，对校正后的子区域显微图像进行图像重建与数据处理(所述数据处理包括对所采集图像内的对象进行形态分割)，得到当前扫描周期下目标扫描区域的三维信息(x,y,z)，当前扫描周期结束；

7)根据设定的扫描周期重复步骤3)-6)进行延时三维显微成像，获得(x,y,z,t)四维时空信息，直至达到设定的扫描总时长，完成宽视场高通量层析显微成像。

本发明还根据上述方法提出一种自适应扫描宽视场高通量层析显微成像装置，其结构如图1所示，包括：超短脉冲激光光源及光束变换系统、基于时空聚焦的子区域扫描系统、光学显微及滤波系统、同步显微成像系统、以及图像重建与数据处理系统；其中，

超短脉冲激光光源及光束变换系统，超短脉冲激光光源用于提供产生非线性光学信号的激发脉冲光，光束变换系统用于调整激发脉冲光光束尺寸；

基于时空聚焦的子区域扫描系统，置于上述光束变换系统之后，包括透镜、光学衍射元件、若干个光学扫描元件以及位于若干个光学扫描元件之间使各光学扫描元件光学共轭的透镜组，光学衍射元件及光学扫描元件分别置于透镜的物方焦面与像方焦面；通过光学衍射元件产生的时空色散作用引入激发脉冲光束的角色散；通过光学扫描元件引入不同方向的可变偏转角并形成与各偏转角对应的子区域，同时激发荧光信号；

光学显微及滤波系统，包括光学显微系统和滤波系统；光学显微系统置于上述光学扫描元件之后，该光学显微系统包括透镜组和显微物镜，由该透镜组连接上述光学扫描元件及显微物镜后入瞳面，并构成4f系统，用于激发光束的色散引入和重聚焦、并探测荧光信号；滤波系统包括多个滤波片，置于荧光信号的探测光路中，用于滤除入射的激发光信号；

同步显微成像系统，置于荧光信号的探测光路的末端，包括透镜和成像器件，用于荧光信号的采集；

图像重建与数据处理系统，与基于时空聚焦的子区域扫描系统中的各光学扫描元件和同步显微成像系统中的成像器件相连，用于对成像器件采集到的各子区域扫描图像进行全局图像拼接，并通过时分复用(Time Division Multiplexing,TDM)方法控制成像器件获取的随时间变化的荧光引起的探测器上的电信号与各子区域扫描信号总时长同步。

进一步地，超短脉冲激光光源及光束变换系统中，在超短脉冲激光输出之前还设有色散预补偿系统，以预补偿超短脉冲在到达物镜聚焦面前所累积的色散。

本发明装置中各组成部分的具体实现方式如下：

超短脉冲激光光源及光束变换系统中，超短脉冲激光光源依照输出脉冲宽度，可选用飞秒脉冲激光光源或皮秒脉冲激光光源；超短脉冲激光光源依照输出波长是否可调，可选用固定波长的超短脉冲激光光源或可调谐波长的超短脉冲激光光源；光束变换系统为伽利略望远镜系统或开普勒望远镜系统。超短脉冲激光光源及光束变换系统提供产生非线性光学信号的激发光中非线性光学信号通过双光子荧光效应、三光子荧光效应、谐波产生效应及相干拉曼散射效应中的任一种产生。

基于时空聚焦子区域扫描系统中，光学衍射元件为光栅、变形镜、空间光调制器或其他光学衍射元件；光学扫描元件为振镜、多面镜或声光调制器等。本基于时空聚焦子区域扫描系统的光学扫描方式可为连续子区域逐个扫描或任意离散子区域随机扫描。

光学显微及滤波系统中，滤波片为二色镜、带通滤波片、低通滤波片或长通滤波片的任意一种或多种。

同步显微成像系统中，成像器件为二维光电探测器或二维光电探测器阵列，二维面探测器为电荷耦合元件(CCD)、电子倍增电荷耦合元件(EMCCD)或科学级互补金属氧化物半导体器件(sCMOS)等。

本发明所得子区域显微成像结果参见图2，，本发明的原理为：将基于时空聚焦技术的宽场激发与扫描技术结合起来，通过对子区域逐个连续扫描(如图2中b所示)并进行同步数据采集，可在低激发功率或高激发效率(高激发效率，即单位荧光功率下荧光分子发射出荧光光子的数量)下获得超宽视场下的层析显微成像，并获得高信噪比。而现有的宽视场层析成像方法如下：利用非线性光学效应并结合时空聚焦技术可在生物样品上产生具有轴向层析能力的面激发，所激发产生的信号经同步显微成像系统在二维面探测器上成像；对于一定的宽视场目标区域，可以通过改变入射激光的直径来调整激发光光路实现全视场并行激发(如图2中a所示)并同步成像，但此时为保证足够的激发效率，所施加的激光功率一般较高甚至远远超过生物组织的安全激光功率水平。如前所述，若全视场与子区域的面积之比为N，则在相同激发功率下，采用图2中b方案所得的信号提高N倍；若在相同激发效率下，采用图2中b方案所需的激发功率为图2中a方案的1/N。此外，考虑到实际宽视场成像时，并非所有的子区域均为感兴趣的目标区域，故还可采用随机扫描(Random Access)策略(即：通过预先给定的扫描路径进行不同区域的拼接成像)仅对目标子区域进行成像(如图2中c所举例示意)，从而提高成像帧率，有效利用了数据通量。

需要指出的是，图2所示仅为本发明的一种实施示意图。在实际实施中，每个激发子区域的形状不限于方形，可包含各种图形形状且各子区域积分时间可灵活调整。

可见，本发明所提出的自适应扫描宽视场高通量层析显微成像方法及装置具有宽视场、高通量、低激发功率(或高激发效率)、高信噪比等优点，可为生物动态过程研究、疾病诊断等提供丰富信息。

实施例1：

下面参照图3，详细叙述本发明实施例1的一种自适应扫描宽视场层析显微成像装置，该装置包括超短脉冲激光光源及光束变换系统、基于时空聚焦的子区域扫描系统、光学显微及滤波系统、同步显微成像系统、以及图像重建与数据处理系统317，生物样品放置在样品台318上。其中，超短脉冲激光光源及光束变换系统中的超短脉冲激光光源301采用Coherent Chameleon Discovery系列飞秒激光器，光束变换系统采用由透镜302和透镜303构成的开普勒望远镜系统(为4f系统)；基于时空聚焦的子区域扫描系统包括光栅304、透镜305、扫描振镜307、扫描振镜310、以及由透镜308和透镜309组成的透镜组；光学显微及滤波系统包括由透镜311、透镜312和显微物镜313构成的光学显微系统，以及由二色镜306和低通滤波片314组成的滤波系统；同步显微成像系统由透镜315和一个二维光电探测器316(采用sCMOS或EMCCD)组成。上述各元器件的连接关系为：所有光学元件的光学面中心与入射激光和荧光的中心光束形成的光轴重合，所有透镜均垂直于光轴；其中，透镜302和透镜303构成4f系统进行扩束，即透镜302与透镜303二者距离等于二者焦距之和；光栅304置于透镜303之后，透镜305、透镜308组成的4f系统和透镜309、透镜311组成的4f系统以及透镜312、显微物镜313组成的4f系统使光栅304和样本台318共轭，透镜308与透镜309构成4f系统使得扫描振镜307与扫描振镜310共轭，即透镜305与光栅304之间的距离为透镜305的焦距，扫描振镜307与透镜305的距离为透镜305的焦距，二色镜306放置在透镜305和扫描振镜307之间，透镜308与扫描振镜307的距离为透镜308的焦距，透镜308与透镜309的距离为透镜308与透镜309的焦距之和，扫描振镜310到透镜309的距离为透镜309的焦距；透镜311与透镜312构成4f系统使得扫描振镜310与显微物镜313的入瞳面共轭，即透镜311与扫描振镜310的距离为透镜311的焦距，透镜311与透镜312的距离为透镜311与透镜312的焦距之和，显微物镜313与透镜311的焦距为透镜312与显微物镜313的焦距之和，样品台318与显微物镜313的距离约为显微物镜313的工作距离；样本318发射的荧光沿激发光路返回后，在二色镜306处发生反射，低通滤波片314放置在反射光路中的二色镜306之后用于过滤掉激发激光，透镜315放置在反射光路中二色镜306之后用于会聚荧光信号，二维光电探测器316收集该荧光信号进行成像，二维光电探测器316到透镜315的距离为透镜315的焦距。

该实施例中，超短脉冲激光光源301所发出的激光束经透镜302、透镜303扩束(改变激光束的直径)后入射到光栅304，在光栅304的作用下该超短脉冲光束产生角色散(目的是使得该引入角色散的光束经后续光学元件后充满物镜的后焦面)，经透镜305准直后透过二色镜306投射到扫描振镜307上并引入x方向可变偏转角(该偏转角由振镜驱动电压驱动，根据扫描区域设定偏转角度)，经由透镜308、透镜309组成的4f系统投射到扫描振镜310上并引入y方向可变偏转角(该偏转角由振镜驱动电压驱动，根据扫描区域设定偏转角度)，最后经由透镜311、透镜312及显微物镜313在样品中的物镜焦面上实现一定面积(本实施例该面积采用1/9的成像视野面积)的层析聚焦区。由非线性光学效应所产生的光信号经显微物镜313收集后反向传输，依次经过透镜312、透镜311、扫描振镜310、透镜309、透镜308、扫描振镜307，并被二色镜306反射。之后，该信号光束依次经过低通滤波片314、透镜315，最后在二维光电探测器316上成像，并由图像重建与数据处理系统317进一步处理。需要注意的是，扫描振镜307、310的扫描触发信号须与二维光电探测器316的信号采集同步。采用上述技术方案，驱动扫描振镜307、310进行逐个子区域扫描，可在低激发功率或高激发效率下获得超宽视场的层析显微成像。根据实际需要，在全视场内选择感兴趣的几个子区域，通过驱动扫描振镜307、310进行随机扫描(Random Access)成像，可提高成像帧率。

实施例2：

下面参照图4，详细叙述本发明实施例2的一种自适应扫描宽视场层析显微成像装置，该装置包括超短脉冲激光光源及光束变换系统、基于时空聚焦的子区域扫描系统、光学显微及滤波系统、同步显微成像系统、以及图像重建与数据处理系统417，生物样品放置在样品台418上。其中，超短脉冲激光光源及光束变换系统中的超短脉冲激光光源401采用Coherent Chameleon Discovery系列飞秒激光器，光束变换系统采用由透镜402和透镜403构成的开普勒望远镜系统(为4f系统)；基于时空聚焦的子区域扫描系统包括光栅404、透镜405、扫描振镜406、扫描振镜409、以及由透镜407和透镜408组成的透镜组；光学显微及滤波系统包括由透镜410、透镜411和显微物镜413构成的光学显微系统，以及由二色镜412和低通滤波片414组成的滤波系统；同步显微成像系统由透镜415和一个二维光电探测器阵列416(采用若干个sCMOS或EMCCD，至少一个)组成。上述各元器件的连接关系为：所有光学元件的光学面中心与入射激光和荧光的中心光束形成的光轴重合，所有透镜均垂直于光轴；其中，透镜402和透镜403构成4f系统进行扩束，即透镜402与透镜03二者距离等于二者焦距之和；光栅404置于透镜403之后，透镜405、透镜407组成的4f系统和透镜408、透镜410组成的4f系统以及透镜411、显微物镜413组成的4f系统使光栅404和样本台418共轭，透镜407与透镜408构成4f系统使得扫描振镜406与扫描振镜409共轭，即透镜405与光栅404之间的距离为透镜405的焦距，扫描振镜406与透镜405的距离为透镜405的焦距，透镜407与扫描振镜406的距离为透镜407的焦距，透镜408与透镜407的距离为透镜407与透镜408的焦距之和，扫描振镜409到透镜408的距离为透镜408的焦距；透镜410与透镜411构成4f系统使得扫描振镜409与显微物镜413的入瞳面共轭，即透镜410与扫描振镜409的距离为透镜410的焦距，透镜411与透镜410的距离为透镜411与透镜410的焦距之和，显微物镜413与透镜411的焦距为透镜411与显微物镜413的焦距之和，样品台418与显微物镜413的距离约为显微物镜413的工作距离；二色镜412放置在透镜411与物镜413之间，样本418发射的荧光沿激发光路返回后，在二色镜412处发生反射，低通滤波片414放置在反射光路中的二色镜412之后用于过滤掉激发激光，透镜415放置在反射光路中二色镜412之后用于会聚荧光信号，二维光电探测器阵列416收集该荧光信号进行成像，二维光电探测器阵列416到透镜415的距离为透镜415的焦距。

该实施例中，超短脉冲激光光源401所发出的激光束经透镜402、透镜403扩束后入射到光栅404，在光栅的作用下该超短脉冲光束产生角色散，经透镜405准直后投射到扫描振镜406上并引入x方向可变偏转角，经由透镜407、透镜408组成的4f系统投射到扫描振镜409上并引入y方向可变偏转角，最后经由透镜410、透镜411、二色镜412及显微物镜413在样品中的物镜焦面上实现层析面聚焦。由非线性光学效应所产生的光信号经显微物镜413收集后反向传输，随后被二色镜412反射。之后，该信号光束依次经过低通滤波片414、透镜415，最后在二维光电探测器阵列416上的相应区域成像，并由图像重建与数据处理系统417进一步处理。需要注意的是，扫描振镜406、扫描振镜409的扫描触发信号须与二维光电探测器阵列416的信号采集同步。采用上述技术方案，驱动x、y方向的扫描振镜进行逐个子区域扫描，可在低激发功率或高激发效率下获得超宽视场的层析显微成像。根据实际需要，在全视场内选择感兴趣的几个子区域，通过驱动x、y方向的扫描振镜进行随机扫描(RandomAccess)成像，可提高成像帧率。此外，采用面探测器阵列进行数据采集，可以突破常规面探测器的帧率限制，提高数据通量。

综上，采用本发明的方法及装置，通过结合时空聚焦技术与扫描技术，根据目标成像区域的需要，采用时分复用原理将各子区域进行快速自适应扫描(包含逐个扫描或随机扫描)，在实现超宽视场层析显微成像的同时，降低了所需激光的功率水平或提高了激发效率。本发明所提出的自适应扫描宽视场层析显微成像系统具有超宽视场、高通量、低激发功率(或高激发效率)、高信噪比等优点，可为系统生物学研究提供丰富信息。

此外，需要说明的是，针对采用像方为曲面的物镜的情况，本发明公开的方法依然适用，但图3、4实施例中的光路需作相应调整；此外，上述说明仅以二维成像进行了介绍，但是本发明所提出的方法同样适用于三维成像。

综上，本发明通过结合时空聚焦技术与扫描技术，根据目标成像区域的需要，采用时分复用原理将各子区域进行快速自适应扫描(包含逐个扫描或随机扫描)，在实现超宽视场层析显微成像的同时，提高了激发效率并降低了光损伤。在激光器输出功率受限时，本发明所公开技术的优势更为显著。本发明具有宽视场、高通量、低激发功率(或高激发效率)、高信噪比等优点。

以上对本发明所提出的自适应扫描宽视场层析显微成像方法与装置进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，这些改变都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (6)

1.一种自适应扫描宽视场高通量层析显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)参数设定：设定沿样品横向、纵向和轴向分别为x轴、y轴和z轴，并设定沿x轴、y轴和z轴的扫描路径，设定沿时间维度方向为t轴；设定样品内的目标扫描区域XYZ，根据所述目标扫描区域的大小设定扫描周期和扫描总时长；

2)利用超短脉冲激光光源产生超短脉冲激光；

3)在一个扫描周期开始时刻，通过时空聚焦方法引入角色散并通过扫描引入可变偏转角，经光学显微后在空间及时间两个维度进行聚焦，形成N个相应面积的层析聚焦区并激发荧光信号，一个所述层析聚焦区记为一个子区域，得到各个子区域的三维信息(x_i,y_i,z_i)，i＝1,2,…N；

4)通过非线性光学效应在步骤3)中产生的荧光信号经由显微物镜收集后反向传输，再次经过所述光学显微后由滤波片滤除反向传输的激发光；然后由面阵探测器进行荧光信号采集，得到各子区域显微图像，其中，通过时分复用方法使所述面阵探测器的探测周期与步骤3)所用时间同步；

5)根据预设的扫描路径同步改变扫描的偏转角和改变聚焦的深度，直至扫描遍历所述目标扫描区域XYZ，完成不同深度荧光信号的获取，则一次三维扫描完成；其中，对各个子区域的扫描方式采用连续子区域逐个扫描或任意离散子区域随机扫描；

6)将经步骤5)获得的所有子区域显微图像分别进行图像校正，对校正后的子区域显微图像进行图像重建与数据处理，得到当前扫描周期下目标扫描区域的三维空间信息(x,y,z)，当前扫描周期结束；

7)根据设定的扫描周期重复步骤3)～步骤6)进行延时三维显微成像，获得(x,y,z,t)四维时空信息，直至达到设定的扫描总时长，完成宽视场高通量层析显微成像。

2.一种采用根据权利要求1所述自适应扫描宽视场高通量层析显微成像方法的装置，其特征在于，该装置包括：超短脉冲激光光源及光束变换系统、基于时空聚焦的子区域扫描系统、光学显微及滤波系统、同步显微成像系统、以及图像重建与数据处理系统；其中，

所述超短脉冲激光光源及光束变换系统，超短脉冲激光光源用于提供产生非线性光学信号的激发脉冲光，光束变换系统用于调整所述激发脉冲光光束尺寸；

所述基于时空聚焦的子区域扫描系统，置于所述光束变换系统之后，包括透镜、光学衍射元件、若干个光学扫描元件以及位于若干个光学扫描元件之间使各光学扫描元件光学共轭的透镜组，且所述光学衍射元件及光学扫描元件分别置于所述透镜的物方焦面与像方焦面；通过所述光学衍射元件产生的时空色散作用引入激发脉冲光束的角色散；通过所述光学扫描元件引入不同方向的可变偏转角并形成与各偏转角对应的子区域，同时激发荧光信号；

所述光学显微及滤波系统，包括光学显微系统和滤波系统；所述光学显微系统置于所述光学扫描元件之后，该光学显微系统包括透镜组和显微物镜，由该透镜组连接所述光学扫描元件及所述显微物镜后入瞳面，并构成4f系统，用于激发光束的色散引入和重聚焦、并探测荧光信号；所述滤波系统包括多个滤波片，置于荧光信号的探测光路中，用于滤除入射的激发光信号；

所述同步显微成像系统，置于所述荧光信号的探测光路的末端，包括透镜和成像器件，用于荧光信号的采集；

所述图像重建与数据处理系统，与所述基于时空聚焦的子区域扫描系统中的各光学扫描元件和所述同步显微成像系统中的成像器件相连，用于对成像器件采集到的各子区域扫描图像进行全局图像拼接，并通过时分复用方法控制成像器件获取的随时间变化的荧光引起的探测器上的电信号与各子区域扫描信号总时长同步。

3.根据权利要求2所述的装置，其特征在于，所述超短脉冲激光光源及光束变换系统中，在超短脉冲激光输出之前还设有色散预补偿系统，以预补偿超短脉冲在到达物镜聚焦面前所累积的色散。

4.根据权利要求2所述的装置，其特征在于，所述超短脉冲激光光源及光束变换系统中，超短脉冲激光光源依照输出脉冲宽度，选用飞秒脉冲激光光源或皮秒脉冲激光光源；超短脉冲激光光源依照输出波长是否可调，选用固定波长的超短脉冲激光光源或可调谐波长的超短脉冲激光光源；光束变换系统为伽利略望远镜系统或开普勒望远镜系统；

该超短脉冲激光光源及光束变换系统提供产生非线性光学信号的激发光中非线性光学信号通过双光子荧光效应、三光子荧光效应、谐波产生效应及相干拉曼散射效应中的任一种产生。

5.根据权利要求2所述的装置，其特征在于，所述基于时空聚焦子区域扫描系统中，光学衍射元件包括光栅、变形镜或空间光调制器中的任意一种；光学扫描元件包括振镜、多面镜或声光调制器中的任意一种。

6.根据权利要求5所述的装置，其特征在于，所述基于时空聚焦子区域扫描系统的光学扫描方式可为连续子区域逐个扫描或任意离散子区域随机扫描。

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