CN110646427B - 免标记高速显微成像方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种免标记高速显微成像方法及装置，其中，方法包括：利用超短脉冲激光光源生成超短脉冲激光；将超短脉冲激光的光束转换成具有扩展轴向焦深的贝塞尔光束，并利用该贝赛尔光束激发样品，并通过非线性光学效应在样品内沿第一预设方向产生具有轴向焦深的谐波信号；控制贝塞尔光束在第二预设方向以预设的横向扫描偏转角进行往复运动，并控制样品以预设的速度沿第三预设方向进行纵向移动，以使得贝塞尔光束在样品平面上进行扫描，激发样品产生谐波信号；根据谐波信号进行数据重建，获得免标记高速高通量谐波显微图像。该方法可以显著提高成像速度及数据通量，并可以用于病理切片等生物样品的快速成像，具有广阔的生物医学应用前景。

Description

免标记高速显微成像方法及装置

技术领域

本发明涉及光学显微技术领域，特别涉及一种免标记高速显微成像方法及装置。

背景技术

生物样品的三维成像在诸多生物医学研究中有着重要应用。病理活检作为临床检查的常规手段，在临床诊断中有重要地位。目前在病理活检中通常采用传统的苏木精—伊红染色法(H&E染色法)对活检切片进行染色，作为病理检测的“金标准”。但是H&E染色法需要将样品经过固定、脱水、浸蜡、脱蜡、切片、染色等复杂的预处理过程后，再置于显微镜下进行观察、成像，无法实现实时观测与诊断。为了提高病理检测的效率，在病理组织成像中免除上述复杂的预处理过程，急需发展免标记的显微成像方法。

近年来，随着非线性光学的发展，人们提出了基于生物组织固有的光物理特性产生的二次谐波(second harmonic generation)信号、三次谐波(third harmonicgeneration)信号进行免标记显微成像的方法。例如，对于具有非中心反演对称结构的样品，可获得较强的二次谐波产生信号；在样品中的结构边界处，可获得较强的三次谐波信号。基于谐波产生效应的显微成像技术由于采用长波长(近红外光)激发，可在一定程度上克服生物组织散射的影响，提高成像深度。基于上述非线性光学效应的显微成像技术具有三维层析的优点，然而，这种三维层析能力使得样品图像的获取需要进行扫描成像：通常情况下，采用驱动振镜组进行二维横向扫描；采用轴向移动物镜或放置样品的载物台的方式进行轴向扫描。考虑到上述机械元件固有的惯性，扫描成像的速度将受到制约，限制了成像通量。同时，大病理切片的成像通常存在着样品放置倾斜造成的离焦问题。在有限景深的条件下，现有轴向层析成像技术需要扩大扫描体积以获得完整的病理切片三维信息，延长了成像时间，影响了成像速度。

另一方面，由于病理切片的尺寸通常大于所用显微镜的视场大小，欲实现完整切片的成像，通常需要先在小区域(如显微镜限定的视场)内进行扫描成像，再通过频繁地移动样品进行成像，然后进行视场拼接。样品的横向移动通常具有较慢的响应速度，浪费了大量时间，进一步降低了病理切片的成像速度及数据通量。

综上，实现高速、高通量显微成像是免标记显微成像领域亟需克服的技术难点。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

为此，本发明的一个目的在于提出一种免标记高速显微成像方法，该方法可以显著提高成像速度及数据通量，并可以用于病理切片等生物样品的快速成像，具有广阔的生物医学应用前景。

本发明的另一个目的在于提出一种免标记高速显微成像装置。

为达到上述目的，本发明一方面实施例提出了一种免标记高速显微成像方法，包括以下步骤：利用超短脉冲激光光源生成超短脉冲激光；利用锥透镜、会聚透镜、中继透镜组和物镜，将所述超短脉冲激光的光束转换成具有扩展轴向焦深的贝塞尔光束；利用具有扩展轴向焦深的贝赛尔光束激发样品，并通过非线性光学效应在所述样品内沿第一预设方向产生具有轴向焦深的谐波信号；利用扫描振镜控制所述贝塞尔光束在第二预设方向以预设的横向扫描偏转角进行往复运动，并利用位移台控制所述样品以预设的速度沿第三预设方向进行纵向移动，以使得所述贝塞尔光束在样品平面上进行扫描，激发所述样品产生谐波信号；根据所述谐波信号进行数据重建，获得免标记高速高通量谐波显微图像。

本发明实施例的免标记高速显微成像方法，通过采用贝塞尔光束扩展轴向激发范围，并与振镜快速横向扫描、位移台纵向推扫相结合，确保高速高通量显微图像的获取，同时有效解决由于样品倾斜造成的离焦问题；结合生物样品固有的光物理特性产生谐波信号，可以实现免标记高速高通量显微图像的获取，从而有望突破现有免标记显微成像的速度瓶颈，实现病理活检切片等生物样品的快速检查，为生物医学应用提供技术支撑。

另外，根据本发明上述实施例的免标记高速显微成像方法还可以具有以下附加的技术特征：

进一步地，在本发明的一个实施例中，还包括：设定沿所述样品横向、纵向和轴向分别为x轴、y轴和z轴；设定实现沿所述样品横向扫描的振镜的所述向扫描偏转角；设定所述位移台沿所述样品纵向移动的所述速度。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述第一预设方向为所述z轴的方向，所述第二预设方向为所述x轴的方向，所述第三预设方向为所述y轴的方向。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述利用锥透镜、会聚透镜、中继透镜组和物镜，将所述超短脉冲激光的光束转换成具有扩展轴向焦深的贝塞尔光束，包括：控制所述锥透镜、所述会聚透镜、所述中继透镜组和所述物镜均与扩束后的光束共轴，使得所述光束依次通过所述锥透镜和所述会聚透镜后，在所述会聚透镜的后焦面形成环状光斑，并通过所述中继透镜组改变环状光斑的直径，及通过位于所述中继透镜组的后焦面处的所述物镜产生具有所述扩展轴向焦深的贝塞尔光束。

进一步地，在本发明的一个实施例中，在输出所述超短脉冲激光之前，还包括：补偿所述超短脉冲激光在到达显微物镜聚焦面前所累积的色散。

为达到上述目的，本发明另一方面实施例提出了一种免标记高速显微成像装置，包括：超短脉冲激光光源及光束变换系统，用于利用超短脉冲激光光源生成超短脉冲激光；可扩展轴向焦深的光束整形系统，用于利用锥透镜、会聚透镜、中继透镜组和物镜，将所述超短脉冲激光的光束转换成具有扩展轴向焦深的贝塞尔光束；横向快速扫描系统，用于利用具有扩展轴向焦深的贝赛尔光束激发样品，并通过非线性光学效应在所述样品内沿第一预设方向产生具有轴向焦深的谐波信号；推扫式扫描系统，用于利用扫描振镜控制所述贝塞尔光束在第二预设方向以预设的横向扫描偏转角进行往复运动，并利用位移台控制所述样品以预设的速度沿第三预设方向进行纵向移动，以使得所述贝塞尔光束在样品平面上进行扫描；信号激发与收集系统，用于激发所述样品产生谐波信号；图像重建与数据处理系统，用于根据所述谐波信号进行数据重建，获得免标记高速高通量谐波显微图像。

本发明实施例的免标记高速显微成像装置，通过采用贝塞尔光束扩展轴向激发范围，并与振镜快速横向扫描、位移台纵向推扫相结合，确保高速高通量显微图像的获取，同时有效解决由于样品倾斜造成的离焦问题；结合生物样品固有的光物理特性产生谐波信号，可以实现免标记高速高通量显微图像的获取，从而有望突破现有免标记显微成像的速度瓶颈，实现病理活检切片等生物样品的快速检查，为生物医学应用提供技术支撑。

另外，根据本发明上述实施例的免标记高速显微成像装置还可以具有以下附加的技术特征：

进一步地，在本发明的一个实施例中，还包括：设定模块，用于设定沿所述样品横向、纵向和轴向分别为x轴、y轴和z轴；设定实现沿所述样品横向扫描的振镜的所述向扫描偏转角；设定所述位移台沿所述样品纵向移动的所述速度。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述第一预设方向为所述z轴的方向，所述第二预设方向为所述x轴的方向，所述第三预设方向为所述y轴的方向。

进一步地，在本发明的一个实施例中，所述可扩展轴向焦深的光束整形系统进一步用于控制所述锥透镜、所述会聚透镜、所述中继透镜组和所述物镜均与扩束后的光束共轴，使得所述光束依次通过所述锥透镜和所述会聚透镜后，在所述会聚透镜的后焦面形成环状光斑，并通过所述中继透镜组改变环状光斑的直径，及通过位于所述中继透镜组的后焦面处的所述物镜产生具有所述扩展轴向焦深的贝塞尔光束。

进一步地，在本发明的一个实施例中，还包括：色散预补偿系统，用于在输出所述超短脉冲激光之前，补偿所述超短脉冲激光在到达显微物镜聚焦面前所累积的色散。

本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为根据本发明实施例的免标记高速显微成像方法的流程图；

图2为根据本发明实施例的免标记高速显微成像装置的结构示意图；

图3为根据本发明一个实施例的免标记高速显微成像装置的结构示意图；

图4为根据本发明实施例的扫描方式原理(b)与传统扫描方式原理(a)的对比示意图；

图5为根据本发明实施例的免标记高速显微成像装置的实施实例的结构示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下面参照附图描述根据本发明实施例提出的免标记高速显微成像方法及装置，首先将参照附图描述根据本发明实施例提出的免标记高速显微成像方法。

图1是本发明一个实施例的免标记高速显微成像方法的流程图。

如图1所示，该免标记高速显微成像方法包括以下步骤：

在步骤S101中，利用超短脉冲激光光源生成超短脉冲激光。

其中，超短脉冲激光为高斯型超短脉冲激光光束。

需要说明的是，在步骤S101之前，本发明实施例进行参数设定：设定沿样品横向、纵向和轴向分别为x轴、y轴和z轴，设定实现沿样品横向扫描的振镜的偏转角，设定位移台沿样品纵向移动的速度。

进一步地，在本发明一个实施例中，在输出超短脉冲激光之前，还包括：补偿超短脉冲激光在到达显微物镜聚焦面前所累积的色散。

在步骤S102中，利用锥透镜、会聚透镜、中继透镜组和物镜，将超短脉冲激光的光束转换成具有扩展轴向焦深的贝塞尔光束。

其中，在本发明的一个实施例中，利用锥透镜、会聚透镜、中继透镜组和物镜，将超短脉冲激光的光束转换成具有扩展轴向焦深的贝塞尔光束，包括：控制锥透镜、会聚透镜、中继透镜组和物镜均与扩束后的光束共轴，使得光束依次通过锥透镜和会聚透镜后，在会聚透镜的后焦面形成环状光斑，并通过中继透镜组改变环状光斑的直径，及通过位于中继透镜组的后焦面处的物镜产生具有扩展轴向焦深的贝塞尔光束。

在步骤S103中，利用具有扩展轴向焦深的贝赛尔光束激发样品，并通过非线性光学效应在样品内沿第一预设方向产生具有轴向焦深的谐波信号。

其中，第一预设方向为z轴的方向。可以理解的是，本发明实施例利用步骤S102中产生的贝塞尔光束激发样品，通过二次谐波、三次谐波等非线性光学效应，在样品内沿z方向产生具有一定轴向焦深的谐波信号。

在步骤S104中，利用扫描振镜控制贝塞尔光束在第二预设方向以预设的横向扫描偏转角进行往复运动，并利用位移台控制样品以预设的速度沿第三预设方向进行纵向移动，以使得贝塞尔光束在样品平面上进行扫描，激发样品产生谐波信号。

其中，第二预设方向为x轴的方向，第三预设方向为y轴的方向。可以理解的是，本发明实施例利用扫描振镜控制贝塞尔光束在x轴方向以设定的横向扫描速度进行往复运动，利用位移台控制样品以设定的速度沿y轴进行纵向移动，以此实现贝塞尔光束在整个样品平面上的扫描，激发样品产生谐波信号。

在步骤S105中，根据谐波信号进行数据重建，获得免标记高速高通量谐波显微图像。

可以理解的是，本发明实施例将采集扫描过程中产生的谐波信号进行数据重建，以获得免标记病理切片高速高通量显微图像。

综上，免标记显微成像技术利用生物组织固有的光物理特性产生的光信号进行观测，无需对样品进行预处理，可极大地提高病理检测效率，但是目前该技术还无法实现高速高通量成像。本发明实施例提供一种基于生物组织结构特性的二次、三次谐波产生效应进行成像的免标记高速显微成像技术，通过利用贝塞尔光束扩展轴向激发范围，并结合横向推扫式扫描，显著提高成像速度及数据通量。该技术可以用于病理切片等生物样品的快速成像，具有广阔的生物医学应用前景。

根据本发明实施例提出的免标记高速显微成像方法，通过采用贝塞尔光束扩展轴向激发范围，并与振镜快速横向扫描、位移台纵向推扫相结合，确保高速高通量显微图像的获取，同时有效解决由于样品倾斜造成的离焦问题；结合生物样品固有的光物理特性产生谐波信号，可以实现免标记高速高通量显微图像的获取，从而有望突破现有免标记显微成像的速度瓶颈，实现病理活检切片等生物样品的快速检查，为生物医学应用提供技术支撑。

其次参照附图描述根据本发明实施例提出的免标记高速显微成像装置。

图2是本发明一个实施例的免标记高速显微成像装置的结构示意图。

如图2所示，该免标记高速显微成像装置10包括：超短脉冲激光光源及光束变换系统100、可扩展轴向焦深的光束整形系统200、横向快速扫描系统300、推扫式扫描系统400、信号激发与收集系统500和图像重建与数据处理系统600。

其中，超短脉冲激光光源及光束变换系统100用于利用超短脉冲激光光源生成超短脉冲激光。可扩展轴向焦深的光束整形系统200用于利用锥透镜、会聚透镜、中继透镜组和物镜，将超短脉冲激光的光束转换成具有扩展轴向焦深的贝塞尔光束。横向快速扫描系统300用于利用具有扩展轴向焦深的贝赛尔光束激发样品，并通过非线性光学效应在样品内沿第一预设方向产生具有轴向焦深的谐波信号。推扫式扫描系统400用于利用扫描振镜控制贝塞尔光束在第二预设方向以预设的横向扫描偏转角进行往复运动，并利用位移台控制样品以预设的速度沿第三预设方向进行纵向移动，以使得贝塞尔光束在样品平面上进行扫描。信号激发与收集系统500用于激发样品产生谐波信号。图像重建与数据处理系统600用于根据谐波信号进行数据重建，获得免标记高速高通量谐波显微图像。本发明实施例的装置10可以显著提高成像速度及数据通量，并可以用于病理切片等生物样品的快速成像，具有广阔的生物医学应用前景。

进一步地，在本发明的一个实施例中，本发明实施例的装置10还包括：设定模块。其中，设定模块用于设定沿样品横向、纵向和轴向分别为x轴、y轴和z轴；设定实现沿样品横向扫描的振镜的向扫描偏转角；设定位移台沿样品纵向移动的速度。

进一步地，在本发明的一个实施例中，第一预设方向为z轴的方向，第二预设方向为x轴的方向，第三预设方向为y轴的方向。

进一步地，在本发明的一个实施例中，可扩展轴向焦深的光束整形系统200进一步用于控制锥透镜、会聚透镜、中继透镜组和物镜均与扩束后的光束共轴，使得光束依次通过锥透镜和会聚透镜后，在会聚透镜的后焦面形成环状光斑，并通过中继透镜组改变环状光斑的直径，及通过位于中继透镜组的后焦面处的物镜产生具有扩展轴向焦深的贝塞尔光束。

进一步地，在本发明的一个实施例中，本发明实施例的装置10还包括：色散预补偿系统。其中，色散预补偿系统用于在输出超短脉冲激光之前，补偿超短脉冲激光在到达显微物镜聚焦面前所累积的色散。

具体而言，如图2所示，超短脉冲激光光源及光束变换系统100，超短脉冲激光光源用于提供激发非线性光学信号的激发脉冲光，光束变换系统100用于调整激发脉冲光的光束尺寸。可扩展轴向焦深的光束整形系统200置于上述光束变换系统100之后，包括锥透镜、会聚透镜、中继透镜组和物镜，均与扩束后的光束共轴，光束依次通过锥透镜和会聚透镜后，在会聚透镜的后焦面形成环状光斑，中继透镜组用以改变环状光斑的直径，物镜位于中继透镜组的后焦面处，用以产生具有扩展轴向焦深的贝塞尔光束。横向快速扫描系统300置于会聚透镜的后焦面处，包括一个一维振镜，利用振镜的高速振动实现贝塞尔光束相对样品的快速横向扫描。推扫式扫描系统400置于物镜下方，包括一个高精度位移台，实现样品的纵向移动，与横向快速扫描系统配合，完成对整个样品平面的扫描。信号激发与收集系统500包括物镜、二向色镜、滤波片、光电倍增管、放大器，激发的谐波信号经物镜收集并反向传输后，经过二向色镜、滤波片进行滤波，使用光电倍增管进行光信号收集与电信号转换，使用放大器对收集到的电信号进行放大。图像重建与数据处理系统600包括信号读取与图像处理程序，用以对采集到的信号进行处理与显示，以实现免标记病理切片高速高通量显微成像。

进一步地，超短脉冲激光光源及光束变换系统100中，在超短脉冲激光输出之前还设有色散预补偿系统，用于预补偿超短脉冲在到达显微物镜聚焦面前所累积的色散。

本发明实施例的装置10中各组成部分的具体实现方式如下：

超短脉冲激光光源及光束变换系统100中，超短脉冲激光光源依照输出脉冲宽度，可选用飞秒脉冲激光光源或皮秒脉冲激光光源；超短脉冲激光光源依照输出波长是否可调，可选用固定波长的超短脉冲激光光源或可调谐波长的超短脉冲激光光源；光束变换系统为伽利略望远镜系统或开普勒望远镜系统。超短脉冲激光光源及光束变换系统提供产生非线性光学信号的激发光，非线性光学信号通过二次谐波效应、三次谐波效应中的任一种产生。

可扩展轴向焦深的光束整形系统200中，选用锥透镜和会聚透镜生成环状光斑，中继透镜组选用不同焦距的两个透镜，以实现对环状光斑的缩放和到物镜入瞳处的中继，选用物镜完成从环状光斑到贝塞尔光束的转换。

信号激发与收集系统500中，激发光透过二向色镜，经物镜在样品处形成贝塞尔光，激发产生的谐波信号经物镜收集、二向色镜反射后，通过与所探测波段匹配的带通滤波片，经会聚透镜会聚到光电倍增管靶面，实现对光信号的收集，再经光电倍增管内部结构和放大器，实现光电信号的转换与电信号的放大。采集到的电信号通过模块化数据采集系统(DAQ)转化成数字信号，存储于硬盘中。

图像重建与数据处理系统600中，使用信号读取与图像拼接程序实现对推扫方式得到的多张条状图像的拼接，从而得到免标记病理切片高速高通量显微图像。

下面将参照图4，示出了本发明实施例提出的扫描方式原理图(b)与传统扫描方式原理图(a)的对比，具体如下：

传统扫描方式利用二维振镜在横向、纵向上的配合完成对样品1区域的扫描，再通过移动位移台将样品的2区域移到显微镜的成像视场中，利用二维振镜的配合实现对2区域的扫描，如此往复，完成对整个样品面的扫描。由于位移台和振镜的机械惯性，传统扫描方式的速度存在很大局限性。在本发明提出的扫描方式中，只使用一维振镜进行横向快速扫描，用高精度位移台的纵向移动代替纵向振镜的扫描，在纵向完成对整个样品的扫描后，停止一维振镜的振动，将位移台横向移动，将区域2’移动到成像视场中，重复上述扫描过程，完成对整个样品面的扫描。本发明提出的扫描方式，大量节约了传统扫描方式下位移台纵向移动时多次启动与停止的时间以及扫描振镜复位与重启的时间。

下面将参照图5详细叙述本实施例的免标记高速显微成像装置10。

该装置包括超短脉冲激光光源及光束变换系统、可扩展轴向焦深的光束整形系统、横向快速扫描系统、推扫式扫描系统、信号激发与收集系统、图像重建与数据处理系统。

将生物样品放置在高精度位移台319上，其中，超短脉冲激光光源及光束变换系统中的超短脉冲激光光源301采用飞秒激光器(如Coherent Chameleon Discovery系列)，光束变换系统采用由透镜302、303构成的开普勒望远镜系统(为4f系统)；可扩展轴向焦深的光束整形系统包括锥透镜304、透镜305、中继透镜组307、308和显微物镜318；横向快速扫描系统包括一维扫描振镜306；推扫式扫描系统包括高精度位移台319；信号激发与收集系统包括二向色镜309与310、平面镜314、带通滤波片311与315、透镜312与316和光电倍增管313与317。上述元器件的相对位置关系为：透镜302与303构成4f系统进行扩束，透镜305将锥透镜304生成的贝塞尔光束成像在一维扫描振镜306处，形成环形光斑，透镜307、308构成的4f系统使得扫描振镜306与显微物镜318的入瞳面共轭，二向色镜309置于物镜318与透镜308之间，二向色镜310置于信号收集光路端，二向色镜309之后，带通滤波片311置于透镜312与二向色镜310的透射端之间，透镜312将二次(或三次)谐波信号汇聚到光电倍增管313靶面上。反射镜314位于二向色镜的反射端，带通滤波片315置于透镜316与反射镜镜314之间，透镜316将三次(或二次)谐波信号汇聚到光电倍增管317靶面上。图3中还示意出了计算机320，用于控制扫描振镜306、高精度位移台319的同步，并对光电倍增管313、317采集到的信息进行图像重建与数据处理。

该实施例中超短脉冲激光光源301所发出的激光束经透镜302、303扩束(改变激光束的直径)后入射到锥透镜304，再经透镜305，在扫描振镜306形成环形光斑，通过扫描振镜引入可变偏转角(该偏转角由振镜驱动电压驱动，根据扫描区域设定偏转角度)，再经由透镜307、308及显微物镜318在生物样品中的物镜焦面上产生扩展焦深的贝塞尔光束。产生的二次谐波、三次谐波信号经显微物镜318收集后反向传输，经过二向色镜309的反射、再经二向色镜310的分束，分别进入两路收集端。一路经带通滤波片311、透镜312，最后进入光电倍增管313进行信号收集；另一路经带通滤波片315、透镜316，最后进入光电倍增管317进行信号收集。

需要说明的是，前述对免标记高速显微成像方法实施例的解释说明也适用于该实施例的免标记高速显微成像装置，此处不再赘述。

根据本发明实施例提出的免标记高速显微成像装置，通过采用贝塞尔光束扩展轴向激发范围，并与振镜快速横向扫描、位移台纵向推扫相结合，确保高速高通量显微图像的获取，同时有效解决由于样品倾斜造成的离焦问题；结合生物样品固有的光物理特性产生谐波信号，可以实现免标记高速高通量显微图像的获取，从而有望突破现有免标记显微成像的速度瓶颈，实现病理活检切片等生物样品的快速检查，为生物医学应用提供技术支撑。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或N个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“N个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

流程图中或在此以其他方式描述的任何过程或方法描述可以被理解为，表示包括一个或更N个用于实现定制逻辑功能或过程的步骤的可执行指令的代码的模块、片段或部分，并且本发明的优选实施方式的范围包括另外的实现，其中可以不按所示出或讨论的顺序，包括根据所涉及的功能按基本同时的方式或按相反的顺序，来执行功能，这应被本发明的实施例所属技术领域的技术人员所理解。

在流程图中表示或在此以其他方式描述的逻辑和/或步骤，例如，可以被认为是用于实现逻辑功能的可执行指令的定序列表，可以具体实现在任何计算机可读介质中，以供指令执行系统、装置或设备(如基于计算机的系统、包括处理器的系统或其他可以从指令执行系统、装置或设备取指令并执行指令的系统)使用，或结合这些指令执行系统、装置或设备而使用。就本说明书而言，"计算机可读介质"可以是任何可以包含、存储、通信、传播或传输程序以供指令执行系统、装置或设备或结合这些指令执行系统、装置或设备而使用的装置。计算机可读介质的更具体的示例(非穷尽性列表)包括以下：具有一个或N个布线的电连接部(电子装置)，便携式计算机盘盒(磁装置)，随机存取存储器(RAM)，只读存储器(ROM)，可擦除可编辑只读存储器(EPROM或闪速存储器)，光纤装置，以及便携式光盘只读存储器(CDROM)。另外，计算机可读介质甚至可以是可在其上打印所述程序的纸或其他合适的介质，因为可以例如通过对纸或其他介质进行光学扫描，接着进行编辑、解译或必要时以其他合适方式进行处理来以电子方式获得所述程序，然后将其存储在计算机存储器中。

应当理解，本发明的各部分可以用硬件、软件、固件或它们的组合来实现。在上述实施方式中，N个步骤或方法可以用存储在存储器中且由合适的指令执行系统执行的软件或固件来实现。如，如果用硬件来实现和在另一实施方式中一样，可用本领域公知的下列技术中的任一项或他们的组合来实现：具有用于对数据信号实现逻辑功能的逻辑门电路的离散逻辑电路，具有合适的组合逻辑门电路的专用集成电路，可编程门阵列(PGA)，现场可编程门阵列(FPGA)等。

本技术领域的普通技术人员可以理解实现上述实施例方法携带的全部或部分步骤是可以通过程序来指令相关的硬件完成，所述的程序可以存储于一种计算机可读存储介质中，该程序在执行时，包括方法实施例的步骤之一或其组合。

此外，在本发明各个实施例中的各功能单元可以集成在一个处理模块中，也可以是各个单元单独物理存在，也可以两个或两个以上单元集成在一个模块中。上述集成的模块既可以采用硬件的形式实现，也可以采用软件功能模块的形式实现。所述集成的模块如果以软件功能模块的形式实现并作为独立的产品销售或使用时，也可以存储在一个计算机可读取存储介质中。

上述提到的存储介质可以是只读存储器，磁盘或光盘等。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (2)

1.一种免标记高速显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

利用超短脉冲激光光源生成超短脉冲激光；在输出所述超短脉冲激光之前，还包括：补偿所述超短脉冲激光在到达显微物镜聚焦面前所累积的色散；设定沿所述样品横向、纵向和轴向分别为x轴、y轴和z轴；所述第一预设方向为所述z轴的方向，所述第二预设方向为所述x轴的方向，所述第三预设方向为所述y轴的方向；设定实现沿所述样品横向扫描的振镜的所述向扫描偏转角；设定所述位移台沿所述样品纵向移动的所述速度；

利用锥透镜、会聚透镜、中继透镜组和物镜，将所述超短脉冲激光的光束转换成具有扩展轴向焦深的贝塞尔光束；所述利用锥透镜、会聚透镜、中继透镜组和物镜，将所述超短脉冲激光的光束转换成具有扩展轴向焦深的贝塞尔光束，包括：控制所述锥透镜、所述会聚透镜、所述中继透镜组和所述物镜均与扩束后的光束共轴，使得所述光束依次通过所述锥透镜和所述会聚透镜后，在所述会聚透镜的后焦面形成环状光斑，并通过所述中继透镜组改变环状光斑的直径，及通过位于所述中继透镜组的后焦面处的所述物镜产生具有所述扩展轴向焦深的贝塞尔光束；

利用具有扩展轴向焦深的贝赛尔光束激发样品，并通过非线性光学效应在所述样品内沿第一预设方向产生具有轴向焦深的谐波信号；

利用扫描振镜控制所述贝塞尔光束在第二预设方向以预设的横向扫描偏转角进行往复运动，并利用位移台控制所述样品以预设的速度沿第三预设方向进行纵向移动，以使得所述贝塞尔光束在样品平面上进行扫描，激发所述样品产生谐波信号；以及

根据所述谐波信号进行数据重建，获得免标记高速高通量谐波显微图像。

2.一种免标记高速显微成像装置，其特征在于，包括：

色散预补偿系统，用于在输出所述超短脉冲激光之前，补偿所述超短脉冲激光在到达显微物镜聚焦面前所累积的色散；

设定模块，用于设定沿所述样品横向、纵向和轴向分别为x轴、y轴和z轴；设定实现沿所述样品横向扫描的振镜的所述向扫描偏转角；设定所述位移台沿所述样品纵向移动的所述速度，所述第一预设方向为所述z轴的方向，所述第二预设方向为所述x轴的方向，所述第三预设方向为所述y轴的方向；

超短脉冲激光光源及光束变换系统，用于利用超短脉冲激光光源生成超短脉冲激光；

可扩展轴向焦深的光束整形系统，用于利用锥透镜、会聚透镜、中继透镜组和物镜，将所述超短脉冲激光的光束转换成具有扩展轴向焦深的贝塞尔光束；所述可扩展轴向焦深的光束整形系统进一步用于控制所述锥透镜、所述会聚透镜、所述中继透镜组和所述物镜均与扩束后的光束共轴，使得所述光束依次通过所述锥透镜和所述会聚透镜后，在所述会聚透镜的后焦面形成环状光斑，并通过所述中继透镜组改变环状光斑的直径，及通过位于所述中继透镜组的后焦面处的所述物镜产生具有所述扩展轴向焦深的贝塞尔光束；

横向快速扫描系统，用于利用具有扩展轴向焦深的贝赛尔光束激发样品，并通过非线性光学效应在所述样品内沿第一预设方向产生具有轴向焦深的谐波信号；

推扫式扫描系统，用于利用扫描振镜控制所述贝塞尔光束在第二预设方向以预设的横向扫描偏转角进行往复运动，并利用位移台控制所述样品以预设的速度沿第三预设方向进行纵向移动，以使得所述贝塞尔光束在样品平面上进行扫描；

信号激发与收集系统，用于激发所述样品产生谐波信号；以及

图像重建与数据处理系统，用于根据所述谐波信号进行数据重建，获得免标记高速高通量谐波显微图像。

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