CN220772934U - 一种基于寻址扫描的超分辨层析成像系统 - Google Patents

Abstract

本实用新型提供一种基于寻址扫描的超分辨层析成像系统，具体涉及光学显微成像技术领域，该系统包括按照光路方向依次设置的激光器、激光预处理装置、声光偏转器、扩束透镜、电调焦透镜、荧光信号预处理装置和显微物镜，以及探测装置、图像探测器和数据采集卡，基于声光偏转器的声波频率，调整射出的脉冲激光扫描样本感兴趣区域的横向位置，以产生一系列二维点阵荧光图像；基于电调焦透镜的电信号，调整射出的脉冲激光扫描样本感兴趣区域的轴向位置，实现三维层析成像。该系统将电调焦透镜与声光偏转器寻址扫描相结合，利用二者快速响应的特性，实现对样品逐层快速进行二维寻址扫描，能够在整体上实现快速三维层析超分辨成像，且不受景深的限制。

Description

一种基于寻址扫描的超分辨层析成像系统

技术领域

本实用新型涉及光学显微成像技术领域，尤其涉及的是一种基于寻址扫描的超分辨层析成像系统。

背景技术

光学显微镜能在纳米尺度上对细胞进行实时、无损、非接触性的观察，是生命科学和生物医学领域最基本和最重要的研究工具之一。由于结构光照明显微的超分辨方案由于成像速度快、且对荧光探针和激发光能量密度均无特殊要求，在活细胞超分辨成像应用中具有天然优势。在结构光照明显微超分辨成像的发展历程中，最早出现的是利用余弦条纹结构光照明样品实现超分辨成像的技术， 称为 SIM (StructuredIlluminationMicroscopy)，它相比普通宽场成像能够实现两倍的分辨率提升。但这种照明机制下的激发光能量密度较低，无法穿透样品表面， 因此成像深度差，无法对较厚的样品进行三维成像。

随后出现的图像扫描显微技术(Image Scanning Microscopy，ISM)结合了传统共聚焦显微技术，在保持了SIM分辨率提升效果的同时提高了层析能力，能够获得更大的成像深度，但ISM单点扫描的方式严重制约了成像速度。 在此基础上， 又出现了多焦点结构光照明显微成像技术(Multifocal Structured Illumination Microscopy，MSIM)，通过并行激发多焦点扫描样品很好地提高了ISM的成像速度，但是MSIM在对厚样品成像时，样品的散射和离焦背景对成像结果有较大影响。双光子显微技术具有良好的光学层析能力和大深度成像优势，结合了双光子激发荧光的双光子多焦点结构光照明显微镜(2P-MSIM)成像性能得到进一步提升，减少了样品的散射和离焦背景对成像的影响。但尽管如此，MSIM技术和2P-MSIM技术在实际应用中仍存在成像深度和三维成像速度互相制约的问题。

实用新型内容

鉴于上述现有技术的不足，本实用新型的目的在于提供一种基于寻址扫描的超分辨层析成像系统， 旨在解决现有技术中三维超分辨成像技术中存在的成像深度和三维成像速度互相制约的问题。

为了实现上述目的，本实用新型提供一种基于寻址扫描的超分辨层析成像系统，包括：

按照光路方向依次设置的激光器、激光预处理装置、声光偏转器、扩束透镜、 电调焦透镜、荧光信号预处理装置和显微物镜， 以及探测装置、图像探测器和数据采集卡，其中，

所述激光器用于发射脉冲激光；

所述激光预处理装置用于调节从所述激光器发射的脉冲激光的参数；

所述声光偏转器位于显微物镜后焦面的共轭面处，用于基于自身的声波频率，调整射出的脉冲激光扫描样本感兴趣区域的横向位置；

所述扩束透镜用于对射入的脉冲激光进行扩束；

所述电调焦透镜位于显微物镜后焦面的共轭面处，用于基于加载在自身的电信号，调整射出的脉冲激光扫描样本感兴趣区域的轴向位置；

所述显微物镜用于收集点激发生成的样品感兴趣区域的荧光信号；

所述荧光信号预处理装置用于调节所述荧光信号的参数；

所述探测装置用于将所述荧光信号预处理装置输出的预处理后的所述荧光信号聚焦于所述图像探测器的探测面上，形成二维点阵荧光图像；

所述数据采集卡分别与所述声光偏转器、所述图像探测器以及电调焦透镜连接，用于控制加载在所述声光偏转器上的声波频率，控制所述图像探测器的曝光频率，控制加载在所述电调焦透镜上的电信号。

可选的，所述探测装置设置于所述电调焦透镜和所述图像探测器之间，以使所述荧光信号预处理装置与所述探测装置之间的距离和所述荧光信号在所述图像探测器上呈现的预设的光斑大小相匹配。

可选的，所述荧光信号预处理装置包括：扫描透镜和管镜，其中，

所述管镜的后焦面与所述显微物镜的后焦面重合；

所述扫描透镜位于所述电调焦透镜与所述管镜的前焦面之间， 以使所述扫描透镜分别与所述扩束透镜和所述管镜共焦，且所述管镜与所述扫描透镜的焦距之比和所述显微物镜的通光孔径相匹配。

可选的，所述探测装置由二向色镜和成像透镜组成，其中，

所述二向色镜设置于所述扩束透镜和所述电调焦透镜之间，用于将所述荧光信号反射进入所述成像透镜；

所述成像透镜设置于所述二向色镜与所述图像探测器之间，用于将接收到的所述荧光信号聚焦于所述图像探测器的探测面上。

可选的，所述扫描透镜和所述成像透镜共焦，且所述扫描透镜与所述成像透镜的焦距之比和射入所述图像探测器的预设的光斑大小相匹配。

可选的，所述扩束透镜包括第一扩束透镜和第二扩束透镜，所述第一扩束透镜设置于所述声光偏转器和所述第二扩束透镜之间， 以使所述第一扩束透镜和所述第二扩束透镜共焦，且所述第一扩束透镜与所述第二扩束透镜的焦距之比和所述电调焦透镜的通光孔径相匹配。

可选的，所述激光预处理装置包括： 光隔离器，所述光隔离器用于将从所述激光器产生的脉冲激光沿光路方向传输。

可选的，所述激光预处理装置还包括：光束衰减器和扩束器，其中，

所述光束衰减器设置在所述光隔离器的出射方向上；

所述扩束器设置在所述光束衰减器的出射方向上。

可选的，所述激光预处理装置还包括：色散补偿棱镜与反射镜，其中，

所述色散补偿棱镜设置在所述扩束器的出射方向上，用于对扩束整形后的脉冲激光进行色散预补偿；

所述反射镜位于所述色散补偿棱镜一侧，用于将色散预补偿后的激光脉冲反射至所述声光偏转器。

可选的，所述声光偏转器包括第一声光偏转器和第二声光偏转器，所述第一声光偏转器和所述第二声光偏转器均位于显微物镜后焦面的共轭面处，且二者射出的脉冲激光偏转方向正交。

与现有技术相比，本方案的有益效果如下：

本实用新型的系统基于样品的宽场图像，选择一个或多个感兴趣区域，通过对声光偏转器的声波频率进行调控， 能够快速改变其出射光束的偏转方向，从而改变脉冲激光会聚在样品上的横向位置， 以产生一系列与每个感兴趣区域一一对应的二维点阵荧光图像；通过改变加载在电调焦透镜上的电信号， 以快速改变其焦距，从而改变激光会聚在样品中的轴向位置；并且将声光偏转器设置于显微物镜后焦面的共轭面处， 以保证沿各个方向偏转的光束均能进入显微物镜到达样品面； 同时，将电调焦透镜设置于显微物镜后焦面的共轭面上， 以保证其与显微物镜组成的复合透镜组在焦距不变的前提下主平面位置随着电调焦透镜焦距的改变而改变，从而保证在轴向扫描过程中激发光斑的横向扫描间距和荧光光斑的放大倍率均保持不变， 以提高样品的荧光信号在图像探测器上形成的二维点阵荧光图像的质量。 由于其响应速率比声光偏转器慢一个数量级，但二者都具有快速响应的特性， 因此与声光偏转器寻址扫描相结合后，可实现对样品逐层进行二维寻址扫描， 能够在整体上实现快速三维层析超分辨成像，且不受景深的限制。该系统有效地解决了现有技术中对样品超分辨动态成像存在的成像深度和三维成像速度互相制约的问题， 能够快速对任意感兴趣区域进行层析成像。

附图说明

为了更清楚地说明本实用新型实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本实用新型的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本实用新型的基于寻址扫描的超分辨层析成像系统及其光路简要示意图；

图2为本实用新型的基于寻址扫描的超分辨层析成像系统及其光路具体实例示意图；

图3(a)为本实用新型的声光偏转器(Acousto-optic Deflector，AOD)的横向扫描示意图；

图3(b)为本实用新型的电调焦透镜(Electrically Tunable Lens，ETL)的轴向扫描示意图；

图3(c)为本实用新型的声光偏转器和电调焦透镜(即AOD和ETL)的寻址扫描层切成像示意图；

图4为本实用新型的基于寻址扫描的超分辨层析成像系统的同步控制信号示意图；

附图标记说明：100、激光器；200、激光预处理装置；300、声光偏转器；400、扩束透镜；500、电调焦透镜；600、荧光信号预处理装置；700、显微物镜；800、探测装置；900、图像探测器；1000、数据采集卡；1100、载物台；210、光隔离器；220、光束衰减器；230、扩束器；240、色散补偿棱镜；250、反射镜；410、第一扩束透镜；420、第二扩束透镜；610、扫描透镜；620、管镜；810、二向色镜；820、成像透镜。

具体实施方式

本实用新型提供一种基于寻址扫描的超分辨层析成像系统，为使本实用新型的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实例对本实用新型进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本实用新型，并不用于限定本实用新型。

在实施方式和申请专利范围中，除非文中对于冠词有特别限定，否则“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式。若本实用新型实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。

应该进一步理解的是，本实用新型的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或它们的组。应该理解，当我们称元件被“连接”或“耦接”到另一元件时，它可以直接连接或耦接到其他元件，或者也可以存在中间元件。此外，这里使用的“连接”或“耦接”可以包括无线连接或无线耦接。这里使用的措辞“和/或”包括一个或更多个相关联的列出项的全部或任一单元和全部组合。

本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)，具有与本实用新型所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样被特定定义，否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。

本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)，具有与本实用新型所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样被特定定义，否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。

另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本实用新型要求的保护范围之内。

目前，基于寻址扫描超分辨显微成像技术(AOD-MSIM)的超分辨显微成像方案，虽然能够对生物样品中的任意感兴趣区域进行快速双光子多焦点结构光照明超分辨显微成像，可用于实现对细胞内某些特定结构的超分辨成像监测。但是该方案仅能很好地对二维平面进行感兴趣区域的寻址扫描，不能充分还原三维样品表面结构等信息。MSIM技术和2P-MSIM技术虽然能够进行三维超分辨成像，但是在实际应用中仍存在成像深度和三维成像速度互相制约的问题。

电调焦透镜(ETL)是一种形状可变的液体透镜，可以在几毫秒内响应电流变化来改变焦点，起到类似一个能够快速响应的变焦透镜的作用，响应时间达到微秒量级，且由于不涉及任何机械操作，采用ETL的成像系统可以克服景深限制获得更优的成像深度，从而为厚样品成像提供了很好的工具。

面对上述问题，本实用新型在寻址扫描超分辨显微成像技术(AOD-MSIM)的基础上，进一步结合ETL的快速变焦功能，提出一种基于寻址扫描的超分辨层析成像系统，该系统利用飞秒激光和二维声光偏转器(2D-AOD)进行快速多焦点扫描成像并生成样品的宽场图像，在此基础上选择一个或多个感兴趣的区域，通过对声光偏转器(AOD)的声波频率进行调控产生对应所选区域的二维点阵进行快速MSIM成像，通过对ETL的电信号进行调控进行焦平面的快速切换，从而快速获得样品的三维超分辨率图像。该系统可解决活体生物样品超分辨动态成像存在的成像深度和三维成像速度互相制约的问题，能够对任意感兴趣区域进行快速MSIM超分辨层析成像的技术，实现对细胞内某些特定结构的超分辨成像监测。

示例性系统

本实用新型实施例提供的一种基于寻址扫描的超分辨层析成像系统，如图1所示，主要包括：按照光路方向依次设置的激光器100、激光预处理装置200、声光偏转器300(AOD)、扩束透镜400、电调焦透镜500(ETL)、荧光信号预处理装置600和显微物镜700，以及探测装置800、图像探测器900、数据采集卡1000。

其中，激光器100用于发射脉冲激光；激光预处理装置200用于调节从激光器100发射的脉冲激光的参数；声光偏转器300位于显微物镜700后焦面的共轭面处，用于基于自身的声波频率，调整射出的脉冲激光扫描样本感兴趣区域的横向位置；扩束透镜400用于对射入的脉冲激光进行扩束；电调焦透镜500位于显微物镜700后焦面的共轭面处，用于基于加载在自身的电信号，调整射出的脉冲激光扫描样本感兴趣区域的轴向位置；显微物镜700用于收集点激发生成的样品感兴趣区域的荧光信号；荧光信号预处理装置600用于调节荧光信号的参数；探测装置800用于将荧光信号预处理装置600输出的预处理后的荧光信号聚焦于图像探测器900的探测面上，形成二维点阵荧光图像；图像探测器900用于基于荧光信号，形成二维点阵荧光图像；数据采集卡1000分别与声光偏转器300、图像探测器900以及电调焦透镜500连接，用于控制加载在声光偏转器300上的声波频率，控制图像探测器900的曝光频率，控制加载在电调焦透镜500上的电信号。

具体地，激光器100发射的脉冲激光，通常为红光或近红外波段，如800纳米波长。图1中激光光束所指的方向为光路方向，脉冲激光依次经过声光偏转器300、扩束透镜400、电调焦透镜500、荧光信号预处理装置600和显微物镜700之后照射在放置在载物台1100上的样品上形成点激发，期间电调焦透镜500可以透过激光光束，但是所加载的电信号为零或者不足以使焦平面距离显微物镜700的距离发生改变，然后通过点激发生成的样品荧光信号由显微物镜700收集，经荧光信号预处理装置600之后返回电调焦透镜500，并经探测装置800聚焦于图像探测器900的探测面上，形成二维点阵，期间电调焦透镜500处于正常工作状态。一般而言，显示在图像探测器900的探测面上的荧光光斑直径至少为像素尺寸的2-3倍。本实施例中电调焦透镜500上的电信号指的是电流或/和电压信号。

数据采集卡用于输出数字信号与模拟信号，其中，数字信号用于控制声光偏转器300的声波频率以调整脉冲激光在样品感兴趣区域产生点激发；模拟信号用于控制电调焦透镜500实现对所选区域进行层切，还用于控制图像探测器900记录和显示对样品感兴趣区域进行层切之后的荧光信号对应的二维点阵图像。其中， 图像探测器可以选择sCMOS相机等。

本实施例的系统利用飞秒激光和声光偏转器300进行快速多焦点扫描成像并生成样品的宽场图像，在样品的宽场图像上选择一个或多个感兴趣的区域，通过调控加载在声光偏转器300上的声波频率来改变扫描点的横向位置，从而在图像探测器900的一次曝光时间内生成一个对应焦平面的双光子激发点阵， 在图像探测器900的每一次曝光时间内(一般在5-10ms内， 以避免过曝)快速生成一个对应于任意感兴趣区域的二维点阵并记录该二维点阵的荧光图像，而相邻两次曝光对应的二维点阵则根据多焦点结构光照明显微成像技术(MSIM)的需要进行扫描， 在完整扫描完一个层切位置的二维平面后，通过调控加载在电调焦透镜500上的电信号快速移动焦平面的轴向位置至下一个层切位置，重复执行上述步骤，从而获得一系列二维点阵荧光图像， 以实现对样品的快速2P-MSIM超分辨层析成像。

声光偏转器300位于显微物镜700后焦面的共轭面处， 以保证沿各个方向偏转的光束均能进入显微物镜700到达样品面； 同时， 电调焦透镜500位于显微物镜700后焦面的共轭面上，可保证其与显微物镜700组成的复合透镜组在焦距不变的前提下主平面位置随着电调焦透镜500焦距的改变而改变，从而保证在轴向扫描过程中激发光斑的横向扫描间距和荧光光斑的放大倍率均保持不变。

由于电调焦透镜500(ETL)是一种形状可变的液体透镜，可以在几毫秒内响应电流变化来改变焦点，起到类似一个能够快速响应的变焦透镜的作用， 响应时间达到毫秒量级，且由于不涉及任何机械操作，采用电调焦透镜500的成像系统可以克服景深限制获得更优的成像深度，又由于声光偏转器300的响应时间达到微秒量级， 因此，在电调焦透镜500切换至下一个焦平面的过程中，声光偏转器300可以重复扫描多个对应于焦平面的双光子激发点阵。该系统能够解决活体生物样品超分辨动态成像存在的成像深度和三维成像速度互相制约的问题， 能够对任意感兴趣区域进行快速MSIM超分辨层析成像，从而实现对细胞内部结构的超分辨成像监测。

下面结合图1和图2，对该系统一步步进行优化，具体如下：

进一步地，探测装置800设置于电调焦透镜500和图像探测器900之间，以使荧光信号预处理装置600与探测装置800之间的距离和荧光信号在图像探测器900上呈现的预设的光斑大小相匹配。

具体地，根据荧光信号在图像探测器900上呈现的预设的光斑大小，来选择合适参数的显微物镜700、荧光信号预处理装置600以及探测装置800，以使荧光信号预处理装置600与探测装置800之间的距离和荧光信号在图像探测器900上呈现的预设的光斑大小相匹配，从而使得样品感兴趣区域的荧光信号能够沿着显微物镜700、荧光信号预处理装置600、电调焦透镜500以及探测装置800布设的位置所形成的光路， 在图像探测器900上呈现出清晰的、合适大小的光斑。本实施例中的参数指的是对应部件或装置的各种出厂参数，如产品名称、规格、型号、产品编号等。

本实施例中预设的光斑大小指的是能够在图像探测器900上呈现大小合适的清晰度高、且保真度高的光斑尺寸。

进一步地，荧光信号预处理装置600包括：扫描透镜610和管镜620，其中， 管镜620的后焦面与显微物镜700的后焦面重合； 扫描透镜610位于电调焦透镜500与管镜620的前焦面之间， 以使扫描透镜610分别与扩束透镜400和管镜620共焦， 且管镜620与扫描透镜610的焦距之比和显微物镜700的通光孔径相匹配。

具体地，扫描透镜610位于电调焦透镜500与管镜620的前焦面之间，且分别与扩束透镜400和管镜620共焦。扫描透镜610和管镜620相结合形成远心系统(主光线平行于光轴的系统)，用于校正像差。具体而言，扫描透镜610用于在入射光角度相对于透镜轴变化时，扫描透镜610能产生光斑尺寸失真较小的平坦的像平面。显微物镜700用于对样品的荧光信号进行准直，并利用管镜620和扫描透镜610将准直后的荧光信号重新返回至电调焦透镜500，然后经探测装置800聚焦于图像探测器900的探测面的有效区域。根据管镜620的光束尺寸与显微物镜700的通光孔径尺寸，以及管镜620的参数与扫描透镜610的参数，确定管镜620的焦距与扫描透镜610的焦距， 以确保荧光信号的失真度在可控范围内降低到最小。

进一步地，探测装置800由二向色镜810和成像透镜820组成，其中，二向色镜810设置于扩束透镜400和电调焦透镜500之间，用于将荧光信号反射进入成像透镜820；成像透镜820设置于二向色镜810与图像探测器900之间，用于将接收到的荧光信号聚焦于图像探测器900的探测面上。

具体地， 由于样品的荧光信号沿着脉冲激光的光路原路返回至电调焦透镜500(ETL)，利用二向色镜810将经过电调焦透镜500(ETL)进行焦平面切换之后的荧光信号除串扰作用之后反射至成像透镜820， 以将荧光信号清晰地聚焦于图像探测器900的探测面上。

进一步地，扫描透镜610和成像透镜820共焦，且扫描透镜610与成像透镜820的焦距之比和射入图像探测器900的预设的光斑大小相匹配。

具体地，根据荧光信号在图像探测器900上呈现的预设的光斑大小以及扫描透镜610的参数，确定成像透镜820的焦距等参数。并确定扫描透镜610的焦距和成像透镜820的焦距， 以提高荧光信号的保真度。

进一步地，扩束透镜400包括第一扩束透镜410和第二扩束透镜420，第一扩束透镜410设置于声光偏转器300和第二扩束透镜420之间， 以使第一扩束透镜410和第二扩束透镜420共焦，且第一扩束透镜410与第二扩束透镜420的焦距之比和电调焦透镜500的通光孔径相匹配。

具体地，根据从激光预处理装置200射出的脉冲激光的光束尺寸与电调焦透镜500的通光孔径尺寸，确定第一扩束透镜410的参数和第二扩束透镜420的焦距等参数，并调整第一扩束透镜410和第二扩束透镜420之间的距离， 以使第一扩束透镜410和第二扩束透镜420共焦，且从第二扩束透镜420出射的脉冲激光光束尺寸与电调焦透镜500的通光孔径相匹配，以提高电调焦透镜500的使用性能和脉冲激光的能量使用率。

进一步地，激光预处理装置200包括：光隔离器210，光隔离器210用于将从激光器100产生的脉冲激光沿光路方向传输。

具体地，确保从激光器100产生的脉冲激光沿光路方向传输，也就是确保沿光路方向传输的脉冲激光通过而隔离反向传输的脉冲激光，从而防止反射脉冲激光影响系统的稳定性。

进一步地，激光预处理装置200还包括：光束衰减器220和扩束器230，光束衰减器220设置在光隔离器210的出射方向上，扩束器230设置在光束衰减器220的出射方向上。

具体地，光束衰减器220用于调节接收到的脉冲激光的功率，扩束器230用于对接收到的脉冲激光进行扩束整形， 以使连续发射的脉冲激光保持在合适的能量范围内，避免过烧、熔损等对系统装置和样品造成破坏的情况。

进一步地，激光预处理装置200还包括：色散补偿棱镜240与反射镜250；其中，色散补偿棱镜240设置在扩束器230的出射方向上，用于对扩束整形后的脉冲激光进行色散预补偿； 反射镜250位于色散补偿棱镜240一侧，用于将色散预补偿后的激光脉冲反射至声光偏转器300。

具体地， 由于超短脉冲激光具有宽带频谱，经过声光偏转器300时会产生色散，因此利用色散补偿棱镜240对扩束整形后进入声光偏转器300之前的脉冲激光进行色散预补偿， 以维持到达样品面上的脉冲激光光斑的形状，避免脉冲激光光斑发生畸变。

进一步地，声光偏转器300包括第一声光偏转器300和第二声光偏转器300，第一声光偏转器300和第二声光偏转器300均位于显微物镜700后焦面的共轭面处，且二者射出的脉冲激光偏转方向正交，并根据各自的声波频率调整射出的脉冲激光的偏转角度， 以改变脉冲激光光斑聚焦在样品面上的位置。

具体地，第一声光偏转器300和第二声光偏转器300射出的脉冲激光偏转方向正交，也就是二者是一对正交声光偏转器300，并通过调节加载在其上的声波频率调整射出的脉冲激光的偏转角度和聚焦位置， 以产生对样品感兴趣区域的二维点阵。正交声光偏转器300位于显微物镜700后焦面的共轭面处， 以保证沿各个方向偏转的光束均能进入显微物镜700到达样品面。

进一步地，数据采集卡1000还用于输出生成的二维点阵荧光图像，以便于后续对生成的二维点阵荧光图像进行处理、分析。

进一步地，作为其他优选实施方式，可以将色散补偿棱镜240更换为棱镜对或光栅对， 以获得更好的色散补偿。

上述基于寻址扫描的超分辨层析成像系统的工作原理，具体如下：

通过改变加载在声光偏转器上的声波频率，可以快速改变其出射光束的偏转方向，从而改变脉冲激光会聚在样品上的横向位置； 一对正交声光偏转器可通过分别改变加载在两个相互垂直方向上的声波频率，实现入射光在这两个方向上的偏转，从而实现聚焦光斑在由这两个方向所在的物平面上任意一点的寻址扫描；通过改变加载在电调焦透镜上的电信号， 以快速改变其焦距，从而改变激光会聚在样品中的轴向位置，但其响应速率相比声光偏转器而言要慢一个数量级，因此与声光偏转器寻址扫描相结合后，可实现对样品逐层进行二维寻址扫描， 以实现三维层析成像。

声光偏转器位于显微物镜后焦面的共轭面处， 以保证沿各个方向偏转的光束均能进入显微物镜到达样品面； 同时， 电调焦透镜位于显微物镜后焦面的共轭面上，可保证其与显微物镜组成的复合透镜组在焦距不变的前提下主平面位置随着电调焦透镜焦距的改变而改变，从而保证在轴向扫描过程中激发光斑的横向扫描间距和荧光光斑的放大倍率均保持不变。这样，结合MSIM超分辨成像的原理，本实用新型提出通过调控声光偏转器，在图像探测器的每一次曝光时间内快速生成一个对应于任意感兴趣区域的二维点阵并记录其点阵荧光图像，而相邻两次曝光对应的二维点阵则根据MSIM成像的需要进行扫描，从而获得一系列点阵荧光图像，用于重构得到对应该扫描焦平面的二维超分辨图像，进而通过调控电调焦透镜，实现对所选区域的轴向层切成像。

利用AOD和ETL实现寻址扫描层析成像的原理如图3所示。其中，图3(a)所示为AOD的横向扫描示意图，脉冲激光经位于显微物镜的共轭平面上的声光偏转器(AOD)，沿光路经过显微物镜(Objective)之后照射在样品平面(Sample plane)上形成若干个点激发； 图3(b)为ETL的轴向扫描示意图， 调焦前、后样品中被激发的焦平面和显微物镜(Objective)的距离变化情况； 图3(c)为AOD+ETL的寻址扫描层切成像示意图， 由于ETL的响应速率比AOD慢一个数量级，因此与AOD寻址扫描相结合后，在ETL的同一个焦平面(Layer 1或Layer2)处，AOD可扫描得到若干个二维点阵，如此，通过改变ETL的焦距，在样品的每一个焦平面处进行二维寻址扫描，均可得到一系列二维点阵荧光图像。

ETL、sCMOS相机和2D-AOD的同步控制信号如图4所示，脉冲激光经过2D-AOD之后对样本进行点激发，每个脉冲对应一个扫描点，每产生Nx*Ny(Nx和Ny均为正整数)个脉冲构成一个脉冲序列，每个脉冲序列对应sCMOS的一次曝光，生成一个对应焦平面的双光子激发点阵，在ETL上的电信号不变的情况下，也就是在同一个焦平面处，共发生k(k为正整数)次曝光，生成k个对应焦平面的双光子激发点阵， 以用于重构一帧对应该焦平面的2P-MSIM超分辨图像；然后通过改变加载在ETL上的电信号，快速移动焦平面的轴向位置并重复上述步骤， 以实现对样品的快速2P-MSIM超分辨层析成像。

所属领域的技术人员可以清楚地了解到，为了描述的方便和简洁，仅以上述各功能单元、装置的划分进行举例说明，实际应用中，可以根据需要而将上述功能分配由不同的功能单元、装置完成， 即将上述装置的内部结构划分成不同的功能单元或装置， 以完成以上描述的全部或者部分功能。实施例中的各功能单元、装置可以集成在一个处理单元中，也可以是各个单元单独物理存在，也可以两个或两个以上单元集成在一个单元中，上述集成的单元既可以采用硬件的形式实现，也可以采用软件功能单元的形式实现。另外，各功能单元、装置的具体名称也只是为了便于相互区分，并不用于限制本实用新型的保护范围。上述系统中单元、装置的具体工作过程，可以参考前述方法实施例中的对应过程，在此不再赘述。

在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述或记载的部分，可以参见其它实施例的相关描述。

本领域普通技术人员可以意识到，结合本文中所公开的实施例描述的各实例的单元及算法步骤，能够以电子硬件、或者计算机软件和电子硬件的结合来实现。这些功能究竟是以硬件还是软件方式来执行，取决于技术方案的特定应用和设计约束条件。专业技术人员可以对每个特定的应用来使用不同法来实现所描述的功能，但是这种实现不应认为超出本实用新型的范围。

在本实用新型所提供的实施例中，应该理解到，所揭露的装置/终端设备和方法，可以通过其它的方式实现。例如， 以上所描述的装置/终端设备实施例仅仅是示意性的，例如，上述装置或单元的划分，仅仅为一种逻辑功能划分，实际实现时可以由另外的划分方式，例如多个单元或组件可以结合或者可以集成到另一个系统，或一些特征可以忽略，或不执行。

以上所述实施例仅用以说明本实用新型的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本实用新型进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解；其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不是相应技术方案的本质脱离本实用新型各实施例技术方案的精神和范围，均应包含在本实用新型的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于寻址扫描的超分辨层析成像系统，其特征在于，包括：按照光路方向依次设置的激光器、激光预处理装置、声光偏转器、扩束透镜、电调焦透镜、荧光信号预处理装置和显微物镜，以及探测装置、图像探测器和数据采集卡，其中，

所述激光器用于发射脉冲激光；

所述激光预处理装置用于调节从所述激光器发射的脉冲激光的参数；

所述声光偏转器位于显微物镜后焦面的共轭面处，用于基于自身的声波频率，调整射出的脉冲激光扫描样本感兴趣区域的横向位置；

所述扩束透镜用于对射入的脉冲激光进行扩束；

所述电调焦透镜位于显微物镜后焦面的共轭面处，用于基于加载在自身的电信号，调整射出的脉冲激光扫描样本感兴趣区域的轴向位置；

所述显微物镜用于收集点激发生成的样品感兴趣区域的荧光信号；

所述荧光信号预处理装置用于调节所述荧光信号的参数；

所述探测装置用于将所述荧光信号预处理装置输出的预处理后的所述荧光信号聚焦于所述图像探测器的探测面上，形成二维点阵荧光图像；

所述数据采集卡分别与所述声光偏转器、所述图像探测器以及电调焦透镜连接，用于控制加载在所述声光偏转器上的声波频率，控制所述图像探测器的曝光频率，控制加载在所述电调焦透镜上的电信号。

2.根据权利要求1所述的基于寻址扫描的超分辨层析成像系统，其特征在于，所述探测装置设置于所述电调焦透镜和所述图像探测器之间，以使所述荧光信号预处理装置与所述探测装置之间的距离和所述荧光信号在所述图像探测器上呈现的预设的光斑大小相匹配。

3.根据权利要求1所述的基于寻址扫描的超分辨层析成像系统，其特征在于，所述荧光信号预处理装置包括：扫描透镜和管镜，其中，

所述管镜的后焦面与所述显微物镜的后焦面重合；

所述扫描透镜位于所述电调焦透镜与所述管镜的前焦面之间，以使所述扫描透镜分别与所述扩束透镜和所述管镜共焦，且所述管镜与所述扫描透镜的焦距之比和所述显微物镜的通光孔径相匹配。

4.根据权利要求3所述的基于寻址扫描的超分辨层析成像系统，其特征在于，所述探测装置由二向色镜和成像透镜组成，其中，

所述二向色镜设置于所述扩束透镜和所述电调焦透镜之间，用于将所述荧光信号反射进入所述成像透镜；

所述成像透镜设置于所述二向色镜与所述图像探测器之间，用于将接收到的所述荧光信号聚焦于所述图像探测器的探测面上。

5.根据权利要求4所述的基于寻址扫描的超分辨层析成像系统，其特征在于，所述扫描透镜和所述成像透镜共焦，且所述扫描透镜与所述成像透镜的焦距之比和射入所述图像探测器的预设的光斑大小相匹配。

6.根据权利要求1所述的基于寻址扫描的超分辨层析成像系统，其特征在于，所述扩束透镜包括第一扩束透镜和第二扩束透镜，所述第一扩束透镜设置于所述声光偏转器和所述第二扩束透镜之间，以使所述第一扩束透镜和所述第二扩束透镜共焦，且所述第一扩束透镜与所述第二扩束透镜的焦距之比和所述电调焦透镜的通光孔径相匹配。

7.根据权利要求1所述的基于寻址扫描的超分辨层析成像系统，其特征在于，所述激光预处理装置包括：光隔离器，所述光隔离器用于将从所述激光器产生的脉冲激光沿光路方向传输。

8.根据权利要求7所述的基于寻址扫描的超分辨层析成像系统，其特征在于，所述激光预处理装置还包括：光束衰减器和扩束器，其中，

所述光束衰减器设置在所述光隔离器的出射方向上；

所述扩束器设置在所述光束衰减器的出射方向上。

9.根据权利要求8所述的基于寻址扫描的超分辨层析成像系统，其特征在于，所述激光预处理装置还包括：色散补偿棱镜与反射镜，其中，

所述色散补偿棱镜设置在所述扩束器的出射方向上，用于对扩束整形后的脉冲激光进行色散预补偿；

所述反射镜位于所述色散补偿棱镜一侧，用于将色散预补偿后的激光脉冲反射至所述声光偏转器。

10.根据权利要求1所述的基于寻址扫描的超分辨层析成像系统，其特征在于，所述声光偏转器包括第一声光偏转器和第二声光偏转器，所述第一声光偏转器和所述第二声光偏转器均位于显微物镜后焦面的共轭面处，且二者射出的脉冲激光偏转方向正交。