CN112858250A - 一种超分辨显微成像系统 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例公开了一种超分辨显微成像系统。该系统包括：激发光源产生模块、成像模块、焦平面锁定模块以及控制与数据采集模块；其中，激发光源产生模块用于产生激发光源；成像模块用于接收激发光源，将激发光源照射在样品玻片的样品上使得样品视场区域产生荧光，并通过相机采集反射回来的荧光；焦平面锁定模块用于向成像模块发射激光，并接收成像模块反射回来的激光，以锁定成像模块中物镜镜头与样品玻片的距离；控制与数据采集模块用于控制调节激发光源产生模块、成像模块以及焦平面锁定模块中的光学元件，并采集成像模块获得的荧光数据以进行数据分析。该系统实现了紧凑自动化程度高且可调可控的单分子定位显微技术，并提高了精度和准确率。
Description
技术领域
本发明实施例涉及显微成像技术领域，尤其涉及一种超分辨显微成像系统。
背景技术
荧光显微镜凭借良好的分子特异性和非侵入式成像的能力，成为观测分析生物细胞所使用的最广泛的技术。由于光的衍射，传统光学显微镜的分辨率始终无法突破阿贝衍射极限，即光波长的一半，约250纳米左右。而大部分生物分子和分子复合体结构的尺寸小于100纳米，因此在过去很长的一段时间内，研究者无法清晰地观测生物分子和细胞的细节信息。近年来，尽管X射线晶体学、核磁共振、冷冻电镜技术凭借硬件和成像方法的改进，使得解构埃米量级的生物三维结构成为可能。但是由于这些技术通常对观测环境的要求极高，同时需要对待测样品进行复杂的预处理步骤(提纯、结晶或冷冻等)，另外考虑到高昂的设备成本，在细胞中原位研究生物大分子的三维结构和组分构成(比如蛋白质复合体，三维基因组结构等)依然是个巨大的挑战。而随着激光技术、光场调控理论以及荧光标记方法的进步，近年来基于光学显微的超分辨成像技术取得了较大进展，包括结构光照明显微技术(Structure Illumination Microscopy，SIM)、受激发射损耗荧光显微技术(StimulatedEmission Depletion，STED)以及单分子定位显微技术(Single molecule localizationmicroscopy，SMLM)等。这些技术凭借荧光分子标记技术和图像重构算法的进步，将光学显微的分辨率拓展到纳米尺度。STED和SIM都是通过光学的方法对照明光进行调制，并利用荧光分子的饱和机制抑制衍射极限区域内的荧光分子同时进行荧光发射，从而减小了爱里斑的大小，以达到突破衍射极限的目的。SMLM则是在不同的时间里对衍射极限区域内的单个荧光分子随机激发来实现突破衍射极限的目的。相比于STED和SIM，SMLM是目前分辨率最高的超分辨显微镜技术，而且由于其相对简单的硬件结构，是目前最为广泛应用的超分辨技术。
但是传统的SMLM一般是在商用宽场显微镜上进行改装实现的，往往存在功能多余以及紧凑型不高的现象，在针对具体的应用时，存在改造升级困难、成本高以及无法满足需求等问题，无法达到采集细胞内原位实时分子活动原始图像的要求。
发明内容
本发明实施例提供一种超分辨显微成像系统，以提高系统的紧凑性和可调可控性，从而解决采集细胞内原位实时分子活动原始图像信息的需求问题，提高现有单分子定位显微方法的精度与准确率。
本发明实施例提供了一种超分辨显微成像系统，包括：激发光源产生模块、成像模块、焦平面锁定模块以及控制与数据采集模块；其中，
所述激发光源产生模块用于产生激发光源；
所述成像模块用于接收所述激发光源，将所述激发光源照射在样品玻片的样品上使得样品视场区域产生荧光，并通过相机采集反射回来的荧光；
所述焦平面锁定模块用于向所述成像模块发射激光，并接收所述成像模块反射回来的激光，以测量并锁定所述成像模块中物镜镜头与所述样品玻片之间的距离；所述成像模块还用于将所述焦平面锁定模块发射的激光照射在所述样本玻片上；
所述控制与数据采集模块用于控制调节所述激发光源产生模块、所述成像模块以及所述焦平面锁定模块中的光学元件，并采集所述成像模块获得的荧光数据以进行数据分析。
可选的，所述成像模块包括二向色镜、可变形反射镜、第一光路单元和第二光路单元；所述二向色镜用于将所述反射回来的荧光分成第一路荧光和第二路荧光，所述第一路荧光经所述第一光路单元汇聚到所述相机的第一通道，所述第二路荧光依次经所述可变形反射镜和所述第二光路单元汇聚到所述相机的第二通道。
可选的，所述成像模块还包括柱面镜和第一伺服电机，所述第一伺服电机用于控制是否将所述柱面镜加入所述二向色镜前的光路中。
可选的，所述成像模块还包括第一滤光片、第二滤光片、第二伺服电机和第三伺服电机；所述第二伺服电机用于控制是否将所述第一滤光片加入所述二向色镜与所述第一光路单元之间的光路中，所述第三伺服电机用于控制是否将所述第二滤光片加入所述二向色镜与所述可变形反射镜之间的光路中，所述第一滤光片和所述第二滤光片用于过滤光路中的杂光。
可选的，所述成像模块还包括第一透镜和第四伺服电机；所述第四伺服电机用于控制是否将所述第一透镜加入所述相机前的光路中，以观察物镜后焦面的情况。
可选的，所述激发光源产生模块包括第一激发光源产生单元和第二激发光源产生单元；所述第一激发光源产生单元包括至少一个电动反射镜以及至少两个耦合器，所述电动反射镜用于从所述耦合器中选择目标耦合器将所述激发光源输出至对应的所述第二激发光源产生单元，所述第二激发光源产生单元用于将接收到的所述激发光源调整后照射到所述成像模块上。
可选的，所述第一激发光源产生单元包括多个不同波长的第一激光器、至少一个长波通二向色镜和声光可调谐滤波器；每个所述第一激光器发出的激光经所述至少一个长波通二向色镜汇聚到所述声光可调谐滤波器上，所述声光可调谐滤波器用于控制所述激发光源的波长和照明光强，并将所述激发光源照射到所述电动反射镜上。
可选的，所述第二激发光源产生单元包括反射镜，所述反射镜设置在直线位移台上，用于将调整后的所述激发光源反射至所述成像模块上，并通过移动所述直线位移台将调整后的所述激发光源聚焦在物镜后焦面的不同位置。
可选的，所述焦平面锁定模块包括第二激光器、第二透镜、D形反射镜和四象限光电二极管；所述第二激光器发出的激光经所述第二透镜照射到所述成像模块上，所述反射回来的激光经所述D形反射镜反射至所述四象限光电二极管上；所述成像模块包括z轴位移台，所述z轴位移台用于调节所述样品玻片与所述物镜镜头之间的距离，所述焦平面锁定模块还包括控制器，所述控制器用于根据激光照射在所述四象限光电二极管上的位置调节或锁定所述z轴位移台。
可选的，所述控制与数据采集模块包括计算机和电子控制设备，所述计算机用于采集并分析所述成像模块获得的荧光数据，以及通过所述电子控制设备控制调节所述激发光源产生模块、所述成像模块以及所述焦平面锁定模块中的光学元件。
本发明实施例提供了一种超分辨显微成像系统，通过以模块化的方式单独实现单分子定位显微技术，功能针对性强，紧凑性更高。并且系统中使用的一些光学元件可调可控，从而便于调整系统的模式状态，以满足单分子图像数据的实验配置要求，提高了现有单分子定位显微方法的精度和准确率，同时也使得成像光路易于搭建和测试，改造升级更加容易，也可降低成本。另外，还通过设置焦平面锁定模块测量并锁定物镜镜头与样品玻片之间的距离，从而实现了实时的轴向漂移校正。
附图说明
图1为本发明实施例一提供的超分辨显微成像系统的结构示意图；
图2为本发明实施例一提供的激发光源产生模块、成像模块以及焦平面锁定模块的详细结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本发明相关的部分而非全部结构。基于本发明实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
此外，术语“第一”、“第二”等可在本文中用于描述各种方向、动作、步骤或元件等，但这些方向、动作、步骤或元件不受这些术语限制。这些术语仅用于将第一个方向、动作、步骤或元件与另一个方向、动作、步骤或元件区分。术语“第一”、“第二”等而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
实施例一
图1为本发明实施例一提供的超分辨显微成像系统的结构示意图。如图1所示，该系统包括：激发光源产生模块a、成像模块b、焦平面锁定模块c以及控制与数据采集模块d；其中，激发光源产生模块a用于产生激发光源；成像模块b用于接收激发光源，将激发光源照射在样品玻片的样品上使得样品视场区域产生荧光，并通过相机采集反射回来的荧光；焦平面锁定模块c用于向成像模块b发射激光，并接收成像模块b反射回来的激光，以测量并锁定成像模块b中物镜镜头与样品玻片之间的距离；成像模块b还用于将焦平面锁定模块c发射的激光照射在样本玻片上；控制与数据采集模块d用于控制调节激发光源产生模块a、成像模块b以及焦平面锁定模块c中的光学元件，并采集成像模块b获得的荧光数据以进行数据分析。
具体的，激发光源产生模块a用于为成像模块b提供激发光源，成像模块b中包括物镜和样品玻片，其中的物镜可以是大数值孔径显微物镜，用于对样品图像起到主要的放大作用。当激发光源产生模块a产生激发光源并由成像模块b接收后，成像模块b可以将激发光源反射到物镜后焦面上，并通过物镜照射在样品玻片的样品上，在激发光源的作用下，样品视场区域将会产生荧光，产生的荧光可以被物镜收集。成像模块b还包括相机，物镜收集的荧光出射后可经过一系列的光路最终到达相机进行成像。其中，相机可以是sCMOS相机，具有设置曝光时间以及记录帧并随后将图像存到计算机等常规功能。
焦平面锁定模块c也可向成像模块b提供一束激光，随后成像模块b可以将该束激光反射到物镜后焦面上，并从物镜出射，在样品玻片的下表面发生反射后可经过一系列的光路最终返回焦平面锁定模块c，焦平面锁定模块c则可以根据返回的光束的状态测量得到物镜镜头与样品玻片之间的距离，然后可以通过一反馈系统调整物镜镜头与样品玻片之间的距离，并根据预先设定的参数实现焦平面锁定。
控制与数据采集模块d可以与激发光源产生模块a、成像模块b以及焦平面锁定模块c连接，可以控制调节其中的一些可调可控的光学元件，如激光器、位移台、伺服电机、声光可调谐滤波器、电动反射镜以及可变形反射镜等等，从而将光路调整到所需的状态。同时，控制与数据采集模块d还可以通过与成像模块b中的相机连接来采集荧光数据，并可以对采集到的荧光数据进行同步数据分析。
可选的，如图2所示，成像模块b包括二向色镜45、可变形反射镜51、第一光路单元和第二光路单元；二向色镜45用于将反射回来的荧光100分成第一路荧光101和第二路荧光102，第一路荧光101经第一光路单元汇聚到相机56的第一通道(图未示)，第二路荧光102依次经可变形反射镜51和第二光路单元汇聚到相机56的第二通道(图未示)。具体的，二向色镜45又称为双色镜，对一定波长的光几乎完全透过，而对另一些波长的光几乎完全反射，当荧光以45度或大角度入射时，可以分离出特定的光谱并改变部分光谱的光路方向，能够有效缩小器件的结构并实现多功能的光路，从而使得系统紧凑。在本实施例中，可将反射回来的荧光100以45度入射角打在二向色镜45上，则荧光将被分为两路，即第一路荧光101和第二路荧光102，第一路荧光101经第一光路单元直接汇聚到相机56上，第二路荧光102依次经可变形反射镜51和第二光路单元汇聚到相机56上，相机56可以同时采集两个通道的荧光。可选的，入射到可变形反射镜51的荧光的入射角为15度，通过调节可变形反射镜51可以实现对厚样品成像的像差校正，从而挖掘更丰富的细胞分子内涵信息。其中，可选的，第一光路单元可以依次包括反射镜49、反射镜48、透镜53和直角棱镜反射镜54，从而将第一路荧光101聚焦到相机56的第一通道，第二光路单元可以依次包括反射镜50、透镜52和直角棱镜反射镜54，从而将第二路荧光102聚焦到相机56的第二通道，第一光路单元可以与第二光路单元共用直角棱镜反射镜54，以使得系统更加紧凑。
可选的，如图2所示，成像模块b还包括柱面镜42和第一伺服电机，第一伺服电机用于控制是否将柱面镜42加入二向色镜45前的光路中。具体的，可以通过控制与数据采集模块d控制第一伺服电机运动，从而控制柱面镜42的移动，如图2所示，当前柱面镜42并未加入二向色镜45前的光路中，则在需要时，可以控制柱面镜42向下移动到指定位置以将其加入二向色镜45前的光路中。通过控制是否加入柱面镜42，可以选择进行二维成像或者三维成像。其中，柱面镜42的焦距可以设置为1米。可选的，成像模块b中在二向色镜45前还包括第三光路单元，并可与二向色镜45、可变形反射镜51、第一光路单元和第二光路单元共同构成成像模块b的主光路，其中，第三光路单元可以依次包括多色滤光片40、套筒透镜41、光阑43以及透镜44，以对样品玻片37反射回来的荧光进行调整，通过对各光学元件摆放位置进行特别优化，使得系统更加紧凑，具体可以设置套筒透镜41的焦距为180毫米，透镜44的焦距为125毫米，透镜52和透镜53的焦距为75毫米。则相应的，第一伺服电机可以控制是否将柱面镜42加入套筒透镜41和光阑43之间的光路中。
可选的，如图2所示，成像模块b还包括第一滤光片46、第二滤光片47、第二伺服电机和第三伺服电机；第二伺服电机用于控制是否将第一滤光片46加入二向色镜45与第一光路单元之间的光路中，第三伺服电机用于控制是否将第二滤光片47加入二向色镜45与可变形反射镜51之间的光路中，第一滤光片46和第二滤光片47用于过滤光路中的杂光。具体的，可以通过控制与数据采集模块d控制第二伺服电机和第三伺服电机运动，从而控制第一滤光片46和第二滤光片47的移动。第一滤光片46和第二滤光片47可以配合不同的二向色镜45帮助双通道主光路过滤杂光，则可以按照实际需要选择不同波段的第一滤光片46、第二滤光片47以及二向色镜45。
可选的，如图2所示，成像模块b还包括第一透镜55和第四伺服电机；第四伺服电机用于控制是否将第一透镜55加入相机56前的光路中，以观察物镜后焦面34的情况。具体的，可以通过控制与数据采集模块d控制第四伺服电机运动，从而控制第一透镜55的移动。通过在相机56前的光路中加入第一透镜55，可以实现在相机56上观察物镜后焦面34的情况。
可选的，如图2所示，在成像模块b中，可以在主光路前的光路中加入低通二向色镜39，从而可以将样品玻片37反射回来的荧光通过低通二向色镜39射入主光路，而将样品玻片37反射回来的激光通过低通二向色镜39反射至焦平面锁定模块c，以实现不同功能的光路，进一步使得系统紧凑。具体可以通过反射镜38将样品玻片37反射回来的荧光和/或激光再次反射至二向色镜39，以优化成像模块b的结构。还可以在反射镜38前的光路中加入二向色镜33，从而可以将激发光源产生模块a提供的激发光源通过二向色镜33反射至物镜后焦面34，而将样品玻片37反射回来的荧光通过二向色镜33射入反射镜38，也可进一步的使得系统紧凑。
则具体光束的传播过程可以是，通过二向色镜33将激发光源反射至物镜后焦面34，并通过物镜36照射在样品玻片37上，同时可以通过样品玻片37所处于的xy轴电动位移台进行视场区域选择，从而使得样品视场区域产生荧光，并被物镜36收集，出射荧光110穿过二向色镜33经反射镜38，再穿过低通二向色镜39后进入成像模块b的主光路。在主光路中，荧光依次垂直经过多色滤光片40、套筒透镜41、光阑43和透镜44，并以45度入射角打在二向色镜45上，往后荧光被分为两路，一路经由反射镜49和反射镜48后垂直穿过透镜53，最后在直角棱镜反射镜54的作用下以45度出射角汇聚到相机56上，另一路经由可变形反射镜51和反射镜50后垂直穿过透镜52，并在直角棱镜反射镜54的作用下以45度出射角汇聚到相机56上，最后由相机56同时采集两个通道的荧光。
可选的，如图2所示，激发光源产生模块a包括第一激发光源产生单元a1和第二激发光源产生单元a2；第一激发光源产生单元a1包括至少一个电动反射镜(如图2中包括电动反射镜20和电动反射镜21两个为例)以及至少两个耦合器(如图2中包括耦合器22、耦合器23和耦合器24三个为例)，电动反射镜用于从耦合器中选择目标耦合器(如图2中可将耦合器24选作目标耦合器)将激发光源输出至对应的第二激发光源产生单元a2，第二激发光源产生单元a2用于将接收到的激发光源调整后照射到成像模块b上。具体的，第一激发光源产生单元a1可以通过激光器产生激发光源，在产生了激发光源后，可以将激发光源入射到电动反射镜20上进行反射，并经由反射镜17和反射镜16照射在耦合器23上，也可以将激发光源通过电动反射镜20后入射到电动反射镜21上进行反射，并经由反射镜19和反射镜18照射在耦合器24上，还可以将激发光源依次通过电动反射镜20和电动反射镜21后直接照射在耦合器22上，从而实现目标耦合器的选择过程。其中，可以通过控制与数据采集模块d控制电动反射镜实现透射或反射，通过设置电动反射镜，可以达到为不同设备提供激发光源的目的。
可选的，如图2所示，第一激发光源产生单元a1包括多个不同波长的第一激光器(如图2中包括第一激光器1、第一激光器2、第一激光器3和第一激光器4四个为例)、至少一个长波通二向色镜(如图2中包括长波通二向色镜10、长波通二向色镜11和长波通二向色镜12三个为例)和声光可调谐滤波器13；每个第一激光器发出的激光经至少一个长波通二向色镜汇聚到声光可调谐滤波器13上，声光可调谐滤波器13用于控制激发光源的波长和照明光强，并将激发光源照射到电动反射镜上。具体示例性的，如图2所示，第一激光器1发出的激光依次经过反射镜5、反射镜9、长波通二向色镜10、长波通二向色镜11和长波通二向色镜12，第一激光器2发出的激光依次经过反射镜6、长波通二向色镜10、长波通二向色镜11和长波通二向色镜12，第一激光器3发出的激光依次经过反射镜7、长波通二向色镜11和长波通二向色镜12，第一激光器4发出的激光依次经过反射镜8和长波通二向色镜12，从而使得四个第一激光器所发出的激光最后可以汇聚通过声光可调谐滤波器13，通过声光可调谐滤波器13可以实现对出射光波长和出射光强的调制，从而控制激发光源的波长和照明光强，以实现多色荧光成像的能力。其中，四个第一激光器可以分别为波长638纳米、561纳米、488纳米和405纳米的激光器。在完成对激发光源的调制后，为优化结构，可以通过反射镜14和反射镜15将激发光源照射到电动反射镜上。
可选的，如图2所示，第二激发光源产生单元a2包括反射镜(如图2中包括反射镜31和反射镜32两个为例)，反射镜设置在直线位移台上，用于将调整后的激发光源反射至成像模块b上，并通过移动直线位移台将调整后的激发光源聚焦在物镜后焦面34的不同位置。具体的，在确定了目标耦合器后，可以将产生的激发光源耦合到单模保偏光纤25中，并通过单模保偏光纤25将激发光源输出至与目标耦合器对应的第二激发光源产生单元a2，如图2所示，第二激发光源产生单元a2包括可二维平移的光纤架26，则可将单模保偏光纤25连接在光纤架26上以接收激发光源。激发光源进入第二激发光源产生单元a2后，可依次通过装在笼式结构内的透镜27、滤光片28、光阑29以及透镜30，最后经由反射镜31和反射镜32聚焦到成像模块b中的物镜后焦面34上，通过调节光阑29可以改变照明视场的大小。其中，可以将反射镜设置在直线位移台上，通过上下移动直线位移台可以使激发光源聚焦在物镜后焦面34的不同位置，从而实现不同的光照模式。
可选的，焦平面锁定模块c包括第二激光器57、第二透镜60、D形反射镜61和四象限光电二极管62；第二激光器57发出的激光经第二透镜60照射到成像模块b上，反射回来的激光经D形反射镜61反射至四象限光电二极管62上；成像模块b包括z轴位移台35，z轴位移台35用于调节样品玻片37与物镜36镜头之间的距离，焦平面锁定模块c还包括控制器，控制器用于根据激光照射在四象限光电二极管62上的位置调节或锁定z轴位移台35。具体的，第二透镜60可装在可上下移动的位移台上，第二激光器57发射激光，经由第二透镜60照射到成像模块b上，通过移动该位移台，可以使得激光聚焦在物镜后焦面34上，然后激光从物镜36出射，在样品玻片37的下表面发生反射后折回D形反射镜61，最终经D形反射镜61反射到四象限光电二极管62上。z轴位移台35可以设置在物镜36上，通过上下移动z轴位移台35可以改变样品玻片37与物镜36镜头之间的距离，而距离的变化可以改变折返的激光打在四象限光电二极管62上的位置，从而可以根据激光打在四象限光电二极管62上的位置测量样品玻片37与物镜36镜头之间的距离。焦平面锁定模块c中的控制器可以与z轴位移台35组成反馈系统，通过配合装在四象限光电二极管62下方的直线位移台，即可根据预先设定的参数锁定样品玻片37与物镜36镜头之间的距离，从而实现实时的轴向漂移校正。其中，第二激光器57可以是波长为785纳米的激光器。另外，为了优化焦平面锁定模块c的结构，可以在第二激光器57和第二透镜60之间的光路中依次加入反射镜58和反射镜59。
可选的，控制与数据采集模块d包括计算机和电子控制设备，计算机用于采集并分析成像模块b获得的荧光数据，以及通过电子控制设备控制调节激发光源产生模块a、成像模块b以及焦平面锁定模块c中的光学元件。具体的，计算机可以直接或通过电子控制设备与显微镜设备通信，其中，显微镜设备即包括激发光源产生模块a、成像模块b以及焦平面锁定模块c中的各种光学元件。同时，电子控制设备也可以独立于计算机执行不同的功能，如监视参数或触发设备等等。一方面计算机可以与成像模块b中的相机56连接，以对荧光数据(细胞样品图像)进行采集，并可进行同步数据分析，分析得到的数据可以存储在服务器上，从而用户可以在服务器中进行实时的数据检索，而采集到的原始数据，由于数据量较大，可以设置自动压缩后存储在服务器上。另一方面计算机可以与电子控制设备连接，以通过电子控制设备控制调节显微镜设备中的一些可调可控的光学元件。电子控制设备可以选用现场可编程门阵列(FPGA)作为核心控制器，并可以对上述的伺服电机、位移台、声光可调谐滤波器、电动反射镜、可变形反射镜以及激光器等等光学元件进行控制，其中的位移台还可以通过自带的控制手柄进行控制，可变形反射镜还可以通过USB接口直接与计算机进行通信等等。具体的，电子控制设备可以通过模拟输入接收来自四象限光电二极管或其他各种传感器的信号，并通过TTL/PWM等信号输出控制激光器与相机之间的联动触发、伺服电机和电动反射镜的移动以及声光可调谐滤波器的调制等。本系统中大部分光学元件都可控可调，以便于调整显微镜的模式状态，满足单分子图像数据的实验配置要求，同时也使成像光路易于搭建和测试。本系统还可以预先利用光学设计软件Zemax对光路进行优化，并在优化后光路的基础上进行相应的光学元件支撑调节架机械结构的设计，以最终达到可调可控紧凑设计的目的。本系统还可以根据具体的成像数据采集需求适当的修改元件尺寸和结构等，可以适配不同型号的激光器、相机、物镜、位移台以及各类光学元件等，具有很强的灵活性。
另外，可以为用户提供计算机托管的软件控制界面Micro-Manager来监督和控制各种过程，并可由用户配置相关的显微镜参数以及控制各个模块的功能实现，其中的显微镜参数可以包括激光强度与触发模式、滤光片、透镜、柱面镜和反射镜的位置、镜头位移台的位置以及图像采集模式等等，从而可以根据预先设定的参数实现焦平面锁定、调整焦点稳焦以及位移台定位等。计算机还可以在没有用户参与的情况下自动控制显微镜设备，具体可以通过计算机与电子控制设备之间的连续反馈和同步使得系统可以根据特定的设计自动的进行实验。
本发明实施例所提供的超分辨显微成像系统，通过以模块化的方式单独实现单分子定位显微技术，功能针对性强，紧凑性更高。并且系统中使用的一些光学元件可调可控，从而便于调整系统的模式状态，以满足单分子图像数据的实验配置要求，提高了现有单分子定位显微方法的精度和准确率，同时也使得成像光路易于搭建和测试，改造升级更加容易，也可降低成本。另外，还通过设置焦平面锁定模块测量并锁定物镜镜头与样品玻片之间的距离，从而实现了实时的轴向漂移校正。
注意，上述仅为本发明的较佳实施例及所运用技术原理。本领域技术人员会理解，本发明不限于这里所述的特定实施例，对本领域技术人员来说能够进行各种明显的变化、重新调整和替代而不会脱离本发明的保护范围。因此，虽然通过以上实施例对本发明进行了较为详细的说明，但是本发明不仅仅限于以上实施例，在不脱离本发明构思的情况下，还可以包括更多其他等效实施例，而本发明的范围由所附的权利要求范围决定。
Claims (10)
1.一种超分辨显微成像系统，其特征在于，包括：激发光源产生模块、成像模块、焦平面锁定模块以及控制与数据采集模块；其中，
所述激发光源产生模块用于产生激发光源；
所述成像模块用于接收所述激发光源，将所述激发光源照射在样品玻片的样品上使得样品视场区域产生荧光，并通过相机采集反射回来的荧光；
所述焦平面锁定模块用于向所述成像模块发射激光，并接收所述成像模块反射回来的激光，以测量并锁定所述成像模块中物镜镜头与所述样品玻片之间的距离；所述成像模块还用于将所述焦平面锁定模块发射的激光照射在所述样本玻片上；
所述控制与数据采集模块用于控制调节所述激发光源产生模块、所述成像模块以及所述焦平面锁定模块中的光学元件，并采集所述成像模块获得的荧光数据以进行数据分析。
2.根据权利要求1所述的超分辨显微成像系统，其特征在于，所述成像模块包括二向色镜、可变形反射镜、第一光路单元和第二光路单元；所述二向色镜用于将所述反射回来的荧光分成第一路荧光和第二路荧光，所述第一路荧光经所述第一光路单元汇聚到所述相机的第一通道，所述第二路荧光依次经所述可变形反射镜和所述第二光路单元汇聚到所述相机的第二通道。
3.根据权利要求2所述的超分辨显微成像系统，其特征在于，所述成像模块还包括柱面镜和第一伺服电机，所述第一伺服电机用于控制是否将所述柱面镜加入所述二向色镜前的光路中。
4.根据权利要求2所述的超分辨显微成像系统，其特征在于，所述成像模块还包括第一滤光片、第二滤光片、第二伺服电机和第三伺服电机；所述第二伺服电机用于控制是否将所述第一滤光片加入所述二向色镜与所述第一光路单元之间的光路中，所述第三伺服电机用于控制是否将所述第二滤光片加入所述二向色镜与所述可变形反射镜之间的光路中，所述第一滤光片和所述第二滤光片用于过滤光路中的杂光。
5.根据权利要求2所述的超分辨显微成像系统，其特征在于，所述成像模块还包括第一透镜和第四伺服电机；所述第四伺服电机用于控制是否将所述第一透镜加入所述相机前的光路中，以观察物镜后焦面的情况。
6.根据权利要求1所述的超分辨显微成像系统，其特征在于，所述激发光源产生模块包括第一激发光源产生单元和第二激发光源产生单元；所述第一激发光源产生单元包括至少一个电动反射镜以及至少两个耦合器，所述电动反射镜用于从所述耦合器中选择目标耦合器将所述激发光源输出至对应的所述第二激发光源产生单元，所述第二激发光源产生单元用于将接收到的所述激发光源调整后照射到所述成像模块上。
7.根据权利要求6所述的超分辨显微成像系统，其特征在于，所述第一激发光源产生单元包括多个不同波长的第一激光器、至少一个长波通二向色镜和声光可调谐滤波器；每个所述第一激光器发出的激光经所述至少一个长波通二向色镜汇聚到所述声光可调谐滤波器上，所述声光可调谐滤波器用于控制所述激发光源的波长和照明光强，并将所述激发光源照射到所述电动反射镜上。
8.根据权利要求6所述的超分辨显微成像系统，其特征在于，所述第二激发光源产生单元包括反射镜，所述反射镜设置在直线位移台上，用于将调整后的所述激发光源反射至所述成像模块上，并通过移动所述直线位移台将调整后的所述激发光源聚焦在物镜后焦面的不同位置。
9.根据权利要求1所述的超分辨显微成像系统，其特征在于，所述焦平面锁定模块包括第二激光器、第二透镜、D形反射镜和四象限光电二极管；所述第二激光器发出的激光经所述第二透镜照射到所述成像模块上，所述反射回来的激光经所述D形反射镜反射至所述四象限光电二极管上；所述成像模块包括z轴位移台，所述z轴位移台用于调节所述样品玻片与所述物镜镜头之间的距离，所述焦平面锁定模块还包括控制器，所述控制器用于根据激光照射在所述四象限光电二极管上的位置调节或锁定所述z轴位移台。
10.根据权利要求1所述的超分辨显微成像系统，其特征在于，所述控制与数据采集模块包括计算机和电子控制设备，所述计算机用于采集并分析所述成像模块获得的荧光数据，以及通过所述电子控制设备控制调节所述激发光源产生模块、所述成像模块以及所述焦平面锁定模块中的光学元件。
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| CN202110390429.6A CN112858250A (zh) | 2021-04-12 | 2021-04-12 | 一种超分辨显微成像系统 |
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN115166960A (zh) * | 2022-07-19 | 2022-10-11 | 华南师范大学 | 一种用于定量fret显微成像的led激发光源及调光方法 |
| CN115480514A (zh) * | 2022-09-28 | 2022-12-16 | 山东大学 | 一种基于fpga的集成光强反馈及光阱量化的系统 |
-
2021
- 2021-04-12 CN CN202110390429.6A patent/CN112858250A/zh active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115166960A (zh) * | 2022-07-19 | 2022-10-11 | 华南师范大学 | 一种用于定量fret显微成像的led激发光源及调光方法 |
| CN115166960B (zh) * | 2022-07-19 | 2023-08-04 | 华南师范大学 | 一种用于定量fret显微成像的led激发光源及调光方法 |
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