CN207689370U - 基于贝塞尔光束脉冲整形的二次谐波显微成像系统 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及一种基于贝塞尔光束脉冲整形的二次谐波显微成像系统，飞秒脉冲激光器将产生能量为高斯分布的飞秒脉冲激光依次经半波片和格兰棱镜发射到空间光隔离器，经空间光隔离器出射的光发射到第一可调光阑，经第一可调光阑出射的光发射到锥透镜转变为贝塞尔光，经锥透镜出射贝塞尔光发射到第二可调光阑，经第二可调光阑出射的光经消色差透镜组发射到第三可调光阑，经第三可调光阑出射光经扫描振镜组扫描并发射到远心共轭系统，经远心共轭系统出射的光发射到另一半波片，经另一半波片出射的光经远心共轭系统发射到二向色镜，经二向色出射的光经显微物镜聚焦放置在载物台上的样品，样品产生二次谐波信号经显微物镜收集后又经二向色镜和滤波片被EMCCD采集。

Description

基于贝塞尔光束脉冲整形的二次谐波显微成像系统

技术领域

本实用新型是关于一种二次谐波显微成像系统，特别是关于一种基于贝塞尔光束脉冲整形的二次谐波显微成像系统，涉及显微成像技术领域。

背景技术

光学显微镜在观察物体时具有直观，样品处理方便等优点，而光学分辨率则是衡量一个光学显微系统是否优秀的一个重要标准。随着激光技术的发展，以激光为光源的显微成像系统得到了长足发展，其分辨率也有了极大的提高。目前基于荧光成像原理的技术取得了很大的进展，例如结构光照明显微术(Structured Illumination Microscopy,SIM)、受激辐射耗尽显微术(Stimulated Emission Depletion Microscopy,STED)和单分子定位和构图技术(Single Molecule Localization and Composition)，其中，单分子定位技术又包括光激活定位显微术(photoactivated localization microscopy,PALM)和随机光学重建显微术(stochastic optical reconstruction microscopy,STORM)等超分辨荧光成像技术。尽管这种技术已经将显微成像的分辨率由原来的光学极限分辨率200nm突破到10nm左右，但是荧光显微系统需要对所检测样品进行相应的荧光染料或者荧光蛋白标记，样品处理相对复杂，成本较高，尤其对于一些不能进行荧光标记的分子及生物小分子成像无能为力。

自从1960年，第一台激光器由Theodore H.Maiman实用新型以来，激光作为一个方向性和单色性好的光源，广泛应用在显微成像领域，基于双光子原理的非线性光学二次谐波成像技术也有一定的发展。二次谐波原理是基于界面对称性的破缺导致的界面二阶非线性超极化率不为零，产生二次谐波信号。因此，二次谐波对界面有独特的分辨作用，非线性效应的强局域性减少了成像时非焦点处发光产生的背景干扰，提高了信噪比和三维空间分辨率。因而以此为基础的二次谐波显微成像技术具有无需标记且分辨率高，样品处理简单，无需额外进行荧光染色标记。此外，二次谐波成像技术的发射与激发波长相距较远，因此信号易于有效分离。但是，以往所搭建的二次谐波显微镜对于入射脉冲激光并没有很好进行能量上的整形，所用激光的能量分布一般为高斯分布，具有一定的发射角，因此在经过光学组件和物镜焦点处产生明显的衍射现象，严重影响成像的分辨率。

发明内容

针对上述问题，本实用新型的目的是提供一种能够提高成像分辨率且降低设备成本的基于贝塞尔光束脉冲整形的二次谐波显微成像系统。

为实现上述目的，本实用新型采取以下技术方案：一种基于贝塞尔光束脉冲整形的二次谐波显微成像系统，其特征在于：该成像系统包括飞秒脉冲激光器、空间光隔离器、第一～第三可调光阑、锥透镜、消色差透镜组、扫描振镜组、远心共轭系统、二向色镜、显微物镜、滤波片和EMCCD；所述飞秒脉冲激光器将产生能量为高斯分布的飞秒脉冲激光依次经一半波片和一格兰棱镜发射到所述空间光隔离器，经所述空间光隔离器出射的光发射到所述第一可调光阑，经所述第一可调光阑出射的光发射到所述锥透镜转变为贝塞尔光，经所述锥透镜出射的贝塞尔光发射到所述第二可调光阑，经所述第二可调光阑出射的光经所述消色差透镜组发射到所述第三可调光阑，经所述第三可调光阑出射的光经扫描振镜组扫描并发射到所述远心共轭系统，经所述远心共轭系统出射的光发射到另一半波片，经所述另一半波片出射的光经所述远心共轭系统发射到所述二向色镜，经所述二向色出射的光经所述显微物镜聚焦放置在载物台上的样品，样品产生的二次谐波信号经所述显微物镜收集后又经所述二向色镜和所述滤波片被所述EMCCD采集。

进一步地，所述消色差透镜组包括依次平行间隔设置的第一～第三消色差透镜，所述第一消色差透镜固定在一维手动平移台上，通过调整所述一维手动平移台的位置，使得从所述锥透镜产生的贝塞尔光束中心通过所述第一消色差透镜中心变成平行光；第二消色差透镜和第三消色差透镜分别固定在二维手动平移台和一维手动平移台上，二者组成扩束镜对，将所得平行贝塞尔光束进行扩束，所述第二消色差透镜的焦距为50mm，所述第三消色差透镜的焦距为100mm，所述另一半波片固定设置在所述无限远矫正透镜套筒前。

进一步地，所述扫描振镜组包括共振式扫描振镜和检流计式扫描振镜，所述共振式扫描振镜用于改变激光在水平方向上的传播方向，所述检流计式扫描振镜用于改变激光在垂直方向上的传播方向。

进一步地，所述远心共轭系统包括消色差透镜与无限远矫正透镜套筒，保证经过所述扫描振镜组的光在所述显微物镜处聚焦，所述消色差透镜焦距为50mm，所述无限远矫正透镜套筒焦距为200mm，镀有增透膜。

进一步地，所述滤波片前设置有XT2准直发射端口适配器，所述XT2准直发射端口适配器用于延长信号收集部分的光路，并保证延长后的图像信号仍然在所述EMCCD处聚焦。

进一步地，所述飞秒脉冲激光器采用掺钛蓝宝石激光器飞秒脉冲激光器。

进一步地，该成像系统还包括若干镀有介质膜的反射镜，所述反射镜的具体位置根据光路传播进行设置，用于改变光传播方向并调整光路的准直。

进一步地，所述空间光隔离器固定在三维平移台上，通过所述三维平移台的运动保证入射脉冲激光垂直通过所述空间光隔离器的中心。

进一步地，所述锥透镜固定在二维手动平移台上，通过调整所述二维精密手动平移台使得入射激光脉冲通过所述锥透镜的中心，所述锥透镜的Altechna材料是UVFS，直径为25.4mm，锥角为176±0.5°。

进一步地，所述滤波片采用350nm～650nm的短通滤波片。

本实用新型由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、本实用新型基于贝塞尔光脉冲整形的二次谐波激光扫描显微成像系统设置的锥透镜将脉冲激光器产生的高斯波形的脉冲激光转变为环形贝塞尔光，理想的零阶贝塞尔光场的分布不随光束传播而变化，具有无衍射(nondiffracting)的性质，即其中心光束的束腰径在传播方向上始终保持在接近于衍射极限的大小而不会发生变化，故也称为“无衍射”光束；贝塞尔光束的另一个优势是如果其中心光束遇到障碍物时，外围的光会在障碍物之后“修复”中心光束的缺失，对于传统的光学显微镜而言，光的衍射性质则是限制光学分辨率的瓶颈，传统高斯波形的脉冲光在经过光学元件和样品时存在一定的衍射现象，因此导致光学分辨率降低，而采用贝塞尔光后则会很好的抑制光的衍射，从而提显微成像高分辨率。2、本实用新型所采集的成像信号是二次谐波信号(Second Harmonic Generation)，二次谐波源自于表面的对称性破缺，只有在焦点以内具有足够大光强(超过阈值光强)的微小区域才会产生，而其他被照明区域因为没有达到阈值而无法产生，SHG和THG的焦斑比激发光的聚焦更小，因此二次谐波显微镜的分辨率能够突破衍射极限。3、只有在焦平面处产生二次谐波信号非中心对称的体系才能产生二次谐波信号，源于物质本身的性质，因而无需额外荧光标记，因此采用贝塞尔光束脉冲整形的二次谐波成像，能够对无标记样品进行成像，成像分辨率高。4、本实用新型将产生的飞秒脉冲激光依次经过半波片、格兰棱镜和空间光隔离器，作为本显微成像系统入射光的初始光束，初始光束通过反射镜进入锥透镜，将初始的具有高斯分布的光束模拟成贝塞尔光束，以减小焦斑尺寸并增加焦深再经过消色差透镜，得到平行的贝塞尔光束，平行贝塞尔光束经过扩束后通过一个光阑，以修正光源光强分布不均匀所带来的偏差，修正后的贝塞尔光束进入XY扫描振镜系统后，再经过消色差透镜和无限远矫正套筒透镜后进入倒置显微镜系统产生的扫描二次谐波图像信号经过滤波片去除基频光后被EMCCD系统采集，本实用新型结构简单，造价低廉、易操作、易搭建、易调试、适用范围广，可有效提高二次谐波成像的分辨率和成像质量。

附图说明

图1为本实用新型基于贝塞尔光脉冲整形的二次谐波激光扫描显微成像系统结构示意图；

图2为本实用新型基于贝塞尔光脉冲整形的二次谐波激光扫描显微成像系统所使用的贝塞尔光束的光斑形状；

图3为本实用新型基于贝塞尔光脉冲整形的二次谐波激光扫描显微成像系统所采集的二次谐波成像效果图；

图4为本实用新型基于贝塞尔光脉冲整形的二次谐波激光扫描显微成像系统采用在Si片上蒸镀上金膜，再通过电子束刻蚀形成周期性G形图案的样本的扫描电子显微镜图效果图；

图中附图标记为：1-飞秒脉冲激光器，2-半波片，3-格兰棱镜，4-反射镜，5-空间光隔离器，6-反射镜，7-第一可调光阑，8-锥透镜，9-第二可调光阑，10-第一消色差透镜，11-第二消色差透镜，12-第三消色差透镜，13-第三可调光阑，14-共振式扫描振镜，15-检流计式扫描振镜，16-第四消色差透镜，17-反射镜，18-反射镜，19-半波片，20-无限远矫正透镜套筒，21-二向色镜，22-显微物镜，23-载物台，24-反射镜，25-XT2准直发射端口适配器，26-滤波片以及27-EMCCD(电子倍增电荷耦合器件)。

具体实施方式

以下结合附图来对本实用新型进行详细的描绘。然而应当理解，附图的提供仅为了更好地理解本实用新型，它们不应该理解成对本实用新型的限制。在本实用新型的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”等仅仅是用于描述的目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

如图1所示，本实用新型提供的基于贝塞尔光束脉冲整形的二次谐波显微成像系统，包括飞秒脉冲激光器1、半波片2、格兰棱镜3、反射镜4、空间光隔离器5、反射镜6、第一可调光阑7、锥透镜8、第二可调光阑9、第一消色差透镜10、第二消色差透镜11、第三消色差透镜12、第三可调光阑13、共振式扫描振镜14、检流计式扫描振镜15、第四消色差透镜16、反射镜17、反射镜18、半波片19、无限远矫正透镜套筒20、二向色镜21、显微物镜22、载物台23、反射镜24、XT2准直发射端口适配器25、滤波片26和EMCCD27。

飞秒脉冲激光器1将产生能量为高斯分布的飞秒脉冲激光依次经半波片2和格兰棱镜3发射到反射镜4，经反射镜4反射的光经空间光隔离器5和反射镜6发射到第一可调光阑7，经第一可调光阑7出射的光发射到锥透镜8转变为贝塞尔光，经锥透镜8中心出射的贝塞尔光发射到第二可调光阑8，经第二可调光阑8出射的光依次经第一消色差透镜10，第二消色差透镜11和第三消色差透镜12发射到第三可调光阑13，经第三可调光阑13出射的光依次经共振式扫描振镜14和检流计式扫描振镜15进行扫描并发射到第四消色差透镜16，经第四消色差透镜16出射的光依次经反射镜17和反射镜18发射到半波片19，经半波片19出射的光经无限远矫正透镜套筒(Infinity-Corrected Tube Lenses)20发射到二向色镜21，经二向色镜21出射的光发射到显微镜系统，并经显微物镜22聚焦放置在载物台23上的样品，样品产生的SHG(二次谐波)信号经显微物镜22收集后发射到二向色镜21，经二向色镜21出射的光经反射镜24依次反射到XT2准直发射端口适配器25(可以采用photometrics的XT2系列延长透镜套筒)和滤波片26并发射到EMCCD27进行采集。

在一个优选实施例中，本实用新型的飞秒脉冲激光器1可以采用掺钛蓝宝石激光器(Ti-Sapphire)飞秒脉冲激光器，其具有单脉冲能量高，方向性好，单色性好等优点。

在一个优选实施例中，半波片2和格兰棱镜3用于调整入射激光的能量，经半波片2和格兰棱镜3的透过中心波长与入射激光波长相同，并与激光入射方向垂直，使得激光在通过半波片2和格兰棱镜3后不发生偏折，保证光路的准确性。

在一个优选的实施例中，反射镜4和反射镜6为镀有介质膜的全反射镜，镀有介质膜能够增大反射镜的反射率；反射镜4和反射镜6与入射激光呈45°角放置，用于改变激光传播方向并调整光路的准直。

在一个优选的实施例中，空间光隔离器5放置在反射镜4和反射镜6之间，并固定在60mm×60mm台面的三维精密平移台A上，三维手动精密平移台A可以在三维空间精密移动，三维行程均为100mm，移动精度为0.01mm，用于保证入射脉冲激光垂直通过空间光隔离器5的中心，空间光隔离器5能够防止光学元件反射回来的光进入激光器，并在激光器腔中的腔镜与干涉仪之间形成震荡，从而影响激光锁模的稳定性。

在一个优选的实施例中，锥透镜8用于将Ti-Sapphire飞秒脉冲激光器1产生的的高斯波形的脉冲激光转变为环形贝塞尔光，锥透镜8固定在台面大小为60mm*60mm的精密二维手动平移台B上，通过调整二维精密手动平移台B可以使得入射激光脉冲通过锥透镜8的中心，获得完美的贝塞尔光斑，如图2所示，本实用新型采用的锥透镜8的Altechna材料是UVFS，直径25.4mm，锥角176±0.5°。

在一个优选的实施例中，第一消色差透镜10固定在一维精密手动平移台C上，一维精密手动平移台可以沿垂直于脉冲激光入射的方向移动，通过调整一维精密手动平移台的位置，使得从锥透镜8产生的贝塞尔光束中心通过第一消色差透镜10的中心，使得光变成平行光。第二消色差透镜11和第三消色差透镜12分别固定在二维精密手动平移台D和一维精密手动平移台E上。第二消色差透镜11的焦距是50mm和第三消色差透镜12的焦距是100mm，二者组成扩束镜对，将所得平行贝塞尔光束进行扩束，本实用新型的扩束倍率为2，以此为例，不限于此。

在一个优选的实施例中，第一可调光阑7，第二可调光阑9和第三可调光阑13为三个等高的可调节大小的光阑，它们的作用是校准入射脉冲激光1的准直以及对入射脉冲激光形状进行校正。

在一个优选的实施例中，第三可调光阑13作用一方面是保证光路准直，另一方面是对通过第三消色差透镜12后所得平行光进行修正，滤除外层光，保留中心部分无衍射光，通过第三可调光阑后的光束直径约为2mm。

在一个优选的实施例中，共振式扫描振镜14和检流计式扫描振镜15构成扫描振镜组，用于激光的高速扫描，共振式扫描振镜14固定在扫描振镜镜座上，镜座固定在三维精密手动位移台上，共振式扫描振镜14用于改变激光在水平方向上的传播方向。检流计式扫描振镜15固定在扫描振镜镜座上，镜座固定在三维精密手动位移台上，检流计式扫描振镜15用于改变激光在垂直方向上的传播方向。

在一个优选的实施例中，第四消色差透镜16与无限远矫正透镜套筒20构成远心共轭系统，保证经过扫描振镜的光在显微物镜22处聚焦。第四消色差透镜16焦距为50mm，无限远矫正透镜套筒20，焦距为200mm，镀有增透膜，用于可见光和近红外范围(680～1600nm)，第四消色差透镜16固定设置二维精密手动平移台F与套筒透镜20一起使用，以形成一个无限远矫正的光学系统。保证激光扫描过程中，激光束在像平面内每个扫描位置上形成统一的光斑尺寸，保证视场上的图像分辨率基本不变。第四消色差透镜16和无限远矫正透镜套筒20构成的远心共轭系统也有扩束作用，将光斑直径由2mm扩大至8mm，使其与物镜22的入射光瞳匹配，提高成像分辨率。

在一个优选的实施例中，半波片19固定在无限远矫正透镜套筒20之前，用于调整进入物镜22前激光的偏振方向，其中心波长为800nm。

在一个优选的实施例中，二向色镜21固定在显微镜的转盘内，其作用是反射808nm的基频光，透射404nm的倍频光。

在一个优选的实施例中，反射镜17和反射镜18构成爬高镜组，爬高镜组采用镀有介质膜的全反射镜，用于调整激光入射高度。

在一个优选的实施例中，显微镜系统采用倒置显微镜系统，显微物镜22采用100倍油镜，Na值1.40，所用油的折射率为1.518。

在一个优选的实施例中，XT2准直发射端口适配器25用于延长信号收集部分的光路，可以在延长的部分增加别的偏振片和滤光片等光学部件，并保证延长后的图像信号仍然在信号采集设备处聚焦。

在一个优选的实施例中，滤波片26用于过滤图像信号中未被二向色镜21完全滤除的基频光，只透过二次谐波信号光，滤波片26可以采用350nm-650nm的短通滤波片。

在一个优选的实施例中，本实用新型采用EMCCD27作为信号收集系统，有利于对弱SHG信号的收集，提高成像的分辨率和信噪比。EMCCD27最大像素为512*512，每个像素点的大小为16微米，具有电子放大功能，量子效率高于95％。

上述各实施例仅用于说明本实用新型，其中各光学元件可以采用常用的支架进行支撑固定，且光学元件的位置等都是可以有所变化的，只要满足本实用新型的光路传播条件即可，凡是在本实用新型技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应排除在本实用新型的保护范围之外。

Claims (10)

1.一种基于贝塞尔光束脉冲整形的二次谐波显微成像系统，其特征在于：该成像系统包括飞秒脉冲激光器、空间光隔离器、第一～第三可调光阑、锥透镜、消色差透镜组、扫描振镜组、远心共轭系统、二向色镜、显微物镜、滤波片和EMCCD；

所述飞秒脉冲激光器将产生能量为高斯分布的飞秒脉冲激光依次经一半波片和一格兰棱镜发射到所述空间光隔离器，经所述空间光隔离器出射的光发射到所述第一可调光阑，经所述第一可调光阑出射的光发射到所述锥透镜转变为贝塞尔光，经所述锥透镜出射的贝塞尔光发射到所述第二可调光阑，经所述第二可调光阑出射的光经所述消色差透镜组发射到所述第三可调光阑，经所述第三可调光阑出射的光经扫描振镜组扫描并发射到所述远心共轭系统，经所述远心共轭系统出射的光发射到另一半波片，经所述另一半波片出射的光经所述远心共轭系统发射到所述二向色镜，经所述二向色出射的光经所述显微物镜聚焦放置在载物台上的样品，样品产生的二次谐波信号经所述显微物镜收集后又经所述二向色镜和所述滤波片被所述EMCCD采集。

2.如权利要求1所述的基于贝塞尔光束脉冲整形的二次谐波显微成像系统，其特征在于：所述消色差透镜组包括依次平行间隔设置的第一～第三消色差透镜，所述第一消色差透镜固定在一维手动平移台上，通过调整所述一维手动平移台的位置，使得从所述锥透镜产生的贝塞尔光束中心通过所述第一消色差透镜中心变成平行光；第二消色差透镜和第三消色差透镜分别固定在二维手动平移台和一维手动平移台上，二者组成扩束镜对，将所得平行贝塞尔光束进行扩束，所述第二消色差透镜的焦距为50mm，所述第三消色差透镜的焦距为100mm，所述另一半波片固定设置在所述远心共轭系统的无限远矫正透镜套筒前。

3.如权利要求1所述的基于贝塞尔光束脉冲整形的二次谐波显微成像系统，其特征在于：所述扫描振镜组包括共振式扫描振镜和检流计式扫描振镜，所述共振式扫描振镜用于改变激光在水平方向上的传播方向，所述检流计式扫描振镜用于改变激光在垂直方向上的传播方向。

4.如权利要求1所述的基于贝塞尔光束脉冲整形的二次谐波显微成像系统，其特征在于：所述远心共轭系统包括消色差透镜与无限远矫正透镜套筒，保证经过所述扫描振镜组的光在所述显微物镜处聚焦，所述消色差透镜焦距为50mm，所述无限远矫正透镜套筒焦距为200mm，镀有增透膜。

5.如权利要求1所述的基于贝塞尔光束脉冲整形的二次谐波显微成像系统，其特征在于：所述滤波片前设置有XT2准直发射端口适配器，所述XT2准直发射端口适配器用于延长信号收集部分的光路，并保证延长后的图像信号仍然在所述EMCCD处聚焦。

6.如权利要求1到5任一项所述的基于贝塞尔光束脉冲整形的二次谐波显微成像系统，其特征在于：所述飞秒脉冲激光器采用掺钛蓝宝石激光器飞秒脉冲激光器。

7.如权利要求1到5任一项所述的基于贝塞尔光束脉冲整形的二次谐波显微成像系统，其特征在于：该成像系统还包括若干镀有介质膜的反射镜，所述反射镜的具体位置根据光路传播进行设置，用于改变光传播方向并调整光路的准直。

8.如权利要求1到5任一项所述的基于贝塞尔光束脉冲整形的二次谐波显微成像系统，其特征在于：所述空间光隔离器固定在三维平移台上，通过所述三维平移台的运动保证入射脉冲激光垂直通过所述空间光隔离器的中心。

9.如权利要求1到5任一项所述的基于贝塞尔光束脉冲整形的二次谐波显微成像系统，其特征在于：所述锥透镜固定在二维手动平移台上，通过调整所述二维精密手动平移台使得入射激光脉冲通过所述锥透镜的中心，所述锥透镜的Altechna材料是UVFS，直径为25.4mm，锥角为176±0.5°。

10.如权利要求1到5任一项所述的基于贝塞尔光束脉冲整形的二次谐波显微成像系统，其特征在于：所述滤波片采用350nm～650nm的短通滤波片。