CN111504968A - 四色激光照明荧光显微镜 - Google Patents
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Abstract
一种四色激光照明荧光显微镜，涉及显微镜技术领域，该四色激光照明荧光显微镜包括四色激光光源系统与二向色镜组、第一反射镜、扩束准直系统、第一半波片、空间光调制系统、4f系统、扫描振镜系统、三角棱镜系统、左出光系统、右出光系统、左空气物镜、右空气物镜、显微镜、滤光轮、相机以及3D平移台。本申请设有四色激光光源系统与二向色镜组，集成了四种激光,适用于不同组织样品成像，操作人员可根据样品特性选择合适的激光波长进行成像。四色激光可适用于大多数样品。克服了空间分辨率、光学层析能力和视场之间矛盾，提高了空间分辨率和光学层析能力，优化了实时成像性能，集成度更高。
Description
技术领域
本申请涉及显微镜技术领域，具体地涉及一种四色激光照明荧光显微镜。
背景技术
由于生物组织固有的三维特性，使得生命科学的研究与探索(如对脑部神经投射、血管分布以及肿瘤微环境等研究)，需基于生物组织三维空间信息而进行深入研究。传统的对较薄切片样品或少量细胞的研究已不能满足研究者的需求，相应的传统成像方法(如共聚焦显微镜对样品三维成像)也已不再适用。
近年来，针对大尺度生物样品(小鼠全脑和脊髓等)处理方法以及三维显微成像方法已逐渐兴起。选择性平面照明显微镜(SPIM)是一种服务于上述三维显微成像方法的新型成像设备，可用于透明化组织的快速三维荧光成像。其原理是通过将照明平面光片限制在检测焦平面的附近进行3D成像。
SPIM显微镜需要薄、厚度均匀且平面尺寸大的光片，可以最大化SPIM显微镜的三维成像能力，SPIM显微镜使用不同类型的平面照明光片获得不同的3D空间分辨率，光学层析能力和视场。然而光的衍射，在物理上是无法产生同时具有薄的、厚度均匀、对激发光有良好约束能力以及大尺寸的理想光片。随着视场增加至几十微米或更大，为满足对多细胞样品的成像需求，平衡上述特性变得非常困难。由于平面照明光片的厚度会随着其尺寸的增大而增大，同时，对照明光的约束能力也会随之降低，空间分辨率和光学层析能力也会随着视场的增大而降低，因此，空间分辨率、光学层析能力和视场大小之间的折衷成为限制常规SPIM显微镜三维成像能力的根本问题。
此外，SPIM显微镜重新校准以及针对不同生物样品进行优化，通常需要使用不同的平面照明光片，该方法不仅非常不方便，而且还阻碍SPIM显微镜实时针对成像对象进行优化以达到最佳成像性能。
发明内容
本申请解决的技术问题是现有的SPIM显微镜三维成像能力不足的缺陷。
为解决上述技术问题，本申请实施例提供一种四色激光照明荧光显微镜，包括四色激光光源系统与二向色镜组、第一反射镜、扩束准直系统、第一半波片、空间光调制系统、4f系统、扫描振镜系统、三角棱镜系统、左出光系统、右出光系统、左空气物镜、右空气物镜、显微镜、滤光轮、相机以及3D平移台；所述四色激光光源系统与二向色镜组发出的光通过第一反射镜的反射进入扩束准直系统，扩束准直系统射出的光经过所述第一半波片进入空间光调制系统，所述空间光调制系统射出的进入4f系统，所述4f系统射出光进入扫描振镜系统，所述扫描振镜系统将光束分成左右两个光束，分别经三角棱镜系统后进入左出光系统和右出光系统；所述左出光系统射出的光经左空气物镜照射至3D平移台的样品左侧，所述右出光系统射出的光经右空气物镜照射至3D平移台的样品右侧；所述显微镜位于左空气物镜和右空气物镜上方，左空气物镜和右空气物镜相对显微镜左右对称设置，左右两个光束照射样品产生的荧光进入显微镜；显微镜射出的光经过滤光轮后到达相机。
在上述技术方案中，进一步的，还包括控制器，所述控制器分别与四色激光光源系统与二向色镜组、空间光调制系统、扫描振镜系统、相机和3D平移台控制连接，所述控制器向空间光调制系统传递不同相位图，改变激发光片的焦线尺寸和焦平面位置，在相机视场内平铺光片，通过改变扫描振镜系统角度位置，对样品左右两侧分别3D图像采集，并通过左右拼接方法完成3D成像。
在上述技术方案中，进一步的，所述四色激光光源系统与二向色镜组包括405纳米激光器、488纳米激光器、561纳米激光器、637纳米激光器、405纳米对应的二向色镜、488纳米对应的二向色镜、561纳米对应的二向色镜以及第二反射镜，所述405纳米激光器发射的光束经所述405纳米对应的二向色镜后的路径、所述488纳米激光器发射光束经所述488纳米对应的二向色镜后的路径、所述561纳米激光器发射光束经所述561纳米对应的二向色镜后的路径和所述637纳米激光器发射光束经所述第二反射镜后的路径重合。
在上述技术方案中，进一步的，所述扩束准直系统包括第一透镜和第二透镜，光束依次经第一透镜和第二透镜，以扩束至预设尺寸。
在上述技术方案中，进一步的，所述空间光调制系统包括空间光调制器、第二半波片和偏振光束分束器，所述扩束准直系统射出的光束，依次经过偏振光束分束器、第二半波片进入空间光调制器，所述空间光调制系统射出的光束依次经过第二半波片、偏振光束分束器后，进入4f系统。
在上述技术方案中，进一步的，所述空间光调制器的调制平面位于所述第一透镜的前焦点，所述扫描振镜系统位于所述第二透镜的后焦点，所述空间光调制器通过4f系统与所述扫描振镜系统共轭，所述扫描振镜系统通过所述左出光系统共轭至所述左空气物镜的入瞳，所述扫描振镜系统通过所述右出光系统共轭至所述右空气物镜的入瞳。
在上述技术方案中，进一步的，所述4f系统包括第三透镜、第四透镜以及第一狭缝；所述第三透镜后焦点和第四透镜前焦点重合，所述第一狭缝位于第三透镜和第四透镜重合的焦点上。
在上述技术方案中，进一步的，所述左出光系统包括第一左透镜、第一左反射镜、第二左透镜和第二左反射镜，所述三角棱镜系统位于所述第一左透镜前焦面，所述第一左反射镜位于所述第一左透镜的后焦面与所述第二左透镜前焦面的重合点，所述第二左反射镜位于第二左透镜后焦面与所述左空气物镜入瞳的重合点；所述右出光系统包括第一右透镜、第一右反射镜、第二右透镜和第二右反射镜，所述三角棱镜系统位于所述第一右透镜前焦面，所述第一右反射镜位于所述第一右透镜的后焦面与所述第二右透镜前焦面的重合点，所述第二右反射镜位于第二右透镜后焦面与所述右空气物镜入瞳的重合点。
在上述技术方案中，进一步的，所述3D平移台沿X、Y或Z轴方向驱动样品，实现3D成像。
与现有技术相比，本申请实施例的技术方案具有以下有益效果：
本申请实施例提供一种四色激光照明荧光显微镜，通过空间光调制器，可依次产生聚焦于同一视野下，不同位置的光束，由这些光束形成的光片对样品进行单个视野内的分段成像，即为平铺光片技术。该技术摒弃常规选择性平面照明显微镜的单光片照明方式，运用多个厚度极薄的光片分段照明。在不损失成像视野范围的情况下，获得更高，更均匀分辨率的3D图像。
尤为重要的是，设有四色激光光源系统与二向色镜组，集成了四种激光，适用于不同组织样品成像，操作人员可根据样品特性选择合适的激光波长进行成像。四色激光可适用于大多数样品。克服了空间分辨率、光学层析能力和视场之间矛盾，提高了空间分辨率和光学层析能力，优化了实时成像性能，集成度更高。
附图说明
图1是本申请实施例的一种四色激光照明荧光显微镜的结构示意图。
附图标记：
1-四色激光光源系统与二向色镜组；2-第一反射镜；3-扩束准直系统；4-第一半波片；5-空间光调制系统；6-4f系统；7-扫描振镜系统；8-三角棱镜系统；9-左出光系统；10-右出光系统；11-左空气物镜；12-右空气物镜；13-显微镜；14-滤光轮；15-相机；16-3D平移台；17-控制器；101-405纳米激光器；102-405纳米对应的二向色镜；103-488纳米激光器；104-488纳米对应的二向色镜；105-561纳米激光器；106-561纳米对应的二向色镜；107-637纳米激光器；108-第二反射镜；301-第一透镜；302-第二透镜；501-空间光调制器；502-第二半波片；503-偏振光束分束器；601-第三透镜；602-第一狭缝；603-第四透镜；901-第一左透镜；902-第一左反射镜；903-第二左透镜；904-第二左反射镜；1001-第一右透镜；1002-第一右反射镜；1003-第二右透镜；1004-第二右反射镜。
具体实施方式
为使本申请的上述目的、特征和有益效果能够更为明显易懂，下面结合附图对本申请的具体实施例做详细的说明。显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
在本申请的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本申请的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本申请中的具体含义。
图1是本申请实施例的一种四色激光照明荧光显微镜的结构示意图。
如图1所示，本申请实施例提供的四色激光照明荧光显微镜，包括四色激光光源系统与二向色镜组1、第一反射镜2、扩束准直系统3、第一半波片4、空间光调制系统5、4f系统6、扫描振镜系统7、三角棱镜系统8、左出光系统9、右出光系统10、左空气物镜11、右空气物镜12、显微镜13、滤光轮14、相机15、3D平移台16以及控制器17。
所述四色激光光源系统与二向色镜组1发出的光通过第一反射镜2的反射进入扩束准直系统3，扩束准直系统3射出的光经过所述第一半波片4进入空间光调制系统5，所述空间光调制系统5射出的进入4f系统6，所述4f系统6射出光进入扫描振镜系统7，扫描振镜系统7将光束分成左右两个光束，分别经三角棱镜系统8后进入左出光系统9和右出光系统10；所述左出光系统9射出的光经左空气物镜11照射至3D平移台16的左侧，所述右出光系统10射出的光经右空气物镜12照射至3D平移台16的右侧；所述显微镜13位于左空气物镜11和右空气物镜12上方，左空气物镜11和右空气物镜12相对显微镜13左右对称设置，左右两个光束照射样品产生的荧光进入显微镜13；显微镜13射出的光经过滤光轮14后到达相机15。
所述控制器17分别与四色激光光源系统与二向色镜组1、空间光调制系统5、三角棱镜系统8、相机15和3D平移台16控制连接，所述控制器17向空间光调制系统5传递不同相位图，改变激发光片的焦线尺寸和焦平面位置，在相机15视场内平铺光片，通过改变扫描振镜系统7角度位置，对样品左右两侧分别3D图像采集，并通过左右拼接方法完成3D成像。
相较于现有技术，本申请实施例提供的四色激光照明荧光显微镜，通过空间光调制器501，Nuohai LS18，可依次产生聚焦于同一视野下，不同位置的光束，由这些光束形成的光片对样品进行单个视野内的分段成像，即为平铺光片技术。该技术摒弃常规选择性平面照明显微镜13的单光片照明方式，运用多个厚度极薄的光片分段照明。在不损失成像视野范围的情况下，获得更高，更均匀分辨率的3D图像。
尤为重要的是，设有四色激光光源系统与二向色镜组1，集成了四种激光(405nm,488nm,561nm,637nm),适用于不同组织样品成像，操作人员可根据样品特性选择合适的激光波长进行成像。四色激光可适用于大多数样品。克服了空间分辨率、光学层析能力和视场之间矛盾，提高了空间分辨率和光学层析能力，优化了实时成像性能，集成度更高。
具体来说，所述四色激光光源系统与二向色镜组1包括405纳米激光器101、488纳米激光器103、561纳米激光器105、637纳米激光器107、405纳米对应的二向色镜102、488纳米对应的二向色镜104、561纳米对应的二向色镜106以及第二反射镜108，所述405纳米激光器101发射的光束经所述405纳米对应的二向色镜102后的路径、所述488纳米激光器103发射光束经所述488纳米对应的二向色镜104后的路径、所述561纳米激光器105发射光束经所述561纳米对应的二向色镜106后的路径和所述637纳米激光器107发射光束经所述第二反射镜108后的路径重合。
在本实施例中，所述扩束准直系统3包括第一透镜301和第二透镜302，光束依次经第一透镜301和第二透镜302，以扩束至预设尺寸。
在本实施例中，所述空间光调制系统5包括空间光调制器501、第二半波片502和偏振光束分束器503，所述扩束准直系统3射出的光束，依次经过偏振光束分束器503、第二半波片502进入空间光调制器501，所述空间光调制系统5射出的光束依次经过第二半波片502、偏振光束分束器503后，进入4f系统6。
在本实施例中，所述空间光调制器501的调制平面位于所述第一透镜301的前焦点，所述扫描振镜系统7位于所述第二透镜302的后焦点，所述空间光调制器501通过4f系统6与所述扫描振镜系统7共轭，所述扫描振镜系统7通过所述左出光系统9共轭至所述左空气物镜11的入瞳，所述扫描振镜系统7通过所述右出光系统10共轭至所述右空气物镜12的入瞳。
在本实施例中，所述4f系统6包括第三透镜601、第四透镜603以及第一狭缝602；所述第三透镜601后焦点和第四透镜603前焦点重合，所述第一狭缝602位于第三透镜601和第四透镜603重合的焦点上。
在本实施例中，所述左出光系统9包括第一左透镜901、第一左反射镜902、第二左透镜903和第二左反射镜904，所述三角棱镜系统8位于所述第一左透镜901前焦面，所述第一左反射镜902位于所述第一左透镜901的后焦面与所述第二左透镜903前焦面的重合点，所述第二左反射镜904位于第二左透镜903后焦面与所述左空气物镜11入瞳的重合点；所述右出光系统10包括第一右透镜1001、第一右反射镜1002、第二右透镜1003和第二右反射镜1004，所述三角棱镜系统8位于所述第一右透镜1001前焦面，所述第一右反射镜1002位于所述第一右透镜1001的后焦面与所述第二右透镜1003前焦面的重合点，所述第二右反射镜1004位于第二右透镜1003后焦面与所述右空气物镜12入瞳的重合点。
在本实施例中，所述3D平移台16沿X、Y或Z轴方向驱动所述样品，实现3D成像。
虽然本申请披露如上，但本申请并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本申请的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本申请的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
Claims (9)
1.一种四色激光照明荧光显微镜，其特征在于，包括四色激光光源系统与二向色镜组、第一反射镜、扩束准直系统、第一半波片、空间光调制系统、4f系统、扫描振镜系统、三角棱镜系统、左出光系统、右出光系统、左空气物镜、右空气物镜、显微镜、滤光轮、相机以及3D平移台；所述四色激光光源系统与二向色镜组发出的光通过第一反射镜的反射进入扩束准直系统，扩束准直系统射出的光经过所述第一半波片进入空间光调制系统，所述空间光调制系统射出的进入4f系统，所述4f系统射出光进入扫描振镜系统，所述扫描振镜系统将光束分成左右两个光束，分别经三角棱镜系统后进入左出光系统和右出光系统；所述左出光系统射出的光经左空气物镜照射至3D平移台的样品左侧，所述右出光系统射出的光经右空气物镜照射至3D平移台的样品右侧；所述显微镜位于左空气物镜和右空气物镜上方，左空气物镜和右空气物镜相对显微镜左右对称设置，左右两个光束照射样品产生的荧光进入显微镜；显微镜射出的光经过滤光轮后到达相机。
2.根据权利要求1所述的四色激光照明荧光显微镜，其特征在于，还包括控制器，所述控制器分别与四色激光光源系统与二向色镜组、空间光调制系统、扫描振镜系统、相机和3D平移台控制连接，所述控制器向空间光调制系统传递不同相位图，改变激发光片的焦线尺寸和焦平面位置，在相机视场内平铺光片，通过改变扫描振镜系统角度位置，对样品左右两侧分别3D图像采集，并通过左右拼接方法完成3D成像。
3.根据权利要求2所述的四色激光照明荧光显微镜，其特征在于，所述四色激光光源系统与二向色镜组包括405纳米激光器、488纳米激光器、561纳米激光器、637纳米激光器、405纳米对应的二向色镜、488纳米对应的二向色镜、561纳米对应的二向色镜以及第二反射镜，所述405纳米激光器发射的光束经所述405纳米对应的二向色镜后的路径、所述488纳米激光器发射光束经所述488纳米对应的二向色镜后的路径、所述561纳米激光器发射光束经所述561纳米对应的二向色镜后的路径和所述637纳米激光器发射光束经所述第二反射镜后的路径重合。
4.根据权利要求2所述的四色激光照明荧光显微镜，其特征在于，所述扩束准直系统包括第一透镜和第二透镜，光束依次经第一透镜和第二透镜，以扩束至预设尺寸。
5.根据权利要求4所述的四色激光照明荧光显微镜，其特征在于，所述空间光调制系统包括空间光调制器、第二半波片和偏振光束分束器，所述扩束准直系统射出的光束，依次经过偏振光束分束器、第二半波片进入空间光调制器，所述空间光调制系统射出的光束依次经过第二半波片、偏振光束分束器后，进入4f系统。
6.根据权利要求5所述的四色激光照明荧光显微镜，其特征在于，所述空间光调制器的调制平面位于所述第一透镜的前焦点，所述扫描振镜系统位于所述第二透镜的后焦点，所述空间光调制器通过4f系统与所述扫描振镜系统共轭，所述扫描振镜系统通过所述左出光系统共轭至所述左空气物镜的入瞳，所述扫描振镜系统通过所述右出光系统共轭至所述右空气物镜的入瞳。
7.根据权利要求2所述的四色激光照明荧光显微镜，其特征在于，所述4f系统包括第三透镜、第四透镜以及第一狭缝；所述第三透镜后焦点和第四透镜前焦点重合，所述第一狭缝位于第三透镜和第四透镜重合的焦点上。
8.根据权利要求2所述的四色激光照明荧光显微镜，其特征在于，所述左出光系统包括第一左透镜、第一左反射镜、第二左透镜和第二左反射镜，所述三角棱镜系统位于所述第一左透镜前焦面，所述第一左反射镜位于所述第一左透镜的后焦面与所述第二左透镜前焦面的重合点，所述第二左反射镜位于第二左透镜后焦面与所述左空气物镜入瞳的重合点；所述右出光系统包括第一右透镜、第一右反射镜、第二右透镜和第二右反射镜，所述三角棱镜系统位于所述第一右透镜前焦面，所述第一右反射镜位于所述第一右透镜的后焦面与所述第二右透镜前焦面的重合点，所述第二右反射镜位于第二右透镜后焦面与所述右空气物镜入瞳的重合点。
9.根据权利要求1所述的四色激光照明荧光显微镜，其特征在于，所述3D平移台沿X、Y或Z轴方向驱动样品，实现3D成像。
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