CN113945151A - 高分辨平铺光片显微镜 - Google Patents

Abstract

本申请涉及显微镜领域，尤其是涉及一种高分辨平铺光片显微镜，包括四色激光光源系统、反射镜系统、扩束准直系统、第一狭缝、空间光调制系统、4f系统、扫描振镜系统、三角棱镜系统、左出光系统、右出光系统、左空气物镜、右空气物镜、高分辨率显微系统、滤光轮、相机以及三维平移台。本申请设有高分辨率显微系统，高分辨显微系统可将系统分辨率提高至300nm×300nm×800nm。高分辨显微系统可适用于大多数透明化样品高分辨成像，成像深度可达8mm，进一步提高了光片显微镜系统的空间分辨率和光学层析能力，优化了实时成像性能，集成度更高。

Description

高分辨平铺光片显微镜

技术领域

本申请涉及显微镜技术领域，尤其是涉及一种高分辨平铺光片显微镜。

背景技术

近年来，针对大尺寸生物样品(小鼠全脑和脊髓等)的处理方法以及三维显微成像方法已逐渐兴起。选择性平面照明显微镜(SPIM)是一种突破衍射极限的服务于上述三维显微成像方法的新型成像设备，可用于透明化大组织的快速三维荧光成像。

随着组织研究不断深入，对SPIM的空间分辨率提出了更高的要求。由于空间分辨率与检测物镜数值孔径和介质的折射率有关，空气的折射率通常相较各种透明化成像液介质的折射率低，所以常用的空气物镜一定程度限制了SPIM的空间分辨率。

发明内容

本申请的目的在于提供一种高分辨平铺光片显微镜，在一定程度上解决了现有技术中存在的常用的空气物镜一定程度限制了SPIM的空间分辨率的技术问题。

本申请提供了一种高分辨平铺光片显微镜，包括：四色激光光源系统、二向色镜系统、反射镜系统、扩束准直系统、空间光调制系统、4f系统、扫描振镜系统、三角棱镜系统、左出光系统、右出光系统、左空气物镜、右空气物镜、高分辨显微系统、滤光轮、相机以及三维平移台；

其中，所述四色激光光源系统发出的光能够通过所述反射镜系统反射后进入所述扩束准直系统，所述扩束准直系统射出的光能够进入所述空间光调制系统，所述空间光调制系统射出的光能够传输至所述4f系统，所述4f系统射出的光能够经所述扫描振镜系统反射后进入所述三角棱镜系统；

所述三角棱镜系统能够将光束分成左右两个光束，且左右两个光束能够分别进入一一对应的所述左出光系统和所述右出光系统；

所述左出光系统射出的光能够经由所述左空气物镜照射至所述三维平移台的样品的左侧，所述右出光系统射出的光能够经由所述右空气物镜照射至所述三维平移台的样品的右侧；

左右两个光束照射样品产生的荧光能够进入所述高分辨显微系统，且所述高分辨显微系统射出的光能够经过所述滤光轮后到达所述相机。

在上述技术方案中，进一步地，所述高分辨显微系统包括介质镜以及转接件，左右两个光束照射样品产生的荧光能够进入所述介质镜，所述介质镜射出的光能够顺次经过所述转接件以及所述滤光轮和镜筒后到达所述相机。

在上述任一技术方案中，进一步地，所述介质镜的20×介质镜。

在上述任一技术方案中，进一步地，所述20×介质镜通过所述转接件与所述滤光轮、所述镜筒和所述相机连接固定，构成所述高分辨显微系统；

所述转接件包括相连接的主体以及支撑部；其中，所述主体为方形板；所述支撑部为方形块体；所述支撑部的底部形成有卡槽；所述卡槽的侧壁形成有朝向所述卡槽的中心延伸的限位凸起；所述支撑部还形成有与所述卡槽相连通的过孔。

在上述任一技术方案中，进一步地，所述四色激光光源系统包括405纳米激光器、488纳米激光器、561纳米激光器以及637纳米激光器；

所述二向色镜系统包括与所述405纳米激光器对应设置的第一二向色镜、与所述488纳米激光器对应设置的第二二向色镜、与所述561纳米激光器对应设置的第三二向色镜以及与所述637纳米激光器对应设置的反射镜；

其中，所述405纳米激光器发射出的光束能够经由所述第一二向色镜后的路径、所述488纳米激光器发射出的光束经由所述第二二向色镜后的路径、所述561纳米激光器发射出的光束经由所述第三二向色镜后的路径以及所述637纳米激光器发射的光束经由所述反射镜后的路径在所述反射镜系统处重合。

在上述任一技术方案中，进一步地，所述空间光调制系统包括空间光调制器、半波片以及偏振光束分束器；其中，所述扩束准直系统射出的光束能够经过所述偏振光束分束器进入所述空间光调制器，所述空间光调制系统射出的光束能够依次经过所述半波片以及所述偏振光束分束器后而进入所述4f系统。

在上述任一技术方案中，进一步地，所述4f系统包括第三透镜、第四透镜以及第一狭缝；其中，所述第三透镜的后焦点位于所述第一狭缝处。

在上述任一技术方案中，进一步地，所述空间光调制器的调制平面位于所述第三透镜的前焦点，所述空间光调制器通过所述4f系统与所述扫描振镜系统共轭，所述扫描振镜系统反射的光束能够通过所述左出光系统到达所述左空气物镜，所述扫描振镜系统反射的光束能够通过所述右出光系统到达所述右空气物镜。

在上述任一技术方案中，进一步地，所述扩束准直系统包括第一透镜和第二透镜，且光束能够依次经过所述第一透镜和所述第二透镜，以扩束至预设尺寸；和/或

所述左出光系统包括第一左透镜、第一左反射镜、第二左透镜以及第二左反射镜；

所述右出光系统包括第一右透镜、第一右反射镜、第二右透镜以及第二右反射镜。

在上述任一技术方案中，进一步地，所述高分辨平铺光片显微镜还包括控制器，所述控制器分别与所述四色激光光源系统、所述空间光调制系统、所述扫描振镜系统、所述相机和所述三维平移台通信连接；

所述控制器用于向所述空间光调制系统传递不同的相位图、改变激发光片的束腰尺寸和焦平面的位置，且在所述相机的视场内平铺光片，通过改变所述扫描振镜系统内的偏转角度，对样品的左右两侧分别进行三维图像采集，并通过左右拼接方法完成三维成像；

所述三维平移台能够沿着X轴、Y轴或Z轴的方向驱动样品改变位置，以实现13mm×13mm×13mm范围内的样品成像。

与现有技术相比，本申请的有益效果为：

本申请提供的高分辨平铺光片显微镜，通过空间光调制器，可依次产生聚焦于同一视野下，不同位置的光束，由这些光束形成的光片对样品进行单个视野内的分段成像，即为平铺光片技术。该技术摒弃常规选择性平面照明显微镜的单光片照明方式，运用多个厚度极薄的光片分段照明。在不损失成像视野范围的情况下，获得更高、更均匀的分辨率的三维图像。

尤为重要的是，设有高分辨率显微系统即集成了介质镜、转接件、滤光轮、镜筒和相机，适用于不同组织样品的高分辨率成像，分辨率可达300nm×300nm×800nm，成像深度可达8mm，操作人员可根据样品特性选择合适的放大倍数。高分辨显微系统可适用于大多数样品的高分辨率成像，进一步提高了SPIM的空间分辨率，优化了实时成像性能，集成度更高。

附图说明

为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请实施例提供的高分辨平铺光片显微镜的结构示意图；

图2为本申请实施例提供的转接件的结构示意图；

图3为本申请实施例提供的转接件的另一结构示意图；

图4为本申请实施例提供的转接件的又一结构示意图。

附图标记：

1-四色激光光源系统；2-二向色镜系统；3-第一反射镜；4-扩束准直系统；5-空间光调制系统；6-4f系统；7-扫描振镜；8-三角棱镜；9-左出光系统；10-右出光系统；11-左空气物镜；12-右空气物镜；13-20×介质镜；14-转接件；15-滤光轮；16-相机；17-三维平移台；18-控制器；101-405纳米激光器；102-488纳米激光器；103-561纳米激光器；104-637纳米激光器；201-第一二向色镜；202-第二二向色镜；203-第三二向色镜；204-第二反射镜；401-第一透镜；402-第二透镜；501-第一半波片；502-空间光调制器；503-第二半波片；504-偏振光束分束器；601-第三透镜；602-第一狭缝；603-第四透镜；901-第一左透镜；902-第一左反射镜；903-第二左透镜；904-第二左反射镜；1001-第一右透镜；1002-第一右反射镜；1003-第二右透镜；1004-第二右反射镜；141-主体；142-支撑部；143-卡槽；144-限位凸起；145-过孔。

具体实施方式

下面将结合附图对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。

通常在此处附图中描述和显示出的本申请实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。

基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

在本申请的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本申请的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本申请中的具体含义。

下面参照图1描述根据本申请一些实施例所述的高分辨平铺光片显微镜。

参见图1所示，本申请的实施例提供了一种高分辨平铺光片显微镜，包括四色激光光源系统1，二向色镜系统2、反射镜系统、扩束准直系统4、空间光调制系统5、4f系统6、扫描振镜系统、三角棱镜系统、左出光系统9、右出光系统10、左空气物镜11、右空气物镜12、高分辨显微系统、滤光轮15、相机16以及三维平移台17。

其中，优选地，高分辨显微系统包括介质镜以及转接件14，且介质镜可优选为20×介质镜13，可见，高分辨率显微系统集成了20×介质镜13和转接件14，适用于不同组织样品的高分辨率成像，分辨率可达300nm×300nm×800nm。

其中，优选地，扫描振镜系统包括一个扫描振镜7，当然，不仅限于此，还可根据实际需要设置。

其中，优选地，三角棱镜系统包括一个三角棱镜8，当然，不仅限于此，还可根据实际需要设置。

其中，优选地，反射镜系统包括一个反射镜，为了与后文出现的反射镜区分，此处命名为第一反射镜3，当然，不仅限于此。

基于上述描述结构得知，本高分辨平铺光片显微镜的工作原理如下：四色激光光源系统1发出的光通过二向色镜系统2在第一反射镜3处合束并反射进入扩束准直系统4，扩束准直系统4射出的光经过空间光调制系统5，空间光调制系统5射出的光进入4f系统6，4f系统6射出的光经扫描振镜7反射后进入三角棱镜8；

三角棱镜8将光束分成左右两个光束，分别进入左出光系统9和右出光系统10；左出光系统9射出的光经左空气物镜11照射至三维平移台17的左侧，右出光系统10射出的光经右空气物镜12照射至三维平移台17的右侧；

20×介质镜13位于左空气物镜11和右空气物镜12的上方，左空气物镜11和右空气物镜12相对20×介质镜13左右对称设置，左右两个光束照射样品产生的荧光进入20×介质镜13；20×介质镜13射出的光经过转接件14、滤光轮15后到达相机16，且具体地，20×介质镜13通过转接件14与滤光轮15、镜筒和相机16连接固定，构成高分辨显微系统。

如图2至图4所示，转接件14包括相连接的主体141以及支撑部142；其中，主体141为方形板；支撑部142为方形块体；支撑部142的底部形成有卡槽143；卡槽143的侧壁形成有朝向卡槽143的中心延伸的限位凸起144；支撑部142还形成有与卡槽143相连通的过孔145，此过孔145用于透光。

基于转接件14的结构描述可知，将主体141固定安装在目标地也即待安装的位置处，具体地，主体141可通过紧固件例如螺钉或者螺栓固定在目标地，20×介质镜13卡设于卡槽143内的限位凸起144之间，相机16、滤光轮15以及镜筒均可以通过紧固件例如螺钉或者螺栓固定在主体141上，并且顺次位于20×介质镜13的上方，且镜筒靠近20×介质镜13设置。

综上，设有高分辨率显微系统，集成了20×介质镜13和转接件14，以适用于不同组织样品的高分辨率成像，操作人员可根据样品特性选择合适的放大倍数进行成像，进一步提高了SPIM的空间分辨率、实时成像性能，集成度更高。

在本发明的一个实施例中，优选地，如图1所示，高分辨平铺光片显微镜还包括控制器18，控制器18分别与四色激光光源系统1、空间光调制系统5、扫描振镜7、滤光轮15、相机16和三维位移台17通信连接，控制器18向空间光调制系统5传递不同的相位图，改变激发光片的束腰尺寸和焦平面的位置，在相机16的视场内平铺光片，通过改变扫描振镜7的角度位置，对样品左右两侧分别三维图像采集，并通过左右拼接方法完成三维成像。

基于以上结构描述可知，通过空间光调制器502，可依次产生聚焦于同一视野下，不同位置的光束，由这些光束形成的光片对样品进行单个视野内的分段成像，即为平铺光片技术。该技术摒弃常规选择性平面照明显微镜的单光片照明方式，运用多个厚度极薄的光片分段照明，在不损失成像视野范围的情况下，获得更高、更均匀的分辨率的三维图像。

在本发明的一个实施例中，优选地，如图1所示，四色激光光源系统1包括405纳米激光器101、488纳米激光器102、561纳米激光器103以及637纳米激光器104；

二向色镜系统2包括与405纳米激光器101对应设置的第一二向色镜201、与488纳米激光器102对应设置的第二二向色镜202、与561纳米激光器103对应设置的第三二向色镜203以及与637纳米激光器104对应设置的反射镜(为了区分，此处命名为第二反射镜204)；

其中，405纳米激光器101发射出的光束能够经由第一二向色镜201后的路径、488纳米激光器102发射出的光束经由第二二向色镜202后的路径、561纳米激光器103发射出的光束经由第三二向色镜203后的路径以及637纳米激光器104发射的光束经由第二反射镜204后的路径在反射镜系统的第一反射镜3处重合。

在本发明的一个实施例中，优选地，如图1所示，空间光调制系统5包括第一半波片501、空间光调制器502、第二半波片503和偏振光束分束器504，扩束准直系统4出射的光，依次经过第一半波片501、偏振光束分束器504以及空间光调制器502，空间光调制器502射出的光束依次经过第二半波片503、偏振光束分束器504后进入4f系统6。

在本发明的一个实施例中，优选地，如图1所示，4f系统6包括第三透镜601、第四透镜603以及第一狭缝602；其中，第三透镜601的后焦点位于第一狭缝602处。

在本发明的一个实施例中，优选地，如图1所示，空间光调制器502的调制平面位于第三透镜601的前焦点，空间光调制器502通过4f系统6与扫描振镜7共轭，扫描振镜7反射的光束能够通过左出光系统9到达左空气物镜11，扫描振镜7反射的光束能够通过右出光系统10到达右空气物镜12。

在本发明的一个实施例中，优选地，如图1所示，扩束准直系统4包括第一透镜401和第二透镜402，且光束能够依次经过第一透镜401和第二透镜402，以扩束至预设尺寸。

在本发明的一个实施例中，优选地，如图1所示，左出光系统9包括第一左透镜901、第一左反射镜902、第二左透镜903以及第二左反射镜904；

右出光系统10包括第一右透镜1001、第一右反射镜1002、第二右透镜1003以及第二右反射镜1004。

在本发明的一个实施例中，优选地，如图1所示，三维平移台17能够沿着X轴、Y轴或Z轴的方向驱动样品改变位置，以实现13mm×13mm×13mm的范围内的样品成像。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种高分辨平铺光片显微镜，其特征在于，包括：四色激光光源系统、二向色镜系统、反射镜系统、扩束准直系统、空间光调制系统、4f系统、扫描振镜系统、三角棱镜系统、左出光系统、右出光系统、左空气物镜、右空气物镜、高分辨显微系统、滤光轮、相机以及三维平移台；

其中，所述四色激光光源系统发出的光能够通过所述反射镜系统反射后进入所述扩束准直系统，所述扩束准直系统射出的光能够进入所述空间光调制系统，所述空间光调制系统射出的光能够传输至所述4f系统，所述4f系统射出的光能够经所述扫描振镜系统反射后进入所述三角棱镜系统；

所述三角棱镜系统能够将光束分成左右两个光束，且左右两个光束能够分别进入一一对应的所述左出光系统和所述右出光系统；

所述左出光系统射出的光能够经由所述左空气物镜照射至所述三维平移台的样品的左侧，所述右出光系统射出的光能够经由所述右空气物镜照射至所述三维平移台的样品的右侧；

左右两个光束照射样品产生的荧光能够进入所述高分辨显微系统，且所述高分辨显微系统射出的光能够经过所述滤光轮后到达所述相机。

2.根据权利要求1所述的高分辨平铺光片显微镜，其特征在于，所述高分辨显微系统包括介质镜以及转接件，左右两个光束照射样品产生的荧光能够进入所述介质镜，所述介质镜射出的光能够顺次经过所述转接件以及所述滤光轮和镜筒后到达所述相机。

3.根据权利要求2所述的高分辨平铺光片显微镜，其特征在于，所述介质镜的20×介质镜。

4.根据权利要求3所述的高分辨平铺光片显微镜，其特征在于，所述20×介质镜通过所述转接件与所述滤光轮、所述镜筒和所述相机连接固定，构成所述高分辨显微系统；

所述转接件包括相连接的主体以及支撑部；其中，所述主体为方形板；所述支撑部为方形块体；所述支撑部的底部形成有卡槽；所述卡槽的侧壁形成有朝向所述卡槽的中心延伸的限位凸起；所述支撑部还形成有与所述卡槽相连通的过孔。

5.根据权利要求1所述的高分辨平铺光片显微镜，其特征在于，所述四色激光光源系统包括405纳米激光器、488纳米激光器、561纳米激光器以及637纳米激光器；

所述二向色镜系统包括与所述405纳米激光器对应设置的第一二向色镜、与所述488纳米激光器对应设置的第二二向色镜、与所述561纳米激光器对应设置的第三二向色镜以及与所述637纳米激光器对应设置的反射镜；

其中，所述405纳米激光器发射出的光束能够经由所述第一二向色镜后的路径、所述488纳米激光器发射出的光束经由所述第二二向色镜后的路径、所述561纳米激光器发射出的光束经由所述第三二向色镜后的路径以及所述637纳米激光器发射的光束经由所述反射镜后的路径在所述反射镜系统处重合。

6.根据权利要求1所述的高分辨平铺光片显微镜，其特征在于，所述空间光调制系统包括空间光调制器、半波片以及偏振光束分束器；其中，所述扩束准直系统射出的光束能够经过所述偏振光束分束器进入所述空间光调制器，所述空间光调制系统射出的光束能够依次经过所述半波片以及所述偏振光束分束器后而进入所述4f系统。

7.根据权利要求6所述的高分辨平铺光片显微镜，其特征在于，所述4f系统包括第三透镜、第四透镜以及第一狭缝；其中，所述第三透镜的后焦点位于所述第一狭缝处。

8.根据权利要求7所述的高分辨平铺光片显微镜，其特征在于，所述空间光调制器的调制平面位于所述第三透镜的前焦点，所述空间光调制器通过所述4f系统与所述扫描振镜系统共轭，所述扫描振镜系统反射的光束能够通过所述左出光系统到达所述左空气物镜，所述扫描振镜系统反射的光束能够通过所述右出光系统到达所述右空气物镜。

9.根据权利要求1所述的高分辨平铺光片显微镜，其特征在于，所述扩束准直系统包括第一透镜和第二透镜，且光束能够依次经过所述第一透镜和所述第二透镜，以扩束至预设尺寸；和/或

所述左出光系统包括第一左透镜、第一左反射镜、第二左透镜以及第二左反射镜；

所述右出光系统包括第一右透镜、第一右反射镜、第二右透镜以及第二右反射镜。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的高分辨平铺光片显微镜，其特征在于，所述高分辨平铺光片显微镜还包括控制器，所述控制器分别与所述四色激光光源系统、所述空间光调制系统、所述扫描振镜系统、所述相机和所述三维平移台通信连接；

所述控制器用于向所述空间光调制系统传递不同的相位图、改变激发光片的束腰尺寸和焦平面的位置，且在所述相机的视场内平铺光片，通过改变所述扫描振镜系统内的偏转角度，对样品的左右两侧分别进行三维图像采集，并通过左右拼接方法完成三维成像；

所述三维平移台能够沿着X轴、Y轴或Z轴的方向驱动样品改变位置，以实现13mm×13mm×13mm范围内的样品成像。

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