CN111307772A - 基于微镜阵列的单物镜光片荧光显微成像装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于微镜阵列的单物镜光片荧光显微成像装置及方法。本发明利用微镜阵列，采用同一个物镜将光片激发与荧光收集合二为一，在样品处实现样品自由，无需对样品进行复杂的处理，利用常规的样品载玻片与盖玻片即可实现，并且避免了光路调节；利用微镜阵列，将样品不同深度的光片激发荧光信息由微镜阵列系统的不同位置反射，成像于信号收集系统的不同位置，实现单物镜光片荧光显微成像，能够实现对大数值孔径物镜的使用，从而改善传统光片荧光显微成像中分辨率无法进一步提升的限制；并且，光路设计简单易行，便于实现后续产业化发展。

Description

基于微镜阵列的单物镜光片荧光显微成像装置及方法

技术领域

本发明涉及光片荧光显微成像技术，具体涉及一种基于微镜阵列的单物镜光片荧光显微成像装置及其成像方法。

背景技术

随着荧光蛋白与染色技术的不断发展，荧光显微技术可以实现对细胞内的各类分子和细胞器的特异性标记，从而可以还原细胞内精细结构，并对单个分子或细胞器进行追踪与检测，进而实现对生命本质的探索与调控。在荧光显微镜中，利用激发光对整个样品的待观测区域进行照明，在获得目标三维分布的同时，必然对荧光集团进行多次曝光，因此从荧光技术发展以来，一直存在着两个问题，即激发光对荧光集团的光漂白和对细胞的光损伤。那么，在此基础上发展出来的光片荧光成像技术，可以很好地改善传统荧光显微镜中存在的问题。

相对于传统荧光显微镜，光片荧光显微技术选用侧向照明的激发方式，对样品直接进行面激发，选择性地激发待观测的样品区域，显著地减少了无效曝光，从而有效地降低了光漂白和光损伤。与此同时，相对于传统荧光显微镜点扫描的成像方式，光片荧光显微技术面扫描的成像方式也会大大提高系统的成像速度。从光片的形成方式上，可以将光片荧光成像技术分为两种：几何光片与数字光片。几何光片是指利用柱透镜，将照明光整形为片状光场直接照射待观测区域；数字光片则是利用聚焦光束的快速扫描形成虚拟的光片对样品进行激发，相比于几何光片，数字光片的照明效率比几何光片高许多，而且能在视野范围内形成均匀光片。

光片荧光显微技术在不断的发展与改进，然而由于激发光片的限制，大多采用两个物镜分别进行样品的激发与荧光信息的收集。而激发物镜与收集物镜垂直摆放的光路设计，由于考虑到物镜的机械构成与工作距离，会限制成像系统对大数值孔径物镜的使用，并从根源上限制系统分辨率的提高。为了解决这一问题，一些单物镜的光片荧光显微成像方法被提出，但这些方法其需要对样品腔进行特别的处理，或是需要对光路进行一个复杂且精密的调控才能实现。

发明内容

基于上述提到的光片荧光显微成像的发展现状与局限，本发明提出了一种基于微镜阵列的单物镜光片荧光显微成像装置及其成像方法，采用数字扫描贝塞尔光束的方式产生均匀的照明光片，并利用一个物镜同时实现荧光的激发和收集，同时利用微镜阵列将沿着光轴分布的光片激发荧光信息进行提取，避免了对样品的复杂处理与光路调节，并且实现了样品自由。

本发明的一个目的在于提出一种基于微镜阵列的单物镜光片荧光显微成像装置。

本发明的基于微镜阵列的单物镜光片荧光显微成像装置包括：激发光光源、高斯光扩束准直系统、贝塞尔光束产生系统、聚焦透镜、光束扫描系统、无限远矫正光学系统、双色镜、激发物镜、压电扫描系统、滤波片、4f透镜组、微镜阵列系统、信号收集系统、数据处理系统和白光照明系统；其中，激发光光源产生高斯光，经过高斯光扩束准直系统后，进入贝塞尔光束产生系统；产生的贝塞尔光束经过聚焦透镜聚焦到光束扫描系统，经过无限远矫正光学系统的整形后作为激发光，经双色镜后进入激发物镜入瞳；激发光由于经过光束扫描系统之后，由激发物镜聚焦后，在激发物镜焦平面形成虚拟的数字激发光片，对样品进行片状激发；聚焦透镜、无限远矫正光学系统和激发物镜满足共焦条件，构成共焦系统，贝塞尔光束通过聚焦透镜和无限远矫正光学系统的共焦传递后，到激发物镜焦平面处的聚焦光斑为轴向线光，由光束扫描系统，使轴向线光变为轴向面光形成数字激发光片，数字激发光片沿着轴向并垂直于样品表面；样品位于激发物镜焦平面处，样品放置在压电扫描系统上；数字激发光片激发样品产生荧光，即光片激发荧光信息，由同一激发物镜进行信号收集，经过滤波片后经4f透镜组传递至微镜阵列系统；由于数字激发光片为轴向面光，从而收集到的光片激发荧光信息也沿轴向分布，因此，样品不同深度的光片激发荧光信息，由微镜阵列系统的不同位置反射，由信号收集系统进行收集，成像于信号收集系统的不同位置，形成二维的样品图像；经微镜阵列系统后直接获得的样品图像为一系列带有条纹的光斑，通过数据处理系统去除这些条纹；白光照明系统发出白光照射至样品的表面，观测样品；利用压电扫描系统对样品进行沿垂直于轴向及数字激发光片的方向进行一维移动扫描，获得整个三维荧光分布，从而得到样品的三维分布。

光束扫描系统为一维扫描振镜。

聚焦透镜、无限远矫正光学系统和激发物镜均满足共焦条件，构成共焦系统；高斯光经过贝塞尔光束产生系统之后，成为零阶贝塞尔光束。由于需要利用光束扫描系统进行扫描，对光束的准直需要有较高要求，利用无限远矫正光学系统(Relay光路)使光束的扫描始终不会偏离激发物镜。无限远矫正光学系统包括扫描透镜和套筒透镜。贝塞尔光束通过聚焦透镜、无限远矫正光学系统的扫描透镜以及套筒透镜的共焦传递后，到激发物镜焦平面处的聚焦光斑为轴向线光，由光束扫描系统，使轴向线光变为轴向面光形成数字激发光片；数字激发光片激发所得的光片激发荧光信息同样为轴向分布，因此需经过微镜阵列的传递，才能够由信号收集系统进行接收。

聚焦透镜与无限远矫正光学系统的扫描透镜和套筒透镜以及激发物镜满足共焦条件，构成共焦传递系统，聚焦透镜的后焦点与扫描透镜的前焦点重合，扫描透镜与套筒透镜满足4f条件，套筒透镜的后焦点位于激发物镜的前焦点附近，通过调节聚焦透镜与贝塞尔光束产生系统的距离，将整个贝塞尔区完整的传递到激发物镜焦平面。

贝塞尔光束产生系统采用角锥镜，通过调节角锥镜与聚焦透镜之间的距离，使得贝塞尔光束的轴向中心与激发物镜的聚焦点重合，从而保证贝塞尔光片的均匀性。对于角锥镜的选择，角锥镜的顶角越大，对应获得的零阶贝塞尔光束的线光的轴向长度越长，同时，贝塞尔光束线光的长度还会受到高斯光光斑直径的影响，高斯光光斑的直径越大，贝塞尔光束的轴向长度越长。或者，贝塞尔光束产生系统利用环形光阑与凸透镜组合产生贝塞尔光束，将环形光阑放置于凸透镜的前焦面，平行光通过环形光阑后，在凸透镜后焦面形成贝塞尔光束，其中，环形光阑的内径、外径和凸透镜的焦距决定了贝塞尔光束的衍射角与最大无衍射传播距离。或者，贝塞尔光束产生系统利用空间光调制器产生贝塞尔光束，通过调控微透镜对高斯光的反射形成贝塞尔光的衍射图像，并利用激发物镜将衍射图像传递到激发物镜焦平面。与此同时，为了将贝塞尔光线变为贝塞尔光片，需要光束扫描系统的介入。贝塞尔光束经光束扫描系统变成贝塞尔光片，贝塞尔光片的厚度主要由贝塞尔光束的光束直径所决定；贝塞尔光片的宽度主要由光束扫描系统决定，即扫描振镜的偏转角度(这由施加在扫描振镜上的电压所决定)，根据Relay光路，利用扫描振镜偏转角度、无限远矫正光学系统的扫描透镜和套筒透镜以及激发物镜的焦距计算出贝塞尔光束的扫描范围，偏转角度越大，扫描范围越大，即贝塞尔光片越宽。

微镜阵列系统是本发明的关键之处，包括前端的聚焦物镜、微镜阵列以及后续的收集物镜；其中，聚焦物镜和收集物镜均为长工作距离物镜，前端的聚焦物镜用来再次收集光片激发荧光信息；微镜阵列为一系列沿轴向等间隔排布的微型反射镜，每个微型反射镜在纵向上视为无限长。微型反射镜的镜面与入射光方向呈θ角倾斜放置，40°≤θ≤50°，微型反射镜的高度与数字激发光片厚度有关，设计上一般将微型反射镜的高度稍大于数字激发光片厚度，但也不宜过高，一般不宜大于数字激发光片厚度的两倍，从而避免阻挡光片激发荧光信息；微型反射镜的周期间隔与激发物镜的轴向分辨率以及激发物镜和微镜阵列前端的聚焦物镜之间的放大倍率有关，利用激发物镜的轴向分辨率和放大倍率能够得到微型反射镜处的理想轴向分辨率，设计上相邻的微型反射镜之间的间隔应小于微型反射镜处的理想轴向分辨率，但也不宜间隔过小，一般不宜小于微型反射镜处的理想轴向分辨率的三分之一，从而避免无效微镜的存在。与此同时，收集到的光片激发荧光信息也沿轴向分布，因此，在样品处不同深度的光片激发荧光信息，由不同位置处的微型反射镜所反射。反射之后的光片激发荧光信息由收集物镜接收，传递到信号收集系统，不同位置处的微型反射镜反射的光片激发荧光信息收集至信号收集系统的不同位置，从而将样品的不同深度的光片激发荧光信息，成像于不同位置。一系列沿轴向等间隔排布的微型反射镜位于500微米以内的范围，均位于收集物镜的视场范围内，因此采用一个收集物镜收集所有微型反射镜的反射的光片激发荧光信息。

微镜阵列固定在一个二维俯仰调节块上，并置于三维手动平移台上。调节前端的聚焦物镜的聚焦轴向方向与微镜阵列的排列方向水平，且聚焦轴线与微镜阵列的中心线重合，并且，调节光片激发荧光信息平面与微镜阵列所在平面重合，即微镜阵列在俯仰上的精确调节，其中，微镜阵列所在平面为YZ平面，且沿着每一个微型反射镜的纵向中心线分布，从而保证光片激发荧光信息最大程度上被传递到后续的收集物镜，同时不会失真。

信号收集系统主要有由一个收集透镜与科研级互补式金属氧化物半导体CMOS相机(Prime 95B)构成。由于微镜阵列的间隔排布，光片激发荧光信息经过微镜阵列系统，到达信号收集系统时，直接获得的样品图像为一系列带有“条纹”的光斑，即实验结果。

将单个量子点取代样品放置在激发物镜焦平面处，数字激发光片激发单个量子点产生荧光，即单个量子点的光片激发荧光信息，经微镜阵列系统后由信号收集系统收集，得到单个量子点的成像结果，作为点扩散函数，单个量子点的成像结果为具有条纹的光斑。

数据处理系统主要是通过利用单个量子点的成像结果作为本发明的基于微镜阵列的单物镜光片荧光显微成像装置的点扩散函数，与实验结果进行频域解卷积处理，将由于微镜阵列存在而带来的“条纹”去除，从而使实验结果更接近样品的真实分布。

本发明的基于微镜阵列的单物镜光片荧光显微成像装置放置在实验平台上，实验平台位于水平面，即XY平面。

本发明的另一个目的在于提出一种基于微镜阵列的单物镜光片荧光显微成像方法。

本发明的基于微镜阵列的单物镜光片荧光显微成像方法，包括以下步骤：

1)激发光光源产生高斯光，经过高斯光扩束准直系统后，进入贝塞尔光束产生系统；

产生的贝塞尔光束经过聚焦透镜聚焦到光束扫描系统，经过无限远矫正光学系统的整形后作为激发光，经双色镜后进入激发物镜入瞳；

2)激发光由于经过光束扫描系统之后，由激发物镜聚焦后，在激发物镜焦平面形成虚拟的数字激发光片，对样品进行片状激发；聚焦透镜、无限远矫正光学系统和激发物镜满足共焦条件，构成共焦系统，贝塞尔光束通过聚焦透镜和无限远矫正光学系统的共焦传递后，到激发物镜焦平面处的聚焦光斑为轴向线光，由光束扫描系统，使轴向线光变为轴向面光形成数字激发光片，数字激发光片沿着轴向并垂直于样品表面；

3)样品位于激发物镜焦平面处，样品放置在压电扫描系统上；

4)数字激发光片激发样品产生荧光，即光片激发荧光信息，由同一激发物镜进行信号收集，经过滤波片后经4f透镜组传递至微镜阵列系统；由于数字激发光片为轴向面光，从而收集到的光片激发荧光信息也沿轴向分布，因此，样品不同深度的光片激发荧光信息，由微镜阵列系统的不同位置反射；

5)由信号收集系统进行收集，样品不同深度的光片激发荧光信息成像于信号收集系统的不同位置，形成二维的样品图像；

6)经微镜阵列系统后直接获得的样品图像为一系列带有条纹的光斑，即实验结果，通过数据处理系统去除这些条纹；

7)同时白光照明系统发出白光照射至样品的表面，观测样品；

8)压电扫描系统对样品进行沿垂直于轴向及数字激发光片的方向进行一维移动扫描，重复步骤1)～6)，获得整个三维荧光分布，从而得到样品的三维分布。

其中，在步骤1)中，调节贝塞尔光束产生系统与聚焦透镜之间的距离，使得贝塞尔光束的轴向中心与激发物镜的聚焦点重合，从而保证数字光片的均匀性。

在步骤1)中，测量激发物镜入瞳的大小以及确定合适的数字激发光片宽度(光片宽度可根据待观测的目标区域的大小决定)，从而确定光束扫描系统的扫描振镜的偏转角度，进而确定施加给扫描振镜的电压范围；同时，根据信号收集系统的曝光时间，选择合适的扫描振镜响应频率，由于在曝光时间内，扫描振镜需要完成整个偏转角度的扫描，才能使得贝塞尔光束形成完整的贝塞尔光片，因此扫描振镜完成角度扫描的时间应小于信号收集系统的曝光时间，扫描振镜响应频率与角度扫描的时间成反比，即曝光时间越短，相应的响应频率越大。

在步骤3)中，样品置于激发物镜上方焦点处，为普通的反射式倒置显微镜系统。

在步骤4)中，调节前端的聚焦物镜的聚焦轴向方向与微镜阵列的排列方向水平，且聚焦轴线与微镜阵列的中心线重合，并且，调节光片激发荧光信息平面与微型反射镜平面重合，即微镜阵列在俯仰上的精确调节，其中，微镜阵列所在平面为YZ平面，且沿着每一个微型反射镜的纵向中心线分布，从而保证光片激发荧光信息最大程度上被传递到后续的收集物镜，同时不会失真。

每一个微型反射镜的纵向为Z方向，微镜阵列的周期排布方向为Y方向，即轴向为Y方向，建立三维直角坐标系进行说明，具体调节方法如下：

a)微镜阵列固定在一个二维俯仰调节块上，并置于三维手动平移台上，调节微镜阵列在沿着光束传播的轴线上无偏离，即微镜阵列Y方向与光束传播方向平行，打开白光照明系统，调节微镜阵列的X方向，在信号收集系统中观察到微镜阵列的分布，循环调节微镜阵列Y方向俯仰角和微镜阵列沿Y方向的位置，直至在信号收集系统中观察到微镜阵列沿着Y方向移动过程中，在白光照明下全程不失焦，之后，在样品处放置单个量子点，利用激发量子点获得的光片激发荧光信息分布，调节微镜阵列的X方向位置，使光束正好处于微镜中心；

b)调节微镜阵列平面与光片激发荧光信息平面平行，即微型反射镜的纵向Z方向垂直于实验平台，以光片激发荧光信息平面与实验平台垂直为依据，同时打开白光照明系统与激发光系统，在信号收集系统内观测到微镜阵列在白光下的分布，以及荧光的分布；若荧光较弱则关闭白光照明系统，只在确定微镜阵列的X方向位置时开启；激发单个量子点能够看到荧光只照亮其中部分微型反射镜，此时使微镜阵列沿着Z方向移动，如果看到聚焦的荧光光斑分离，说明此时微镜阵列Z向存在倾斜；循环调节微镜阵列Z方向俯仰角和微型反射镜沿Z方向的位置，直至在信号收集系统中观察到微镜阵列沿着Z方向移动过程中，聚焦的荧光光斑不分离。

在步骤5)中，调节信号收集系统的科研级CMOS相机的接收平面与入光方向垂直，同时保证入光点位于接收平面的正中间位置。

在步骤6)中，将单个量子点取代样品放置在激发物镜焦平面处，数字激发光片激发单个量子点产生荧光，即单个量子点的光片激发荧光信息，经微镜阵列系统后由信号收集系统收集，得到单个量子点的成像结果，作为点扩散函数，单个量子点的成像结果为具有条纹的光斑。

数据处理系统主要是通过利用单个量子点的成像结果作为本发明的基于微镜阵列的单物镜光片荧光显微成像装置的点扩散函数，与实验结果进行频域解卷积处理，将由于微镜阵列存在而带来的“条纹”去除，从而使实验结果更接近样品的真实分布。

本发明的优点：

本发明利用微镜阵列，采用同一个物镜将光片激发与荧光收集合二为一，在样品处实现样品自由，无需对样品进行复杂的处理，利用常规的样品载玻片与盖玻片即可实现，并且避免了光路调节；利用微镜阵列实现单物镜光片荧光显微成像，能够实现对大数值孔径物镜的使用，从而改善传统光片荧光显微成像中分辨率无法进一步提升的限制；并且，光路设计简单易行，便于实现后续产业化发展。

附图说明

图1为本发明的基于微镜阵列的单物镜光片荧光显微成像装置的实施例一的光路图；

图2为本发明的基于微镜阵列的单物镜光片荧光显微成像装置的实施例二的光路图；

图3为本发明的基于微镜阵列的单物镜光片荧光显微成像装置的实施例一的微镜阵列的示意图，其中，(a)为微镜阵列的理论结构示意图，其中黑色区域为微镜阵列，(b)为微镜阵列部分区域在明场显微镜下的分布，其中明亮部分为微型反射镜所在位置，灰暗区域为微镜之间间隔；

图4为本发明的基于微镜阵列的单物镜光片荧光显微成像装置的实施例一在激发物镜焦平面处激发光的聚焦光斑形貌图，其中，(a)为贝塞尔光束在XY平面光斑形貌，(b)为贝塞尔光束在YZ平面光斑形貌，(c)为贝塞尔光束在XZ平面光斑形貌；

图5为本发明的基于微镜阵列的单物镜光片荧光显微成像装置的实施例一对直径10微米的荧光小球样品的成像结果与数据处理结果，其中，(a)为直径10微米的荧光小球样品在明场下分布，(b)为实验结果的XY平面，(c)为实验结果的YZ平面分布，(d)为数据处理后实验结果的XY平面分布，(e)为数据处理后实验结果的YZ平面分布；

图6为本发明的基于微镜阵列的单物镜光片荧光显微成像装置的实施例一对直径2微米的荧光小球样品的成像结果与数据处理结果，其中，(a)为直径2微米的荧光小球样品在明场下分布，(b)为系统所得实验结果，(c)为数据处理之后结果。

具体实施方式

下面结合附图，通过具体实施例，进一步阐述本发明。

如图1所示，本实施例的基于微镜阵列的单物镜光片荧光显微成像装置包括：激发光光源1、高斯光扩束准直系统2、贝塞尔光束产生系统4、聚焦透镜5、光束扫描系统6、无限远矫正光学系统7、双色镜8、激发物镜9、压电扫描系统10、滤波片11、4f透镜组12、微镜阵列系统13、信号收集系统14、数据处理系统和白光照明系统15；其中，激发光光源1产生高斯光，经过高斯光扩束准直系统2后，进入贝塞尔光束产生系统4；产生的贝塞尔光束经过聚焦透镜5聚焦到光束扫描系统6，经过无限远矫正光学系统7的整形后作为激发光，经双色镜8反射后进入激发物镜9入瞳；激发光由于经过光束扫描系统7之后，由激发物镜9聚焦后，在激发物镜焦平面形成虚拟的数字激发光片，对样品进行片状激发；聚焦透镜5、无限远矫正光学系统7和激发物镜9满足共焦条件，构成共焦系统，贝塞尔光束通过聚焦透镜5和无限远矫正光学系统7的共焦传递后，到激发物镜焦平面处的聚焦光斑为轴向线光，由光束扫描系统6，使轴向线光变为轴向面光形成数字激发光片，数字激发光片沿着轴向并垂直于样品表面，即位于YZ平面；样品位于激发物镜焦平面处，样品放置在压电扫描系统10上；数字激发光片激发样品产生荧光，形成光片激发荧光信息，由同一激发物镜9进行信号收集，经双色镜8透射再经过滤波片11后由4f透镜组12传递至微镜阵列系统13，f为焦距；由于数字激发光片为轴向面光，从而收集到的光片激发荧光信息也沿轴向分布，因此，样品不同深度的光片激发荧光信息，由微镜阵列系统13的不同位置反射，由信号收集系统14进行收集成像于信号收集系统14的不同位置，形成二维的样品图像；经微镜阵列系统13后直接获得的样品图像中会存在条纹，通过数据处理系统去除这些条纹；白光照明系统15发出白光照射至样品的表面，观测样品；利用压电扫描系统10对样品进行沿垂直于轴向及数字激发光片的方向进行一维移动扫描，获得整个三维荧光分布，从而得到样品的三维分布，图中箭头表示压电扫描系统的移动方向。

在本实施例中，激发光光源1为561纳米连续光半导体激光器，高斯光经过扩束准直系统2后，扩束到直径约12毫米，进入贝塞尔光束产生系统4，将高斯光束变为贝塞尔光束。其中，贝塞尔光束产生系统4采用顶角为176度的角锥镜。贝塞尔光束经过聚焦透镜5，聚焦到光束扫描系统6上，同时需要调节聚焦透镜5与角锥镜之间的距离，使贝塞尔光束的轴向中心与激发物镜9的聚焦点重合，本实施例中，角锥镜与聚焦透镜5之间的距离为290毫米，此时得到的激发物镜9后零阶贝塞尔光束状态能够很好的满足实验要求。信号收集系统由一个收集透镜14-1与科研级互补式金属氧化物半导体CMOS相机14-2构成。

无限远矫正光学系统7中扫描透镜7-1有效焦距为70mm，套筒透镜7-2有效焦距为200mm。选取振镜扫描幅度为电压每增加或减少1V，最大偏转角度增加或减少1°。依据无限远矫正光学系统的扫描透镜7-1和套筒透镜7-2以及激发物镜9的共焦关系，为了获得100微米的光片宽度，选择施加到振镜上的电压范围是－4.5V到4.5V，扫描振镜响应频率为10000赫兹。

双色镜8对于激发光波段为全反射，对信号光波段为全透射，信号光经过滤波片11，从而去除激发光部分的干扰。

微镜阵列系统包括前端的聚焦物镜13-1、微镜阵列13-2和收集物镜13-3；聚焦物镜13-1与收集物镜13-3的光轴与信号光传播的光轴重合。特别需要注意，此系统中对微镜阵列13-2的调节，需保证微镜阵列13-2所在平面与光片激发荧光信息平面完全重合。微镜阵列13-2固定在一个二维俯仰调节块，并置于三维手动平移台上，选取微镜阵列13-2纵向为Z方向，微镜周期排布方向为Y方向，建立三维直角坐标系进行说明。首先，调节微镜阵列13-2在沿着光束传播的轴线上没有偏离，即调节前端的聚焦物镜13-1的聚焦轴向方向与微镜阵列13-2的排列方向水平，且聚焦轴线与微镜阵列13-2的中心线重合。其次，调节光片激发荧光信息平面与微型反射镜平面重合，即微镜阵列13-2在俯仰上的精确调节，实验平台位于XY平面。在这两个调节过程中，微镜阵列13-2需要沿着X方向的位置需要进行积极修正。

实施例所使用微镜阵列形貌如图3所示，其中，(a)为微镜阵列的理论结构示意图，(b)为微镜阵列部分区域在明场显微镜下的分布，其中明亮部分为微镜所在位置，灰暗区域为微镜之间间隔。在横向上，相邻两个微镜间隔约为6微米。微镜镜面与入射光方向呈约45度夹角倾斜放置，同时，在沿光束入射方向上，微镜的高度约为600纳米。

激发光的聚焦光斑在激发物镜焦平面位置的形貌如图4所示，其中，(a)为贝塞尔光束在XY平面光斑形貌，(b)为贝塞尔光束在YZ平面光斑形貌，(c)为贝塞尔光束在XZ平面光斑形貌。

图5为本实施例中对直径10微米的荧光小球样品的成像结果与数据处理结果。其中，(a)为直径10微米的荧光小球样品在明场下分布，(b)为实验结果的XY平面，(c)为实验结果的YZ平面分布。(d)为数据处理后实验结果的XY平面分布，(e)为数据处理后实验结果的YZ平面分布。可以看出，数据处理后，可以将“条纹”去除，更接近样品实际形貌。

图6为本实施例的基于微镜阵列的单物镜光片荧光显微成像系统对直径10微米的荧光小球样品的成像结果与数据处理结果。其中，(a)为直径2微米的荧光小球样品在明场下分布，(b)为系统所得实验结果，(c)为数据处理之后结果。

实施例二

如图2所示，在本实施例中，贝塞尔光束产生系统4利用环形光阑4-1与凸透镜4-2将高斯光束变为贝塞尔光束，调节凸透镜4-2与聚焦透镜5之间的距离，使贝塞尔光束的轴向中心与激发物镜9的聚焦点重合。同时，双色镜8对于激发光波段为全透射，对信号光波段为全反射。其他结构同实施例一。

最后需要注意的是，公布实施例的目的在于帮助进一步理解本发明，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附的权利要求的精神和范围内，各种替换和修改都是可能的。因此，本发明不应局限于实施例所公开的内容，本发明要求保护的范围以权利要求书界定的范围为准。

Claims (10)

1.一种基于微镜阵列的单物镜光片荧光显微成像装置，其特征在于，所述基于微镜阵列的单物镜光片荧光显微成像装置包括：激发光光源、高斯光扩束准直系统、贝塞尔光束产生系统、聚焦透镜、光束扫描系统、无限远矫正光学系统、双色镜、激发物镜、压电扫描系统、滤波片、4f透镜组、微镜阵列系统、信号收集系统、数据处理系统和白光照明系统；其中，激发光光源产生高斯光，经过高斯光扩束准直系统后，进入贝塞尔光束产生系统；产生的贝塞尔光束经过聚焦透镜聚焦到光束扫描系统，经过无限远矫正光学系统的整形后作为激发光，经双色镜后进入激发物镜入瞳；激发光由于经过光束扫描系统之后，由激发物镜聚焦后，在激发物镜焦平面形成虚拟的数字激发光片，对样品进行片状激发；聚焦透镜、无限远矫正光学系统和激发物镜满足共焦条件，构成共焦系统，贝塞尔光束通过聚焦透镜和无限远矫正光学系统的共焦传递后，到激发物镜焦平面处的聚焦光斑为轴向线光，由光束扫描系统，使轴向线光变为轴向面光形成数字激发光片，数字激发光片沿着轴向并垂直于样品表面；样品位于激发物镜焦平面处，样品放置在压电扫描系统上；数字激发光片激发样品产生荧光，即光片激发荧光信息，由同一激发物镜进行信号收集，经过滤波片后经4f透镜组传递至微镜阵列系统；由于数字激发光片为轴向面光，从而收集到的光片激发荧光信息也沿轴向分布，因此，样品不同深度的光片激发荧光信息，由微镜阵列系统的不同位置反射，由信号收集系统进行收集，成像于信号收集系统的不同位置，形成二维的样品图像；经微镜阵列系统后直接获得的样品图像为一系列带有条纹的光斑，通过数据处理系统去除这些条纹；白光照明系统发出白光照射至样品的表面，观测样品；利用压电扫描系统对样品进行沿垂直于轴向及数字激发光片的方向进行一维移动扫描，获得整个三维荧光分布，从而得到样品的三维分布。

2.如权利要求1所述的基于微镜阵列的单物镜光片荧光显微成像装置，其特征在于，所述聚焦透镜与无限远矫正光学系统的扫描透镜和套筒透镜以及激发物镜满足共焦条件，构成共焦传递系统，聚焦透镜的后焦点与扫描透镜的前焦点重合，扫描透镜与套筒透镜满足4f条件，套筒透镜的后焦点位于激发物镜的前焦点。

3.如权利要求1所述的基于微镜阵列的单物镜光片荧光显微成像装置，其特征在于，所述贝塞尔光束产生系统采用角锥镜，通过调节角锥镜与聚焦透镜之间的距离，使得贝塞尔光束的轴向中心与激发物镜的聚焦点重合；或者，贝塞尔光束产生系统利用环形光阑与凸透镜组合产生贝塞尔光束，将环形光阑放置于凸透镜的前焦面，平行光通过环形光阑后，在凸透镜后焦面形成贝塞尔光束；或者，贝塞尔光束产生系统利用空间光调制器产生贝塞尔光束，通过调控微透镜对高斯光的反射形成贝塞尔光的衍射图像，并利用激发物镜将衍射图像传递到激发物镜焦平面。

4.如权利要求1所述的基于微镜阵列的单物镜光片荧光显微成像装置，其特征在于，所述微镜阵列系统包括前端的聚焦物镜、微镜阵列以及后续的收集物镜；其中，聚焦物镜和收集物镜均为长工作距离物镜，前端的聚焦物镜用来再次收集光片激发荧光信息；微镜阵列为一系列沿轴向等间隔排布的微型反射镜。

5.如权利要求4所述的基于微镜阵列的单物镜光片荧光显微成像装置，其特征在于，所述微型反射镜的镜面与入射光方向呈θ角倾斜放置，40°≤θ≤50°；微型反射镜的高度大于数字激发光片厚度，小于数字激发光片厚度的两倍；微型反射镜的周期间隔小于微型反射镜处的理想轴向分辨率，大于微型反射镜处的理想轴向分辨率的三分之一。

6.一种如权利要求1所述的基于微镜阵列的单物镜光片荧光显微成像装置的成像方法，其特征在于，所述成像方法包括以下步骤：

1)激发光光源产生高斯光，经过高斯光扩束准直系统后，进入贝塞尔光束产生系统；产生的贝塞尔光束经过聚焦透镜聚焦到光束扫描系统，经过无限远矫正光学系统的整形后作为激发光，经双色镜后进入激发物镜入瞳；

2)激发光由于经过光束扫描系统之后，由激发物镜聚焦后，在激发物镜焦平面形成虚拟的数字激发光片，对样品进行片状激发；聚焦透镜、无限远矫正光学系统和激发物镜满足共焦条件，构成共焦系统，贝塞尔光束通过聚焦透镜和无限远矫正光学系统的共焦传递后，到激发物镜焦平面处的聚焦光斑为轴向线光，由光束扫描系统，使轴向线光变为轴向面光形成数字激发光片，数字激发光片沿着轴向并垂直于样品表面；

3)样品位于激发物镜焦平面处，样品放置在压电扫描系统上；

4)数字激发光片激发样品产生荧光，即光片激发荧光信息，由同一激发物镜进行信号收集，经过滤波片后经4f透镜组传递至微镜阵列系统；由于数字激发光片为轴向面光，从而收集到的光片激发荧光信息也沿轴向分布，因此，样品不同深度的光片激发荧光信息，由微镜阵列系统的不同位置反射；

5)由信号收集系统进行收集，样品不同深度的光片激发荧光信息成像于信号收集系统的不同位置，形成二维的样品图像；

6)经微镜阵列系统后直接获得的样品图像为一系列带有条纹的光斑，即实验结果，通过数据处理系统去除这些条纹；

7)同时白光照明系统发出白光照射至样品的表面，观测样品；

8)压电扫描系统对样品进行沿垂直于轴向及数字激发光片的方向进行一维移动扫描，重复步骤1)～6)，获得整个三维荧光分布，从而得到样品的三维分布。

7.如权利要求6所述的成像方法，其特征在于，在步骤1)中，调节贝塞尔光束产生系统与聚焦透镜之间的距离，使得贝塞尔光束的轴向中心与激发物镜的聚焦点重合，从而保证数字光片的均匀性。

8.如权利要求7所述的成像方法，其特征在于，在步骤4)中，调节前端的聚焦物镜的聚焦轴向方向与微镜阵列的排列方向水平，且聚焦轴线与微镜阵列的中心线重合，并且，调节光片激发荧光信息平面与微型反射镜平面重合，即微镜阵列在俯仰上的精确调节，其中，微镜阵列所在平面为YZ平面，且沿着每一个微型反射镜的纵向中心线分布，从而保证光片激发荧光信息最大程度上被传递到后续的收集物镜，同时不会失真。

9.如权利要求8所述的成像方法，其特征在于，在步骤4)中，每一个微型反射镜的纵向为Z方向，微镜阵列的周期排布方向为Y方向，即轴向为Y方向，具体调节方法如下：

a)微镜阵列固定在一个二维俯仰调节块上，并置于三维手动平移台上，调节微镜阵列在沿着光束传播的轴线上无偏离，即微镜阵列Y方向与光束传播方向平行，打开白光照明系统，调节微镜阵列的X方向，在信号收集系统中观察到微镜阵列的分布，循环调节微镜阵列Y方向俯仰角和微镜阵列沿Y方向的位置，直至在信号收集系统中观察到微镜阵列沿着Y方向移动过程中，在白光照明下全程不失焦，之后，在样品处放置单个量子点，利用激发量子点获得的光片激发荧光信息分布，调节微镜阵列的X方向位置，使光束正好处于微镜中心；

b)调节微镜阵列平面与光片激发荧光信息平面平行，即微型反射镜的纵向Z方向垂直于实验平台，以光片激发荧光信息平面与实验平台垂直为依据，同时打开白光照明系统与激发光系统，在信号收集系统内观测到微镜阵列在白光下的分布，以及荧光的分布；若荧光较弱则关闭白光照明系统，只在确定微镜阵列的X方向位置时开启；激发单个量子点能够看到荧光只照亮其中部分微型反射镜，此时使微镜阵列沿着Z方向移动，如果看到聚焦的荧光光斑分离，说明此时微镜阵列Z向存在倾斜；循环调节微镜阵列Z方向俯仰角和微型反射镜沿Z方向的位置，直至在信号收集系统中观察到微镜阵列沿着Z方向移动过程中，聚焦的荧光光斑不分离。

10.如权利要求7所述的成像方法，其特征在于，在步骤6)中，将单个量子点取代样品放置在激发物镜焦平面处，数字激发光片激发单个量子点产生荧光，即单个量子点的光片激发荧光信息，经微镜阵列系统后由信号收集系统收集，得到单个量子点的成像结果，作为点扩散函数，单个量子点的成像结果为具有条纹的光斑；数据处理系统通过利用单个量子点的成像结果作为点扩散函数，与实验结果进行频域解卷积处理，将由于微镜阵列存在而带来的条纹去除，从而使实验结果更接近样品的真实分布。

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