CN109416461A - 显微镜的光学路径中盖玻片的倾斜度测量和校正 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种在显微镜(1)的光学路径中调整样品保持件(7)的方法，其中将照明辐射(BS)中的至少一个束指引到样品保持件(7)上；通过检测器(19)检测由样品保持件(7)反射的一部分照明辐射(BSref)并且确定检测的照明辐射(BSref)的测量值；根据测量值，确定关于光学路径的样品保持件(7)的实际的目前位置；将确定的实际位置与期望的位置比较，并且产生用于修改实际的位置的控制命令，通过执行该控制命令将样品保持件(7)移动到期望的位置中。

Description

显微镜的光学路径中盖玻片的倾斜度测量和校正

技术领域

本发明涉及在显微镜的束路径中调整样品保持件的方法。

背景技术

光片显微术的主要应用中的一个存在于以几百μm上至若干毫米的尺寸来成像例如有机体的中型样品。通常，这些样品包埋在琼脂糖中并且布置在玻璃毛细管中。出于检查样品的目的，将玻璃毛细管引入到充满水的样品室中并且将具有样品的琼脂糖按压出毛细管一点。由光片照明样品。通过检测物镜，将样品中激发的并且从样品发出的荧光成像到特别是照相机的检测器上，该检测物镜垂直于光片并且因此还垂直于光片光学单元。

根据现有技术，光片显微术的显微镜1的布局(SPIM布局、单平面照明显微术)包括照明物镜2和检测物镜3(下面也称为SPIM物镜)，将照明物镜2和检测物镜3各自从上方相对于样品平面4以45°的角且关于彼此以直角指引到样品平面4上(参见图1a)。布置在样品平面4上的样品5位于例如实施为培养皿的样品保持件7的基底上。用例如水的液体8填充样品保持件7，并且在应用光片显微术期间将两个SPIM物镜2、3浸没在液体8中(未示出)。样品平面4延伸在由笛卡尔坐标系中的X轴X和Y轴Y所跨越的XY平面中。第一光轴A1和第二光轴A2延伸在由笛卡尔坐标系中的Y轴Y和Z轴Z所跨越的平面YZ中。

该方法提供了轴线方向上的高分辨的优点，因为薄光片6可以通过照明物镜2来产生。由于更高的分辨率，可以检查更小的样品5。此外，显著地降低麻烦的背景荧光并且由此改进信噪比。

根据现有技术，借助于通过位于样品5下方的宽场物镜20垂直穿过样品保持件7的透明基底所记录的宽场像，来产生与样品平面4和样品保持件7平行的概览像。发射的光对样品5的照明并且捕获该发射的光在此是不可能的，因为两个SPIM物镜2、3相对于彼此布置得太紧。

为了在诸如多孔板的标准样品容器中促进更简易的样品准备，可以维持45°配置但是具有倒置布置中的两个SPIM物镜2、3，将两个SPIM物镜2、3从下方穿过样品保持件7的透明基底指引到样品平面4中(图1b)。在这个布置中，必须通过使用特别的光学元件来校正由样品保持件7引起的像差，该样品保持件7相对于光轴A1和A2倾斜并且以盖玻片的形式出现。穿过样品保持件7的基底照明布置在样品平面4中的样品5，并且检测样品5的激发的荧光。可以使用诸如多孔板、培养皿和/或物体支撑件的样品保持件7，并且特别地在高通量筛选的情况下可以避免样品5的污染。

如果例如Alvarez板12布置在照明物镜2和/或检测物镜3的束路径中(图1b)，则其它技术难题发生(US 3305294 A)。Alvarez板12以它们校正像差的方式来实施，该像差可能恰好发生在例如盖玻片的样品保持件7和相应的物镜2、3的光轴A1、A2之间设定的角的情况下。导致较差图像质量的不需要的像差已经发生在小角度偏离(例如＜0.1°)的情况下。因此，例如在实验开始之前必须将盖玻片对准使得角度偏离位于可容许的公差内。此外，有帮助的是，如果除了角度以外，在物镜2、3之间的距离或者可能出现的附加的透镜(例如弯月形透镜)以及盖玻片也是可调整的，使得样品5或其将要成像的区域位于检测物镜3的像平面BE中。

DE 10 2007 046 601 A1公开了在反射的光系统中调整灯具的设备。至少一个孔径光阑布置在所述反射的光系统中的反射的光照明束路径中。检测器布置在反射的光系统的检测束路径中。反射的光照明束路径和检测束路径一起延伸并且在部分反射的光系统中平行。在部分反射的光系统中，光学元件是可定位的，随着光学元件将孔径光阑成像到检测器上。

DE 10 2008 007 178A涉及激光扫描显微镜的校准设备，其具有在公共框架中牢固地彼此对准的聚焦光学单元和布置在聚焦光学单元的焦平面中的测试结构，所述测试结构具有在反射光和/或透射光中可检测的结构元件。显微镜中，测试结构可切换到显微镜束路径中，使得聚焦光学单元的光瞳与激光扫描显微镜的物镜光瞳重合或者所述光瞳位于与其共轭的平面中。

从由McGorty等人的出版物(2015：用于常规安装的样品的顶部开口的选择性平面照明显微镜(Open-top selective plane illumination microscope forconventionally mounted specimens)，光学快报23：16142-16153)获悉校正由盖玻片引起的显微镜的像差的可能性。倒置的SPIM显微镜包含具有以下效果的水棱镜：部分地补偿由于穿过盖玻片的检测光的倾斜通道发生的像差。

发明内容

本发明基于以下目的：提出在显微镜的束路径中调整样品保持件的方法。

该目的由根据独立权利要求1的主题实现。在从属权利要求中指定有利的配置。

该目的由在显微镜的束路径中调整样品保持件的方法来实现，其中将照明辐射中的至少一个束指引到样品保持件上。通过检测器捕获由样品保持件反射的照明辐射的分量，并且确定捕获的照明辐射的测量值。样品保持件的相对于束路径的目前实际的定位方式(下文也称为实际位置)取决于这些测量值来确立。比较确立的实际的定位方式与预期的定位方式(下文也称为预期的位置)，并且产生修改实际的定位方式的控制命令，执行该控制命令引起样品保持件移动到预期的定位方式中。

本发明的核心在于，使用照明辐射的反射分量(反射)以关于样品保持件的相对角度位置和其关于束路径的距离对例如盖玻片的样品保持件进行调整。

例如，在盖玻片的上侧和下侧通常反射照明辐射的分量。在各种情况下，这些界面处的反射通常以近似3％的反射率发生。在此，照明辐射的反射分量通常实质上完整的位于检测器NA内。其结果是，可以将反射分量很大程度上成像在光学连接到检测物镜的检测器上。这个反射分量现在可以用于关于角度和距离对盖玻片的进行调整。

不需要在绝对项中建立实际的定位方式，例如以独立坐标系的坐标的形式。在方法的配置中，实际位置还可以是确立为关于束路径的相对位置关系的形式。

当样品保持件设想为预料的或期望的定位方式时达到预期的定位方式。可以确定预期的定位方式的可容许的公差。

提供照明辐射并且将该照明辐射指引到品保持件上作为单独射线(束)中的至少一个束。在此，在根据本发明的方法的各种配置中，照明辐射可以是具有自重构束或非衍射束的辐射，并且可以实施为例如高斯束、贝塞尔束、Mathieu束、sinc³束、晶格光片、相干贝塞尔束、分段贝塞尔束或艾里束的形式并且可以被指引到样品保持件上。

根据具有椭圆坐标的赫姆霍兹方程，Mathieu束可以被认为是传播不变的光场(Gutierrez-Vega，J.C.et al，2001：光学Mathieu束的实验演示(Experimentaldemonstration of optical Mathieu beams)；光学通信195：35-40)。

在方法的其它配置中，将形式为光片的照明辐射指引到样品保持件。在此，在方法的一个配置中，可以用与用于成像的照明辐射的波长不同的波长的照明辐射来产生光片。这有利地降低了图像质量的损害，并且可以通过用于产生光片的波长及其强度的目标选择来减少照明辐射在样品上的光漂白(bleaching)效应。

因此，可以使用不同的照明辐射，例如以便于执行根据本发明的方法的不同的分步骤。

在方法的有利配置中使用实施为倒置的显微镜的显微镜。倒置显微镜包括具有第一光轴的照明物镜，其中第一光轴穿透由X轴和正交于X轴的Y轴所跨越的样品平面。此外，具有第二光轴的检测物镜(实施为检测来自样品平面的光)出现，其中照明物镜和检测物镜关于彼此以及关于样品平面对准使得第一光轴和第二光轴在样品平面中交叉并且其间包含实质上的直角。第一光轴和第二光轴各自包含关于第三轴线不为零的角，该第三轴线在Z轴的方向上正交指向样品平面并且用作参考轴线。

上面指定的配置特别地适用于光片显微术。

在方法的可能的配置中，该方法包含两个步骤。下面，实际的相对位置和预期的相对位置指代检测器上(特别是检测器的检测表面上)的反射分量的图像的相对位置。

步骤1中，具有含有第一侧面和对照明辐射透明的第二侧面的基底的样品保持件在Z轴的方向上移位，直到由基底的第一侧面(例如，上侧)反射的照明辐射的分量被捕获。

样品保持件和检测器之间的相对位置关于彼此被修改，使得检测器上捕获的分量的实际的相对位置近似于预期的相对位置。预期的相对位置有利地在检测器表面上的中央，以便于很大程度上避免当调整预期的相对位置时反射分量的实际的相对位置在检测器表面的外面。

作为示例，基底可以是例如由玻璃或塑料制成的盘的基底。具有其第一和第二侧面的盖玻片是上述意义内的基底也是可能的。基底的材料对(多个)照明辐射的充足的透明度以及充当界面的第一侧面和第二侧面在此是十分重要的，在该第一侧面和第二侧面处可以实现照明辐射的折射和/或反射。

步骤2中，借助于确立实际的相对位置与预期的相对位置的角度偏离来检查第一侧面关于X轴的倾斜的存在。如果在此确定大于可容许角度偏离的角度偏离，样品保持件绕X轴旋转直到角度偏离最小化。可选地，可以确立优选的旋转方向来补偿倾斜，以便于例如通过最短旋转路径来补偿角度偏离。随后，检查Z轴方向上的预期的位置与实际的位置的偏离的发生。如果不容许的偏离发生，则重复步骤1并且可选地重复步骤2。在步骤2之后，样品保持件平行于X轴对准。

可选地，步骤3中，借助于样品保持件在Y轴方向上移位并且由检测器上捕获的反射分量的迁移确定与Y轴的方向的偏离，检查Y轴的方向上第一侧面的对准。如果发生捕获的反射分量的迁移，即实际的相对位置的迁移，则样品保持件绕X轴旋转直到不再发生迁移或直到迁移在可容许的公差限制内。

在方法的其它配置中，调整的样品保持件在Z轴的方向上从第一(预期的)定位方式移位，其中在该第一预期的相对位置捕获由第一侧面反射的分量，直到捕获的反射分量的图像达到第二预期的相对位置，其中捕获从基底的第二侧面(例如下侧)反射的分量。确立Z轴的方向上第一和第二侧面彼此之间的实际位置，这取决于Z轴的方向上行进在第一预期的相对位置和第二预期的相对位置之间的位移路径。所确立的距离因此对应于基底的厚度。

可以计算出距离或基底的厚度。下面在示例性实施例的上下文中指定计算可选项。

通过检测器，例如通过例如包括CCD或CMOS芯片的照相机或者通过四象限二极管，来捕获反射的分量。

常规的显微镜系统被认为是具有以下类型的实施例(倒置布置)或者具有样品平面上方布置的物镜的、反射光和透射光显微镜。

在方法的其它可能配置中，通过自动准直的望远镜将照明辐射指引到样品保持件上，并且取决于检测器上捕获的反射分量的实际的相对位置与检测器上捕获的反射分量的预期的相对位置的偏离，确立样品保持件的实际的定位方式(倾斜度)。

确立样品保持件的倾斜角取决于确立的偏离。如果确立的倾斜角大于倾斜角的可容许的公差，则修改样品保持件的实际的定位方式，以便借助于适合的控制命令的产生和执行将倾斜角设定在可容许的公差内。

方法的这个配置适合于倒置和正置的显微镜二者。

另外，准直的激光器的辐射可以作为照明辐射以平行于垂线的方式被指引到样品保持件上，并且发生的反射可以被镜面反射出并且被捕获。四象限二极管可以用作捕获目的。

方法的其它可能的配置的特征在于限定图像质量测量，(例如逐步地、迭代地)修改样品保持件的实际的定位方式，并且捕获图像质量测量的测量值或捕获的反射分量的测量值以分配到所选择的实际的定位方式中的每一个。

基于图像质量测量的测量值或捕获的反射分量的测量值各确立图像质量测量的目前值，并且选择期望的(例如最大或最大化的)图像质量测量出现的实际的定位方式。

选择的实际的定位方式可以设定为未来预期的定位方式。

例如，可以从样品保持件(和)/或照明辐射的束轮廓推导出图像质量测量的测量值或捕获的反射分量的测量值。这个配置适合于倒置的显微镜系统。

此外，照明辐射的反射可以用于确立样品保持件的形貌(特别是第一和/或第二侧面的形貌)的方法中，其中在样品保持件的至少三个点(下面还被称为测量点)处确立相对的高度值并且取决于确立的高度值确立样品保持件的实际的定位方式(倾斜度)。

由从样品保持件的表面上的测量点确定的相对高度确定形貌，该相对高度由相对高度值指定。作为示例，将相对高度指定为Z轴的方向上的坐标的形式。

通过各种变型可以确定形貌。

作为示例，干涉仪的使用是可能的。在此，通过(光纤)干涉仪将照明辐射指引到样品保持件上，并且取决于检测器上捕获的反射分量的实际的相对位置与检测器上捕获的反射分量的预期的相对位置的偏离，确立样品保持件的实际的定位方式。

此外，可以产生样品保持件的图像，并且在其它变型中在至少三个像点处可以确立至少一个图像质量测量的图像质量值。取决于图像质量值确立对应于三个像点的高度值。

还可以由三角测量确立形貌。为此，从彼此不同的至少两个观察点来捕获测量点。测量点是在样品保持件的表面上的待测量的点。确立相应的观察角，观察的测量点以该观察角离开相应的观察点，并且取决于观察点和关联的观察角确立测量点的实际的定位方式。取决于至少一个测量点的实际的定位方式确立样品保持件的实际的定位方式。测量至少三个测量点。

本发明涉及调整样品保持件的可选项，例如测量倾斜度并且校正盖玻片的倾斜度的可选项，特别是在SPIM的情况下。有利地，利用装备有检测物镜和照明物镜的倒置的显微镜，用于光片显微术的根据本发明的方法是可使用的，该检测物镜和照明物镜是彼此垂直的并且从下方穿过盖玻片以一角度各分别照明并且检测。

特别是在具有倒置的布置和倾斜的束路径的显微镜的情况下，倾斜度测量并且必要时倾斜度校正是不可缺少的，因为在非常小的倾斜度的情况下已经发生相当大的像差。

有利地，根据本发明的方法还可以用于具有(多个)束路径的垂直对准的显微镜。尽管在这样的常规布置中的像差更小，但是这些像差对于具有大数值孔径的现代物镜(特别是水浸没的物镜或TIRF(全内反射荧光显微术)物镜)的成像质量更加重要。

附图说明

下面基于示例性实施例和附图更详细地解释本发明。附图中：

图1a示出了根据现有技术具有样品平面上方以45°布置的照明物镜和检测物镜并且具有样品平面下方的宽场物镜的显微镜的示意图；

图1b示出了根据现有技术具有样品平面下方以45°布置的照明物镜和检测物镜并且具有样品平面上方的宽场物镜的显微镜的示意图；

图2示出了针对具有Alvarez板和弯月形透镜的实施用于光片显微术的显微镜的一个示例性实施例的示意图；

图3示出了倒置光片显微镜的一个示例性实施例的示意图；

图4示出了倒置的显微镜的样品保持件上的反射和孔径关系的示意性草图的示意图；

图5示出了样品中的光片的相对位置和检测器上光片的反射分量的像的示意图；

图6示出了照明辐射在样品保持件的上侧处的反射的示意图；

图7示出了检测器上照明辐射的反射分量的倾斜像的示意图；

图8示出了平行于Y轴调整样品保持件的原理的示意图；

图9示出了确定样品保持件的厚度的原理的示意图；

图10示出了通过干涉仪确立样品保持件的形貌的布置的示意图；

图11示出了通过三角测量确立样品保持件的形貌的布置的示意图。

具体实施方式

在现有技术的示例和本发明的示例性实施例的以下示意图中，相同的参考标记表示相同的元件。

从现有技术已知如图1a中示意性描绘的正置的显微镜1，其包括照明物镜2、检测物镜3和宽场物镜20。光片6通过照明物镜2沿着第一光轴A1来产生或者是可产生的，所述光片可用于检查布置在样品平面4中的样品5。检测物镜3具有第二光轴A2，沿着该第二光轴A2可以捕获来自样品平面4的光。第一光轴A1和第二光轴A2彼此正交对准，并且各自包含与用作参考平面的样品平面4成45°的角。

宽场物镜20具有第三光轴A3，该第三光轴正交地指向样品平面4并且用作参考轴线B。第一至第三光轴A1至A3相交在样品5中的光片6的范围的区域中。此外，第一光轴A1包含与参考轴线B的第一角α1，并且第二光轴A2包含与参考轴线B成90°-α1的第二角α2，例如分别为45°。

将样品5保持在样品保持件7中，该样品保持件7位于样品台11上并且用液体8填充。

图1b示意性示出了具有倒置布置的照明物镜2和检测物镜3的显微镜1，其中照明物镜2和检测物镜3布置在样品平面20的下方并且宽场物镜20布置在样品平面20的上方。再次，角α1和α2各为45°。

以下示例性实施例以基于倒置的显微镜1的示例性方式示出并且在其它实施例中还可以实施为正置的显微镜1。

图2示出了实施为用于光片显微术并且包括Alvarez板12和弯月形透镜10的倒置的显微镜1的示例性实施例。角α1和α2各为45°。Alvarez板12用于校正像差，该像差可能由于照明辐射BS穿过样品保持件7的基底的倾斜通道而发生。弯月形透镜10辅助照明辐射BS从空气到浸没介质18中再到液体8中的输送，以及辅助检测辐射DS从液体8到浸没介质18再到空气中的输送。

将样品保持件7保持在样品台11上。通过没有更详细地示出的驱动器，在由X轴X和Y轴Y跨越的XY平面中以控制的方式可调整样品台11自身。

通过在这种情况下实施为压电驱动器的物镜驱动器14，分别沿着第一光轴A1和沿着第二光轴A2以控制的方式可各自可调整照明物镜2和检测物镜3。

照明辐射BS由激光器模块15提供并且通过束成形单元16来成形。例如，束成形16例如是通过其将所提供的照明辐射BS准直的光学单元。

扫描仪17存在在束成形单元16的下游，通过所述扫描仪(XY扫描仪)在两个方向上以控制的方式可偏转成形的照明辐射BS。

在扫描仪的下游，照明物镜2布置在第一光轴A1上。由扫描仪17偏转的照明辐射BS到达照明物镜2，并且由该照明物镜2将该照明辐射BS成形和/或聚焦。

将检测辐射DS沿着第二光轴A2指引到检测器19上并且能够由所述检测器捕获。

出于致动样品台11、压电驱动器14、Alvarez板12、激光器模块15、束成形16、扫描仪17和/或检测器19的目的，存在控制单元13，所述控制单元以适合于数据传输的连接来联接到将要致动的元件。

在其它实施例中，控制单元13附加地配置为捕获、储存和/或评估测量值。显微镜1的其它元件和单元通过控制单元13可以是可致动的，和/或可以由此获得并且评估测量值。

出于说明目的，下面使用具有相互正交轴线的两个坐标系。第一坐标系是具有X轴X、Y轴Y和Z轴Z的整个布置的坐标系。理想地，样品保持件7(特别是其基底)与由X轴X和Y轴Y跨越的XY平面平行地对准。第二坐标系是具有X轴X、y轴y’和z轴z’的检测器19的坐标系。对例如从像平面BE到检测器19上的像进行的成像具有坐标X和y’。X轴X在两个坐标系中是相同的并且以正交方式指向附图绘图的平面。另外两个轴线Y和y’以及Z和z’分别可以通过绕X轴X旋转而彼此重叠。

以下的示例性实施例以示例性方式基于倒置的光片显微镜，其中照明物镜2的第一光轴A1包含关于参考轴线B成60°的角α1并且检测物镜3的第二光轴A2包含30°的角α2(图3)。为了改进说明的清楚性，没有在所有附图中示出可选的弯月形透镜10。此外，对于例如形式为盖玻片的样品保持件7或样品保持件7的基底，采用n＝1.52的折射率，并且对于水为浸没介质18，采用n＝1.33的折射率。

图4中，将数值孔径NA1、NA2分别示出作为照明物镜2和检测物镜3的孔径角。照明物镜2具有0.45的数值孔径NA1，而检测物镜3具有1.0的数值孔径NA2。为了清楚起见，示意图并不是按照真实尺寸。

参考轴线B以0°角延伸。第一光轴A1以-60°角α1延伸。第一数值孔径NA1跨越从-40°到-80°的锥体。第二光轴A2以30°角α2延伸。第二数值孔径NA2跨越从-19°到79°的锥体。

样品保持件7的材料对照明辐射BS是透明的。在浸没介质18和样品保持件7之间的界面处以及在样品保持件7和样品5之间的界面处反射照明辐射的分量BSref。在各种情况下，反射率近似为3％。由照明辐射的反射分量BSref形成的照明锥达到从40°到80°并且实质上完整地位于检测物镜3的第二数值孔径NA2内。这使得可以实质上完整地将照明辐射的反射分量BSref(＝反射BSref)成像在检测器19上(参见图2、3和5)。反射BSref可以用于进行样品保持件7的实际的定位方式，并且根据确立的目前的实际的定位方式进行样品保持件7的调整。

为了阐明反射BSref从整个布置的坐标系变换到检测器19的坐标系中，图5示意性示出了例如盖玻片的样品保持件7的轮廓。光片6已经形成在样品保持件7中。以它的横截面，光片6入射在作为样品保持件7的第一侧面OS的上侧上，在该处，光片6的分量(即照明辐射3的分量)被反射并且作为反射BSref穿过作为样品保持件7的第二侧面US的下侧转向到检测器19的检测器表面19.1上，并且在那里成像为光片横截面的图像60。

图5中，以俯视图示出检测器表面19.1，而以侧视图示出样品保持件7和光片6。从相对于彼此旋转的这些视图得出检测器19具有轴线X、y’、z’的坐标系的说明的取向。

基于图6至9描绘了根据本发明的方法的实施例和可能的配置。

图6中示出照明辐射BS和检测辐射DS的示例性束路径。将照明辐射BS以与垂线成60°的角沿着第一光轴A1指引到样品保持件7的下侧US上。当照明辐射BS穿过由下侧US形成的、在具有折射率n＝1.33的空气和具有折射率n＝1.52的样品保持件7的材料之间的界面时，照明辐射BS朝向垂线折射并且以48°的角行进到样品保持件7的上侧OS。

在像平面BE中第一侧面OS处将照明辐射的分量BSref反射回第二侧面US(还参见图5)。当照明辐射的反射分量BSref穿过第二侧面US时，该反射分量BSref再次远离垂线折射并且作为检测辐射DS沿着第二光轴A2到达例如检测器19(未示出)。

为了调整样品保持件7，步骤1中样品保持件7在Z轴(Z)的方向上移位，直到在所示出的示例性实施例中从上侧、从第一侧面OS反射的照明辐射的分量BSref被捕获。在此，作出假设的是，将像平面BE固定。将样品保持件7和检测器19相对于彼此的相对位置改变，使得照明辐射的分量BSref的实际的相对位置(捕获为图像60)接近检测器19的检测器表面19.1上图像60的预期的相对位置(图7)。

当光片6的横截面的图像60中心地位于检测器表面19.1上时，优化调整样品保持件7在Z轴Z的方向上的实际位置。

因为存在从盖玻片的第一侧面OS和第二侧面US二者的反射BSref，所以能够区别这两者是必要的。如果样品保持件7在沿着Z轴Z的正方向(图6中朝上)上移动，则可以首先将第一侧面OS处的反射BSref中心地定位于检测器表面19.1上。可以在沿着Z轴Z的正方向上的其它位移的情况下，仅中心地调整由第二侧面US引起的反射BSref。

如果中心地调整光片7的横截面，则图像60在检测器表面19上中心成像地出现，如图7示意性示出。

步骤2中，借助于确立实际的相对位置与预期的相对位置的角度偏离来检查第一侧面关于Y轴的倾斜的存在。图7中，通过检测器表面19.1上方的水平延伸的点划线以示例性方式示出预期的相对位置。当达到预期的相对位置时，图像60的纵向轴线应该与水平的点划线完全重合或几乎重合。在图7所示的示例中，图像60的纵向轴线关于预期的相对位置倾斜了角β。图像60的目前的实际的相对位置偏离于预期的相对位置。

如果确定角度偏离大于可容许角度偏离，样品保持件7绕Y轴Y旋转直到角度β最小化。

随后，执行检查是否发生Z轴Z的方向上预期的位置与实际的位置的偏离。如果存在Z轴Z方向上的实际的位置的不允许的偏差(例如由于角度偏差的校正)，则重复上文描述的第一步骤1。样品现在平行于X轴。

在可选的步骤3中，样品保持件7，特别是第一侧面OS附加地还与Y轴Y平行对准。为此，将样品保持件7沿着Y轴Y移位，如图8中示意性所示出。如果样品保持件7，特别是第一侧面OS不与Y轴Y平行对准，则存在光片横截面的图像60在检测器表面19.1的y’方向上的位移。

图8用实线示出了目前的实际位置中的样品保持件7和检测器表面19.1上的相关图像60。图8由虚线加框示出了虚拟(virtually)移位的样品保持件7’的实际位置和虚拟移位的样品保持件7’的光片横截面的相关虚拟图像60’。同样的应用到照明辐射BS和照明辐射的反射分量BSref对应的相关束路径。

在位移过程期间，第一光轴A1保持固定。因此，移位的样品保持件7’的第一侧面OS在Z轴Z的方向上偏移了一定量，这是为什么移位的样品保持件7’的图像60’以y’轴y’的方向上的偏移入射在检测器表面19.1上。

借助于将样品保持件7在Y轴Y的方向上移位来检查第一侧面OS在Y轴Y的方向上的对准。如果与Y轴Y的方向的偏离由检测器19上(特别是在检测器表面19.1上)的捕获的反射分量BSref的迁移来确定，则通过样品台11的控制的驱动器绕X轴X旋转样品保持件7，例如直到迁移不再发生或迁移发生在可容许的公差限制内。

通过绕X轴X倾斜样品保持件7，现在将其对准使得在其在Y轴Y方向上位移期间光片横截面的图像60的迁移不再发生在y’轴y’的方向上。

上文所述的对样品保持件7的调整可以通过确定例如样品保持件7的基底的厚度d来补充。下面，为了简化起见，参考样品保持件7的基底的厚度d或者用作样品保持件7的盖玻片的厚度d。

在照明辐射BS穿过样品保持件7的倾斜通道期间发生的像差取决于样品保持件7的厚度d。为此，例如将Alvarez板12(图2)可移位地安装在照明物镜2和/或检测物镜3中，以便于通过相对于彼此移位Alvarez板12将像差校正与厚度d匹配。

可以基于来自第一和第二侧面OS、US的反射BSref来确定样品保持件7的厚度d。图9中示意性示出两个反射BSref，其中d是盖玻片的厚度并且d’是盖玻片在沿着Z轴Z的正方向上的位移。

如下确定厚度d：

首先，设定样品保持件7使得来自第一侧面OS的反射BSref位于例如如图像60一样中心地在检测器表面19.1上(参见图5、7、8)的预期的相对位置中，并且样品保持件7没有倾斜度。在示例中，照明辐射BS和参考轴线B之间的角为48°。参考轴线B延伸穿过像平面BE并且穿过照明辐射BS在第一侧面OS上的入射点(以简化方式所示的)。在Y轴Y的方向上，Δy表示照明辐射BS通过第二侧面US的经过点和第一侧面OS上的入射点之间的路径。

然后，样品保持件7在沿着Z轴Z的正方向上移位，直到来自第二侧面US的反射Bsref位于如图像60一样在检测器表面19.1上的预期的相对位置。为此所需的位移路径d’被确立，例如被测量或计算出。示例中照明辐射BS和参考轴线B之间的角现在是60°。

可以通过以下三角函数关系和示例中指定的角计算出厚度d：

tan(60°)＝Δy/d’

tan(48°)＝Δy/d

其中Δy表示在X轴X的方向上所测量的、照明辐射BS的通道和参考轴线B之间的路径。

厚度d由d’×tan(60°)/tan(48°)计算出。

在方法的其它配置中，可以存在倾斜的附加或替代校正，其借助于以不用于成像的波长(例如在红外光的范围中)来产生光片6。该光片6可以永久地或在某些时候(例如在实验期间)用于检查样品保持件7的实际位置(特别是在Z轴Z方向上样品保持件7的实际位置)，并且该光片6可选地用于在实验期间校正所述实际位置。还可以使用束(例如高斯束、贝塞尔束或Mathieu束)来代替光片6。四象限二极管可以用作检测器19。

在其它可能的配置中，可以将自动准直的望远镜指引到样品保持件7上。将样品保持件7的倾斜位置变换为自动准直的望远镜的检测器19上的反射BSref的位移。仅可以使用该方法调整倾斜角。

其它可能的配置需要准直的激光，将其指引到样品保持件7上。将激光平行于垂线(例如参考轴线B)对准。作为示例，将反射BSref通过分束器或极光学单元反射出并且将其记录在四象限二极管上。现在，可以借助于四象限二极管的信号设定并且校正样品保持件7的倾斜度。使用该配置设定Z轴Z的方向上的实际位置是不可能的。两个前述的方法适合于常规的显微镜系统和光片显微镜。

另外，在方法的其它配置中附加地采取根据的图像质量测量的评估是可能的。因此，例如，可以反复地调整检测物镜3的倾斜度和/或聚焦位置，以便将所选择的图像质量测量的测量值带到期望的测量值或者以便最大化所述测量值。为此，可以使用自身将要测量的样品5，或者分析所选择的照明辐射BS的束的束轮廓。

无论如何，可能的是，要迭代检查的参数空间太大或者系统不能朝着全局最小值(例如样品保持件7的最优倾斜度和最优聚焦位置)进行迭代优化并且保持在替代的局部最小值。因此，如果图像质量评估的方法以与该方法的上述配置中的一个的组合来执行，则是有利的。在此，通过如上所描述的方法中的一个，最初近似地设定样品保持件7的倾斜度和Z轴Z的方向上的实际位置。随后，通过图像质量评估来执行精细的调整。该方法不适用于常规的显微镜系统。

图10和11示意性示出了通过其可以捕获样品保持件7的形貌的布置的示例性实施例。

为了捕获形貌，该形貌对应于相应的测量点Pn处的样品保持件7的相对高度，在样品保持件7的区域上至少三个测量电Pn处捕获该形貌。将相对高度捕获作为相对高度值。基于所捕获的相对高度值可以确立样品保持件7的倾斜度。

可以通过作为示例实施为光纤干涉仪的干涉仪21确立形貌。图10中以更加简化的方式示出了适当的布置。在倒置布置的显微镜1中，样品保持件7位于样品台11上。将干涉仪21的光导纤维21.1指引在样品保持件7的基底的上侧OS的测量点Pn处。将辐射通过光纤21.1穿过光纤出射表面21.2指引或可指引到测量点Pn上。在样品保持件7处发生的反射以及光纤出射表面21.1二者出现在玻璃/空气-变换处并且是可比较的，因此获得或者可以获得具有高调制深度的干涉信号。

在其它实施例中，可以将光纤21.1在物镜2、3之间带至样品保持件7或者关于物镜横向偏移。

测量的测量点Pn中的至少一个可以位于显微镜1的视场中，以便于捕获局部盖玻片倾斜度。在形貌测量之后，干涉仪21还可以定位在其它位置，通过用驱动器的方式可以移动的样品台11，可以将样品保持件7移位到根据图10的观察位置中。

还可以用并行方式使用光纤干涉仪，即多个光纤21.1并行地布置并且操作使得可以同时测量样品保持件7的更大区域。

在倒置布置的情况下，还可以使用常规的宽场干涉仪。

形貌测量方法适合于常规的显微镜系统和光片显微镜。

在其它可能的实施例中，通过在至少三个点处测量支持的样品5的锐度或另一个图像质量标准并且通过适当地调整物镜2、3中的至少一个与样品5的距离，来确定样品5的形貌，并且由此计算出局部盖玻片的倾斜度。

在其它可能的配置中，位于样品保持件7上的纳米颗粒(所谓的基准点)或者施加到样品保持件7的标记可以充当样品5。

该方法，也称为锐度测量，适合于常规显微镜系统和光片显微镜二者。

基于图11解释测量形貌的其它方法，其中示意性示出了通过三角测量确立样品保持件的形貌的布置。

为了执行三角测量，通过激光器模块15的激光辐射照明测量点Pn，并且从至少两个相互不同的观察点OP(即从至少两个不同方向)把该测量点作为目标。确立观察角，以该观察角从某一观察点OP把相应的测量点Pn作为目标。

图11中，检测器19的检测器表面19.1上的点以示例性方式表示为观察点OP，将关联的测量点Pn通过成像光学单元9成像在该检测器19的检测器表面19.1上。

因为，观察点OP的相对位置已知并且确立了观察角，可以取决于观察点OP和关联的观察角确立测量点Pn在二维和/或三维上的实际定位方式的坐标。在其它步骤中，取决于测量点Pn的实际的定位方式，通过控制单元13确立样品保持件7的实际的定位方式。

对于所示出的测量用于确定沿轴线的倾斜的形貌的情况，在此只有测量点Pn的z坐标是重要的，因此具有含两个测量点Pn的干涉仪21的布置就足够了，该两个测量点Pn在垂直于样品平面4的平面中对准。

如果预期在空间中确立样品保持件7的相对位置，则需要三个测量点Pn。

该方法适合于常规的显微镜系统和光片显微镜二者。

附图标记

1 显微镜

2 照明物镜

3 检测物镜

4 样品平面

5 样品

6 光片

60 图像(光片横截面的成像/图像)

60’ (在移位的样品保持件7’的情况下光片横截面的)图像

BS 照明辐射

BSref (照明辐射BS的)反射分量

DS 检测辐射

BE 像平面

7 样品保持件

7’ 虚拟移位的样品保持件7

8 液体

9 成像光学系统

B 参考轴线

10 弯月形透镜

11 样品台

12 Alvarez板

13 控制单元

14 物镜驱动器

15 激光器模块

16 束成形

17 XY-扫描仪

18 浸没介质

19 检测器

19.1 检测器表面

20 宽场物镜

21 干涉仪

21.1 光纤

21.2 光纤出射表面

NA1 (照明物镜2的)数值孔径

NA2 (检测物镜3的)数值孔径

A1 第一光轴

A2 第二光轴

A3 第三光轴

α1 角(第一光轴A1和第三光轴A3之间)

α2 角(第二光轴A1和第三光轴A3之间)

d 距离、厚度

d’ 位移路径

OS 第一侧面、上侧

US 第二侧面、下侧

Pn 第n个测量点

角β 实际的相对位置和预期的相对位置之间的角

OP 观察点

Δy (Y轴Y的方向上的)路径

Claims (17)

1.一种方法，用于在显微镜(1)的束路径中调整样品保持件(7)，

其中将照明辐射(BS)中的至少一个束指引到所述样品保持件(7)上，

通过检测器(19)捕获由所述样品保持件(7)反射的所述照明辐射的分量(BSref)并且确定捕获的照明辐射(BSref)的测量值；

取决于所述测量值确立所述样品保持件(7)关于所述束路径的目前的实际的定位方式，

将确立的实际的定位方式与预期的定位方式比较，并且

产生用于修改所述实际的定位方式的控制命令，所述控制命令的执行引起所述样品保持件(7)移动到所述预期的定位方式中。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述照明辐射(BS)以光片(6)的形式指引到所述样品保持件(7)上。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述照明辐射(BS)是具有自重构射线的辐射。

4.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于，所述照明辐射(BS)以高斯束、贝塞尔束、相干贝塞尔束、分段贝塞尔束、sinc³束、晶格光片、艾里束或Mathieu束的形式被指引到所述样品保持件(7)上。

5.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于，以与用于成像的照明辐射(BS)的波长不同的波长的照明辐射(BS)来产生所述光片(6)。

6.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于，

使用实施为倒置的显微镜(1)的显微镜(1)，该显微镜包括：

具有第一光轴(A1)的照明物镜(2)和具有第二光轴(A2)的检测物镜(3)，其中所述第一光轴(A1)与由X轴(X)和正交于所述X轴(X)的Y轴(Y)所跨越的样品平面(4)相交，并且所述检测物镜(3)实施为检测来自所述样品平面(4)的光，

其中

所述照明物镜(2)和所述检测物镜(3)关于彼此并且关于所述样品平面(4)对准，使得所述第一光轴(A1)和所述第二光轴(A2)在所述样品平面(4)中相交并且包含其间的实质的直角，并且

所述第一光轴(A1)和所述第二光轴(A2)各包含与第三轴线(A3)成不同于零的角，所述第三轴线(A3)在Z轴(Z)的方向上正交地指向所述样品平面(4)并且用作参考轴线(B)。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，

使用实施为倒置显微镜(1)的显微镜(1)，所述显微镜(1)包括：

具有第一光轴(A1)的照明物镜(2)和具有第二光轴(A2)的检测物镜(3)，其中所述照明物镜(2)实施为通过所述照明辐射(BS)产生光片(6)，其中至少部分地在由X轴(X)和正交于所述X轴(X)的Y轴(Y)所跨越的样品平面(4)中产生或可产生所述光片(6)，并且所述检测物镜(3)实施为检测来自所述样品平面(4)的光，

其中

所述照明物镜(2)和所述检测物镜(3)关于彼此并且关于所述样品平面(4)对准，使得所述第一光轴(A1)和所述第二光轴(A2)在所述样品平面(4)中相交并且包含其间的实质的直角，并且

所述第一光轴(A1)和所述第二光轴(A2)各包含与第三轴线(A3)成不同于零的角，所述第三轴线(A3)在Z轴(Z)的方向上正交地指向所述样品平面(4)并且用作参考轴线(B)。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，

在步骤1中，

所述样品保持件(7)具有对所述照明辐射(BS)透明、包含第一侧面(OS)和第二侧面(US)的基底，将所述样品保持件(7)在所述Z轴(Z)的方向上移位，直到由所述基底的第一侧面(OS)反射的照明辐射的分量(BSref)被捕获，并且修改所述样品保持件(7)和所述检测器(19)关于彼此的相对位置使得捕获的分量(BSref)的实际的相对位置接近所述检测器(19)上的预期的相对位置。

步骤2中，

借助于确立实际的相对位置与预期的相对位置的角度偏离来检查所述基底的第一侧面(OS)关于所述Y轴(Y)的倾斜的存在，

如果确定角度偏离大于可容许的角度偏离，则绕所述Y轴(Y)旋转所述样品保持件(7)直到所述角度偏离最小化，并且

检查在所述Z轴(Z)的方向上预期的位置与实际的位置的偏离的发生，并且如果不容许的偏差发生则重复第一步骤1。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，

步骤3中，

借助于将所述样品保持件(7)在所述Y轴(Y)的方向上移位且由所述检测器(19)上所述捕获的反射分量(BSref)的迁移确定与所述Y轴(Y)的方向的偏离，来检查所述第一侧面(OS)在所述Y轴(Y)的方向上的对准，并且

如果迁移发生，则所述样品保持件(7)绕所述X轴(X)旋转直到不再发生迁移。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，

将调整的样品保持件(7)从实际位置沿着位移路径(d’)在所述Z轴(Z)的方向上移位，其中在预期的相对位置，由所述检测器(19)捕获从所述第一侧面(OS)或从所述第二侧面(US)反射的分量(BSref)，直到在所述预期的相对位置捕获相应另一侧面(OS、US)的反射分量(BSref)，并且

取决于在所述Z轴(Z)的方向上的横向位移路径(d’)，确立在所述Z轴(Z)的方向上第一和第二侧面(OS、US)之间的距离(d)。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过自动准直的望远镜将所述照明辐射(BS)指引到所述样品保持件(7)上，并且取决于所述检测器(19)上所述捕获的反射分量(BSref)的实际的相对位置与所述检测器(19)上的所述捕获的照明辐射的反射分量(BSref)的预期的相对位置的偏离，确立所述样品保持件(7)的实际的定位方式。

12.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其特征在于，

限定图像质量测量，

修改所述样品保持件(7)的实际的定位方式，

捕获所述图像质量测量的测量值或所述捕获的照明辐射的反射分量(BSref)的测量值，以分配到所选择的实际的定位方式中的每一个，

基于所述图像质量测量的测量值或所述捕获的照明辐射的反射分量(BSref)的测量值，各确立图像质量测量的目前值，并且

选择实际的定位方式，其中存在期望的图像质量测量。

13.根据前一权利要求所述的方法，其特征在于，所述图像质量测量的测量值或者所述捕获的照明辐射的反射分量(BSref)的测量值从所述样品保持件(7)和/或所述照明辐射(BS)的束轮廓来推导。

14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，借助于在所述样品保持件(7)在所述侧面(OS、US)中至少一个上的至少三个点处确立相对高度值，确立所述样品保持件(7)的形貌，并且取决于确立的高度值确立所述样品保持件(7)的实际的定位方式。

15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过干涉仪(22)将所述照明辐射(BS)指引到所述样品保持件(7)上，并且取决于所述检测器(19)上所述捕获的照明辐射的反射分量(BSref)的实际的相对位置与所述检测器(19)上的所述捕获的照明辐射的反射分量(BSref)的预期的相对位置的偏离，确立所述样品保持件(7)的实际的定位方式。

16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

产生所述样品(5)的图像，

在至少三个测量点(Pn)处确立至少一个图像质量测量的图像质量值，并且

取决于所述图像质量值确立与所述三个测量点(Pn)对应的高度值。

17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

从彼此不同的至少两个观察点(OP)捕获至少一个测量点(Pn)，

确立相应的观察角，以所述相应的观察角，观察的测量点(Pn)离开相应的观察点(OP)。

取决于所述观察点(OP)和关联的观察角，确立所述测量点(Pn)的实际的定位方式，并且

取决于所述至少一个测量点(Pn)的实际的定位方式，确立所述样品保持件(7)的实际的定位方式。