CN105359025A - 用于光片显微技术的设备 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于光片显微技术的设备。这种设备包括用于容纳位于介质(2)中的样本(3)的样本容器(1)。样本容器(1)相对于平面形参照面被对齐。该设备还包括具有照明物镜(6)的照明光学系统，用于以光片照明样本(3)，其中，照明物镜(6)的光学轴线(7)与光片位于这样的平面中，该平面与参照面的法线围成不等于0的照明角度(β)，以及具有检测物镜(8)的检测光学系统，检测物镜(8)的光学轴线(9)与参照面的法线围成不等于0的检测角度(δ)。在这种设备中设有包括一个或多个厚度预定且材料预定的层的分离层系统，用于将样本(3)位于其中的介质(2)与照明物镜(6)和检测物镜(8)空间分离，其中，该分离层系统以平行于参照面的边界面(11)至少在对于照明物镜(6)和检测物镜(8)为照明和探测可到达的区域中接触介质(2)。在此，照明角度(β)和检测角度(δ)是借助检测物镜(8)或照明物镜(6)的数值孔径(NA_D，NA_B)来预先给定的。

Description

用于光片显微技术的设备

本发明涉及一种用于光片显微技术的设备。这种设备包括用于容纳位于介质中的样本的样本容器，其中，样本容器相对于平面形参照面被对齐。该设备还包括具有照明物镜的照明光学系统，用于以光片照明样本，其中，照明物镜的光学轴线与光片位于这样的平面中，该平面与参照面的法线围成不等于0的照明角度β。该设备还包括具有检测物镜的检测光学系统，检测物镜的光学轴线与参照面的法线围成不等于0的检测角度δ。照明物镜和检测物镜在此也可以构建为所谓的双物镜，如例如在EP0866993B1中所描述的那样。两个物镜于是综合在共同的结构单元中，于是，各个光学系统，即物镜及其所属的光路和位于其中的光学元件，共享一些元件。

这种设备尤其在检查生物样本时使用，在该检查中，以光片照明样本，光片的平面与检测的光轴线以不等于0的角度相交。通常在此，光片与通常为检测物镜的光轴线的检测方向围成直角。借助该也称作SPIM(SelectivePlaneIlluminationMicroscopy选择性平面照明显微镜)的技术可以在较短时间中也建立较厚样本的空间记录。基于光学剖切结合在垂直于剖面的方向上的相对运动，可以以图像方式、空间延展地示出样本。

SPIM技术优选用于荧光显微镜，在那里该技术也称作LSFM(LightSheetFluorescenceMicroscopy光片荧光显微镜)。相对于诸如共焦激光扫描显微镜或二光子显微镜的其它已知方法而言，LSFM技术具有多个优点：因为检测可以在宽视场中进行，所以可以采集更大的样本区域。虽然分辨率比共焦激光扫描显微镜小一些，但是用LSFM技术还可以分析更厚的样本，因为进入深度更大。此外，在该方法中，样本的光负荷是最小的，这尤其降低了使样本褪色的风险，因为样本仅通过与检测方向成不为0的角度的薄光片被照射。

在此，不仅能使用例如借助圆柱透镜产生的静态光片，还能使用准静态光片。该准静态光片可以通过用于光束迅速扫描样本的方式来产生。通过使光束经历相对于待观察样本的极为快速的相对运动以及在此时间上相继地多次连续进行，形成了光片状的照明。在此，将其上的传感器最终成像样本的相机的积分时间(Integrationszeit)选择为使得扫描在积分之间内完成。替代具有2D阵列的相机，还可以使用结合检测光学系统中的重新扫描(Rescan)的阵列传感器。该检测还可以共焦地进行。

SPIM技术如今在文献中被多次描述，例如在DE10257423A1和基于其的WO2004/053558A1中或者在概览性文章“SelectivePlaneIlluminationMicroscopyTechniquesinDevelopmentalBiology发育生物学中的选择性平面照明显微镜技术”，J.Huisken等著，发表于2009年，杂志Development，136卷，1963页中。

光片显微镜的主要应用之一在于成像平均尺寸的、大小为100μm至数毫米的有机体。通常，这些有机体嵌入在琼脂糖凝胶中，其又位于玻璃毛细管中。玻璃毛细管被从上方或下方引入到装有水的样本室中，并且将样本从毛细管中挤出一段。用光片照明琼脂糖中的样本，并且用垂直于光片和由此也垂直于光片光学系统的检测物镜将荧光在照相上成像。光片显微镜的该方法具有三个大不利。首先，待检查的样本比较大，它源自发育生物学。此外，由于样本准备和样本室的尺寸，光片较厚并且由此限制了可达到的轴向分辨率。再者，样本准备是麻烦的，与在荧光显微镜用于检查单个细胞时常用的标准样本准备和标准样本保持也不兼容。

为了能够至少部分地避开这些限制，近年来实现了SPIM结构，其中照明物镜和检测物镜相互垂直，并且分别以45°的角度从上方指向样本。如果例如将样本保持部位于其上的桌面或者另一水平面看做参照面，则照明角度β和检测角度δ分别为45°。这种结构例如在WO2012/110488A2和在WO2012/122027A2中被描述。

样本在这种结构中例如位于皮氏培养皿的底板上。该皮氏培养皿装有水，照明物镜和检测物镜浸泡在该液体中，水也承担了浸没液体的功能。该方法提供了在轴向上较高分辨率的优点，因为可以产生更薄的光片。由于该更高的分辨率，于是可以检查更小的样本。样本准备也变得简单很多。然而，样本准备和样本保持还是非标准的，该标准如在荧光显微学在单个细胞情况下如今适用。于是皮氏培养皿必须较大，以便将两个物镜都浸泡在该培养皿中，而不撞到培养皿的边缘。微量滴定板，也称作多孔板是在生物学很多领域中的标准并且恰也在对单个细胞的荧光显微学分析中使用，微量滴定板在所述方法中无法使用，因为物镜不能以被浸到格栅状布置在板上的很小的凹处中。另一缺点在于，用该构造难以短时内分析多个样本(高通量筛选技术)，因为物镜在样本变更时必须被清洁，以避免不同样本间的污染。

本发明的任务在于改进开头所述类型的用于光片显微技术的设备，使得尤其简化对大量样本的分析，方法是，在两个样本间更换时有效避免交叉污染。

该任务在开头描述类型的用于光片显微技术的设备中这样解决，即，该设备包括具有一个或多个厚度预定且材料预定的层的分离层系统，用于将样本位于其中的介质与照明物镜和检测物镜空间分离。在此，该分离层系统以平行于参照面的边界面至少在对于照明物镜和检测物镜为照明样本和检测来自样本的光而可到达的区域中与介质接触，完全地或至少几乎完全地接触。照明角度β和检测角度δ在此是借助检测物镜的数值孔径NA_D和照明物镜的NA_B预先给定的。该预先给定在此在如下意义下进行，即，部件相对于彼此布置为使得在无需其它措施的条件下将所存在的像差最小化。当然，若容忍较大的像差还可以设置其它角度，而成像质量将下降。

在最简单的情况下，分离层系统还可以仅由唯一的层构成，则该层也可是空气层，其中，照明物镜和检测物镜构建为干燥物镜。然而分离层系统还可以包括多个层，例如玻璃或塑料层，其作为薄膜或板将样本容器相对于两个物镜遮盖。在该玻璃或塑料层与物镜之间于是存在空气层或者具有浸没液体的层，两个物镜与其接触。然而分离层系统还可以由唯一的流体层构成，只要确保了该流体层不与样本位于其中的介质混合。该流体于是同样可以用作浸没介质。

通过引入分离层系统，虽然可以有效地避免污染，但是由于照明和检测光是穿过分离层系统的边界面到达样本位于其中的介质的，所以在为0.3的低数值孔径的情况下就会出现极端的成像误差如球面像差和慧差(Koma)。通过倾斜地穿过，增加了另外的不对称像差，或者其它像差增强。为了将这些像差最小化，因此借助检测物镜或照明物镜的数值孔径NA_D、NA_B预先给定照明角度β和检测角度δ。在此，以比检测物镜更大的角度布置具有较低数值孔径的、通常为照明物镜的物镜。检测物镜很少会有比照明物镜更大的数值孔径。也常使用对称的配置，其中将照明物镜和检测物镜相同地构造并且两个物镜与法线围成相同的角度。理想的是，照明角度β和检测角度δ之和总为90°。如果与此不同，例如两个物镜可能以更小的角度布置，则该和小于90°，于是由于物面相对于检测物镜的光学轴线倾斜而必须注意满足Scheimpflug条件，即相机的图像传感器于是同样必须相应地倾斜。也可以考虑其中如开头提到的双物镜那样将照明和检测物镜综合在一个光学模块中的布置。

如果该类型的、可以用标准物镜进行的将像差简单地最小化显得不足够，则其他进一步降低或完全排除像差的措施也是可能的。

在本发明的一个优选构型中，因此照明光学系统和/或检测光学系统包括用于将像差、特别是由于照明光和/或待测光倾斜穿过分离层系统的边界面而形成的像差减小的校正装置。

在一个优选构型中，因此校正装置包括在照明物镜或者检测物镜中的校正透镜和/或校正元件。校正透镜例如可以构建为圆柱透镜、相对于相应的光学轴线倾斜的透镜或者非轴向布置的透镜，其对称轴于是并不位于照明或检测物镜的光学轴线上。校正元件例如可以构建为具有非球形表面或者自由形状表面的元件。可以在一个物镜中组合一个类型或不同类型的不同的校正透镜/校正元件。

对于每个分离层系统，于是可以根据分离层系统的材料组成和厚度来生成自己的照明和检测物镜组，其却涉及高成本开销，因为必须实现多个组，还涉及提高的工作开销，其是在更换分离层系统时更换物镜而造成的。

在一个替选构型中，校正装置因此具有布置在照明光路和/或检测光路中的、用于操纵照明和/或检测光的相位波前的适配光学元件。该适配光学元件例如可以构建为可变形镜、相位板或者空间光调制器。这些元件优选可以配置为可控制的，从而可以用照明和检测物镜的同一布置实现适配于多个可能的分离层系统。

这两个替选方案的组合在如下意义下也是可能的，即，例如通过固定安装的校正透镜实现对最常用的分离层系统或者可能还对于(如在标准玻璃和厚度的显微镜物镜中常出现的那样)垂直透射情况下的球面像差实现主要的基础校正，并且借助光路中的适配光学元件进行个别的、适配于相应的分离层系统的精细校正。

分离层系统优选如已经提及那样包括封闭样本容器的、由材料预定并且厚度预定的、板状或薄膜状的盖部。该板状或薄膜状的盖部的第一大表面在此与样本位于其中的介质至少在对于照明物镜和检测物镜为照明和检测可到达的区域中几乎完全接触。该盖部的第二大表面优选与作为分离层系统的其它部件的例如为空气的气体或者浸没介质至少在对于照明物镜和检测物镜为照明和检测可到达的区域中接触。对于所提及的在照明物镜中或光路中的校正装置替选或补充地，也可以相应地匹配分离层系统，以便减小像差。在相应地适配分离层系统时，也可能尤其在很大程度上省去校正物镜，或者不用那么强地进行这些校正。

在本发明的一个优选构型中，盖部的材料因此具有这样的折射率，该折射率与样本位于其中的介质的折射率相差小于5％。如果两种材料具有相同的折射率，则可以完全避免在介质与盖部之间的边界面上的像差。当将在波长λ_d＝578.56nm折射率为n_d＝1.33水用作样本位于其中的介质时，则适于作为盖部的材料的例如是PTFE(聚四氟乙烯，n_d＝1.35)、(n_d＝1.34)或者FEP(全氟乙丙烯，n_d＝1.34)。全氟二氧戊环聚合物也可以使用，其折射率同样通常位于1.33与1.36之间。还有一种特别合适的材料是AF，其通常具有n_d＝1.32的折射率。这种材料是无定形聚合物，在此，可以将玻璃化转变温度调节为使得该聚合在冷却状态下具有样本位于其中的介质的折射率。其它具有可调节的玻璃化转变温度的无定形聚合物当然也可以使用。

如果折射率并不精确一致，则还会出现像差，虽然程度减小。为了进一步避免该像差，则分离层/盖部应选择得尽可能薄，并且不会厚于几百微米。如果盖部同时用作样本容器的底板，如在倒置布置时那样，或者在躺卧的观察布置中用作侧壁，则当然还需要注意相对于由样本位于其中的介质所施加的压力的足够稳定性。这一点在对于直立观察而言盖部作为样本容器的顶板的情况下不必要，在此材料可以更薄许多地成形，厚度小于100微米。

在本发明的另一构型中，盖部的材料是纳米结构化材料，其由第一和第二组分组成，其中，第一组分的折射率小于而第二组分的折射率大于用于容纳样本的介质的折射率。在相应地将带有第一组分的份额的第二组分纳米结构化的情况下，或者在有合适的材料的情况下也仅通过两种材料按份额的混合才能制造出具有在已提及的、与用于容纳样本的介质的折射率相差5％以下的范围中的有效折射率的材料。在此，在纳米结构化中有前提条件，即，由第一组分的材料制成的区域的平均结构尺寸具有比用于照明的和待被检测的光的波长小的直径，因为只有这样才能设置在与例如为水的介质的折射率相差5％以下的范围中的有效折射率。在此，例如可以使用不同的聚合物，充分利用它们的混合特性或离析特性(如果这些材料不混合的话)，或者也可以使用纳米多孔的二氧化硅。在后一情况下，第一组分是空气，而第二种组分是二氧化硅。这样纳米结构化的材料例如在文章“Opticalthin-filmmaterialswithlowrefractiveindexforbroadbandeliminationofFresnelreflection用于宽带地消除菲尼尔反射的具有低折射率的光学薄膜材料”，J.-O.Xi等著，发表于2007年NaturePhotonics，第1卷第176-179页中，结合抗反射层的制造进行过描述。在此也应将盖部的厚度选为尽可能薄，在此适用上面描述过的那样的边界条件。

包括盖部在内的分离层系统例如可以包括用于常见的微量滴定板的容器顶板，在此于是可以使用光片显微镜的已知的直立结构，其中，借助用于将样本定位在样本容器的关于其深度的上四分之一中或者定位在容器顶板中的定位装置确保样本对于显微镜构件而言是可到达的。

然而，用于光片显微镜技术的设备也可以包括倒置的光片显微镜，其中将照明和检测物镜布置在样本容器下方。在该情况下，作为分离层系统的部分的盖部形成样本容器的、必须保持特殊的样本容器的容器底板或者带有透明容器底板的标准多孔板。

此外，躺卧的配置也是可能的，其中照明和检测物镜的光学轴线位于水平面中。对于该情况和对于直立观察的情况下，样本容器合乎目的地包括用于将样本在距照明物镜和检测物镜的工作距离内定位在样本容器的侧面或者说上面的区域中的装置。

所理解的是，上面提及和下面还要阐述的特征不仅以所说明的组合，还以其它组合或者单独地可使用，而不偏离本发明的范围。

下面例如借助同样公开根据本发明的特征的附图来详细阐述本发明。其中：

图1示出了直立观察下的用于光片显微技术的设备，

图2示出了图1中那样的、但是倒置观察下的用于光片显微技术的设备，

图3示出了具有布置在光路中的校正装置的又一用于光片显微技术的设备，

图4示出了一个具有用于补偿光路中的成像误差的校正装置的替选设备，以及

图5示出了纳米结构化的盖部的一个示例。

图1首先示出了直立观察下的用于光片显微技术的设备。该设备包括用于容纳位于介质2中的样本3的样本容器1。样本容器1相对于平面形参照面被对齐，参照面在此通过样本台4来限定。该设备包括照明光学系统，该照明光学系统具有光源5和用于以光片照明样本3的照明物镜6，其中，照明物镜6的光学轴线7和光片位于这样的平面中，该平面与参照面的法线围成不等于0的照明角度β。该设备还包括具有检测物镜8的检测光学系统，该检测物镜的光学轴线9与参照面的法线围成不等于0的检测角度δ。将来自样本3的光传至检测器10，在那里记录；使得所记录的信号对于进一步处理和/或在屏幕上的示出可存取。

该设备还包括具有厚度预定且材料预定的一个或多个层的分离层系统，用于将样本3位于其中的介质2与照明物镜6和检测物镜8空间分离。分离层系统具有平行于参照面11的边界面11，该分离层系统以该边界面至少在对于照明物镜6和检测物镜8为照明和检测可用的区域中完全或至少几乎完全接触介质2。照明角度β和检测角度δ在此是根据检测物镜8或照明物镜6的数值孔径NA_D和NA_B预先给定的。

例如可以将水用作介质2，然而也可以使用其它液体或者凝胶。

因为照明物镜6和检测物镜8现在不再与介质2直接接触，所以在两个带有不同样本的样本容器间进行更换时不再出现污染。通过在最简单的情况下可以由一层空气构成的分离层系统，却由于光穿过边界面而出现像差、尤其是球面像差和慧差。可以用不同的措施来在较小的规模中或者也以更高的量级来减小这些像差，或者完全避免这些像差，这些像差在倾斜光透射的情况下主要是像散和慧差。

并非必要的第一措施可以在于，借助照明物镜6和检测物镜8的数值孔径预先给定照明角度β和检测角度δ。这同样在图1中示出。照明物镜6的数值孔径NA_B小于检测物镜8的数值孔径NA_D。因为像差在NA大的物镜的情况下更强地可觉察，所以对于这种物镜将其光学轴线定位为尽可能靠近参照面的法线，即具有与该法线特别小的角度，是有利的，因为光入射越倾斜，则物镜的光学轴线与参照面的法线所围成的角度越大，进而像差越大。对于照明，可以另一方面使用具有较小数值孔径的物镜，因为对于产生光片而言，通常小于0.5的数值孔径是足够的，而对于高分辨率基础上的检测，为1.0或更高的尽可能高的数值孔径是必要的。在图1中示出的情况中即为这种情况，照明物镜6的数值孔径NA_B小于检测物镜8的数值孔径NA_D。照明角度β因此可以选为大于检测角度δ。在此优选地，也如在图1中所示，照明角度β和检测角度δ之和为90°。在与此不同的角度的情况下，检测器10必须设置为相应地倾斜，从而满足所提及的Scheimpflug条件。

在此，分离层系统是封闭样本容器的、材料预定且厚度预定的板状盖部12。板状盖部12的在此与边界面11重合的第一大表面与介质2至少在对于照明物镜6和检测物镜8为照明和检测可到达的区域中几乎完全接触。盖部12的第二大表面13在此与例如为空气的气体接触，并且形成另一边界面。替代气体，还可以将浸没介质用作分离层系统的其它部件，其与盖部的第二大表面13同样至少在对于照明物镜6和检测物镜8为照明和检测可到达的区域中接触。第二大表面13同样用作边界面并且下面可能也称作边界面。

通过将照明物镜6和检测物镜8在其相对于参照面的法线的角度方面予以定向，虽然可以将尤其通过光纤倾斜穿透边界面而形成的像差最小化至一定的程度，然而该像差还是强至使得尤其在高数值孔径下检测时为了详细的记录而需要其它校正。因此，照明光学系统和/或检测光学系统包括用于将像差减小的校正装置，该像差是由于照明光和/或待测光倾斜穿过分离层系统的边界面11、13而形成的。

该校正装置例如可以包括照明物镜6和/或检测物镜8中的校正透镜和/或校正元件。例如，校正透镜可以构建为圆柱透镜、相对于光学轴线倾斜的和/或非轴向布置的透镜，和/或，校正元件构建为具有非球形表面或者自由形状表面。图1示例地示出了照明物镜6中非轴向布置的透镜14以及检测物镜8中偏轴布置的透镜15。

在图2中示出了用于光片显微技术的设备，其部件类似于图1中那样地构造和布置，区别是，在此照明物镜6和检测物镜8布置在样本容器1下方，即涉及倒置的光片显微技术的设备。盖部12在该情况下由样本容器1的底板形成。这种倒置设备尤其适于分析微量滴定板中的样本，因为样本通常由于重力而定位在容器底板上，从而其对于倒置的构造而言比直立构造更容易被到达，因为凹处被设计为非常狭窄，从上面观察是很难到达的。当照明物镜6和检测物镜8布置在样本容器1上方时，则适宜的是使用这样的样本容器1，其具有用于将样本3定位在样本容器1的上部区域中的装置，从而样本3也可以从上方被到达。

在图3和4中示出的用于光片显微技术的另一构型中，该设备包括布置在照明光路和/或检测光路中的校正装置，并且该校正装置为用于操纵照明或检测光的相位波前的适配光学元件。优选地，将可变形镜、空间光调制器或者相位板用作该校正装置。该校正装置当然可以与图1和2中示出那样的校正性物镜组合。在图3和4中，仅示出了用于光片显微技术的设备的倒置构造，以与图1和2等同的方式，也可以容易地设计这样的构造，其中将照明物镜6和检测物镜8布置在样本容器1上方。也可以实现躺卧的布置，其中照明物镜6的光学轴线7和检测物镜8的光学轴线9位于水平面中，并且参照面竖直地定向。原则上也可以考虑倾斜的布置。

在图3中示出了一个设备，其首先与图2中的构造是相近的。样本3位于样本容器1中，样本容器1布置在样本台4上。样本位于介质2、例如水中。出于简单性原因和仅示例性地，将照明物镜6和检测物镜8在此实施为相同的，它们因此可以布置为与参照面的法线分别成45°的角度。在照明光路中布置有可变形镜16，在检测光路中布置有可变形镜17，待测光在经由透镜18在检测器10上成像之前，该光射到该可变形镜17上。可变形镜16和17也可以通过在这些位置上的空间光调制器或者相位板取代，可变形镜16和17是可控制的并且由此不仅可以适配于不同的照明角度β和检测角度δ，也可以适配于不同的物镜配置和不同的分离层系统、尤其是不同的盖部12。以该方式，可以几乎完全矫正像差。可变形镜和空间光调制器还可以被附加地用于校正这种通过样本造成的像差。

图4示出一个略简化的构造，其中，照明物镜6和检测物镜8相同地构造并且照明角度β和检测角度δ同样相同，但其中仅使用一个可变形镜19就够了。为此，在光源5之前布置分束器20，其构建为对于照明波长范围是透射的，并且对于待检测的荧光波长是反射的。在检测器10之前还布置有分束器21，其一方面对于待检测的检测波长范围是透射的，但另一方面设计为对于照明波长范围是反射的。通过省一个可变形镜可以将该设备更为成本低廉地制造。

可以与光路中或物镜中的所提及的校正装置可能性组合的另一用于避免或减小像差的可能性在于，对于盖部12选择这样的材料，其折射率与样本3位于其中的介质2的折射率相差在5％以下。像差由此已经被强烈减小，校正装置于是无需再像没有该措施时那么强地介入光路，这简化了制造并且使得成本更为低廉，例如方法是，可以替代自由形状表面使用非球形透镜。如果例如将水用作样本3位于其中的介质2，则盖部12的材料例如可以使用PTFE、FEP、AF或者全氟二氧戊环聚合物。如果使用例如为AF的无定形聚合物，则优选将其玻璃化转变温度设置为使得该聚合物在冷却状态下具有供样本3位于其中的介质2的折射率。

如果附加地还将水用作盖部12的另一侧的浸没介质，则当折射率相同或者差别仅在千分之一的范围中时，完全避免了在光穿过边界面情况下的像差出现。

减小或避免像差出现的另一可能性在于，将由第一组分22和第二组分23的纳米结构化材料用作盖部12的材料。第一组分22的折射率小于用于容纳样本的介质2的折射率，第二组分23的折射率大于用于容纳样本的介质2的折射率。用这两种组分22和23可以制造纳米结构化材料，其具有与介质2的折射率相差在5％以下的有效折射率。前提是，在该纳米结构化材料中，由第一组分22制成的区域的平均结构尺寸或平均直径小于用于照明的和待检测的光的光波长。在最简单的近似中，该有效折射率得自这两个组分的体积比。在具有折射率n_d＝1.33的水作为用于容纳样本3的介质2的情况下，适用作为第一组分22的特别是空气，使用纳米多孔的材料可以实现这一点。

这种纳米结构化材料的一个示例在图5中示出，即，纳米结构化的二氧化硅。在那里，示出了例如可以形成容器底板或容器顶板的盖部12的强烈放大的局部剖面。例如可以将二氧化硅选作第二组分23，在该情况下可以将空气用作第一组分22。水的折射率在两个组分的折射率之间。作为第二组分23的二氧化硅在将空气用作第一组分22的情况下例如具有圆柱形开口，其直径小于所使用的光波长。在此该示图仅是说明性的，实际上这些开口也可以具有随机的、例如通过刻蚀产生的形状。重要的是体积比例，以及保证平均的开口直径小于所使用的或待检测的光波长。

替代纳米结构化材料，也可以使用两种组分混合的材料或者离析的材料。

为了将像差保持为尽可能小，还有利的是，总是将盖部12的厚度选择得尽可能小，在此，几百微米的厚度对于构建为容器底板的盖部12足够，几微米的厚度对于用作样本容器1的顶板的、构建为薄膜的盖部12足够。

借助上面描述的用于光片显微技术的设备，可以尤其在期望对大量样本进行分析的方法的范围中避免在样本更换时出现污染。尤其在将照明物镜6和检测物镜8布置在样本容器1下方的布置中，也可以使用相应的微量滴定板，其具有平的容器底板和多个凹处。

附图标记列表

1样本容器

2介质

3样本

4样本台

5光源

6照明物镜

7光学轴线

8检测物镜

9光学轴线

10检测器

11边界面/第一大表面

12盖部

13边界面/第二大表面

14,15非轴向透镜

16,17可变形镜

18透镜

19可变形镜

20,21分束器

22第一组分

23第二组分

Claims (13)

1.一种用于光片显微技术的设备，包括：

-用于容纳位于介质(2)中的样本(3)的样本容器(1)，其中，所述样本容器(1)相对于平面形参照面被对齐，

-具有照明物镜(6)的照明光学系统，用于以光片照明样本(3)，其中，照明物镜(6)的光学轴线(7)与光片位于这样的平面中，该平面与参照面的法线围成不等于0的照明角度β，

-具有检测物镜(8)的检测光学系统，所述检测物镜(8)的光学轴线(9)与所述参照面的法线围成不等于0的检测角度δ，其特征在于，

-所述设备包括具有一个或多个厚度预定且材料预定的层的、用于将样本(3)位于其中的所述介质(2)与所述照明物镜(6)和所述检测物镜(8)空间分离的分离层系统，其中，该分离层系统以平行于所述参照面的边界面(11)至少在对于所述照明物镜(6)和所述检测物镜(8)为照明和检测可到达的区域中接触所述介质(2)，以及，

-所述照明角度β和所述检测角度δ是借助所述检测物镜(8)或所述照明物镜(6)的数值孔径(NA_D，NA_B)来预先给定的。

2.根据权利要求1所述的用于光片显微技术的设备，其特征在于，所述照明物镜(6)的数值孔径NA_B小于所述检测物镜(8)的数值孔径NA_D，并且所述照明角度β大于所述检测角度δ，或者所述照明物镜(6)和所述检测物镜(8)构建为相同的并且所述照明角度β等于所述检测角度δ，其中，所述照明角度β与所述检测角度δ之和优选总是为90°。

3.根据权利要求1或2所述的用于光片显微技术的设备，其特征在于，所述照明光学系统和/或所述检测光学系统包括校正装置，用于减小由于照明光和/或待测光倾斜穿过所述分离层系统的边界面(11,13)而导致的像差。

4.根据权利要求3所述的用于光片显微技术的设备，其特征在于，所述校正装置包括在所述照明物镜(6)和/或所述检测物镜(8)中的校正透镜和/或校正元件。

5.根据权利要求4所述的用于光片显微技术的设备，其特征在于，所述校正透镜构建为圆柱形透镜、相对于所述光学轴线(7,9)倾斜的透镜和/或非轴向布置的透镜(14,15)，并且所述校正元件构建为具有非球形表面或者自由形状表面的元件。

6.根据权利要求3所述的用于光片显微技术的设备，其特征在于，所述校正装置包括布置在照明光路和/或检测光路中的、用于操纵照明和/或检测光的相位波前的适配光学元件，优选包括可变形镜(16、17)、空间光调制器或者相位板。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的用于光片显微技术的设备，其特征在于，所述分离层系统包括封闭样本容器(1)的、材料预定且厚度预定的、板状或薄膜状的盖部(12)，其中，所述板状或薄膜状的盖部(12)的第一大表面与所述介质(2)至少在对于所述照明物镜(6)和所述检测物镜(8)为照明和检测可到达的区域中几乎完全接触，并且所述盖部的第二大表面与作为所述分离层系统的其它部件的优选为空气的气体或者浸没介质至少在对于所述照明物镜(6)和所述检测物镜(8)为照明和检测可到达的区域中接触。

8.根据权利要求7所述的用于光片显微技术的设备，其特征在于，所述盖部(12)的材料具有这样的折射率，该折射率与所述样本(3)位于其中的所述介质(2)的折射率相差在5％以下。

9.根据权利要求8所述的用于光片显微技术的设备，其特征在于，所述样本(3)位于其中的所述介质(2)是水，并且所述盖部(12)的材料是PTFE、FEP、AF或者全氟二氧戊环聚合物。

10.根据权利要求8或9所述的用于光片显微技术的设备，其特征在于，所述盖部(12)是由无定形聚合物构成的，其玻璃化转变温度被设置为使得该聚合物在冷却状态下具有所述样本(3)位于其中的所述介质(2)的折射率。

11.根据权利要求8所述的用于光片显微技术的设备，其特征在于，所述盖部(12)的材料是由第一组分(22)和第二组分(23)构成的纳米结构化材料，其中，所述第一组分(22)的折射率小于所述介质(2)的折射率，而所述第二组分(23)的折射率大于所述介质(2)的折射率，并且其中，由所述第一组分(22)制成的区域的平均结构尺寸具有这样的平均直径，该平均直径小于用于照明的光的和待检测的光的光波长。

12.根据权利要求1至11之一所述的用于光片显微技术的设备，其特征在于，所述照明物镜(6)和所述检测物镜(8)布置在所述样本容器(1)下方。

13.根据权利要求1至11之一所述的用于光片显微技术的设备，其特征在于，所述照明物镜(6)和所述检测物镜(8)布置在所述样本容器(1)上方，并且所述样本容器(1)具有用于将所述样本(3)定位在所述样本容器(1)的关于其深度的上四分之一中的装置。