EP3019904A1 - Anordnung zur lichtblattmikroskopie - Google Patents

Anordnung zur lichtblattmikroskopie

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EP3019904A1
EP3019904A1 EP14735991.3A EP14735991A EP3019904A1 EP 3019904 A1 EP3019904 A1 EP 3019904A1 EP 14735991 A EP14735991 A EP 14735991A EP 3019904 A1 EP3019904 A1 EP 3019904A1
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EP
European Patent Office
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illumination
detection
objective
sample
light
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP14735991.3A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jörg SIEBENMORGEN
Thomas Kalkbrenner
Helmut Lippert
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Carl Zeiss Microscopy GmbH
Original Assignee
Carl Zeiss Microscopy GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Carl Zeiss Microscopy GmbH filed Critical Carl Zeiss Microscopy GmbH
Publication of EP3019904A1 publication Critical patent/EP3019904A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Definitions

  • the invention relates to an arrangement for light-sheet microscopy.
  • Such an arrangement comprises a sample vessel for receiving a sample contained in a medium, wherein the sample vessel is aligned with respect to a flat reference surface.
  • the assembly also includes an illumination optic having an illumination objective for illuminating the specimen with a light sheet, the optical axis of the illumination objective and the light sheet lying in a plane including a non-zero illumination angle ⁇ with the reference plane normal.
  • the arrangement finally comprises detection optics with a detection objective whose optical axis encloses a non-zero detection angle ⁇ with the normal of the reference surface.
  • the illumination objective and the detection objective can also be configured as a so-called double objective, as described for example in EP 0 866 993 B1. Both lenses are then combined in a common unit, the respective optics - i. Lenses with associated beam paths and optical elements arranged therein - then share some elements.
  • Such a device is used in particular in the examination of biological samples, in which the illumination of the samples with a light sheet whose plane intersects the optical axis of the detection at a non-zero angle occurs.
  • the light sheet encloses a right angle with the detection direction, which generally corresponds to the optical axis of the detection objective.
  • SPIM Selective Plane Illumination Microscopy
  • the SPIM technique is preferably used in fluorescence microscopy, where it is also referred to as LSFM (Light Sheet Fluorescence Microscopy).
  • LSFM Light Sheet Fluorescence Microscopy
  • the LSFM technique has several advantages: Since the detection in the far field can take place, larger sample areas can be detected. Although the resolution is somewhat lower than with confocal laser scanning microscopy, the LSFM technique allows thicker samples to be analyzed, since the penetration depth is higher. In addition, the light exposure of the samples in this method is the lowest, which among other things reduces the risk of bleaching a sample, since the sample is illuminated only by a thin light blue at a non-zero angle to the detection direction.
  • both a static light sheet which is generated for example by means of cylindrical lenses, can be used, as well as a quasi-static light sheet.
  • This can be generated by quickly scanning the sample with a light beam.
  • the light sheet-like illumination is created by the light beam is subjected to a very fast relative movement to the observed sample and this time successively multiple strung together.
  • the integration time of the camera, on the sensor of which the sample is finally imaged is selected such that the scanning is completed within the integration time.
  • a line sensor in combination with a rescan in the detection optics can also be used.
  • the detection can also be confocal.
  • One of the main applications of light sheet microscopy is in the imaging of medium-sized organisms with a size of several 100 microns to a few millimeters, usually these organisms are embedded in an agarose gel, which in turn is in a glass capillary.
  • the glass capillary is inserted from above or from below into a water-filled sample chamber and the sample is pushed out of the capillary a bit.
  • the sample in the agarose is illuminated with a light sheet and the fluorescence is imaged onto a camera with a detection objective that is perpendicular to the light sheet and thus perpendicular to the light sheet optics.
  • This method of light sheet microscopy has three major disadvantages. First, the samples to be examined are relatively large, they come from developmental biology.
  • the light sheet is relatively thick and thus limits the achievable axial resolution.
  • sample preparation is expensive and incompatible with standard sample preparations and standard sample holders, as is common in fluorescence microscopy for single cell examination.
  • a SPIM structure has been implemented in which the illumination objective and the detection objective are perpendicular to one another and are directed at an angle of 45 ° from above onto the sample. If, for example, the plane of a table on which the sample holder is mounted, or another horizontal plane, is used as reference surface, the illumination angle ⁇ and the detection angle ⁇ are each 45 °.
  • WO 2012/110488 A2 is described, for example, in WO 2012/110488 A2 and in WO 2012/122027 A2.
  • the sample is in such structures, for example, on the bottom of a Petri dish.
  • the Petri dish is filled with water, the lighting lens and detection lens are immersed in the liquid, the water also performs the function of an immersion liquid.
  • This approach offers the advantage of higher resolution in the axial direction because a thinner sheet of light can be generated. Due to the higher resolution then smaller samples can be examined. Also, the sample preparation has become much easier. Nevertheless, the sample preparation and the sample holder still do not conform to the standard currently valid in single-cell fluorescence microscopy. Thus, the Petri dish must be relatively large, so that the two lenses can be immersed in the shell, without hitting the edge of the shell.
  • a further disadvantage is that with this structure an analysis of a large number of samples in a short time (high-throughput screening) is not readily possible since the objectives must be cleaned when changing the sample in order to avoid contamination of the various samples ,
  • the object of the invention is to further develop an arrangement for light sheet microscopy of the type described above in that the analysis in particular of a plurality of samples is simplified by cross-contamination is effectively prevented when changing between two samples.
  • this object is achieved in an arrangement for light sheet microscopy of the type described above in that this arrangement is a separation layer system with one or more layers with predetermined thicknesses and of predetermined materials for the spatial separation of the medium in which the sample is located from the illumination objective and the Detection lens includes.
  • the separating layer system with an aligned parallel to the reference surface interface at least in the area that is responsible for the The illumination objective and the detection objective for illuminating the sample and detecting light coming from the sample are in contact with the medium - completely or at least almost completely.
  • the illumination angle ⁇ and the detection angle ⁇ are predefined on the basis of the numerical apertures NA D of the detection objective and NA B of the illumination objective.
  • the specification is made in the sense that the components are arranged to each other so that the existing aberrations are minimal without further action. Of course, you can also adjust other angles if you accept larger aberrations, but the image quality then decreases.
  • the separation layer system consists only of a single layer, this layer can also be an air layer, wherein the illumination and detection lens are designed as dry lenses.
  • the separating layer system may, however, also comprise a plurality of layers, for example a glass or plastic layer which, as a foil or plate, covers the sample vessel with respect to both objectives. Between this glass or plastic layer and the lenses is then an air layer or a layer with an immersion liquid, with which the two lenses are in contact.
  • the separation layer system can also consist of a single liquid layer, if it is ensured that this liquid layer does not mix with the medium in which the sample is located. This liquid can then also serve as immersion medium.
  • the introduction of a separating layer system can effectively prevent contamination, extreme light aberrations occur even at low numerical apertures such as 0.3 due to the passage of illumination and detection light through the interfaces of the separating layer system to the medium in which the sample is located like spherical aberrations and coma.
  • the oblique passage adds further, asymmetrical aberrations, or the others are amplified.
  • the illumination angle ⁇ and the detection angle ⁇ are predetermined on the basis of the numerical apertures NA D , NA B of the detection objective or of the illumination objective.
  • the objective with the lower numerical aperture which is usually the illumination objective, is arranged at a larger angle than the detection objective.
  • the detection lens may also have a larger numerical aperture than the illumination objective.
  • symmetrical configurations are also used in which the illumination objective and the detection objective are the same and both lenses include the same angle with the normal.
  • the sum of the illumination angle ⁇ and the detection angle ⁇ is ideally 90 ° in all cases. Is deviated from, for example, because both lenses can be arranged at a more acute angle, so that the sum is smaller than 90 ° is, then, since the object plane is now wrong with respect to the optical axis of the detection lens, to ensure that the Scheimpflug condition is met - the image sensor of the camera must then also be aligned obliquely. Arrangements are also conceivable in which the illumination and detection objectives are combined in an optical module such as the double objective mentioned above.
  • the illumination optics and / or the detection optics therefore comprise correction means for reducing the aberrations, in particular those aberrations which arise through the oblique passage of illumination light and / or light to be detected through interfaces of the separation layer system.
  • the correction means therefore comprise correction lenses and / or correction elements in the illumination objective or in the detection objective.
  • the correction lenses can be configured, for example, as cylindrical lenses, as lenses tilted against the respective optical axis or as non-axially arranged lenses whose axis of symmetry therefore does not lie on the optical axis of the illumination or detection objective.
  • the correction elements can be designed, for example, as elements with aspherical surfaces or free-form surfaces. Various corrective lenses / correction elements of one type or different types can also be combined in one lens.
  • a separate set of illumination and detection objectives can then be generated for each separating layer system, which however involves a high cost, since several sets have to be purchased, as well as an increased amount of work, which is associated with the change of lenses when changing the separation layer system is connected.
  • the correction means therefore comprise adaptive optical elements arranged in the illumination beam path and / or in the detection beam path for manipulating the phase fronts of the illumination or detection sound light.
  • These can be designed, for example, as deformable mirrors, phase plates or spatial light modulators.
  • These elements can preferably be configured controllable, so that an adaptation to a variety of possible Separation layer systems with one and the same arrangement of illumination and detection lens is possible.
  • the separating layer system preferably comprises, as already mentioned, a plate-shaped or foil-shaped cover which terminates the sample vessel and consists of a predetermined material and of a predetermined thickness.
  • a first large area of this plate- or film-shaped cover is in this case almost completely in contact with the medium in which the sample is located, at least in the area accessible to the illumination objective and the detection objective for illumination and detection.
  • a second large area of the cover is preferably in contact with a gas, for example air, or an immersion medium as further component of the separating layer system, at least in the area accessible to the illumination objective and the detection objective for illumination and detection.
  • Alternatively or in addition to the said correction means in the lenses or in the beam path and the separation layer system can be adjusted accordingly to reduce the aberrations. With a corresponding adaptation of the interface materials may also be a further correction of the lenses may be waived, or these corrections must not be so strong.
  • the material for the cover has a refractive index which differs from the refractive index of the medium in which the sample is located by less than 5%. If both materials have the same refractive index, aberrations at the interface between the medium and the cover can be completely avoided.
  • This material is an amorphous polymer, here the glass transition temperature can be adjusted so that the polymer in the cooled state has the refractive index of the medium in which the sample is located.
  • the glass transition temperature can be adjusted so that the polymer in the cooled state has the refractive index of the medium in which the sample is located.
  • other amorphous polymers with adjustable glass transition temperature can be used.
  • the separation layer / cover should be as thin as possible and should not be thicker than a few hundred ⁇ m. If the cover serves at the same time as the bottom of the sample vessel, as is the case with an inverse arrangement, or as a side wall in a horizontal observation arrangement, then of course sufficient stability against the pressure exerted by the medium in which the sample is located must be ensured become. This is not required for a cover as a lid of the sample vessel for an upright observation, here, the material can be made significantly thinner with thicknesses of less than 100 microns.
  • the material for the cover is a nanostructured material composed of a first and a second component, wherein the refractive index of the first component is smaller and the refractive index of the second component is greater than the refractive index of the medium for receiving the sample is.
  • the average structure sizes of the regions of material of the first component have a diameter which is smaller than the wavelengths of light used for illumination and the light to be detected, since only then an effective refractive index in a range of 5 % to the refractive index of the medium, for example water, can be adjusted.
  • different polymers can be used whose mixing behavior or demixing behavior, if the materials do not mix, is exploited, or nanoporous silica.
  • the first component is the air and the second component is silicon dioxide.
  • Such nanostructured materials are described, for example, in the article "Optical thin-film materials with low refractive index for broadband elimination of Fresnel reflection" by J. Q.
  • the separation layer system including the cover may comprise, for example, a vessel lid for conventional microtiter plates, then the known upright construction of a light sheet microscope can be used, with appropriate positioning means for positioning the sample in the upper quarter of the sample vessel, based on its depth, or for positioning in the vessel lid it is ensured that the sample is accessible to the microscope setup.
  • the arrangement for light-sheet microscopy can also include an inverted light-sheet microscope in which the illumination and detection objective are arranged below the sample vessel.
  • the cover forms part of the separation layer system, the bottom of the vessel sample, so it must be kept special sample containers or standard multi-well plates with transparent bottom of the vessel.
  • the sample vessel suitably comprises means for positioning the sample in a lateral or upper region of the sample vessel within the working distance of the illumination objective and the detection objective.
  • FIG. 3 shows a further arrangement for light-sheet microscopy with correction means arranged in the beam path
  • FIG. 5 shows an example of a nanostructured cover.
  • FIG. 1 shows first an arrangement suitable for upright observation for light sheet microscopy.
  • This comprises a sample vessel 1 for receiving a medium in a second
  • the sample vessel 1 is aligned with respect to a flat reference surface, which is defined here by a sample stage 4.
  • the arrangement comprises an illumination optical unit with a light source 5 and an illumination objective 6 for illuminating the sample 3 with a light sheet, wherein the optical axis 7 of the illumination objective 6 and the light sheet lie in a plane which corresponds to the normal of the reference surface a non-zero illumination angle ⁇ includes.
  • the arrangement also comprises detection optics with a detection objective 8 whose optical axis 9 encloses a non-zero detection angle ⁇ with the reference plane normal. Light coming from the sample 3 is directed to a detector 10, registered there; the registered signals are made available for further processing and / or presentation on a screen.
  • the arrangement also comprises a separating layer system with one or more layers of predetermined thicknesses and of predetermined materials for the spatial separation of the medium 2, in which the sample 3 is located, from the illumination objective 6 and the detection objective 8.
  • the separating layer system has an alignment parallel to the reference surface Interface 11, with which it is completely or at least almost completely in contact with the medium 2 at least in the area accessible for the illumination objective 6 and the detection objective 8 for illumination and detection.
  • Beieuchtungswinkel ß and detection angle ⁇ are given by numerical apertures NA D and NA B of the detection lens 8 and the illumination objective 6, respectively.
  • the medium 2 for example, water can be used, but also the use of other liquids or even gels is possible.
  • a first, not necessarily necessary, measure may be to specify the illumination angle ⁇ and the detection angle ⁇ based on the numerical apertures of the illumination objective 6 and the detection objective 8. This is also shown in FIG.
  • the numerical aperture NA B of the illumination objective 6 is smaller than the numerical aperture NA D of the detection objective 8. Since the aberrations in the case of objectives with a large NA To make more noticeable, for such lenses positioning their optical axis as close to the normal of the reference surface, so with a particularly small angle to this advantageous, since the aberrations are also greater, the more oblique the light is, the greater than that Angle, which includes the optical axis of the lens with the normal of the reference surface.
  • a lens with a smaller numerical aperture can be used, since numerical apertures of less than 0.5 are generally sufficient for the generation of a light sheet, while the highest possible numerical aperture of 1.0 or higher for detection due to the high resolution necessary is.
  • the numerical aperture NA B of the illumination objective 6 is smaller than the numerical aperture NA D of the detection objective 8.
  • the illumination angle ⁇ can therefore be selected larger than the detection angle ⁇ . It is preferred, as shown in Figure 1, the sum of illumination angle ß and detection angle ⁇ 90 °. In the case of deviating angles, the detector 10 must be tilted accordingly, so that the so-called Scheimpflug condition is fulfilled.
  • the separating layer system here has a plate-shaped cover 12 terminating the sample vessel and made of a predetermined material and of a predetermined thickness.
  • a first large area of the plate-shaped cover 12, which here coincides with the boundary surface 11, is almost completely in contact with the medium 2 at least in the area accessible to the illumination objective 6 and the detection objective 8 for illumination and detection.
  • a second Crufikiee 13 of the cover 12 is here with a gas, such as air, in contact and forms another interface.
  • a gas such as air
  • the second large area 13 also acts as an interface and is sometimes referred to as such in the following.
  • the illumination optics and / or the detection optics therefore comprise correction means for reducing such aberrations, which result from the oblique passage of illumination light and / or to light to be detected through boundary surfaces 11, 13 of the separation layer system.
  • correction means may include, for example, corrective lenses and / or correction elements in the illumination objective 6 and / or in the detection objective.
  • the correction lenses may be formed as cylindrical lenses, as tilted against the optical axis and / or not axially arranged lenses and / or as correction elements with aspherical surfaces or free-form surfaces.
  • 1 shows, as an example, a non-axially arranged lens 14 in the illumination objective 6 and an off-axis lens 15 in the detection objective 8.
  • FIG. 2 shows an arrangement for light-sheet microscopy, the components of which are constructed and arranged similarly to FIG. 1, with the difference that here the illumination objective 6 and the detection objective 8 are arranged below the sample vessel 1, that is to say an arrangement for inverse light sheet microscopy.
  • the cover 12 is formed in this case by the bottom of the sample vessel 1.
  • Such an inverse arrangement is particularly suitable for the analysis of samples in microtiter plates, since the samples are usually located by gravity on the vessel bottom, so that they are more accessible for an inverse structure than for an upright structure, since the wells very closely conceived and difficult to access from the top.
  • the illumination objective 6 and the detection objective 8 are arranged above the sample vessel 1, it will therefore be expedient to use sample vessels 1 which have means for positioning the sample 3 in the upper region of the sample vessel 1, so that the sample 3 is also accessible from above.
  • the arrangement comprises correction means arranged in the illumination beam path and / or in the detection beam path and which are adaptive optical elements for manipulating the phase fronts of the illumination system. or the detection law.
  • correction means can be combined with corrected objectives, as also shown in FIGS. 1 and 2.
  • Figures 3 and 4 only the inverse structure of the arrangement for light sheet microscopy is shown, in an equivalent way to Figures 1 and 2, a structure can be readily constructed, are arranged at the illumination objective 6 and detection lens 8 above the sample vessel 1.
  • FIG 3 an arrangement is shown, which is initially similar to the structure in Figure 2.
  • a sample 3 is stored in a sample vessel 1, which is arranged on a sample table 4.
  • the sample is in a medium 2, for example water.
  • the illumination objective 6 and the detection objective 8 are identical in this case, they can therefore be arranged at an angle of 45 ° to the normal of the reference surface.
  • a deformable mirror 16 is arranged, in the detection beam path a deformable mirror 17, which is hit by the light to be detected, before it is imaged onto the detector 10 via a lens 18.
  • deformable mirrors 16 and 17 which can also be replaced by spatial light modulators or phase plates at these positions, are controllable and thus adaptable to different illumination angles ⁇ and detection angle 5 as well as to different lens configurations and different separating layer systems, in particular different covers 12. In this way, the aberrations can be almost completely corrected.
  • Deformable mirrors and spatial light modulators can also be used in addition to correct for aberrations caused by the sample.
  • FIG. 1 A somewhat simplified construction, in which the illumination objective 6 and the detection objective 8 are constructed identically and the illumination angle .beta. And the detection angle .delta. Are also identical, but in which it is sufficient to use only one deformable mirror 19, is illustrated in FIG.
  • a beam splitter 20 is arranged in front of the light source 5, which is permeable to the illumination wavelength range and is designed to be reflective for the wavelengths of the fluorescent light to be detected.
  • a beam splitter 21 is arranged, which in turn is permeable to the detection wavelength range to be detected, but is designed to be reflective for the illumination wavelength range.
  • Another possibility for reducing or avoiding aberrations, which can be combined with the already mentioned possibilities of the correction means in the beam paths or in the objectives, is to select a material for the cover 12 which has a refractive index which is of the refractive index of the medium 2 in which the sample 3 is embedded differs by less than 5%.
  • the aberrations are thereby already greatly reduced, the correction means must then no longer engage as strongly in the beam path, as without such a measure, which simplifies the Hersannon and makes cheaper, for example, in that aspherical lenses can be used instead of free-form surfaces.
  • the medium 2 in which the sample 3 is located can be used as the material for the cover 12, for example PTFE, CYTOP ®, FEP, Teflon ® AF or a perfluordioxolanes polymer.
  • amorphous polymer such as Teflon® AF
  • its glass transition temperature is preferably adjusted so that the polymer when cold has the refractive index of the medium 2 in which the sample 3 is located.
  • water is used as the immersion medium on the other side of the cover 12, if the refractive indices are identical or differ only in the per thousand range, the occurrence of aberrations in the passage of light through the interfaces can be completely avoided.
  • a nanostructured material comprising a first component 22 and a second component 23 as the material for the cover 12.
  • the refractive index of the first component 22 is smaller than the refractive index of the medium 2 for receiving the sample
  • the refractive index of the second component 23 is greater than the refractive index of the medium 2 for receiving the sample 3.
  • From these two components 22 and 23 can be a nanostructured Produce material which has an effective refractive index, which differs from the refractive index of the medium 2 by less than 5%.
  • the average structure sizes or mean diameters of regions of the first component 22 are smaller than the light wavelength of the light used for illumination and of the light to be detected.
  • the effective refractive index results from the volume ratio of the two components.
  • nanostructured silica An example of such a nanostructured material is shown in Figure 5, nanostructured silica.
  • a cover 12 which may form, for example, the vessel bottom or the vessel lid shown.
  • silicon dioxide can be selected as the second component 23, and air can be used as the first component 22 in this case.
  • the refractive index of water is between the refractive indices of the two components.
  • the drawing serves only to illustrate, in fact, the openings may also have more random, for example, generated by etching, forms.
  • Essential is the volume ratio and that it is ensured that the average opening diameter are smaller than the wavelengths of light used or to be detected.
  • a two-component mixed material or a segregated material may also be used.
  • the thickness of the cover 12 as small as possible in each case, here suffices a thickness of a few hundred microns for a designed as a vessel bottom cover 12 and a few microns for a designed as a film cover 12, which serves as a lid for the sample vessel 1.

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Anordnung zur Lichtblattmikroskopie. Eine solche Anordnung umfasst ein Probengefäß (1) zur Aufnahme einer in einem Medium (2) befindlichen Probe (3). Das Probengefäß (1) ist hinsichtlich einer ebenen Bezugsfläche ausgerichtet. Die Anordnung umfasst außerdem eine Beleuchtungsoptik mit einem Beleuchtungsobjektiv (6) zur Beleuchtung der Probe (3) mit einem Lichtblatt, wobei die optische Achse (7) des Beleuchtungsobjektivs (6) und das Lichtblatt in einer Ebene liegen, die mit der Normalen der Bezugsfläche einen von Null verschiedenen Beleuchtungswinkel (ß) einschließt, sowie eine Detektionsoptik mit einem Detektionsobjektiv (8), dessen optische Achse (9) mit der Normalen der Bezugsfläche einen von Null verschiedenen Detektionswinkel (δ) einschließt. Bei einer solchen Anordnung ist ein Trennschichtsystem einer oder mehreren Schichten vorgegebener Dicken und aus vorgegebenen Materialien zur räumlichen Trennung des Mediums (2), in welchem sich die Probe (3) befindet, von dem Beleuchtungsobjektiv (6) und dem Detektionsobjektiv (8) vorgesehen, wobei das Trennschichtsystem mit einer parallel zur Bezugsfläche ausgerichteten Grenzfläche (11) zumindest in dem für das Beleuchtungsobjektiv (6) und das Detektionsobjektiv (8) für die Beleuchtung und die Detektion zugänglichen Bereich mit dem Medium (2) in Kontakt steht. Dabei sind Beleuchtungswinke! (ß) und Detektionswinkel (δ) anhand numerischer Aperturen (NAD, NAB) des Detektionsobjektivs (8) bzw. des Beleuchtungsobjektivs (6) vorgegeben.

Description

Anordnung zur Lichtblattmikroskopie
Die Erfindung betrifft eine Anordnung zur Lichtblattmikroskopie. Eine solche Anordnung umfasst ein Probengefäß zur Aufnahme einer in einem Medium befindlichen Probe, wobei das Probengefäß hinsichtlich einer ebenen Bezugsfläche ausgerichtet ist. Die Anordnung umfasst außerdem eine Beleuchtungsoptik mit einem Beleuchtungsobjektiv zur Beleuchtung der Probe mit einem Lichtblatt, wobei die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs und das Lichtblatt in einer Ebene liegen, die mit der Normalen der Bezugsfläche einen von Null verschiedenen Beleuchtungswinkel ß einschließt. Die Anordnung umfasst schließlich eine Detektionsoptik mit einem Detektionsobjektiv, dessen optische Achse mit der Normalen der Bezugsfläche einen von Null verschiedenen Detektionswinkel δ einschließt. Beleuchtungsobjektiv und Detektionsobjektiv können dabei auch als sogenanntes Doppelobjektiv ausgestaltet sein, wie es beispielsweise in der EP 0 866 993 B1 beschrieben ist. Beide Objektive sind dann in einer gemeinsamen Baueinheit zusammengefasst, die jeweiligen Optiken - d.h. Objektive mit zugehörigen Strahlengängen und darin angeordneten optischen Elementen - teilen sich dann einige Elemente.
Eine solche Vorrichtung wird insbesondere bei der Untersuchung von biologischen Proben eingesetzt, bei der die Beleuchtung der Proben mit einem Lichtblatt, dessen Ebene die optische Achse der Detektion in einem von Null verschiedenen Winkel schneidet, erfolgt. Üblicherweise schließt dabei das Lichtblatt mit der Detektionsrichtung, die in der Regel der optischen Achse des Detektionsobjektivs entspricht, einen rechten Winkel ein. Mit dieser auch als SPIM (Selective Plane Illumination Microscopy) bezeichneten Technik lassen sich in relativ kurzer Zeit räumliche Aufnahmen auch dickerer Proben erstellen. Auf der Basis von optischen Schnitten kombiniert mit einer Relativbewegung in einer Richtung senkrecht zur Schnittebene ist eine bildliche, räumlich ausgedehnte Darstellung der Probe möglich.
Die SPIM-Technik wird bevorzugt in der Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt, wo sie dann auch als LSFM (Light Sheet Fluorescence Microscopy) bezeichnet wird. Gegenüber anderen etablierten Verfahren wie der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie oder der Zwei-Photonen- Mikroskopie weist die LSFM-Technik mehrere Vorzüge auf: Da die Detektion im Weitfeld erfolgen kann, lassen sich größere Probenbereiche erfassen. Zwar ist die Auflösung etwas geringer als bei der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie, jedoch lassen sich mit der LSFM- Technik dickere Proben analysieren, da die Eindringtiefe höher ist. Darüber hinaus ist die Lichtbelastung der Proben bei diesem Verfahren am geringsten, was u.a. die Gefahr des Ausbleichens einer Probe reduziert, da die Probe nur durch ein dünnes Lichtblau in einem von Null verschiedenen Winkel zur Detektionsrichtung beleuchtet wird.
Dabei kann sowohl ein statisches Lichtblatt, welches beispielsweise mit Hilfe von Zylinderlinsen erzeugt wird, verwendet werden, als auch ein quasi-statisches Lichtblatt. Dieses kann erzeugt werden, in dem die Probe mit einem Lichtstrahl schnell abgetastet wird. Die lichtblattartige Beleuchtung entsteht, indem der Lichtstrahl einer sehr schnellen Relativbewegung zu der zu beobachteten Probe unterworfen wird und dabei zeitlich aufeinanderfolgend mehrfach aneinandergereiht wird. Dabei wird die Integrationszeit der Kamera, auf deren Sensor die Probe letztendlich abgebildet wird, so gewählt, dass die Abtastung innerhalb der Integrationszeit abgeschlossen wird. Anstelle einer Kamera mit 2D-Array kann auch ein Zeilensensor in Kombination mit einem erneuten Abtasten (Rescan) in der Detektionsoptik verwendet werden. Die Detektion kann außerdem auch konfokal erfolgen.
Die SPIM-Technik ist in der Literatur inzwischen vielfach beschrieben, beispielsweise in der DE 102 57423 A1 und der darauf aufbauenden WO 2004/053558 A1 oder in dem Übersichtsartikel "Selective Plane Illumination Microscopy Techniques in Davetopmental Biology" von J. Huisken etal., erschienen im Jahr 2009 in der Zeitschrift Development, Bd. 136, S. 1963.
Eine der Hauptanwendungen der Lichtblattmikroskopie liegt in der Bildgebung mittergroßer Organismen mit einer Größe von einigen 100 μm bis hin zu wenigen Millimetern, in der Regel werden diese Organismen in ein Agarose-Gel eingebettet, welches sich wiederum in einer Glaskapillare befindet. Die Glaskapillare wird von oben bzw. von unten in eine wassergefüllte Probenkammer eingebracht und die Probe ein Stück aus der Kapillare herausgedrückt. Die Probe in der Agarose wird mit einem Lichtblatt beleuchtet und die Fluoreszenz mit einem Detektionsobjektiv, dass senkrecht zum Lichtblatt und damit auch senkrecht zur Lichtblattoptik steht, auf eine Kamera abgebildet. Diese Methode der Lichtblattmikroskopie hat drei große Nachteile. Zum einen sind die zu untersuchenden Proben relativ groß, sie stammen aus der Entwicklungsbiologie. Außerdem ist aufgrund der Probenpräparation und der Abmessungen der Probenkammer das Lichtblatt relativ dick und somit die erzielbare axiale Auflösung eingeschränkt. Zusätzlich ist die Probenpräparation aufwendig und nicht kompatibel zur Standard-Probenpräparationen und zu Standard-Probenhalterungen, wie sie in der FJuoreszenzmikroskopie zur Untersuchung einzelner Zellen üblich sind. Um diese Einschränkungen zumindest teilweise umgehen zu können, wurde in den letzten Jahren ein SPIM-Aufbau realisiert, bei dem das Beleuchtungsobjektiv und das Detektionsobjektiv senkrecht zueinander stehen und unter einem Winkel von jeweils 45° von oben auf die Probe gerichtet sind. Zieht man als Bezugsfläche beispielsweise die Ebene eines Tisches heran, auf dem die Probenhalterung gelagert ist, oder eine andere, horizontale Ebene, so betragen der Beleuchtungswinkel ß und der Detektionswinkel δ jeweils 45º. Ein solcher Aufbau wird beispielsweise in der WO 2012/110488 A2 und in der WO 2012/122027 A2 beschrieben.
Die Probe befindet sich bei solchen Aufbauten beispielsweise auf dem Boden einer Petrischale. Die Petrischale ist mit Wasser gefüllt, Beleuchtungsobjektiv und Detektionsobjektiv werden in die Flüssigkeit eingetaucht, das Wasser übernimmt auch die Funktion einer Immersionsflüssigkeit. Dieser Ansatz bietet den Vorteil einer höheren Auflösung in axialer Richtung, da ein dünneres Lichtblatt erzeugt werden kann. Aufgrund der höheren Auflösung können dann kleinere Proben untersucht werden. Auch ist die Probenpräparation bedeutend einfacher geworden. Dennoch entsprechen Probenpräparation und Probenhalterung weiterhin noch nicht dem Standard, wie er in der Fluoreszenzmikroskopie bei einzelnen Zellen derzeit gültig ist. So muss die Petrischale relativ groß sein, damit die beiden Objektive in die Schale eingetaucht werden können, ohne an den Rand der Schale anzustoßen. Mikrotiterplatten - auch als Multi-Well-Platten bezeichnet -, die Standard in vielen Bereichen der Biologie sind und gerade auch bei der fluoreszenzmikroskopischen Analyse einzelner Zellen eingesetzt werden, können mit diesem Verfahren nicht verwendet werden, da die Objektive nicht in die sehr kleinen Vertiefungen, welche rasterförmig auf der Platte angeordnet sind, eintauchen können. Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass mit diesem Aufbau eine Analyse einer Vielzahl von Proben in kurzer Zeit (High-Throughput-Screening) nicht ohne weiteres möglich ist, da die Objektive beim Wechseln der Probe gereinigt werden müssen, um Kontaminierungen der verschiedenen Proben zu vermeiden.
Die Aufgabe der Erfindung besteht daher darin, eine Anordnung zur Lichtblattmikroskopie der eingangs beschriebenen Art dahingehend weiterzuentwickeln, dass die Analyse insbesondere einer Vielzahl von Proben vereinfacht wird, indem beim Wechsel zwischen zwei Proben eine Kreuzkontaminierung effektiv verhindert wird.
Diese Aufgabe wird bei einer Anordnung zur Lichtblattmikroskopie der eingangs beschriebenen Art dadurch gelöst, dass diese Anordnung ein Trennschichtsystem mit einer oder mehreren Schichten mit vorgegebenen Dicken und aus vorgegebenen Materialien zur räumlichen Trennung des Mediums, in welchem sich die Probe befindet, von dem Beleuchtungsobjektiv und dem Detektionsobjektiv umfasst. Dabei steht das Trennschichtsystem mit einer parallel zur Bezugsfläche ausgerichteten Grenzfläche zumindest in dem Bereich, der für das Beleuchtungsobjektiv und das Detektionsobjektiv für die Beleuchtung der Probe und die Detektion von Licht, welches von der Probe kommt, zugänglich ist mit dem Medium in Kontakt - vollständig oder doch zumindest nahezu vollständig. Beleuchtungswinkel ß und Detektionswinkel δ sind dabei anhand der numerischen Aperturen NAD des Detektionsobjektivs und NAB des Beleuchtungsobjektivs vorgegeben. Die Vorgabe erfolgt dabei in dem Sinne, dass die Komponenten zueinander so angeordnet werden, dass die vorhandenen Aberrationen ohne weitere Maßnahmen minimal sind. Selbstverständlich lassen sich auch andere Winkel einstellen, wenn man größere Aberrationen in Kauf nimmt, die Abbildungsqualität nimmt dann jedoch ab.
Im einfachsten Fall besteht das Trennschichtsystem nur aus einer einzigen Schicht, diese Schicht kann auch eine Luftschicht sein, wobei Beleuchtungs- und Detektionsobjektiv als Trockenobjektive ausgestaltet werden. Das Trennschichtsystem kann aber auch mehrere Schichten umfassen, beispielsweise eine Glas- oder Kunststoffschicht, die als Folie oder Platte das Probengefäß gegenüber beiden Objektive abdeckt. Zwischen dieser Glas- oder Kunststoffschicht und den Objektiven befindet sich dann eine Luftschicht oder eine Schicht mit einer Immersionsflüssigkeit, mit welcher die beiden Objektive in Kontakt stehen. Das Trennschichtsystem kann aber auch aus einer einzigen Flüssigkeitsschicht bestehen, wenn sichergestellt ist, dass sich diese Flüssigkeitsschicht nicht mit dem Medium, in welchem sich die Probe befindet, vermischt. Diese Flüssigkeit kann dann ebenfalls als Immersionsmedium dienen.
Durch die Einführung eines Trennschichtsystems lässt sich zwar eine Kontaminierung effektiv verhindern, jedoch treten aufgrund des Durchtritts von Beleuchtungs- und Detektionslicht durch die Grenzflächen des Trennschichtsystems bis zum Medium, in welchem sich die Probe befindet, schon bei niedrigen numerischen Aperturen wie 0,3 extreme Abbildungsfehler wie sphärische Aberrationen und Koma auf. Durch den schrägen Durchtritt kommen weitere, unsymmetrische Abbildungsfehler hinzu, bzw. werden die anderen verstärkt. Um diese Abbildungsfehler zu minimieren werden daher der Beleuchtungswinkel ß und der Detektionswinkel δ anhand der numerischen Aperturen NAD, NAB des Detektionsobjektivs bzw. des Beleuchtungsobjektivs vorgegeben. Dabei wird das Objektiv mit der niedrigeren numerischen Apertur, welches in der Regel das Beleuchtungsobjektiv ist, unter einem größeren Winkel als das Detektionsobjektiv angeordnet wird. In seltenen Fällen kann auch das Detektionsobjektiv eine größere numerische Apertur als das Beleuchtungsobjektiv aufweisen. Oft werden auch symmetrische Konfigurationen verwendet, bei denen Beleuchtungsobjektiv und Detektionsobjektiv gleich aufgebaut sind und beide Objektive den gleichen Winkel mit der Normalen einschließen. Die Summe von Beleuchtungswinkel ß und Detektionswinkel δ ist in allen Fällen idealerweise 90°. Wird davon abgewichen, weil beispielsweise beide Objektive unter einem spitzeren Winkel angeordnet werden können, so dass die Summe kleiner als 90º ist, so muss, da die Objektebene jetzt schief in Bezug auf die optische Achse des Detektionsobjektivs liegt, darauf geachtet werden, dass die Scheimpflugbedingung erfüllt ist - der Bildsensor der Kamera muss dann ebenfalls entsprechend schräg ausgerichtet sein. Es sind auch Anordnungen denkbar, bei denen Beleuchtungs- und Detektionsobjektiv in einem optischen Modul wie dem eingangs erwähnten Doppelobjektiv zusammengefasst sind.
Sollte sich diese Art der einfachen Minimierung der Aberrationen, die mit Standardobjektiven vorgenommen werden kann, als nicht ausreichend erweisen, so sind weitere Maßnahmen möglich, um die Aberrationen weiter zu vermindern bzw. ganz auszuschließen.
In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung umfassen die Beleuchtungsoptik und / oder die Detektionsoptik daher Korrekturmittel zur Verringerung der Aberrationen, insbesondere von solchen Aberrationen, welche durch den schrägen Durchtritt von Beleuchtungslicht und / oder zu detektierenden Licht durch Grenzflächen des Trennschichtsystems entstehen.
In einer bevorzugten Ausgestaltung umfassen die Korrekturmittel daher Korrekturlinsen und / oder Korrekturelemente im Beleuchtungsobjektiv oder im Detektionsobjektiv. Die Korrekturlinsen können beispielsweise als Zylinderlinsen ausgestaltet sein, als gegen die jeweilige optische Achse verkippte Linsen oder als nicht axial angeordnete Linsen, deren Symmetrieachse also nicht auf der optischen Achse des Beleuchtungs- bzw. des Detektionsobjektivs liegt. Die Korrekturelemente können beispielsweise als Elemente mit asphärischen Flächen oder Freiformflächen ausgebildet sein. Verschiedene Korrekturlinsen / Korrekturelemente eines Typs oder verschiedener Typen können auch in einem Objektiv kombiniert werden.
Für jedes Trennschichtsystem kann dann in Abhängigkeit von der Materialzusammensetzung und der Dicke des Trennschichtsystems ein eigener Satz von Beleuchtungs- und Detektionsobjektiven generiert werden, was jedoch sowohl mit einem hohen Kostenaufwand verbunden ist, da mehrere Sätze angeschafft werden müssen, als auch mit einem erhöhten Arbeitsaufwand, der mit dem Wechsel der Objektive beim Wechsel des Trennschichtsystems mit sich bringt, verbunden ist.
In einer alternativen Ausgestaltung umfassen die Korrekturmittel daher im Beleuchtungsstrahlengang und / oder im Detektionsstrahlengang angeordnete adaptive optische Elemente zur Manipulation der Phasenfronten des Beleuchtungs- bzw. des Detekttonslichts. Diese können beispielsweise als verformbare Spiegel, Phasenplatten oder räumliche Lichtmodulatoren ausgestaltet sein. Diese Elemente lassen sich bevorzugt ansteuerbar konfigurieren, so dass eine Adaption an eine Vielzahl möglicher Trennschichtsysteme mit ein und derselben Anordnung von Beleuchtungs- und Detektionsobjektiv möglich wird.
Denkbar ist auch eine Kombination der beiden Alternativen in dem Sinne, dass beispielsweise durch die fest eingebauten Korrekturlinsen eine wesentliche Grundkorrektur für die am häufigsten verwendeten Trennschichtsysteme und ggf. auch für die sphärischen Aberrationen bei senkrechtem Durchtritt - wie es bei Mikroskopobjektiven für Standardgläser und -dicken oft der Fall ist - vorgenommen wird und mit Hilfe der adaptiven optischen Elemente im Strahlengang eine individuelle, an das jeweilige Trennschichtsystem angepasste Feinkorrektur vorgenommen wird.
Das Trennschichtsystem umfasst bevorzugt, wie bereits erwähnt, eine das Probengefäß abschließende, plattenförmige oder folienförmige Abdeckung aus einem vorgegebenen Material und von einer vorgegebenen Dicke. Eine erste Großfläche dieser platten- oder folienförmigen Abdeckung steht dabei mit dem Medium, in welchem sich die Probe befindet, zumindest in dem für das Beleuchtungsobjektiv und das Detektionsobjektiv für die Beleuchtung und die Detektion zugänglichen Bereich nahezu vollständig in Kontakt. Eine zweite Großfläche der Abdeckung steht bevorzugt mit einem Gas - beispielsweise Luft - oder einem Immersionsmedium als weitere Komponente des Trennschichtsystems zumindest in dem für das Beleuchtungsobjektiv und dem Detektionsobjektiv für die Beleuchtung und Detektion zugänglichen Bereich in Kontakt. Alternativ oder in Ergänzung zu den genannten Korrekturmitteln in den Objektiven bzw. im Strahlengang kann auch das Trennschichtsystem entsprechend angepasst werden um die Aberrationen zu vermindern. Bei einer entsprechenden Anpassung der Trennschichtmaterialien kann auch eine weitergehende Korrektur der Objektive unter Umständen verzichtet werden, bzw. müssen diese Korrekturen nicht so stark ausfallen.
In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung weist das Material für die Abdeckung daher einen Brechungsindex auf, welcher sich von dem Brechungsindex des Mediums, in welchem sich die Probe befindet, um weniger als 5 % unterscheidet. Weisen beide Materialien den gleichen Brechungsindex auf, so lassen sich Aberrationen an der Grenzfläche zwischen Medium und Abdeckung ganz vermeiden. Wenn als Medium, in welchem sich die Probe befindet, beispielsweise Wasser verwendet wird, welches eine Brechzahl nd = 1,33 bei einer Wellenlänge λd = 578,56 nm hat, so eignet sich als Material für die Abdeckung beispielsweise PTFE (Polytetrafluorethylen, nd = 1,35), CYTOP® (nd = 1,34), oder FEP (Perfluorethylenpropylen, nd = 1,34) ist. Auch perfluorodioxolane Polymere lassen sich verwenden, deren Brechungsindex ebenfalls in der Regel zwischen 1 ,33 und 1 ,36 liegt. Ein besonders gut geeignetes Material ist auch Teflon® AF, welches üblicherweise einen Brechungsindex nd = 1,32 aufweist. Bei diesem Material handelt es sich um ein amorphes Polymer, hier kann die Glasübergangstemperatur so eingestellt werden, dass das Polymer im erkalteten Zustand den Brechungsindex des Mediums, in welchem sich die Probe befindet, aufweist. Auch andere amorphe Polymere mit einstellbarer Glasübergangstemperatur lassen sich selbstverständlich verwenden.
Stimmen die Brechungsindizes nicht exakt überein, so treten weiterhin Aberrationen auf, wenn auch im verringertem Maße. Um diese Aberrationen weiter zu vermindern, sollte die Trennschicht / Abdeckung daher so dünn wie möglich gewählt werden und nicht dicker als einige hundert μm sein. Dient die Abdeckung gleichzeitig als Boden des Probengefäßes, wie es bei einer inversen Anordnung der Fall ist, oder als Seitenwand bei einer liegenden Beobachtungsanordnung, so muss selbstverständlich auf eine ausreichende Stabilität gegenüber dem von dem Medium, in welchem sich die Probe befindet, ausgeübten Druck geachtet werden. Dies ist bei einer Abdeckung als Deckel des Probengefäßes für eine aufrechte Beobachtung nicht erforderlich, hier kann das Material noch wesentlich dünner ausgeformt werden mit Dicken von weniger als 100 μm.
In einer wetteren Ausgestaltung der Erfindung ist das Material für die Abdeckung ein nanostrukturiertes Material, welches aus einer ersten und einer zweiten Komponente zusammengesetzt ist, wobei der Brechungsindex der ersten Komponente kleiner und der Brechungsindex der zweiten Komponente größer als der Brechungsindex des Mediums zur Aufnahme der Probe ist. Bei entsprechender Nanostrukturierung der zweiten Komponente mit Anteilen der ersten Komponente, bzw. bei geeigneten Materialien auch nur durch anteilige Mischung der beiden Komponenten lässt sich dann ein Material mit einem effektiven Brechungsindex herstellen, welcher in den bereits genannten Bereich von 5 % um den Brechungsindex des Mediums zur Aufnahme der Probe fällt. Bei einer Nanostrukturierung ist dabei jedoch Voraussetzung, dass die mittleren Strukturgrößen der Bereiche aus Material der ersten Komponente einen Durchmesser aufweisen, der geringer als die Lichtwellenlängen des zur Beleuchtung verwendeten und des zu detektierenden Lichts ist, da nur dann ein effektiver Brechungsindex in einem Bereich von 5% um den Brechungsindex des Mediums, beispielsweise Wasser, eingestellt werden kann. Hier lassen sich beispielsweise unterschiedliche Polymere verwenden, deren Mischungsverhalten bzw. Entmischungsverhalten, wenn sich die Materialien nicht mischen, ausgenutzt wird, oder auch nanoporöses Siliziumdioxid. In dem letzteren Fall ist die erste Komponente die Luft und die zweite Komponente Siliziumdioxid. Solcherart nanostrukturierte Materialien werden beispielsweise in dem Artikel„Optical thin-film materials with low refractrve index for broadband elimination of Fresnel reflection" von J.-Q. Xi et al., erschienen im Jahre 2007 in Nature Photonics, Vol. 1, S.176-179 im Zusammenhang mit der Herstellung von Antireflexionsschichten beschrieben. Auch hier sollte die Dicke der Abdeckung so dünn wie möglich gewählt werden, es gelten die gleichen Randbedingungen wie bereits oben beschrieben. Das Trennschichtsystem einschließlich der Abdeckung kann beispielsweise einen Gefäßdeckel für übliche Mikrotiterplatten umfassen, hier lässt sich dann der bekannte aufrechte Aufbau eines Lichtblattmikroskops verwenden, wobei mit entsprechenden Positionierungsmitteln zur Positionierung der Probe im oberen Viertel des Probengefäßes, bezogen auf seine Tiefe, oder zur Positionierung im Gefäßdeckel sichergestellt wird, dass die Probe dem Mikroskopaufbau zugänglich ist.
Die Anordnung zur Lichtblattmikroskopie kann aber auch ein inverses Lichtblattmikroskop umfassen, bei dem Beleuchtungs- und Detektionsobjektiv unterhalb des Probengefäßes angeordnet sind. In diesem Fall bildet die Abdeckung als Teil des Trennschichtsystems den Gefäßboden des Probengefäßes, es müssen also spezielle Probengefäße vorgehalten werden oder Standard-Multi-Well-Platten mit transparentem Gefäßboden.
Daneben ist außerdem auch eine liegende Konfiguration möglich, bei der sich die optischen Achsen von Beleuchtungs- und Detektionsobjektiv in einer horizontalen Ebene befinden. Für diesen Fall und für den Fall der aufrechten Beobachtung umfasst das Probengefäß zweckmäßig Mittel zur Positionierung der Probe in einem seitlichen bzw. oberen Bereich des Probengefäßes innerhalb des Arbeitsabstandes von Beleuchtungsobjektiv und Detektionsobjektiv.
Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen:
Fig.1 eine erste Anordnung zur Lichtblattmikroskopie mit aufrechter Beobachtung,
Fig.2 eine Anordnung zur Lichtblattmikroskopie wie in Fig.1, jedoch mit inverser Beobachtung,
Fig.3 eine weitere Anordnung zur Lichtblattmikroskopie mit im Strahlengang angeordneten Korrekturmitteln,
Fig.4 eine alternative Anordnung mit Korrekturmitteln zur Kompensation der
Abbildungsfehler im Strahlengang und
Fig.5 ein Beispiel für eine nanostrukturierte Abdeckung.
Fig.1 zeigt zunächst eine für die aufrechte Beobachtung geeignete Anordnung zur Lichtblattmikroskopie. Diese umfasst ein Probengefäß 1 zur Aufnahme einer in einem Medium 2 befindlichen Probe 3. Das Probengefäß 1 ist hinsichtlich einer ebenen Bezugsfläche ausgerichtet, die hier durch einen Probentisch 4 definiert wird. Die Anordnung umfasst eine Beleuchtungsoptik mit einer Lichtquelle 5 und einem Beleuchtungsobjektiv 6 zur Beleuchtung der Probe 3 mit einem Lichtblatt, wobei die optische Achse 7 des Beleuchtungsobjektivs 6 und das Lichtblatt in einer Ebene liegen, die mit der Normalen der Bezugfläche einen von Null verschiedenen Beieuchtungswinkel ß einschließt. Die Anordnung umfasst außerdem eine Detektionsoptik mit einem Detektionsobjektiv 8, dessen optische Achse 9 mit der Normalen der Bezugsfläche einen von Null verschiedenen Detektionswinkel δ einschließt. Von der Probe 3 kommendes Licht wird auf einen Detektor 10 geleitet, dort registriert; die registrierten Signale werden einer Weiterverarbeitung und / oder einer Darstellung auf einem Bildschirm zugänglich gemacht.
Die Anordnung umfasst außerdem ein Trennschichtsystem mit einer Schicht oder mehreren Schichten vorgegebener Dicken und aus vorgegebenen Materialien zur räumlichen Trennung des Mediums 2, in welchem sich die Probe 3 befindet, von dem Beleuchtungsobjektiv 6 und dem Detektionsobjektiv 8. Das Trennschichtsystem weist eine parallel zur Bezugsfläche ausgerichtete Grenzfläche 11 auf, mit der es zumindest in dem für das Beleuchtungsobjektiv 6 und das Detektionsobjektiv 8 für die Beleuchtung und die Detektion zugänglichen Bereich vollständig oder zumindest nahezu vollständig mit dem Medium 2 in Kontakt steht. Beieuchtungswinkel ß und Detektionswinkel δ sind dabei anhand numerischer Aperturen NAD und NAB des Detektionsobjektivs 8 bzw. des Beleuchtungsobjektivs 6 vorgegeben.
Als Medium 2 kann beispielsweise Wasser verwendet werden, aber auch die Verwendung anderer Flüssigkeiten oder sogar von Gelen ist möglich.
Da Beleuchtungsobjektiv 6 und Detektionsobjektiv 8 nun nicht mehr direkt mit dem Medium 2 in Kontakt stehen, kann es nicht mehr zur Kontaminierung beim Wechsel zwischen zwei Probengefäßen mit verschiedenen Proben kommen. Durch das Trennschichtsystem, welches im einfachsten Fall aus einer Schicht Luft bestehen kann, kommt es jedoch aufgrund des Durchtritts von Licht durch die Grenzflächen zum Auftreten von Aberrationen, insbesondere von sphärischen Aberrationen und Koma. Um diese Aberrationen - bei schrägem Lichtdurchtritt in erster Linie Astigmatisums und Koma, in geringerem Umfang diese auch in höheren Ordnungen - zu verringern bzw. ganz zu vermeiden, sind verschiedene Maßnahmen möglich.
Eine erste, nicht zwingend notwendige, Maßnahme kann darin bestehen, den Beleuchtungswinkel ß und den Detektionswinkel δ anhand der numerischen Aperturen des Beleuchtungsobjektivs 6 und des Detektionsobjektivs 8 vorzugeben. Dies ist ebenfalls in Fig.1 gezeigt. Die numerische Apertur NAB des Beleuchtungsobjektivs 6 ist kleiner als die numerische Apertur NAD des Detektionsobjektivs 8. Da sich die Aberrationen bei Objektiven mit großer NA stärker bemerkbar machen, ist für solche Objektive eine Positionierung ihrer optischen Achse möglichst nah an der Normalen der Bezugsfläche, also mit einem besonders kleinen Winkel zu dieser vorteilhaft, da die Aberrationen auch um so größer werden, je schräger der Lichteinfall ist, desto größer als der Winkel ist, den die optische Achse des Objektivs mit der Normalen der Bezugsfläche einschließt. Für die Beleuchtung kann andererseits ein Objektiv mit einer kleineren numerischen Apertur verwendet werden, da für die Erzeugung eines Lichtblatts in der Regel numerische Aperturen von weniger als 0.5 ausreichend sind, während für die Detektion aufgrund der hohen Auflösung eine möglichst hohe numerische Apertur von 1.0 oder höher notwendig ist. In der in Fig.1 dargestellten Situation ist dies der Fall, die numerische Apertur NAB des Beleuchtungsobjektivs 6 ist kleiner als die numerische Apertur NAD des Detektionsobjektives 8. Der Beleuchtungswinkel ß kann daher größer als der Detektionswinkel δ gewählt werden. Bevorzugt ist dabei, wie auch in Fig.1 gezeigt, die Summe von Beleuchtungswinkel ß und Detektionswinkel δ 90°. Bei davon abweichenden Winkeln muss der Detektor 10 entsprechend schief gestellt werden, so dass die sogenannte Scheimpflugbedingung erfüllt ist.
Das Trennschichtsystem weist hier eine das Probengefäß abschließende, plattenförmige Abdeckung 12 aus einem vorgegebenen Material und von einer vorgegebenen Dicke auf. Eine erste Großfläche der plattenförmigen Abdeckung 12, die hier mit der Grenzfläche 11 zusammenfällt, steht mit dem Medium 2 zumindest in dem für das Beleuchtungsobjektiv 6 und das Detektionsobjektiv 8 für die Beleuchtung und die Detektion zugänglichen Bereich nahezu vollständig in Kontakt. Eine zweite Großfiäche 13 der Abdeckung 12 steht hier mit einem Gas, beispielsweise Luft, in Kontakt und bildet eine weitere Grenzfläche. Anstelle des Gases kann auch ein Immersionsmedium als weitere Komponente des Trennschichtsystems verwendet werden, welches mit der zweiten Großfläche 13 der Abdeckung ebenfalls zumindest in dem für das Beleuchtungsobjektiv 6 und das Detektionsobjektiv 8 für die Beleuchtung für die Detektion zugänglichen Bereich in Kontakt steht. Die zweite Großfläche 13 wirkt ebenfalls als Grenzfläche und wird im folgenden auch gelegentlich als solche bezeichnet.
Durch die Ausrichtung des Beleuchtungsobjektivs 6 und des Detektionsobjektivs 8 hinsichtlich ihrer Winkel zur Normalen der Bezugsfläche lassen sich die Aberrationen, die insbesondere durch den schrägen Durchtritt des Lichts durch die Grenzflächen entstehen, zwar bis zu einem gewissem Grad minimieren, sind jedoch immer noch so stark, dass für detaillierte Aufnahmen insbesondere bei hohen numerischen Aperturen bei der Detektion weitere Korrekturen notwendig sind. Die Beleuchtungsoptik und / oder die Detektionsoptik umfasst daher Korrekturmittel zur Verringerung von solchen Aberrationen, welche durch den schrägen Durchtritt von Beleuchtungslicht und / oder zu detektierendem Licht durch Grenzflächen 11, 13 des Trennschichtsystems entstehen. Diese Korrekturmittel können beispielsweise Korrekturlinsen und / oder Korrekturelemente im Beleuchtungsobjektiv 6 und / oder im Detektionsobjektiv umfassen. Beispielsweise können die Korrekturlinsen als Zylinderlinsen, als gegen die optische Achse verkippte und / oder nicht axial angeordnete Linsen und / oder als Korrekturelemente mit asphärischen Flächen oder Freiformflächen ausgebildet sein. Fig.1 zeigt als Beispiel eine nicht axial angeordnete Linse 14 im Beleuchtungsobjektiv 6 und eine außeraxial angeordnete Linse 15 im Detektionsobjektiv 8.
In Fig.2 ist eine Anordnung zur Lichtblattmikroskopie gezeigt, deren Komponenten ähnlich wie in Fig.1 aufgebaut und angeordnet sind, mit dem Unterschied, dass hier Beleuchtungsobjektiv 6 und Detektionsobjektiv 8 unterhalb des Probengefäßes 1 angeordnet sind, es handelt sich also um eine Anordnung zur inversen Lichtblattmikroskopie. Die Abdeckung 12 wird in diesem Fall durch den Boden des Probengefäßes 1 gebildet. Eine solche inverse Anordnung eignet sich insbesondere auch für die Analyse von Proben in Mikrotiterplatten, da die Proben in der Regel aufgrund der Schwerkraft am Gefäßboden lokalisiert sind, so dass sie für einen inversen Aufbau leichter zugänglich sind als für einen aufrechten Aufbau, da die Vertiefungen sehr eng konzipiert und von oben der Beobachtung nur schwer zugänglich sind. Wenn Beleuchtungsobjektiv 6 und Detektionsobjektiv 8 oberhalb des Probengefäßes 1 angeordnet sind, wird man daher zweckmäßig Probengefäße 1 verwenden, welche Mittel zur Positionierung der Probe 3 in oberen Bereich des Probengefäßes 1 aufweisen, so dass die Probe 3 auch von oben zugänglich wird.
In weiteren Ausgestaltungen der Anordnung zur Lichtblattmikroskopie, die in den Figuren 3 und 4 dargestellt sind, umfasst die Anordnung Korrekturmittel, die im Beleuchtungsstrahlengang und / oder im Detektionsstrahlengang angeordnet sind, und bei denen es sich um adaptive optische Elemente zur Manipulation der Phasenfronten des Beleuchtungs- bzw. des Detektionslrchts handelt. Bevorzugt werden als adaptive optische Elemente verformbare Spiegel, räumliche Lichtmodulatoren oder Phasenplatten eingesetzt. Diese Korrekturmittel lassen sich selbstverständlich mit korrigierten Objektiven, wie sie auch in den Figuren 1 und 2 gezeigt sind, kombinieren. In den Figuren 3 und 4 ist nur der inverse Aufbau der Anordnung zur Lichtblattmikroskopie gezeigt, in äquivalenter Weise zu den Figuren 1 und 2 lässt sich auch ohne weiteres ein Aufbau konstruieren, bei dem Beleuchtungsobjektiv 6 und Detektionsobjektiv 8 oberhalb des Probengefäßes 1 angeordnet sind. Auch eine liegende Anordnung, bei der die optische Achse 7 des Beleuchtungsobjektivs 6 und die optische Achse 9 des Detektionsobjektivs 8 in einer horizontalen Ebene liegen und die Bezugsfläche vertikal ausgerichtet ist, ist realisierbar. Grundsätzlich ist auch eine schräge Anordnung denkbar.
In Fig.3 ist eine Anordnung gezeigt, die zunächst ähnlich dem Aufbau in Fig.2 ist. Eine Probe 3 ist in einem Probengefäß 1 gelagert, welches auf einem Probentisch 4 angeordnet ist. Die Probe befindet sich in einem Medium 2, beispielsweise Wasser. Der Einfachheit halber und nur beispielhaft sind Beleuchtungsobjektiv 6 und Detektionsobjektiv 8 hier identisch ausgeführt, sie können daher in einem Winkel von jeweils 45° zur Normalen der Bezugsfläche angeordnet werden. Im Beleuchtungsstrahlengang ist ein verformbarer Spiegel 16 angeordnet, im Detektionsstrahlengang ein verformbarer Spiegel 17, auf den das zu delektierende Licht trifft, bevor es über eine Linse 18 auf den Detektor 10 abgebildet wird. Die verformbaren Spiegel 16 und 17, die auch durch räumliche Lichtmodulatoren oder Phasenplatten an diesen Positionen ersetzt werden können, sind ansteuerbar und somit sowohl an verschiedene Beleuchtungswinkel ß und Detektionswinkel 5, als auch an verschiedene Objektivkonfigurationen und verschiedene Trennschichtsysteme, insbesondere verschiedene Abdeckungen 12 anpassbar. Auf diese Weise können die Aberrationen nahezu vollständig korrigiert werden. Verformbare Spiegel und räumliche Lichtmodulatoren lassen sich außerdem zusätzlich dazu verwenden, solche Aberrationen, die durch die Probe verursacht werden, zu korrigieren.
Ein etwas vereinfachter Aufbau, bei dem Beleuchtungsobjektiv 6 und Detektionsobjektiv 8 identisch aufgebaut sind und Beleuchtungswinkel ß und Detektionswinkel δ ebenfalls identisch sind, bei dem es jedoch ausreicht, nur einen verformbaren Spiegel 19 zu verwenden, ist in Fig.4 dargestellt. Dazu ist vor der Lichtquelle 5 ein Strahlteiler 20 angeordnet, welcher für den Beleuchtungswellenlängenbereich durchlässig ist und für die zu detektierenden Wellenlängen des Fluoreszenzlichts reflektierend ausgestaltet ist. Auch vor dem Detektor 10 ist ein Strahlteiler 21 angeordnet, welcher seinerseits für den zu detektierenden Detektionswellenlängenbereich durchlässig ist, jedoch für den Beleuchtungswellenlängenbereich reflektierend ausgestaltet ist. Durch die Einsparung eines verformbaren Spiegels lässt sich die Anordnung kostengünstiger herstellen.
Eine weitere Möglichkeit zur Verminderung bzw. Vermeidung von Aberrationen, die mit den bereits genannten Möglichkeiten der Korrekturmittel in den Strahlengängen bzw. in den Objektiven kombiniert werden kann, besteht darin, für die Abdeckung 12 ein Material zu wählen, welches einen Brechungsindex aufweist, der sich von dem Brechungsindex des Mediums 2, in welchem die Probe 3 eingebettet ist, um weniger als 5% unterscheidet. Die Aberrationen werden dadurch bereits stark verringert, die Korrekturmittel müssen dann nicht mehr so stark in den Strahlengang eingreifen, wie ohne eine solche Maßnahme, was die Hersteilung vereinfacht und kostengünstiger macht, beispielsweise indem anstelle von Freiformflächen auch asphärische Linsen eingesetzt werden können. Wird beispielsweise Wasser als Medium 2 verwendet, in welchem sich die Probe 3 befindet, so kann als Material für die Abdeckung 12 beispielsweise PTFE, CYTOP®, FEP, Teflon® AF, oder ein perfluordioxolanes Polymer verwendet werden. Wird ein amorphes Polymer wie beispielsweise Teflon® AF verwendet, so ist dessen Glasübergangstemperatur bevorzugt so eingestellt, dass das Polymer im erkaltetem Zustand den Brechungsindex des Mediums 2, in welchem sich die Probe 3 befindet, aufweist. Wird zusätzlich noch Wasser als Immersionsmedium auf der anderen Seite der Abdeckung 12 verwendet, so kann, wenn die Brechungsindizes identisch sind oder sich nur im Promillebereich unterscheiden, das Auftreten von Aberrationen beim Lichtdurchtritt durch die Grenzflächen vollständig vermieden werden.
Eine andere Möglichkeit, das Auftreten von Aberrationen zu verringern bzw. zu vermeiden, besteht schließlich darin, als Material für die Abdeckung 12 ein nanostrukturiertes Material aus einer ersten Komponente 22 und einer zweiten Komponente 23 zu verwenden. Der Brechungsindex der ersten Komponente 22 ist kleiner als der Brechungsindex des Mediums 2 zur Aufnahme der Probe, der Brechungsindex der zweiten Komponente 23 ist größer als der Brechungsindex des Mediums 2 zur Aufnahme der Probe 3. Aus diesen beiden Komponenten 22 und 23 lässt sich ein nanostrukturiertes Material herstellen, welches einen effektiven Brechungsindex hat, der sich von dem Brechungsindex des Mediums 2 um weniger als 5 % unterscheidet. Voraussetzung dafür ist, dass in dem nanostrukturierten Material die mittleren Strukturgrößen bzw. mittleren Durchmesser von Bereichen aus der ersten Komponente 22 kleiner als die Lichtwellenlänge des zur Beleuchtung verwendeten und des zu detektierenden Lichts sind. In einfachster Näherung ergibt sich der effektive Brechungsindex aus dem Volumenverhältnis der beiden Komponenten. Im Falle von Wasser als Medium 2 zur Aufnahme der Probe 3, welches einen Brechungsindex nd = 1,33 aufweist, eignet sich als erste Komponente 22 besonders Luft, was die Verwendung von nanoporösen Materialien ermöglicht.
Ein Beispiel für ein solches nanostrukturiertes Material ist in Fig.5 gezeigt, nanostrukturiertes Siliziumdioxid. Dort ist ein stark vergrößerter Ausschnitt aus einer Abdeckung 12, die beispielsweise den Gefäßboden oder den Gefäßdeckel bilden kann, dargestellt. Als zweite Komponente 23 kann beispielsweise Siliziumdioxid gewählt werden, als erste Komponente 22 lässt sich in diesem Fall Luft verwenden. Der Brechungsindex von Wasser liegt zwischen den Brechungsindizes der beiden Komponenten. Das Siliziumdioxid als zweite Komponente 23 weist, wenn als erste Komponente 22 Luft verwendet wird, beispielsweise zylinderförmige Öffnungen auf, deren Durchmesser kleiner als die verwendeten Lichtwellenlängen sind. Die Zeichnung dient dabei nur der Veranschaulichung, tatsächlich können die Öffnungen auch eher zufällige, beispielsweise durch Ätzen erzeugte, Formen aufweisen. Wesentlich ist das Volumenverhältnis sowie dass sichergestellt ist, dass die mittleren Öffnungsdurchmesser kleiner als die verwendeten bzw. zu detektierenden Lichtwellenlängen sind.
Anstelle eines nanostrukturierten Materials kann auch ein aus zwei Komponenten gemischtes Material oder entmischtes Material verwendet werden.
Um die Aberrationen so gering wie möglich zu halten, ist es außerdem vorteilhaft, die Dicke der Abdeckung 12 in jedem der Fälle so gering wie möglich zu wählen, hier genügt eine Dicke von wenigen hundert μm für eine als Gefäßboden ausgestaltete Abdeckung 12 und von wenigen μm für eine als Folie ausgestaltete Abdeckung 12, die als Deckel für das Probengefäß 1 dient.
Mit den vorangehend beschriebenen Anordnungen für die Lichtblattmikroskopie lässt sich das Auftreten von Kontaminierungen beim Probenwechsel insbesondere im Rahmen eines Verfahrens, bei dem ein hoher Durchsatz erwünscht ist, vermeiden. Insbesondere im Falle einer Anordnung von Beleuchtungsobjektiv 6 und Detektionsobjektiv 8 unterhalb des Probengefäßes 1 lassen sich auch entsprechende Mikrotiterplatten mit flachen Gefäßböden und einer Vielzahl von Vertiefungen verwenden.
Bezugszeichenliste
1 Probengefäß
2 Medium
3 Probe
4 Probentisch
5 Lichtquelle
6 Beleuchtungsobjektiv
7 optische Achse
8 Detektionsobjektrv
9 optische Achse
10 Detektor
11 Grenzfläche / erste Großfläche
12 Abdeckung
13 Grenzfläche / zweite Großfläche
14, 15 nicht axiale Linse
16, 17 verformbarer Spiegel
18 Linse
19 verformbarer Spiegel
20, 21 Strahlteiler
22 erste Komponente
23 zweite Komponente

Claims

Patentansprüche 1 . Anordnung zur Lichtblattmikroskopie, umfassend
ein Probengefäß (1) zur Aufnahme einer in einem Medium (2) befindlichen Probe (3), wobei das Probengefäß (1) hinsichtlich einer ebenen Bezugsfläche ausgerichtet ist, eine Beleuchtungsoptik mit einem Beleuchtungsobjektiv (6) zur Beleuchtung der Probe (3) mit einem Lrchtblatt, wobei die optische Achse (7) des Beleuchtungsobjektivs (6) und das Lichtblatt in einer Ebene liegen, die mit der Normalen der Bezugsfläche einen von Null verschiedenen Beleuchtungswinkel ß einschließt,
eine Detektionsoptik mit einem Detektionsobjektiv (8), dessen optische Achse (9) mit der Normalen der Bezugsfläche einen von Null verschiedenen Detektionswinkel δ einschließt, dadurch gekennzeichnet, dass
die Anordnung ein Trennschichtsystem mit einer oder mehreren Schichten mit vorgegebenen Dicken und aus vorgegebenen Materialien zur räumlichen Trennung des Mediums (2), in welchem sich die Probe (3) befindet, von dem Beleuchtungsobjektiv (6) und dem Detektionsobjektiv (8) umfasst, wobei das Trennschichtsystem mit einer parallel zur Bezugsfläche ausgerichteten Grenzfläche (11 ) zumindest in dem für das Beleuchtungsobjektiv (6) und das Detektionsobjektiv {8} für die Beleuchtung und die Detektion zugänglichen Bereich mit dem Medium (2) in Kontakt steht, und dass
Beleuchtungswinkel ß und Detektionswinkel δ anhand numerischer Aperturen NAD, NAB des Detektionsobjektivs (8) bzw. des Beleuchtungsobjektivs (6) vorgegeben sind.
2. Anordnung zur Lichtblattmikroskopie nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die numerische Apertur NAs des Beieuchtungsobjektivs (6) kleiner als die numerische Apertur NAD des Detektionsobjektivs (8) und der Beleuchtungswinkel ß größer als der Detektionswinkel δ ist, oder dass Beleuchtungsobjektiv (6) und Detektionsobjektiv (8) identisch aufgebaut sind und der Beleuchtungswinkel ß gleich dem Detektionswinkel δ ist, wobei die Summe von Beleuchtungswinkel ß und Detektionswinkel δ jeweils bevorzugt 90° ist.
3. Anordnung zur Lichtblattmikroskopie nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Beleuchtungsoptik und / oder die Detektionsoptik Korrekturmittel zur Verringerung von solchen Aberrationen umfasst, welche durch den schrägen Durchtritt von Beleuchtungslicht und/oder zu detektierendem Licht durch Grenzflächen (11, 13) des Trennschichtsystems entstehen.
4. Anordnung zur Lichtblattmikroskopie nach Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet, dass die Korrekturmittel Korrekturlinsen und / oder Korrekturelemente im Beleuchtungsobjektiv (6) und / oder im Detektionsobjektiv (8) umfassen.
5. Anordnung zur Lichtblattmikroskopie nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Korrekturlinsen als Zylinderlinsen, als gegen die optische Achse (7, 9) verkippte Linsen und/oder nicht axial angeordnete Linsen (14, 15), und die Korrekturelemente als Elemente mit asphärischen Flächen oder Freiformflächen ausgebildet sind.
6. Anordnung zur Lichtblattmikroskopie nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Korrekturmittel im BeJeuchtungsstrahlengang und / oder im Detektionsstrahlengang angeordnete adaptive optische Elemente zur Manipulation der Phasenfronten des Beleuchtungs- und / oder des Detektionslichts umfassen, bevorzugt verformbare Spiegel (16, 17), räumliche Lichtmodulatoren, oder Phasenplatten.
7. Anordnung zur Lichtblattmikroskopie nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Trennschichtsystem eine das Probengefäß (1) abschließende, plattenförmige oder folienförmige Abdeckung (12) aus einem vorgegebenen Material und von einer vorgegebenen Dicke umfasst, wobei eine erste Großfläche der plattenförmigen oder folienförmigen Abdeckung (12) mit dem Medium (2) zumindest in dem für das Beleuchtungsobjektiv (6) und das Detektionsobjektiv (8) für die Beleuchtung und die Detektion zugänglichen Bereich nahezu vollständig in Kontakt steht und eine zweite Großfläche der Abdeckung mit einem Gas, bevorzugt Luft, oder einem Immersionsmedium als weiterer Komponente des Trennschichtsystems zumindest in dem für das Beleuchtungsobjektiv (6) und das Detektionsobjektiv (8) für die Beleuchtung und die Detektion zugänglichen Bereich in Kontakt steht.
8. Anordnung zur Lichtblattmikroskopie nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Material für die Abdeckung (12) einen Brechungsindex aufweist, welcher sich von dem Brechungsindex des Mediums (2), in welchem sich die Probe (3) befindet, um weniger als 5% unterscheidet.
9. Anordnung zur Lichtblattmikroskopie nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium (2), in welchem sich die Probe (3) befindet, Wasser ist, und dass das Material für die Abdeckung (12) PTFE, CYTOP® FEP, Teflon® AF oder ein perfluorodioxolanes Polymer ist.
10. Anordnung zur Lichtmikroskopie nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Abdeckung (12) aus einem amorphen Polymer ist, dessen Glasübergangstemperatur so eingestellt ist, dass das Polymer im erkalteten Zustand den Brechungsindex des Mediums (2), in welchem sich die Probe (3) befindet, aufweist.
11. Anordnung zur Lichtblattmikroskopie nach Anspruch 8 dadurch gekennzeichnet, dass das Material für die Abdeckung (12) ein nanostrukturiertes Material aus einer ersten Komponente (22) und einer zweiten Komponente (23) ist, wobei der Brechungsindex der ersten Komponente (22) kleiner und der Brechungsindex der zweiten Komponente (23) größer als der Brechungsindex des Mediums (2) ist, und wobei die mittleren Strukturgrößen von Bereichen aus der ersten Komponente (22) einen mittleren Durchmesser aufweisen, der geringer als die Lichtwellenlängen des zur Beleuchtung verwendeten und des zu detektierenden Lichts ist.
12. Anordnung zur Lichtblattmikroskopie nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchtungsobjektiv (6) und das Detektionsobjektiv (8) unterhalb des Probengefäßes (1) angeordnet sind.
13. Anordnung zur Lichtblattmikroskopie nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchtungsobjektiv (6) und das Detektionsobjektiv (8) oberhalb des Probengefäßes (1) angeordnet sind und das Probengefäß (1) Mittel zur Positionierung der Probe (3) im oberen Viertel des Probengefäßes (1), bezogen auf seine Tiefe, aufweist.
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