JP5980471B2 - 収差補正方法、この収差補正方法を用いた顕微鏡観察方法、この収差補正方法を用いたレーザ照射方法、収差補正装置、及び、収差補正プログラム - Google Patents

Description

本発明は、レーザ照射装置、特に液浸対物レンズを備える顕微鏡観察装置に用いるレーザ照射装置の収差を補正する収差補正方法、この収差補正方法を用いた顕微鏡観察方法、この収差補正方法を用いたレーザ照射方法、収差補正装置、及び収差補正プログラムに関するものである。

レーザ照射装置は、レーザ加工装置や顕微鏡観察装置などの様々な光学装置に用いられている。この種のレーザ照射装置では、空間光変調器（以下、ＳＬＭという。）を備えるものがある。下記特許文献１〜５には、ＳＬＭを備えるレーザ照射装置が開示されている。

特許文献１及び２に記載のレーザ加工装置に用いられるレーザ照射装置は、ＳＬＭを用いて、照射対象物（加工対象物）に対するレーザ光の照射位置を制御しており、特許文献３に記載のレーザ加工装置に用いられるレーザ照射装置は、ＳＬＭを用いてレーザ光を制御している。また、特許文献４に記載のレーザ加工装置に用いられるレーザ照射装置は、レーザ光の波面の歪みを計測する手段を有し、計測した波面歪みをＳＬＭを用いて補正している。しかし、この方法では波面の歪みを計測する手段が必要であり、光学系が複雑になる上、レーザ加工や顕微鏡観察など波面の歪みを計測できない応用には適用できないという問題がある。

また、特許文献５には、レーザ光を透明媒質に集光すると収差が発生し、深さ方向に照射点（加工点）が長くなる問題点が記載されており、特許文献５に記載のレーザ加工装置に用いられるレーザ照射装置は、媒質の分散等により発生する色収差や回折素子での波長による光路変化を積極的に利用し、光源波長の波長ごとの強度を調整することにより照射位置（加工位置）の制御を行っている。

また、特許文献６には、既知の収差の逆の位相分布を入射光にＳＬＭ等の波面制御素子で与えることによって、収差を補正する方法が記述されている。ここで、非特許文献１では、平行平面基板を光学系に挿入することによって発生する球面収差を近軸近似のもとで解析的に求めている。レーザ光を透明媒質に集光することは、平行平面基板を光学系に挿入することと同等なので、非特許文献１に記載されている結果を、特許文献６の方法における既知の収差として取り扱うことで、レーザ光を透明媒質に集光することによって発生する球面収差を補正することが可能である。しかし、この方法では収差の逆の位相分布の位相範囲が波面制御素子の性能を超えて大きくなるため、媒質に対するレーザ照射位置が深い場合に適用できないという問題がある。さらに、正確なレーザ照射位置が求められないという問題もある。

これらの特許文献１〜６及び非特許文献１に記載のレーザ加工装置に用いられるレーザ照射装置に関する開示内容は、顕微鏡観察装置に用いられるレーザ照射装置にも応用可能である。特に、顕微鏡観察装置では、高い解像度での観察が行えることが望まれており、スライドガラス上のカバーガラスと対物レンズとの間を浸液（例えば、水や油）（雰囲気媒質）で満たした液浸対物レンズを用いることが考案されており（特許文献７）、この種の顕微鏡観察装置に用いられるレーザ照射装置に好適に応用可能である。

特開２００６−６８７６２号公報 特開２００６−１１９４２７号公報 特開２００２−２０７２０２号公報 特開２００６−１１３１８５号公報 特開２００５−２２４８４１号公報 国際公開第２００３／０３６３６８号パンフレット 特開平１０−３９２２０号公報

久保田広、「光学」、岩波書店、１９６７年、ｐ．１２８−１２７、ｐ．３００−３０１ Brenner M "Imaging dynamic events inliving tissue using water immersion objectives." American Laboratory 14:14-19 1994.

ところで、顕微鏡観察装置では、更なる高解像度での観察が行えることが望まれている。すなわち、レーザ光の集光点が極力小さいものが望まれている。しかしながら、観察対象物の内部に集光点を生成する場合、収差によって集光点が広がりピーク強度が低下し、分解能や像コントラストが低下する。その結果、良好な観察を行うことが困難となる。

特に、液浸対物レンズを用いた顕微鏡観察装置では、観察対象物がスライドガラスとカバーガラスとの間の溶液中においてカバーガラスと接している必要があるが、観察対象物がカバーガラスと接しておらず集光位置が深くなると、大きな球面収差が発生してしまう（非特許文献２）。その結果、上記したように、集光点が広がりピーク強度が低下して、分解能や像コントラストが低下し、良好な観察を行うことが困難となる。

そこで、本発明は、媒質に対するレーザ照射位置が深くても、レーザ光の集光度合を高めることが可能な収差補正方法、この収差補正方法を用いた顕微鏡観察方法、この収差補正方法を用いたレーザ照射方法、収差補正装置、及び、収差補正プログラムを提供することを目的としている。

本願発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、媒質に対するレーザ照射位置が深くなると、レーザ光を補正するための波面のＰＶ（peak to valley）値（ＰＶ値とは波面収差の最大値と最小値との差であり、位相変調量の大きさに相当する。）が大きくなり、空間光変調器などの波面を制御する素子の性能を超えるために、収差を十分に補正できなくなることを見出した。波面を制御できる空間光変調器には、独立した画素に電圧を印加する位相変調型の空間光変調器や、膜ミラーをアクチュエータで変形させる可変鏡などがある。一般に、独立した画素に電圧を印加する位相変調型の空間光変調器で物理的に与えることの出来る位相変調範囲は２π〜６π程度である。この範囲を物理的位相変調範囲と呼ぶことにする。しかし、位相折り畳み技術(Phasewrapping)を用いることで、実効的な位相変調範囲を数十波長程度に広げることができる。位相折り畳み技術によって、広げられた実効的な位相変調範囲を実効的位相変調範囲と呼ぶことにする。位相折り畳み技術とは、位相０と２ｎπ（ｎは整数）が同値であることを利用して、物理的位相変調範囲を超える値を有する位相分布を、物理的位相変調範囲内に折りたたむ技術である。しかし、レーザ光を補正するための波面において、空間光変調器における隣接する画素間の位相変調量の差が、物理的位相変調範囲を超えると位相折り畳み技術を適用できなくなる。そのため、空間光変調器における隣接する画素間の位相変調量の差が物理的位相変調範囲を超えると、収差を補正するための波面を十分に再現しきれず、集光度合が低下し、良好な顕微鏡観察が困難であった。可変鏡などの他の空間光変調器においては、物理的位相変調範囲は独立した画素に電圧を印加する位相変調型の空間光変調器よりも大きいが、それでも変調できる位相範囲に限界があるため、レーザ照射位置が深くなると、収差を十分に補正できなくなる。なお、可変鏡の場合、空間的に連続した位相分布しか変調できず、位相折り畳み技術を適用できないため、物理的位相変調範囲が実効的位相変調範囲に等しい。

そして、本願発明者らは、補正後のレーザ光の集光点の光軸方向の位置が、補正前の近軸光線の集光点の光軸方向の位置と補正前の最外縁光線の集光点の光軸方向の位置との間の範囲、すなわち媒質内部で縦収差が存在する範囲の間にあるように、レーザ光の収差を補正すると、収差補正のために与える波面変調のＰＶ値が低減されることを見出した。収差補正のための波面変調のＰＶ値が低減される結果、集光位置が深い場合においても、空間光変調器における隣接する画素間の位相変調量の差が小さくなり、位相折り畳み技術を適用できるようになる。以降では、位相折り畳みを適用する前の収差補正のための波面変調パターンを補正波面と呼び、それに位相折り畳みを適用したパターンを収差補正位相パターンと呼ぶことにする。

そこで、本発明の収差補正方法では、光透過性を有する媒質内部にレーザ光を集光するレーザ照射装置の収差補正方法において、レーザ照射装置は、媒質内部にレーザ光を集光するための集光手段であって、当該集光手段の雰囲気媒質の屈折率が媒質の屈折率より大きい当該集光手段を備えており、媒質の屈折率をｎ、媒質の入射面から集光手段が有する焦点距離における焦点までの深さをｄ、媒質によって発生する縦収差の最大値をΔｓと定義すると、レーザ光の集光点が、媒質の入射面からｎ×ｄ−Δｓより大きく、ｎ×ｄより小さい範囲に位置するように、レーザ光の収差を補正することによって、収差を補正しないときに媒質内部で縦収差が存在する範囲の間に位置するように、レーザ光の収差を補正することを特徴とする。

この収差補正方法によれば、レーザ光の集光点が、収差を補正しないときに媒質内部で縦収差が存在する範囲の間に位置するように、レーザ光の収差を補正するので、波面のＰＶ値を低減することができる。その結果、位相変調量に制限がある空間光変調器を用いても、収差補正のための位相変調量を低減させることで、空間光変調器の負担を減らし、高精度な波面制御を可能とする。その結果、媒質に対するレーザ照射位置が深くても、レーザ光の集光度合を高めることができ、レーザ光のピーク強度を高めることができる。その結果、顕微鏡観察装置における分解能や像コントラストを高めることができ、良好な観察を行うことが可能となる。特に、浸液（雰囲気媒質）の屈折率が媒質の屈折率より大きい液浸レンズを用いた顕微鏡観察装置において、観察対象物である媒質がカバーガラスと接しておらず集光位置が深くなっても、レーザ光の集光度合及びピーク強度を高めることができ、その結果、分解能や像コントラストを高めることができ、良好な観察を行うことが可能となる。また、これはカバーガラスに接した観察対象物である媒質の内部を観察する場合においても有効である。

上記した集光手段は液浸集光レンズであり、集光手段の雰囲気媒質は浸液であることが好ましい。上記したように、本発明の収差補正方法は、浸液の屈折率が媒質の屈折率より大きい液浸レンズを用いた顕微鏡観察装置に好適である。

また、上記したレーザ照射装置は、集光手段としての集光レンズと、レーザ光の収差を補正するための空間光変調器とを備えており、上記した収差補正方法では、集光レンズの入射部に対応する空間光変調器上の任意の画素における位相変調量と、上記画素に隣接する画素における位相変調量との位相差が位相折り畳み技術を適用できる位相範囲以下であることを特徴とする。

この構成によれば、隣接する画素間の位相差が小さくなるので、物理的位相変調範囲に限界がある空間光変調器での位相折り畳みの実現を可能にし、高精度な波面制御を可能とする。

また、上記した収差補正方法では、補正波面の位相値が極大点及び極小点を有するように、前記レーザ光の集光点を設定することを特徴とする。

このように、補正波面の位相値が極大点及び極小点を有するように集光点を設定することによって、補正波面のＰＶ値を低減することが可能となる。

本発明の顕微鏡観察方法は、レーザ光を生成する光源と、光源からのレーザ光の位相を変調するための空間光変調器と、空間光変調器からのレーザ光を観察対象物内部における観察位置に集光するための集光レンズであって、当該集光レンズの雰囲気媒質の屈折率が観察対象物の屈折率より大きい当該集光レンズとを備える顕微鏡観察装置の顕微鏡観察方法において、観察対象物内部における観察位置を設定し、観察対象物の屈折率をｎ、観察対象物の入射面から集光レンズが有する焦点距離における焦点までの深さをｄ、観察対象物によって発生する縦収差の最大値をΔｓと定義すると、観察位置が、観察対象物の入射面からｎ×ｄ−Δｓより大きく、ｎ×ｄより小さい範囲に位置するように、観察対象物の相対移動量を設定することによって、収差を補正しないときに観察対象物内部で縦収差が存在する範囲の間に位置するように、観察対象物の相対移動量を設定し、観察位置にレーザ光が集光するように補正波面を算出して、空間光変調器に表示し、観察対象物と集光レンズとの距離が相対移動量となるように、集光位置を相対的に移動し、光源からのレーザ光を観察対象物における観察位置へ照射する。

この顕微鏡観察方法によれば、観察位置が、収差を補正しないときに観察対象物内部で縦収差が存在する範囲の間に位置するように設定され、空間光変調器によって、この観察位置にレーザ光の集光点が位置するように、レーザ光の収差が補正されるので、波面のＰＶ値を低減することができる。その結果、位相変調量に制限がある空間光変調器を用いても、収差補正のための位相変調量を低減させることで、空間光変調器の負担を減らし、高精度な波面制御を可能とする。その結果、観察対象物に対するレーザ照射位置が深くても、レーザ光の集光度合を高めることができ、レーザ光のピーク強度を高めることができる。その結果、分解能や像コントラストを高めることができ、良好な観察を行うことが可能となる。特に、浸液（雰囲気媒質）の屈折率が媒質の屈折率より高い液浸レンズを用いた顕微鏡観察装置において、観察対象物がカバーガラスと接しておらず観察位置が深くなっても、レーザ光の集光度合及びピーク強度を高めることができ、その結果、分解能や像コントラストを高めることができ、良好な観察を行うことが可能となる。また、これはカバーガラスに接した観察対象物である媒質の内部を観察する場合においても有効である。

また、本発明のレーザ照射方法は、レーザ光を生成する光源と、光源からのレーザ光の位相を変調するための空間光変調器と、空間光変調器からのレーザ光を媒質内部の所定の集光位置に集光するための集光レンズであって、当該集光レンズの雰囲気媒質の屈折率が前記媒質の屈折率より大きい当該集光レンズとを備える媒質内レーザ集光装置のレーザ照射方法において、媒質内部における集光位置を設定し、媒質の屈折率をｎ、媒質の入射面から集光レンズが有する焦点距離における焦点までの深さをｄ、媒質によって発生する縦収差の最大値をΔｓと定義すると、集光位置が、媒質の入射面からｎ×ｄ−Δｓより大きく、ｎ×ｄより小さい範囲に位置するように、媒質の相対移動量を設定することによって、収差を補正しないときに媒質内部で縦収差が存在する範囲の間に位置するように、媒質の相対移動量を設定し、集光位置にレーザ光が集光するように補正波面を算出して、空間光変調器に表示し、媒質と集光レンズとの距離が相対移動量となるように、集光位置を相対的に移動し、光源からのレーザ光を媒質における集光位置へ照射する。

このレーザ照射方法によれば、集光位置が、収差を補正しないときに媒質内部で縦収差が存在する範囲の間に位置するように設定され、空間光変調器によって、この集光位置にレーザ光の集光点が位置するように、レーザ光の収差が補正されるので、波面のＰＶ値を低減することができる。その結果、位相変調量に制限がある空間光変調器を用いても、収差補正のための位相変調量を低減させることで、空間光変調器の負担を減らし、高精度な波面制御を可能とする。その結果、媒質に対するレーザ照射位置が深くても、レーザ光の集光度合を高めることができ、レーザ光のピーク強度を高めることができる。その結果、顕微鏡観察装置における分解能や像コントラストを高めることができ、良好な観察を行うことが可能となる。特に、浸液（雰囲気媒質）の屈折率が媒質の屈折率より大きい液浸レンズを用いた顕微鏡観察装置において、観察対象物である媒質がカバーガラスと接しておらず集光位置が深くなっても、レーザ光の集光度合及びピーク強度を高めることができ、その結果、分解能や像コントラストを高めることができ、良好な観察を行うことが可能となる。また、これはカバーガラスに接した観察対象物である媒質の内部を観察する場合においても有効である。

また、本発明の別の収差補正方法は、光透過性を有する媒質内部にレーザ光を集光するレーザ照射装置の収差補正方法において、レーザ照射装置は、媒質内部にレーザ光を集光するための集光手段であって、当該集光手段の雰囲気媒質の屈折率が媒質の屈折率より大きい当該集光手段を備えており、（ａ）媒質の屈折率をｎ、媒質の入射面から集光手段が有する焦点距離における焦点までの深さをｄ、媒質によって発生する縦収差の最大値をΔｓと定義すると、レーザ光の集光点が、媒質の入射面からｎ×ｄ−Δｓより大きく、ｎ×ｄより小さい範囲に位置するように、レーザ光の収差を補正することによって、収差を補正しないときに媒質内部で縦収差が存在する範囲の間に位置するように、レーザ光の収差を補正するための補正波面であって、媒質内部の複数の観察位置にそれぞれ対応する複数の当該補正波面と、媒質内部の複数の観察位置にそれぞれ対応する複数の媒質表面から媒質がないときの集光点の位置までの距離（媒質移動量）とを求める第１の補正波面生成ステップと、（ｂ）複数の媒質表面から媒質がないときの集光点の位置までの距離の高次多項式近似を行うことによって第１の高次多項式を求める第１の多項式近似ステップと、（ｃ）複数の補正波面の高次多項式近似をそれぞれ行うことによって複数の第２の高次多項式を求める第２の多項式近似ステップと、（ｄ）複数の第２の高次多項式における同一次数項の係数からなる複数の係数列の高次多項式近似をそれぞれ行うことによって、観察位置をパラメータとする複数の第３の高次多項式を求める第３の多項式近似ステップと、（ｅ）第１の高次多項式における複数の次数項の係数と、複数の第３の高次多項式における複数の次数項の係数とを記憶する記憶ステップと、（ｆ）第１の高次多項式における複数の次数項の係数と、第１の高次多項式と、複数の第３の高次多項式における複数の次数項の係数及び複数の第３の高次多項式を用いて、複数の第２の高次多項式に相当する任意の観察位置の第２の高次多項式を求め、当該第２の高次多項式を用いて当該任意の観察位置の補正波面を求める第２の補正波面生成ステップと、を含むことを特徴とする。

また、本発明の収差補正装置は、光透過性を有する媒質内部にレーザ光を集光するレーザ照射装置のための収差補正装置において、レーザ照射装置は、媒質内部にレーザ光を集光するための集光手段であって、当該集光手段の雰囲気媒質の屈折率が媒質の屈折率より大きい当該集光手段を備えており、（ａ）媒質の屈折率をｎ、媒質の入射面から集光手段が有する焦点距離における焦点までの深さをｄ、媒質によって発生する縦収差の最大値をΔｓと定義すると、レーザ光の集光点が、媒質の入射面からｎ×ｄ−Δｓより大きく、ｎ×ｄより小さい範囲に位置するように、レーザ光の収差を補正することによって、収差を補正しないときに媒質内部で縦収差が存在する範囲の間に位置するように、レーザ光の収差を補正するための補正波面であって、媒質内部の複数の観察位置にそれぞれ対応する複数の当該補正波面と、媒質内部の複数の観察位置にそれぞれ対応する複数の媒質表面から媒質がないときの集光点の位置までの距離（媒質移動量）とを求める第１の補正波面生成手段と、（ｂ）複数の媒質表面から媒質がないときの集光点の位置までの距離の高次多項式近似を行うことによって第１の高次多項式を求める第１の多項式近似手段と、（ｃ）複数の補正波面の高次多項式近似をそれぞれ行うことによって複数の第２の高次多項式を求める第２の多項式近似手段と、（ｄ）複数の第２の高次多項式における同一次数項の係数からなる複数の係数列の高次多項式近似をそれぞれ行うことによって、観察位置をパラメータとする複数の第３の高次多項式を求める第３の多項式近似手段と、（ｅ）第１の高次多項式における複数の次数項の係数と、複数の第３の高次多項式における複数の次数項の係数を記憶する記憶手段と、（ｆ）第１の高次多項式における複数の次数項の係数と、第１の高次多項式と、複数の第３の高次多項式における複数の次数項の係数及び複数の第３の高次多項式を用いて、複数の第２の高次多項式に相当する任意の観察位置の第２の高次多項式を求め、当該第２の高次多項式を用いて当該任意の観察位置の補正波面を求める第２の補正波面生成手段と、を備えることを特徴とする。

また、本発明の収差補正プログラムは、光透過性を有する媒質内部にレーザ光を集光するレーザ照射装置のための収差補正プログラムにおいて、レーザ照射装置は、媒質内部にレーザ光を集光するための集光手段であって、当該集光手段の雰囲気媒質の屈折率が媒質の屈折率より大きい当該集光手段を備えており、コンピュータを、（ａ）媒質の屈折率をｎ、媒質の入射面から集光手段が有する焦点距離における焦点までの深さをｄ、媒質によって発生する縦収差の最大値をΔｓと定義すると、レーザ光の集光点が、媒質の入射面からｎ×ｄ−Δｓより大きく、ｎ×ｄより小さい範囲に位置するように、レーザ光の収差を補正することによって、収差を補正しないときに媒質内部で縦収差が存在する範囲の間に位置するように、レーザ光の収差を補正するための補正波面であって、媒質内部の複数の観察位置にそれぞれ対応する複数の当該補正波面と、媒質内部の複数の観察位置にそれぞれ対応する複数の媒質表面から媒質がないときの集光点の位置までの距離（媒質移動量）とを求める第１の補正波面生成手段と、（ｂ）複数の媒質表面から媒質がないときの集光点の位置までの距離の高次多項式近似を行うことによって第１の高次多項式を求める第１の多項式近似手段と、（ｃ）複数の補正波面の高次多項式近似をそれぞれ行うことによって複数の第２の高次多項式を求める第２の多項式近似手段と、（ｄ）複数の第２の高次多項式における同一次数項の係数からなる複数の係数列の高次多項式近似をそれぞれ行うことによって、観察位置をパラメータとする複数の第３の高次多項式を求める第３の多項式近似手段と、（ｅ）第１の高次多項式における複数の次数項の係数と、複数の第３の高次多項式における複数の次数項の係数を記憶する記憶手段と、（ｆ）第１の高次多項式における複数の次数項の係数と、第１の高次多項式と、複数の第３の高次多項式における複数の次数項の係数及び複数の第３の高次多項式を用いて、複数の第２の高次多項式に相当する任意の観察位置の第２の高次多項式を求め、当該第２の高次多項式を用いて当該任意の観察位置の補正波面を求める第２の補正波面生成手段と、として機能させる。

これらの別の収差補正方法、本発明の収差補正装置及び収差補正プログラムによれば、レーザ光の集光点が、収差を補正しないときに媒質内部で縦収差が存在する範囲の間に位置するようにレーザ光の収差を補正するための補正波面を予め求め、この補正波面の高次多項式近似による近似式を用いて任意の観察位置における補正波面を求めるので、この任意の観察位置の補正波面は、レーザ光の集光点が、収差を補正しないときに媒質内部で縦収差が存在する範囲の間に位置するようにレーザ光の収差を補正することができ、波面のＰＶ値を低減することができる。その結果、位相変調量に制限がある空間光変調器を用いても、収差補正のための位相変調量を低減させることで、空間光変調器の負担を減らし、高精度な波面制御を可能とする。その結果、媒質に対するレーザ照射位置が深くても、レーザ光の集光度合を高めることができ、レーザ光のピーク強度を高めることができる。その結果、顕微鏡観察装置における分解能や像コントラストを高めることができ、良好な観察を行うことが可能となる。特に、浸液（雰囲気媒質）の屈折率が媒質の屈折率より大きい液浸レンズを用いた顕微鏡観察装置において、観察対象物である媒質がカバーガラスと接しておらず集光位置が深くなっても、レーザ光の集光度合及びピーク強度を高めることができ、その結果、分解能や像コントラストを高めることができ、良好な観察を行うことが可能となる。また、これはカバーガラスに接した観察対象物である媒質の内部を観察する場合においても有効である。

ここで、収差の形状や大きさは集光位置により異なるので、観察位置を変更する観察では、その都度、補正波面を求め直す必要があり、その算出時間が大きかった。例えば、レーザ光の集光点が、収差を補正しないときに媒質内部で縦収差が存在する範囲の間に位置するように補正波面を求めるためには、複数のパラメータに関して多重の探索を行うことによって適切な値を導き出す必要があり、多大な計算時間を要していた。その結果、観察位置を変えながら観察を行う場合には、観察中の探索処理により、観察速度の低下を招いてしまうこととなる。

しかしながら、これらの別の収差補正方法、本発明の収差補正装置及び収差補正プログラムによれば、複数の観察位置に対する補正波面を予め求め、これらの補正波面の高次多項式近似を行っているので、この近似式による演算を行うだけで適切な補正波面を求めることができる。その結果、観察位置を変更する際に補正波面を求め直す時間を短縮することができ、観察速度の低下を低減することができる。また、上記した探索処理により実際に求めた観察位置と異なる任意の観察位置に対しても、適切な補正波面を求めることができる。

また、本発明の更に別の収差補正方法では、光透過性を有する媒質内部に照射光を集光する光照射装置の収差補正方法において、光照射装置は、媒質内部に照射光を集光するための集光手段であって、当該集光手段の雰囲気媒質の屈折率が媒質の屈折率より大きい当該集光手段を備えており、媒質の屈折率をｎ、媒質の入射面から集光手段が有する焦点距離における焦点までの深さをｄ、媒質によって発生する縦収差の最大値をΔｓと定義すると、照射光の集光点が、媒質の入射面からｎ×ｄ−Δｓより大きく、ｎ×ｄより小さい範囲に位置するように、照射光の収差を補正することによって、媒質内部に発生する収差範囲の間に位置するように、照射光の収差を補正することを特徴とする。

この収差補正方法によれば、照射光の集光点が、媒質内部に発生する収差範囲の間に位置するように、すなわち、収差を補正しないときに媒質内部で縦収差が存在する範囲の間に位置するように、照射光の収差を補正するので、波面のＰＶ値を低減することができる。その結果、位相変調量に制限がある空間光変調器を用いても、収差補正のための位相変調量を低減させることで、空間光変調器の負担を減らし、高精度な波面制御を可能とする。その結果、媒質に対する光照射位置が深くても、照射光の集光度合を高めることができ、レーザ光のピーク強度を高めることができる。その結果、顕微鏡観察装置における分解能や像コントラストを高めることができ、良好な観察を行うことが可能となる。特に、浸液（雰囲気媒質）の屈折率が媒質の屈折率より大きい液浸レンズを用いた顕微鏡観察装置において、観察対象物である媒質がカバーガラスと接しておらず集光位置が深くなっても、レーザ光の集光度合及びピーク強度を高めることができ、その結果、分解能や像コントラストを高めることができ、良好な観察を行うことが可能となる。また、これはカバーガラスに接した観察対象物である媒質の内部を観察する場合においても有効である。

本発明によれば、媒質に対するレーザ照射位置が深くても、レーザ光の集光度合を高めることができる。

第１の実施形態に係る顕微鏡観察装置（レーザ照射装置、レーザ集光装置）の構成を示す図である。 図１に示す顕微鏡観察装置の構成を簡略化した示す図である。 集光光学系に平行平面が挿入された場合のレーザ光の光路を示す図である。 集光点が平行平面内部にある場合のレーザ光の光路を示す図である。 図４に示す集光光学系における補正波面の位相変調量を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る収差補正方法、顕微鏡観察方法及びレーザ照射方法を説明するためのレーザ光の光路を示す図である。 図６に示す集光光学系における補正波面の位相変調量を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る収差補正方法、顕微鏡観察方法及びレーザ照射方法の手順を示すフローチャートである。 第２の実施形態に係る顕微鏡観察装置（レーザ照射装置、レーザ集光装置）、及び、本発明の実施形態に係る収差補正装置の構成を示す図である。 第１の補正波面生成手段によって生成される複数の補正波面の位相変調量を示す図である。 第２の多項式近似手段によって求められる複数の第２の高次多項式を示す図である。 図１１に示す複数の第２の高次多項式における同一次数項の係数からなる複数の係数列をグラフ化した図である。 第３の多項式近似手段によって求められる複数の第３の高次多項式を示す図である。 図１３に示す複数の第３の高次多項式における複数の次数項の係数、及び、第１の高次多項式における係数列であって、記憶手段に記憶される係数データセットを示す図である。 本発明の第２の実施形態に係る収差補正方法を示すフローチャートである。 本発明の実施形態に係る収差補正プログラムの構成を、記録媒体と共に示す図である。 記録媒体に記録されたプログラムを実行するためのコンピュータのハードウェア構成を示す図である。 記録媒体に記憶されたプログラムを実行するためのコンピュータの斜視図である。 本発明の変形例に係る収差補正装置及び顕微鏡観察装置の構成を示す図である。 本発明の変形例に係る収差補正装置及び顕微鏡観察装置の構成を示す図である。 第２の実施形態の収差補正方法による補正波面の位相変調量を示す図である。 本発明の収差補正方法を用いた光照射装置の一例を示す図である。

以下、図面を参照して本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。なお、各図面において同一又は相当の部分に対しては同一の符号を附すこととする。
［第１の実施形態］

まず、本発明の第１の実施形態に係る収差補正方法、顕微鏡観察方法及びレーザ照射方法を説明する前に、この収差補正方法を用いる顕微鏡観察装置（レーザ照射装置、レーザ集光装置）について示す。

図１は、第１の実施形態に係る顕微鏡観察装置（レーザ照射装置、レーザ集光装置）の構成を示す図である。図１に示す顕微鏡観察装置１は、光源１０、レンズ２０、ミラー３０、空間光変調器（以下、ＳＬＭという。）４０、液浸対物レンズ（集光手段、集光レンズ）５０、リレーレンズ２４Ｂ，２６Ｂ、及び、観察結果を確認する観察光学系７０を備えている。なお、図１には、液浸対物レンズ５０に用いられる浸液（雰囲気媒質）６０Ａと、溶液６１Ａ中の観察対象物６１Ｂと、溶液６１Ａと観察対象物６１Ｂとを閉じ込めるカバーガラス６０Ｂ及びスライドガラス６２とが示されている。

光源１０は、レーザ光を出力する。レンズ２０は、例えば、コリメートレンズであり、光源１０からのレーザ光を平行光に変換する。ミラー３０は、レンズ２０からのレーザ光をＳＬＭ４０へ向けて反射させると共に、ＳＬＭ４０からのレーザ光を液浸対物レンズ５０へ向けて反射させる。ＳＬＭ４０は、例えば、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ（Liquid Crystal on Silicon - Spatial Light Modulator）であり、ミラー３０からのレーザ光の位相を変調する。液浸対物レンズ５０は、ミラー３０からのレーザ光を集光し、観察対象物６１Ｂへ出射する。

なお、本実施形態では、液浸対物レンズ５０の入射瞳面とＳＬＭ４０の変調面とが共役関係になるように、液浸対物レンズ５０とＳＬＭ４０との間にリレーレンズ２４Ｂ，２６Ｂが設けられている。このように、液浸対物レンズ５０とＳＬＭ４０との間に、１枚あるいは２枚以上のレンズからなるリレーレンズ系を配置し、対物レンズ５０の入射瞳面とＳＬＭ４０の変調面との間に結像関係を形成することにより、ＳＬＭ４０で変調された波面が対物レンズ５０にフレネル回折を起こすことなく伝播されるため、良好な収差補正を行うことができる。また、ＳＬＭ４０の変調面が対物レンズ５０の瞳面より大きい場合に、結像系が縮小系も兼ねると、レーザ光の光量を有効に利用することが可能であると共に、ＳＬＭ４０の有効領域を十分に利用することが可能となる。

液浸対物レンズを用いた顕微鏡観察装置においては、対物レンズ５０のＮＡを高めるために、屈折率の高い浸液６０Ａとカバーガラス６０Ｂを用い、浸液６０Ａとカバーガラス６０Ｂの屈折率差が等しいないしは極めて小さくなるように浸液６０Ａとカバーガラス６０Ｂを選定することが望ましい。また、観察対象物６１Ｂと溶液６０Ａとも同様に屈折率差が小さくなるように溶液６０Ａを選定することが望ましい。これにより、屈折率が極めて近いもの同士をまとめることができ、図２のようなモデルを立てることができる。すなわち、液浸対物レンズ５０から射出された光は、液浸対物レンズ５０と接した屈折率ｎ_ｄの浸液媒質（雰囲気媒質）６０を通過し、浸液媒質６０と接した屈折率ｎの観察対象物６１の内部に集光するものと考えることができる。

特に、液浸対物レンズ５０として油浸対物レンズを用いた顕微鏡観察装置においては、浸液媒質６０の屈折率ｎ_ｄと観察対象物６１の屈折率ｎとの関係はｎ＜ｎ_ｄとなる。

図３は、集光光学系に平行平面が挿入された場合のレーザ光の光路を示す図である。図３に示すように、集光レンズ５０による集光光学系に、平行平面状の光透過性を有する媒質６１が挿入された場合、焦点がＯからＯ’へとδだけずれる。この焦点ずれの値δは、集光レンズ５０に入射する光の入射高Ｈによって変わる。このように入射光によって集光点位置が異なることにより、球面収差が発生することとなる。このとき、近軸光線の集光位置からの光軸方向のズレ量が、縦収差表現された球面収差（longitudinal spherical aberration）となり、最外縁光線でもっとも収差が大きくなる。このときの縦収差の最大値Δｓは非特許文献１の第１４−２節に記載の第（１４−４）式を用いて、下記（１）式で表される。

ｎ：集光光学系における雰囲気媒質の屈折率
ｎ’：媒質６１の屈折率
ｄ’：媒質６１の厚さ
θ_ｍａｘ：媒質６１に対するレーザ光の入射角θであって、このレーザ光の最外縁光線の入射角（＝ａｒｃｔａｎ（ＮＡ））
なお、縦収差（longitudinal aberration）は、縦方向収差や縦光線収差（longitudinalray aberration）、縦方向誤差（longitudinal error）と表現されることもある。

図４は、集光点が平行平面内部にある場合のレーザ光の光路を示す図である。図４に示すように、集光レンズ５０による焦点Ｏが平行平面状の光透過性を有する媒質６１内部にある場合、焦点がＯからＯ’へとδだけずれる。この焦点ずれの値δは、集光レンズ５０に入射する光の入射高Ｈによって変わるので、球面収差が発生することとなる。このときの縦収差の最大値Δｓは非特許文献１の第１４−２節に記載の第（１４−３）式を変形して、下記（２）式で表される。

ｎ：集光光学系における雰囲気媒質６０の屈折率
ｎ’：媒質６１の屈折率
ｄ：媒質６１の移動量
θ_ｍａｘ：媒質６１に対するレーザ光の入射角θであって、このレーザ光の最外縁光線の
入射角

ここで、集光レンズ５０の焦点距離をｆとすると、上記（２）式の球面収差Δｓより、波面収差Ｅ（ｈ）は、非特許文献１の第２８−１節に記載の第（２８−６）式を用いて、下記（３）式で表される。

特許文献６によれば、上記（２）式の球面収差Δｓを補正する場合には、集光前の波面、すなわち、集光レンズ５０に入射する波面を、上記（３）式の波面収差Ｅ（ｈ）とは逆の波面とすればよいこととなる。第１の実施形態の顕微鏡観察装置１では、上記（３）式の波面収差Ｅ（ｈ）とは逆の波面に位相折り畳みを適用したものをＳＬＭ４０の収差補正位相パターンとすればよい。このとき、縦収差の最大値Δsは近軸光線からの集光位置のズレ量で表されているため、補正後の集光点は、おおむね補正前の近軸光線の集光位置と一致することになる。ただし、収差を近似で求めているため、正確な集光位置は求まらない。

例えば、レンズ５０の焦点距離がｆ＝１．８ｍｍ、観察対象物６１の屈折率がｎ’＝１．３３、対象物と対物レンズとの間の浸液媒質６０の屈折率ｎ＝１．５１５、開口数がＮＡ＝１．４、レーザ波長が５３２ｎｍであり、観察対象物６１の移動量をｄ＝２５μｍとした場合、補正後の集光深さは近似的に観察対象物６１の移動量ｄ×屈折率（ｎ−ｎ’）となり、観察対象物６１の表面から４．６２５μｍの位置となる。このときの補正波面は図５に示すような補正パターンとなり、補正波面の位相変調量が４００ｒａｄｉａｎ以上となる。

顕微鏡観察装置１による観察位置Ｏ’が深くなるほど、この球面収差Δｓが大きくなるので、補正波面の位相変調量が膨大となり、ＳＬＭ４０の分解能が不足し、収差を補正することが困難となる。

このように、波面収差を解析的に求めた上でその逆の位相分布を波面制御素子に与えて、各入射高に対する光線の集光点を、観察対象物６１の移動量ｄ×屈折率（ｎ−ｎ’）の位置に戻す補正では、すなわち、観察対象物６１内部に発生する縦収差範囲において最も集光レンズ５０側に合わせる補正では、収差を補正することが困難である。

そこで、本発明の第１の実施形態に係る収差補正方法、顕微鏡観察方法及びレーザ照射方法では、レーザ光の集光点が観察対象物６１内部に発生する収差範囲の間に位置するように、すなわち、収差を補正しないときに観察対象物６１内部で縦収差が存在する範囲の間に位置するように、レーザ光の収差を補正する。換言すれば、レーザ光の集光点が、収差を補正しないときの光軸上の光線の奥行き方向の集光位置と収差を補正しないときの最外縁光線の奥行き方向の集光位置との間の範囲の間に位置するように、レーザ光の収差を補正する。そのために、第１の実施形態の収差補正方法、顕微鏡観察方法及びレーザ照射方法では、各光線の光路長差から補正波面を算出する。すなわち、特許文献６に記載のように収差を求めてその逆の位相分布を与えるのではなく、集光レンズ５０に入射する光線が全て一点に集光すると仮定し、逆光線追跡によって補正波面を算出する。その際に、観察対象物６１の移動量ｄを適切な値とすることで、補正波面のＰＶ値を小さくし、物理的または実効的位相変調範囲が限定されている空間光変調器での深い位置での収差補正が可能になる。更に、正確な集光深さが決定できる。

図６は、本発明の第１の実施形態に係る収差補正方法、顕微鏡観察方法及びレーザ照射方法を説明するためのレーザ光の光路を示す図である。図６に示すように、波面補正前の光線の観察対象物６１への入射角をθ、波面補正後の光線の観察対象物６１への入射角をθ_１、屈折角をθ_２とすると、光軸の高さｈ_１、ｈ_２、ｈはそれぞれ下記（４）式、（５）式、（６）式によって表される。なお、下記（４）式、（５）式、（６）式は、観察対象物６１と液浸対物レンズ５０の間の浸液媒質６０の屈折率ｎ_ｄと観察対象物６１の屈折率ｎとの関係がｎ＜ｎ_ｄである場合である。また、図６においては波面補正を行うことにより観察対象物６１へのレーザ光の光路が波面補正前の光路と異なっている。

ここで、θ_１とθ_２はスネルの法則により一意に関係づけられ、θ_１が与えられるとθ_２を求めることが可能であり、逆にθ_２が与えられてもθ_１を求めることが可能である。また、ｈ＝ｈ_１＋ｈ_２と、上記（４）〜（６）式により、入射角θ、θ_１、θ_２が一意的に関係づけられる。ある特定のθ_１あるいはθ_２が与えられたとき、上記（４）式及び（５）式をｈ＝ｈ_１＋ｈ_２に代入し、上記（６）式を解くことで容易にθを決定することができる。しかし、ある特定のθが与えられたときに、θ_１とθ_２を解析的に求めるのは困難である。ある特定のθに対するθ_１とθ_２を求めるには、探索を行えばよい。例えば、θ_１あるいはθ_２の値を徐々に変化させて、その都度θを求め、所望のθとなるθ_１あるいはθ_２が得られるまで、θ_１あるいはθ_２を変化させて探索すればよい。

一方、観察対象物６１と、観察対象物６１と液浸対物レンズ５０の間の浸液媒質６０により生じる光路差ＯＰＤ（optical path difference）は、下記（７）式により表される。

なお、この（７）式中の「−ｆ−（ｎ_ｄ−ｎ）×ｄ＋Δ」は定数項であり、ＯＰＤの値が大きくなりすぎるのを防ぐために付加した項である。

この（７）式から求められる補正波面のＰＶ値を減少させるように、波面補正後の焦点ずれの値Δを適切な値とすることにより、球面収差を補正するための位相変調量が低減される。ここで、適切な焦点ずれの値Δは、例えば上記した探索によって求める。すなわち、焦点ずれの値Δを初期値ｎ_ｄ×ｄ−ｎ×ｄに設定し、徐々に変化させて、その都度ＯＰＤ（θ）を求め、θ_ｍａｘ≧θ≧−θ_ｍａｘの範囲におけるＯＰＤ（θ）が所望の形状になるまでΔを徐々に変化せしめればよい。なお、ｄ−Δは所望の集光深さであり固定値なので、探索の間はこの値が一定となるようにΔとｄを変化させる。集光深さｄ−Δが固定値なので、Δが決定されれば、集光深さからΔを差し引くことにより観察対象物６１の移動量ｄも決定される。固定値である集光深さ（観察位置）ｄ−Δを以降は、Ｄと表記する。

具体的には、集光レンズ５０の入射部に対応するＳＬＭ４０上の任意の画素における位相変調量と、この画素に隣接する画素における位相変調量との位相差が物理的位相変調量以下となるように、集光点シフト量Δ及び移動量ｄを決定する。なお、この補正後のレーザ光のシフト量Δは、０＜Δ＜Δｓを満たすこととする。

これにより、隣接する画素間の位相差が小さくなるので、物理的位相変調量に限界があるＳＬＭ４０の負担を減らすことができる。

これによって、観察対象物６１の屈折率をｎ、観察対象物６１と液浸対物レンズ５０との間の浸液媒質６０の屈折率をｎ _ｄ 、観察対象物６１の移動量をｄ、観察対象物６１によって発生する縦収差の最大値をΔｓとすると、レーザ光の集光点が、観察対象物６１の入射面からｎ×ｄ−Δｓより大きく、ｎ×ｄより小さい位置、すなわち、ｎ×ｄ−Δｓ以上ｎ×ｄ以下の縦収差範囲の間に位置することとなる。

なお、上記では集光レンズ５０の入射部に対応するＳＬＭ４０上の任意の画素における位相変調量と、この画素に隣接する画素における位相変調量との位相差が物理的位相変調量以下となるように、集光点シフト量Δを決定したが、この探索条件は曖昧であり、複数のΔが解になりうる。探索の終了判定を容易にするため、もっと具体的な探索条件に基づいて決定しても良い。例えば、θ_ｍａｘ≧θ≧−θ_ｍａｘの範囲におけるＯＰＤ（θ）のＰＶ値が最小となるようにΔを決定してもよい。あるいは、θ_ｍａｘ≧θ≧−θ_ｍａｘの範囲におけるＯＰＤ（θ）の微分値の絶対値が最小となるようにΔを決定してもよい。なお、例に挙げた２つの条件はともに、最初のＳＬＭ４０上の任意の画素における位相変調量とこの画素に隣接する画素における位相変調量との位相差が物理的位相変調量以下となるという条件に含まれるか、ほぼ等しい条件である。なお、探索条件としては、他にも、「ＯＰＤ（θ）のＲＭＳ（Root Mean Square）値が最小となる」や、「観察対象物６１の移動量ｄが、集光深さＤを変数とする特定の関数で表される」など様々なものが考えられる。

なお、観察対象物６１と液浸対物レンズ５０の間の浸液媒質６０の屈折率ｎ_ｄと観察対象物６１の屈折率ｎとの関係がｎ＜ｎ_ｄであるときには、下記（８）式のように全反射が発生する条件がある。

この（８）式を満たす角度で入射してくる光は対象物６１に入射しない。その角度で入射する光は対物レンズの瞳の周辺部より射出された光である。そこでＯＰＤを求める際には、（８）を満たすようなθ_１に対応するθのＯＰＤは無視して考える。

例えば、集光レンズ５０の焦点距離がｆ＝１．８ｍｍ、観察対象物６１の屈折率がｎ＝１．３３、浸液媒質６０の屈折率がｎ_ｄ＝１．５１５、レーザ波長が６３０ｎｍ、開口数がＮＡ＝１．４であり、観察対象物６１の移動量をｄ＝２５μｍとした場合、ＯＰＤ（θ）のＰＶ値が最小となるように探索したときのΔは１６．５６５μｍとなり、また、補正波面は図７に示すような補正パターンとなり、補正波面の位相変調量が２５ｒａｄｉａｎ程度に減少する。このときの集光深さは、Ｄ＝８．４３５μｍであり、従来法を用いた場合と同じ集光深さを実現しているにもかかわらず、位相変調量が少ないために、十分に収差が補正可能となる。

なお、このときｎ＜ｎ_ｄであるため全反射が発生する。今回の条件では、上式（８）よりその領域はθ_１≧１．０７１４［ｒａｄ］以上のときであり、これを満たす条件の領域に関してはＯＰＤの導出を行っていない。

図７によれば、この補正波面の位相値は、位置０ｍｍ、すなわち、光軸位置において極小点を有する。また、位置１．４ｍｍ及び−１．４ｍｍ付近に極大点を有する。このように、補正波面の位相値が極大点及び極小点を有するように集光点を設定することによって、補正波面のＰＶ値を低減することが可能となる。

図８は、第１の実施形態の収差補正方法、顕微鏡観察方法及びレーザ照射方法の手順を示すフローチャートである。まず、集光点を観察対象物６１の表面に設定し、この位置を観察原点とする（ステップＳ０１）。次に、観察対象物６１内部における観察位置（深さ）を設定する（ステップＳ０２）。

次に、上記した探索条件に基づいて、観察対象物６１の移動量ｄおよび集光点シフト量Δを設定する。これによって、観察位置が、収差を補正しないときに観察対象物６１内部で縦収差が存在する範囲（観察対象物６１の入射面からｎ×ｄ−Δｓより大きく、ｎ×ｄより小さい範囲）の間に位置するように、観察対象物６１の移動量ｄおよび集光点シフト量Δが設定される（ステップＳ０３）。尚、移動量ｄ及びシフト量Δは空間光変調器の最大変調量（空間光変調器の物理的位相変調範囲）以下となるように設定する。

次に、ステップＳ０２及びＳ０３で設定された観察位置にレーザ光が集光するように補正波面を算出し、ＳＬＭ４０に表示する（ステップＳ０４）。次に、観察対象物６１を移動量ｄだけ移動する（ステップＳ０５）。次に、レーザ光を照射し、観察を開始する。すると、ＳＬＭ４０の補正波面により、レーザ光が設定された観察位置に集光することとなる（ステップＳ０６）。

次に、観察終了時に、レーザ光照射を停止する（ステップＳ０７）。他に観察位置がある場合にはステップＳ０２に戻り、ない場合にはこの観察対象物６１の観察を終了する（ステップＳ０８）。

尚、ステップＳ０５においては、ＳＬＭ４０と集光レンズ５０とで構成される集光光学系と観察対象物６１との相対位置を変化させれば良いので、観察対象物６１の移動の代わりに集光レンズ５０を移動させても良いし、両者を移動させても良い。なお、集光レンズ５０を移動させる場合において、集光レンズ５０の入射瞳とＳＬＭ４０とが結像関係にあるときには、集光光学系の単位で、すなわち、ＳＬＭ４０も共に移動する必要がある。

また、ステップＳ０１において、一旦観察用レーザ光を観察対象物６１の表面に集光することで、観察原点を決定しているが、他の手段、例えばオートフォーカス装置などを用いて集光レンズと観察対象物との相対位置を決定してもよい。

また、レーザ光を連続照射しても問題ない場合には、ステップＳ０７を省略してもよい。

さらに、上記の例では独立した画素に電圧を印加する位相変調型の空間光変調器を用いて波面形状を制御しているが、可変鏡など他の空間光変調器を用いても良い。可変鏡などの位相変調範囲が２πなどの小さい範囲に限定されない空間光変調器を用いる場合には、補正波面をそのままの形で表現できるので、位相折り畳み処理を省略できる。

第１の実施形態の収差補正方法、顕微鏡観察方法及びレーザ照射方法によれば、レーザ光の集光点が、収差を補正しないときの媒質６１内部での縦収差範囲の間に位置するように、レーザ光の収差を補正するので、波面のＰＶ値を低減することができる。その結果、位相変調量に制限があるＳＬＭ４０を用いても、補正波面のＰＶ値を低減させることで、ＳＬＭ４０の負担を減らし、高精度な波面制御を可能とする。その結果、媒質６１に対するレーザ照射位置が深くても、レーザ光の集光度合を高めることができ、レーザ光のピーク強度を高めることができる。その結果、顕微鏡観察装置における分解能や像コントラストを高めることができ、良好な観察を行うことが可能となる。

このように、補正波面のＰＶ値を低減することが可能となる位置に、レーザ光を集光する媒質（例えば、観察対象物等）６１内での集光位置を移動するので、簡易な方法でＳＬＭ４０の負担を減らしつつ、高精度な波面制御が可能となる。

また、第１の実施形態の収差補正方法、顕微鏡観察方法及びレーザ照射方法によれば、集光レンズ５０の入射部に対応するＳＬＭ４０上の任意の画素における位相変調量と、この画素に隣接する画素における位相変調量との位相差がＳＬＭ４０で位相折り畳み技術を適用できる位相範囲以下となる。したがって、物理的位相変調範囲に限界があるＳＬＭ４０の負担を減らし、高精度な波面制御を可能とする。そして、特許文献６のように収差を近似で求めているものでは正確な集光位置は求まらないが、本発明では正確な集光位置を求めることができる。

第１の実施形態の収差補正方法、顕微鏡観察方法及びレーザ照射方法を用いた顕微鏡観察装置１は、溶液中の細胞や細胞内部の観察に好適に適用可能である。特に、油浸対物レンズのように浸液の屈折率が媒質の屈折率より高い液浸レンズを用いた際には、細胞がカバーガラスに接しておらず集光位置が深いと良好な観察結果が得られなかったが、観察位置が深くなっても、空間光変調器によって収差を補正し、レーザ光の集光度合及びピーク強度を高めることができ、その結果、分解能や像コントラストを高めることができ、良好な観察を行うことが可能となる。また、これはカバーガラスに接した観察対象物の内部を観察する場合においても有効である。ただし、油浸対物レンズの場合には、ｎ＜ｎ_ｄであることから全反射が起こる入射角度がある。その角度で入射する光は対物レンズの瞳の周辺部より射出された光であるため、実行的なＮＡが低下する。
［第２の実施形態］

上記した第１の実施形態の収差補正方法、顕微鏡観察方法及びレーザ照射方法では、図６に示す観察位置Ｏ’が変わると球面収差Δｓが変わるので、観察位置Ｏ’を変更するたびに、上記（７）式による補正波面を求め直す必要があり、その算出時間が大きいことがある。

具体的には、上記（７）式中のθ_１、θ_２、Δは、上記したように直接求めることが困難であり、Δの値を徐々に変化させて繰り返し補正波面を計算する探索によって求めることとなる。さらに、Δを変化させた探索の各回において、上記（７）式中のθもしくはθ_１とθ_２の値を上記した探索方法で求める必要がある。すなわち、２重の探索となっており、多大な計算時間を要することがある。

その結果、観察位置を変えながら観察を行う場合には、観察中の探索処理により、観察レートの低下を招いてしまうことがある。

そこで、本願発明者らは、第１の実施形態の収差補正方法を用いて、すなわち、上記探索を用いて、位相変調量が小さい収差補正波面を予め求め、この収差補正波面の多項式近似を行った近似式を用いて、任意の観察位置における補正波面を求めることによって、時間短縮を図る収差補正方法を見出した。以下では、時間短縮を図る本発明の第２の実施形態に係る収差補正方法を説明する。

まず、本発明の第２の実施形態に係る収差補正方法を説明する前に、この収差補正方法を用いる顕微鏡観察装置（レーザ照射装置、レーザ集光装置）について示す。

図９は、第２の実施形態に係る顕微鏡観察装置（レーザ照射装置、レーザ集光装置）の構成を示す図である。図９に示す顕微鏡観察装置１Ａは、第１の実施形態の顕微鏡観察装置１において制御部８０と本発明の実施形態に係る収差補正装置９０とを更に備える構成で顕微鏡観察装置１と異なっている。顕微鏡観察装置１Ａのその他の構成は図１に示す顕微鏡観察装置１と同一である。なお、本発明の思想の説明簡素化のため、図９には、図１に示す顕微鏡観察装置１に代えて図２に示すモデルを示す。

制御部８０は、収差補正装置９０から補正波面情報を受けて、ＳＬＭ４０の位相変調量を制御する。

収差補正装置９０は、例えばコンピュータであり、後述する収差補正プログラムを実行することによって、第１の補正波面生成部９１と、第１の多項式近似部９２と、第２の多項式近似部９３と、第３の多項式近似部９４と、記憶部９５と、第２の補正波面生成部９６と、として機能する。

第１の補正波面生成部９１は、対物レンズ５０により定まる開口数ＮＡ及び焦点距離ｆと、観察対象物６１の媒質により定まる屈折率ｎと、観察対象物６１と液浸対物レンズ５０との間の浸液媒質６０により定まる屈折率ｎ_ｄとを受ける。また、第１の補正波面生成部９１は、観察の深さを変える観察において予め予想される観察の深さの範囲内及びこの範囲付近における複数の観察位置（集光の深さ）Ｄ_１、Ｄ_２、・・・Ｄ_ｐ、・・・Ｄ_Ｐを受ける。これらの集光深さの個数と間隔は、後述する多項式近似が十分な精度で行えるように設定する。第１の補正波面生成部９１は、第１の実施形態の収差補正方法に従い、上記（７）式及び上記（４）〜（６）式等を用いた探索によって、複数の観察位置Ｄ_１、Ｄ_２、・・・Ｄ_ｐ、・・・Ｄ_Ｐにそれぞれ対応する複数の補正波面と複数の観察対象物６１の移動量ｄ_１、ｄ_２、・・・d_ｐ、・・・ｄ_Ｐを求める。すなわち、第１の補正波面生成部９１は、レーザ光の集光点が、収差を補正しないときに観察対象物６１内部で縦収差が存在する範囲の間に位置し、補正波面の位相変調量が最小となるように、複数の観察位置Ｄ_１、Ｄ_２、・・・Ｄ_ｐ、・・・Ｄ_Ｐにそれぞれ対応する複数の補正波面と複数の観察対象物６１の移動量を求める。探索の際の探索条件には、１個の観察位置に対して補正波面と観察対象物６１の移動量が一意に定まるような条件、例えば「補正波面のＰＶ値が最小となるように」を適用する。このようにして求められた複数の補正波面の位相変調量Φ_１ｘ、Φ_２ｘ、・・・Φ_ｐｘ、・・・Φ_Ｐｘを動径位置ｘに関してプロットしたものを図１０に示す。

上記したように、観察対象物６１と液浸対物レンズ５０の間の浸液媒質６０の屈折率ｎ_ｄと観察対象物６１の屈折率ｎの関係がｎ＜ｎ_ｄであるときには、上記（８）式のように全反射が発生する条件があり、この（８）式を満たす角度で入射してくる光は観察対象物６１に入射しない。その角度で入射する光は対物レンズの瞳の周辺部より射出された光である。そこで補正波面を求める際には、上記（８）式を満たすようなθ_１に対応するθを無視して補正波面を得る。

以上の作業によって、複数の観察位置Ｄ_１、Ｄ_２、・・・Ｄ_ｐ、・・・Ｄ_Ｐに対する、観察対象物６１の移動量ｄ_１、ｄ_２、・・・ｄ_ｐ、・・・ｄ_Ｐと、点Ｏから観察位置までの距離Δ_１、Δ_２、・・・Δ_ｐ、・・・Δ_Ｐと、補正波面Φ_１ｘ、Φ_２ｘ、・・・Φ_ｐｘ、・・・Φ_Ｐｘが得られる。

第１の多項式近似部９２は、観察対象物６１の移動量のデータセットｄ_１、ｄ_２、・・・ｄ_ｐ、・・・ｄ_Ｐを、所望の集光深さを変数とするＭ次のべき多項式で近似し、１個の第１の高次多項式を求める（下式（９））。

ここで、Ｄは所望の集光深さであり、Ｄ＝ｄ−Δである。

第２の多項式近似部９３は、図１０に示す複数の補正波面の位相変調量Φ_１ｘ、Φ_２ｘ、・・・Φ_ｐｘ、・・・Φ_Ｐｘをそれぞれ、動径位置ｘを変数とするＱ次のべき多項式で近似し、図１１に示すように、複数の第２の高次多項式を求める。これらの第２の高次多項式における同一次数項の係数からなる複数の係数列ａ_１ｐ、ａ_２ｐ、・・・ａ_ｑｐ、・・・ａ_Ｑｐ、すなわち、第１次項の係数列ａ_１ｐ〜第Ｑ次項の係数列ａ_Ｑｐをそれぞれ観察対象物６１の移動量ｄ_ｐに対してグラフ化したものを図１２に示す。

第３の多項式近似部９４は、図１２に示す複数の第２の高次多項式における第１次項の係数列ａ_１ｐ〜第Ｑ次項ａ_Ｑｐをそれぞれ、移動量ｄを変数とするＫ次のべき多項式で近似し、図１３に示すように複数の第３の高次多項式を求める。

記憶部９５は、図１３に示す複数の第３の高次多項式における複数の次数項の係数、すなわち、複数の第１次項〜第Ｑ次項の係数ｂ_１１〜ｂ_１Ｑ、ｂ_２１〜ｂ_２Ｑ、・・・ｂ_ｋ１〜ｂ_ｋＱ、・・・ｂ_Ｋ１〜ｂ_ＫＱと、第１の高次多項式における係数列ｃ_１、ｃ_２、・・・ｃ_ｑ、・・・,ｃ_Ｑを図１４に示すように、係数データセットとして記憶する。

以上の作業で記憶された係数データセットを用いて、任意の位置の集光深さに対する補正波面を生成することができる。次に、その生成方法を説明する。

第２の補正波面生成部９６は、係数データセットにおける係数ｃ_１〜ｃ_Ｑおよび第１の多項式を用いて任意の集光深さＤに対する観察対象物６１の移動量ｄを求め、さらに係数データセットにおける係数ｂ_１１〜ｂ_１Ｑ、ｂ_２１〜ｂ_２Ｑ、・・・ｂ_ｋ１〜ｂ_ｋＱ、・・・ｂ_Ｋ１〜ｂ_ＫＱ、及び、図１３に示す複数の第３の高次多項式を用いて、任意の集光深さＤに対する第２の高次多項式の第１次項係数Ａ_１〜第Ｑ次項係数Ａ_Ｑを求める、すなわち、図１１に示す複数の第２の高次多項式に相当する任意の観察位置Ｄの第２の高次多項式を求める（下式（１０））。

第２の補正波面生成部９６は、この上記（１０）式の第２の高次多項式を用いて、任意の観察位置ｎ×ｄ_ｎ−Δにおける補正波面を求める。

上記では、第１〜第３の多項式に、１次から特定の次数までのべき乗項で構成される多項式を用いたが、他の構成の多項式を用いてもよい。例えば、第１〜第３の多項式に０次のべき乗項を加えてもよい。また、第２の多項式に偶数次のべき乗項で構成される多項式を用いてもよい。さらに、べき乗関数ではなく、他の関数、例えばツェルニケ多項式やガウス関数、ローレンツ関数などを含む多項式を用いてもよい。また、第２及び第３の多項式には観察対象物６１の移動量ｄを変数として用いたが、集光深さ（観察位置）Ｄや、集光点シフト量Δを変数として用いてもよい。また、探索条件が「観察対象物６１の移動量ｄが、集光深さＤを変数とする特定の関数で表される」というものであった場合、当該関数を上記（９）式の代わりに用い、第１の多項式近似ステップを省略してもよい。

次に、本実施形態の収差補正装置９０の動作を説明すると共に、本発明の第２の実施形態に係る収差補正方法を説明する。図１５は、本発明の第２の実施形態に係る収差補正方法を示すフローチャートである。

まず、対物レンズ５０により定まる開口数ＮＡ及び焦点距離ｆ、観察対象物６１により定まる屈折率ｎ、観察対象物６１と液浸対物レンズ５０との間の浸液媒質６０により定まる屈折率ｎ_ｄが入力され、観察の深さを変える観察において予め予想される観察の深さの範囲内及びこの範囲付近における複数の観察位置（集光の深さ）Ｄ_１、Ｄ_２、・・・Ｄ_ｐ、・・・Ｄ_Ｐが入力されると、第１の補正波面生成部９１によって、第１の実施形態の収差補正方法に従い、上記（７）式及び上記（４）〜（６）式を用いた探索によって、複数の集光深さＤ_１、Ｄ_２、・・・Ｄ_ｐ、・・・Ｄ_Ｐにそれぞれ対応する複数の補正波面Φ_１ｘ、Φ_２ｘ、・・・Φ_ｐｘ、・・・Φ_Ｐｘと、複数の観察対象物６１の移動量ｄ_１、ｄ_２、・・・ｄ_ｐ、・・・ｄ_Ｐが求められる。すなわち、レーザ光の集光点が、収差を補正しないときに観察対象物６１内部で縦収差が存在する範囲の間に位置し、補正波面のＰＶ値が最小となるように、複数の集光深さＤ_１、Ｄ_２、・・・Ｄ_ｐ、・・・Ｄ_Ｐにそれぞれ対応する複数の補正波面Φ_１ｘ、Φ_２ｘ、・・・Φ_ｐｘ、・・・Φ_Ｐｘが求められる（Ｓ１１：第１の補正波面生成ステップ）。

次に、第１の多項式近似部９２によって、複数の観察対象物６１の移動量ｄ_１、ｄ_２、・・・ｄ_ｐ、・・・ｄ_Ｐのべき多項式近似が行われ、上記（９）式に示すように、１個の第１の高次多項式が求められる（Ｓ１２：第１の多項式近似ステップ）。

次に、第２の多項式近似部９３によって、図１０に示す複数の補正波面の位相変調量Φ_１ｘ、Φ_２ｘ、・・・Φ_ｐｘ、・・・Φ_Ｐｘのべき多項式近似がそれぞれ行われ、図１１に示すように、複数の第２の高次多項式が求められる。これらの第１の高次多項式における同一次数項の係数からなる複数の係数列ａ_１ｐ、ａ_２ｐ、・・・ａ_ｑｐ、・・・ａ_Ｑｐ、すなわち、第１次項の係数列ａ_１ｐ〜第Ｑ次項の係数列ａ_Ｑｐが得られる（Ｓ１３：第２の多項式近似ステップ）。

次に、第３の多項式近似部９４によって、図１２に示す複数の第２の高次多項式における第１次項の係数列ａ_１ｐ〜第Ｑ次項の係数列ａ_Ｑｐのべき多項式近似がそれぞれ行われ、図１３に示すように、観察対象物６１の移動量ｄを変数とする複数の第３の高次多項式が求められる（Ｓ１４：第３の多項式近似ステップ）。これらの複数の第３の高次多項式における複数の次数項の係数、すなわち、複数の第１次項〜第Ｑ次項の係数ｂ_１１〜ｂ_１Ｑ、ｂ_２１〜ｂ_２Ｑ、・・・ｂ_ｋ１〜ｂ_ｋＱ、・・・ｂ_Ｋ１〜ｂ_ＫＱ、ならびに第１の高次多項式における１項からＭ項までの係数ｃ_１、ｃ_２、・・・ｃ_ｑ、・・・,ｃ_Ｍは、図１４に示すように、係数データセットとして記憶部９５に記憶される（Ｓ１５：記憶ステップ）。

記憶された係数データセットから補正波面を算出するには、第２の補正波面生成部９６において、所望の集光深さＤに対する観察対象物６１の移動量と、第２の多項式の係数とを求めた後、補正波面を算出する。まず、係数データセットにおける係数ｃ_１、ｃ_２、・・・ｃ_ｑ、・・・,ｃ_Ｍと第１の多項式を用いて、任意の集光深さＤに対する観察対象物６１の移動量ｄを求める。次に、観察対象物６１の移動量ｄと、係数データセットにおける係数ｂ_１１〜ｂ_１Ｑ、ｂ_２１〜ｂ_２Ｑ、・・・ｂ_ｋ１〜ｂ_ｋＱ、・・・ｂ_Ｋ１〜ｂ_ＫＱ、及び、図１３に示す複数の第３の高次多項式を用いて、任意の集光深さＤの第２の高次多項式の第１次項係数ａ_１ｐ〜第Ｑ次項係数ａ_Ｑｐが求められる、すなわち、図１１に示す複数の第２の高次多項式に相当する任意の集光深さＤの第２の高次多項式が（９）式の形で求められる。その後、この（９）式の第２の高次多項式を用いて、任意の集光深さＤにおける補正波面が求められる（Ｓ１６：補正波面生成ステップ）。尚、観察深さを変える際には、ステップＳ１６を行ってその深さに対応した補正波面を生成すれば良い。

上記した第１の補正波面生成ステップＳ１１での探索では、「補正波面のＰＶ値が最小となるように」という条件を用いたが、他の条件を用いることができる。ただし、１個の観察位置に対して補正波面と観察対象物６１の移動量が一意に定まり、かつ隣接する画素の間の位相差が物理的位相変調量以下となるような条件である必要がある。

次に、コンピュータを収差補正装置９０として動作させるための収差補正プログラムについて説明する。図１６は、本発明の実施形態に係る収差補正プログラムの構成を、記録媒体と共に示す図である。

図１６に示すように、収差補正プログラムＰ１００は、記録媒体１００に格納されて提供される。記録媒体１００としては、フロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、あるいはＲＯＭ等の記録媒体、あるいは半導体メモリ等が例示される。

図１７は、記録媒体に記録されたプログラムを実行するためのコンピュータのハードウェア構成を示す図であり、図１８は、記録媒体に記憶されたプログラムを実行するためのコンピュータの斜視図である。

図１７に示すように、コンピュータ２００は、フロッピーディスクドライブ装置、ＣＤ−ＲＯＭドライブ装置、ＤＶＤドライブ装置等の読取装置２０２と、オペレーティングシステムを常駐させた作業用メモリ（ＲＡＭ）２０４と、記録媒体１００に記憶されたプログラムを記憶するメモリ２０６と、ディスプレイといった表示装置２０８と、入力装置であるマウス２１０及びキーボード２１２と、データ等の送受を行うための通信装置２１４と、プログラムの実行を制御するＣＰＵ２１６とを備えている。コンピュータ２００は、記録媒体１００が読取装置２０２に挿入されると、読取装置２０２から記録媒体１００に格納された収差補正プログラムＰ１００にアクセス可能になり、当該収差補正プログラムＰ１００によって、収差補正装置９０として動作することが可能になる。

図１８に示すように、収差補正プログラムＰ１００は、搬送波に重畳されたコンピュータデータ信号２２０としてネットワークを介して提供されるものであってもよい。この場合、コンピュータ２００は、通信装置２１４によって受信した収差補正プログラムＰ１００をメモリ２０６に格納し、当該収差補正プログラムＰ１００を実行することができる。

図１６に示すように、収差補正プログラムＰ１００は、第１の補正波面生成モジュールＰ１０と、第１の多項式近似モジュールＰ２０と、第２の多項式近似モジュールＰ３０と、第２の多項式近似モジュールＰ４０と、記憶モジュールＰ５０と、第２の補正波面生成モジュールＰ６０とを備えている。

第１の補正波面生成モジュールＰ１０、第１の多項式近似モジュールＰ２０、第２の多項式近似モジュールＰ３０、第２の多項式近似モジュールＰ４０、記憶モジュールＰ５０、及び、第２の補正波面生成モジュールＰ６０がコンピュータに実現させる機能はそれぞれ、上述した第１の補正波面生成部９１、第１の多項式近似部９２、第２の多項式近似部９３、第２の多項式近似部９４、記憶部９５、及び、第２の補正波面生成部９６のうち対応要素と同様である。

なお、本実施形態では、収差補正装置９０として機能するコンピュータが顕微鏡観察装置の内部に一体的に備えられた形態を示したが、収差補正装置９０として機能するコンピュータは顕微鏡観察装置１Ａと別体的に外部に設けられ、コンピュータと顕微鏡観察装置との間で補正波面情報をやりとりしてもよい（図１９）。

また、顕微鏡観察装置１Ａの内部と外部とにそれぞれコンピュータ９０Ａ，９０Ｂを備え、これらの２つのコンピュータ９０Ａ，９０Ｂによって収差補正装置９０が実現されてもよい。例えば、収差補正装置９０の一部の第１の補正波面生成部９１、第１の多項式近似部９２、第２の多項式近似部９３、第３の多項式近似部９４及び記憶部９５Ａが外部コンピュータ９０Ａによって実現され、他の記憶部９５Ｂ及び第２の補正波面生成部９６が内部コンピュータ９０Ｂによって実現されてもよい。これによれば、外部コンピュータ９０Ａと内部コンピュータ９０Ｂ、すなわち、顕微鏡観察装置１Ａとの間で係数データセットが、記憶媒体や通信経路などを介してやりとりされ、外部コンピュータ９０Ａの記憶部９５Ａの内容が内部コンピュータ９０Ｂの記憶部９５Ｂに複製される（図２０）。

このように、第２の実施形態の収差補正方法、本実施形態の収差補正装置９０及び収差補正プログラムでも、第１の実施形態の収差補正方法と同様の利点を有する。すなわち、第２の実施形態の収差補正方法、本実施形態の収差補正装置及び収差補正プログラムでも、上記したように、レーザ光の集光点が収差を補正しないときの観察対象物６１内部での縦収差範囲の間に位置するようにレーザ光の収差を補正するための補正波面を予め求め、この補正波面の高次多項式近似による近似式を用いて任意の観察位置における補正波面を求めるので、この任意の観察位置の補正波面は、レーザ光の集光点が収差を補正しないときの観察対象物６１内部での縦収差範囲の間に位置するようにレーザ光の収差を補正することができ、波面のＰＶ値を低減することができる。その結果、位相変調量に制限がある空間光変調器を用いても、収差補正のための位相変調量を低減させることで、空間光変調器の負担を減らし、高精度な波面制御を可能とする。その結果、媒質に対するレーザ照射位置が深くても、レーザ光の集光度合を高めることができ、レーザ光のピーク強度を高めることができる。その結果、顕微鏡観察装置における分解能や像コントラストを高めることができ、良好な観察を行うことが可能となる。特に、浸液の屈折率が媒質の屈折率より高い液浸レンズを用いた顕微鏡観察装置において、観察対象物である媒質がカバーガラスと接しておらず集光位置が深くなっても、レーザ光の集光度合及びピーク強度を高めることができ、その結果、分解能や像コントラストを高めることができ、良好な観察を行うことが可能となる。また、これはカバーガラスに接した観察対象物である媒質の内部を観察する場合においても有効である。

例えば、集光レンズ５０の焦点距離がｆ＝１．８ｍｍ、観察対象物６１の屈折率がｎ＝１．３３、浸液媒質６０の屈折率がｎ_ｄ＝１．５１５、レーザ波長が６３０ｎｍ、開口数がＮＡ＝１．４であり、観察対象物６１の移動量をｄ＝２０μｍとした場合、ＯＰＤ（θ）のＰＶ値が最小となるように探索したときのΔは１３．１９μｍとなり、また、補正波面は図２１に示すような補正パターンとなり、補正波面の位相変調量が２０ｒａｄｉａｎ程度に減少する。

更に、第２の実施形態の収差補正方法、本実施形態の収差補正装置及び収差補正プログラムによれば、複数の観察位置に対する補正波面を予め求め、これらの補正波面の高次多項式近似を行っているので、この近似式による演算を行うだけで適切な補正波面を求めることができる。その結果、観察の深さを変更する際に補正波面を求め直す時間を短縮することができ、観察レートの低下を低減することができる。また、上記した探索処理により実際に求めた観察位置と異なる任意の観察位置に対しても、適切な補正波面を求めることができる。

なお、本発明は上記した本実施形態に限定されることなく種々の変形が可能である。例えば、本実施形態では、独立した画素に電圧を印加する位相変調型で反射型のＳＬＭ４０を用いたが、独立した画素に電圧を印加する位相変調型で透過型のＳＬＭを用いる場合であっても同様の利点を得ることができる。また、可変鏡を用いる場合であっても同様の利点を得ることができる。

また、本実施形態では、ＳＬＭ４０と対物レンズ５０の間にリレーレンズ２４Ｂ，２６Ｂを配置したが、ＳＬＭ４０と対物レンズ５０の間が短いときなど伝搬による波面の変化が小さいと考えられる場合においてはリレーレンズ２４Ｂ，２６Ｂは配置しなくともよい。

また、本実施形態では、単点観察を例示したが、本発明の思想は、観察点が複数有り、それらが３次元的に分布している多点観察にも適用可能である。例えば、２点観察では、集光位置の異なる２つのフレネルレンズパターンにそれぞれの観察深さを考慮した補正波面を位相同士で足し合わせる。得られた２点のパターンの位相をそれぞれΦ_Ａ、Φ_Ｂとすると、exp(Φ_Ａ)+exp(Φ_Ｂ) から位相のみを取り出すことで、空間光変調器のホログラムパターンが得られる。このように、空間光変調器は３次元観察において利点を有する。すなわち、入射光を変調することにより奥行き方向にも面内にも位置の異なる多数の集光点を生成することができ、単点観察を繰り返す観察に比べて、観察のスループットを向上することができる。

この多点観察でも、本実施形態と同様に、それぞれ異なる観察深さに集光するため、それぞれの観察位置に応じた補正波面をもそれぞれ求める。このとき、上記（７）式及び上記（４）〜（６）式等を用いた探索を行い、レーザ光の集光点が観察対象物６１内部に発生する縦収差範囲の間に位置し、補正波面の位相変調量が最小となるように、補正波面を求めることができるが、探索処理に多大な時間を要する。そこで、この多点観察でも、上記した収差補正装置９０を用いた収差補正方法を適用することによって、観察の深さを変更する際に補正波面を求め直す時間を短縮することができ、観察レートの低下を低減することができる。

なお、この多点観察では、上記したフレネルレンズパターンに代えてフレネルゾーンプレートパターン（０又はπの２値で構成されたもの)が用いられてもよい。また、フレネルレンズパターンにそれぞれの観察深さを考慮した補正波面を位相同士で足し合わせる際に、同一深さの平面内で多点を生成する例えばグレーティングパターンや任意のＣＧＨパターンの位相をそれらに足し合わせてもよい。

また、本実施形態では、顕微鏡観察装置における収差補正方法について説明したが、以下では、別の実施形態に係るレーザ照射装置及びレーザ照射方法として、レーザ走査顕微鏡の一例を示す。

例えば、レーザ走査顕微鏡は、レーザ光の集光位置を光軸方向に垂直な方向だけでなく光軸方向に走査する。すなわち、レーザ走査顕微鏡は、測定対象物の表面だけでなく、内部にも集光点を生成する。このとき収差によって集光点が広がりピーク強度が低下し、分解能と像コントラストが低下する。このレーザ走査顕微鏡に、本実施形態の収差補正方法及びレーザ照射方法を適用すれば、位相変調量に制限のあるＳＬＭを用いて、測定対象物の内部におけるレーザ光の集光度合を高め、深い位置においても分解能と像コントラストの高い像を計測することができる。レーザ走査顕微鏡の一種である、コンフォーカル顕微鏡や多光子励起レーザ走査顕微鏡（Multi-Photon Laser-Scanning Microscope）では、照射光の集光位置でのピーク強度が低下すると測定光強度が激減するため、特に収差補正の効果が大きい。また、レーザ走査顕微鏡のように、集光ビームを走査して像を得る撮像装置においては、ＳＬＤ（Super-Luminescentdiode）など波長帯域が狭く空間コヒーレンスの高い、レーザに類似した光源が用いられることがあるが、そのような光源に対してもここで記述した収差補正法及びレーザ照射方法を適用することができる。

また、本発明の収差補正方法は、上記したレーザ走査顕微鏡の他にも様々な顕微鏡に適用可能であり、例えば、測定対象を広く照明してイメージセンサで検出を行う顕微鏡等の撮像装置にも好適に適用可能である。この種の顕微鏡では、光源としてレーザ光に限らず、非コヒーレントな光が用いられることがある。このように、非コヒーレントな光を用いる顕微鏡（光照射装置）においても、本発明の収差補正方法を適用可能である。以下では、本発明に係る光照射装置として、この種の顕微鏡の一例を示す。

図２２は、本発明の実施形態に係る光照射装置であって、測定対象を広く照明してイメージセンサで撮像を行う顕微鏡の一例を示す。図２２に示す顕微鏡１Ｂは、光源１０Ｂ、コンデンサーレンズ２０Ｂ、ミラー２２Ｂ、液浸対物レンズ５０、リレーレンズ２４Ｂ，２６Ｂ、プリズムミラー３０、空間光変調器４０、結像用レンズ２８Ｂ、及び、カメラ（イメージセンサ）７０Ｂを備えている。

光源１０Ｂは、例えば、白熱灯などの照明である。光源１０Ｂからの光は、コンデンサーレンズ２０Ｂによって平行光に変換され、ミラー２２Ｂによって反射されて、観察対象物６１を広く照射する。観察対象物６１から発する透過及び前方散乱光は対物レンズ５０に入射し、対物レンズ５０から射出された光は、リレーレンズ２４Ｂ，２６Ｂ及びプリズムミラー３０を介してＳＬＭ４０上に導かれる。ＳＬＭ４０で反射された光は、プリズムミラー３０及び結像用レンズ２８Ｂを介してカメラ７０Ｂへと導かれ、カメラ７０Ｂの面上に観察対象物６１の像を結ぶ。なお、この実施形態でも、対物レンズ５０の入射瞳面とＳＬＭ４０とが共役関係になるように、対物レンズ５０とＳＬＭ４０との間にリレーレンズ２４Ｂ，２６Ｂが設けられている。また、各レンズ５０、２４Ｂ，２６Ｂ，２８Ｂは、観察対象物６１とカメラ７０Ｂの面とが結像関係になるように配置されている。

この実施形態の光照射装置では、観察対象物６１を点の集まりと見なし、各点が２次光源となっていると考える。すなわち、観察対象物６１を２次の点光源の集まりと見なす。このようにして、２次点光源の集まりである観察対象物６１とカメラ７０Ｂとの間において、本発明の収差補正方法を適用することとなる。

各２次点光源からは球面波の光が発せられ、対物レンズ５０によって概ね平面波の光に変換される。ここで、観察対象物６１は水中にあるため、各２次点光源から射出された光は、浸液やカバーガラスとの間の屈折率ミスマッチによる球面収差を有することとなり、対物レンズ５０から射出される光は、上記（７）式で表される波面収差を含んだ平面波になることとなる。そのため、結像用レンズ２８Ｂによってカメラ７０Ｂ上に結像される際に収差の影響を受けることになり、像の空間分解能とコントラストとが低下することになる。

この対物レンズ５０から射出される光であって、波面収差を含んだ平面波の光は、リレーレンズ２４Ｂ，２６ＢによってＳＬＭ４０上に伝達される。このとき、ＳＬＭ４０に上記（７）式で表される位相変調を加えることによって収差を除去することができる。これにより、ＳＬＭ４０を射出する光は、波面収差が除去されたほぼ完全な平面波の光となる。その結果、結像用レンズ２８Ｂによってカメラ７０Ｂ上に結像する際に、収差のない結像が行われることになり、像の分解能とコントラストとを向上させることが可能となる。

第１及び第２の実施形態のレーザ加工装置では、プリズムミラー３０上方に光源があり、上方から下方に光が伝播していたが、この実施形態の光照射装置では、光の伝播方向が逆であり、対物レンズ５０下方に光源があり、下方から上方に光が伝播する。古典光学の範囲では、光伝播は時間反転に対して不変なので、同じ構成であれば、光の伝播方向にかかわらず収差補正が行われることは自明である。ただし、第１及び第２の実施形態のレーザ加工装置では、集光点が光軸上にあったが、この実施形態の光照射装置では、光源１０Ｂは光軸上以外にも存在するので、その影響について検討する。

観察対象物６１中にある２つの発光点を考える。一方の発光点から発する光は、光軸上にあるので球面収差の影響のみを受け、本発明による収差補正により良好に収差が除去される。一方、他方の発光点から発する光については、光軸上にないため、球面収差のみならず他の収差をも含むことになる。ただし、通常の顕微鏡においては観察視野が狭い。他方の発光点がその観察視野に含まれる限り、光軸からの外れ量は小さく、球面収差以外の収差は十分に小さい。したがって、他方の発光点から発せられる光についても、本発明による収差補正により、良好に収差が除去される。

この実施形態の光照射装置では、透過照明の場合を示したが、落射照明の場合にも本発明の収差補正方法を適用できる。また、この実施形態の光照射装置では、リレーレンズ２４Ｂ，２６Ｂを用いたが、これらは省略することも可能である。その場合、ＳＬＭ４０と対物レンズ５０とを近接せしめることが望ましい。また、この実施形態の光照射装置では、光源１０Ｂとして白熱灯を用いたが、光源１０Ｂには他の白色光源やレーザ、ＳＬＤ、ＬＥＤなどを用いることも可能である。さらに、白色光源にバンドパスフィルタを用いて波長帯域を制限した光を照明光として用いることもできる。

また、本実施形態では、顕微鏡観察の例を用いて実施例を説明したが、１つ以上の屈折率の異なる媒質を通過し、最後に通過した媒質と異なる屈折率を持つ媒質に集光する、特にｎ＜ｎ_ｄのような関係の場合に本発明を適用できる。例えば、屈折率の異なるガラスが２枚以上張り合わされており、屈折率の高いガラスを通過し、屈折率の低いガラスに集光させ、改質層を形成する場合にも適用できる。改質層とはクラック、屈折率変化などのことを言う。

１，１Ａ…顕微鏡観察装置（レーザ照射装置、レーザ集光装置）、１Ｂ…光照射装置（顕微鏡）、１０，１０Ｂ…光源、２０，２０Ｂ，２４Ｂ，２６Ｂ，２８Ｂ…レンズ、３０，２２Ｂ…ミラー、４０…空間光変調器（ＳＬＭ）、５０…液浸対物レンズ（集光手段、集光レンズ）、６０…浸液媒質（雰囲気媒質）、６０Ａ…浸液（雰囲気媒質）、６０Ｂ…カバーガラス、６１…観察対象物（媒質）、６１Ａ…溶液、６１Ｂ…観察対象物（媒質）、６２…スライドガラス、７０…観察光学系、７０Ｂ…カメラ（イメージセンサ）、８０…制御部、９０，９０Ａ，９０Ｂ…収差補正装置、９１…第１の補正波面生成部（第１の補正波面生成手段）、９２…第１の多項式近似部（第１の多項式近似手段）、９３…第２の多項式近似部（第２の多項式近似手段）、９４…第３の多項式近似部（第３の多項式近似手段）、９５…記憶部（記憶手段）、９６…第２の補正波面生成部（第２の補正波面生成手段）、１００…記録媒体、２００…コンピュータ、２０２…読取装置、２０６…メモリ、２０８…表示装置、２１０…マウス、２１２…キーボード、２１４…通信装置、２２０…コンピュータデータ信号、Ｐ１００…収差補正プログラム、Ｐ１０…第１の補正波面生成モジュール、Ｐ２０…第１の多項式近似モジュール、Ｐ３０…第２の多項式近似モジュール、Ｐ４０…第３の多項式近似モジュール、Ｐ５０…記憶モジュール、Ｐ６０…第２の補正波面生成モジュール。

Claims (10)

1. 光透過性を有する媒質内部にレーザ光を集光するレーザ照射装置の収差補正方法において、
   前記レーザ照射装置は、前記媒質内部にレーザ光を集光するための集光手段であって、
   当該集光手段の雰囲気媒質の屈折率が前記媒質の屈折率より大きい当該集光手段を備えており、
   前記媒質の屈折率をｎ、前記媒質の入射面から前記集光手段が有する焦点距離における焦点までの深さをｄ、前記媒質によって発生する縦収差の最大値をΔｓと定義すると、
   前記レーザ光の集光点が、前記媒質の入射面からｎ×ｄ−Δｓより大きく、ｎ×ｄより小さい範囲に位置するように、前記レーザ光の収差を補正することによって、収差を補正しないときに前記媒質内部で縦収差が存在する範囲の間に位置するように、前記レーザ光の収差を補正し、
   前記レーザ照射装置は、前記集光手段としての集光レンズと、前記レーザ光の収差を補正するための空間光変調器とを備えており、
   前記集光手段、前記雰囲気媒質、及び、前記媒質の間に空気層が介在していない、
   ことを特徴とする、
   収差補正方法。
2. 前記集光手段は液浸集光レンズであり、
   前記集光手段の雰囲気媒質は浸液である、
   請求項１に記載の収差補正方法。
3. 前記集光レンズの入射部と共役関係及び結像関係にある前記空間光変調器上の任意の画素における位相変調量と、前記画素に隣接する画素における位相変調量との位相差が２π以下であることを特徴とする、
   請求項１に記載の収差補正方法。
4. 前記レーザ光の収差を補正するための補正波面の位相値が極大点及び極小点を有するように、前記レーザ光の集光点を設定することを特徴とする、請求項１に記載の収差補正方法。
5. レーザ光を生成する光源と、前記光源からのレーザ光の位相を変調するための空間光変調器と、前記空間光変調器からのレーザ光を観察対象物内部における観察位置に集光するための集光レンズであって、当該集光レンズの雰囲気媒質の屈折率が前記観察対象物の屈折率より大きい当該集光レンズとを備える顕微鏡観察装置の顕微鏡観察方法において、
   前記観察対象物内部における前記観察位置を設定し、
   前記観察対象物の屈折率をｎ、前記観察対象物の入射面から前記集光レンズが有する焦点距離における焦点までの深さをｄ、前記観察対象物によって発生する縦収差の最大値をΔｓと定義すると、前記観察位置が、前記観察対象物の入射面からｎ×ｄ−Δｓより大きく、ｎ×ｄより小さい範囲に位置するように、前記観察対象物の相対移動量を設定することによって、収差を補正しないときに前記観察対象物内部で縦収差が存在する範囲の間に位置するように、前記観察対象物の相対移動量を設定し、
   前記観察位置に前記レーザ光が集光するように補正波面を算出して、前記空間光変調器に表示し、
   前記観察対象物と前記集光レンズとの距離が前記相対移動量となるように、前記集光位置を相対的に移動し、
   前記光源からのレーザ光を前記観察対象物における観察位置へ照射し、
   前記集光レンズ、前記雰囲気媒質、及び、前記観察対象物の間に空気層が介在していない、
   顕微鏡観察方法。
6. レーザ光を生成する光源と、前記光源からのレーザ光の位相を変調するための空間光変調器と、前記空間光変調器からのレーザ光を媒質内部の所定の集光位置に集光するための集光レンズであって、当該集光レンズの雰囲気媒質の屈折率が前記媒質の屈折率より大きい当該集光レンズとを備える媒質内レーザ集光装置のレーザ照射方法において、
   前記媒質内部における前記集光位置を設定し、
   前記媒質の屈折率をｎ、前記媒質の入射面から前記集光レンズが有する焦点距離における焦点までの深さをｄ、前記媒質によって発生する縦収差の最大値をΔｓと定義すると、前記集光位置が、前記媒質の入射面からｎ×ｄ−Δｓより大きく、ｎ×ｄより小さい範囲に位置するように、前記媒質の相対移動量を設定することによって、収差を補正しないときに前記媒質内部で縦収差が存在する範囲の間に位置するように、前記媒質の相対移動量を設定し、
   前記集光位置に前記レーザ光が集光するように補正波面を算出して、前記空間光変調器に表示し、
   前記媒質と前記集光レンズとの距離が前記相対移動量となるように、前記集光位置を相対的に移動し、
   前記光源からのレーザ光を前記媒質における集光位置へ照射する、
   前記集光レンズ、前記雰囲気媒質、及び、前記媒質の間に空気層が介在していない、
   レーザ照射方法。
7. 光透過性を有する媒質内部にレーザ光を集光するレーザ照射装置の収差補正方法において、
   前記レーザ照射装置は、前記媒質内部にレーザ光を集光するための集光手段であって、
   当該集光手段の雰囲気媒質の屈折率が前記媒質の屈折率より大きい当該集光手段を備えており、
   前記媒質の屈折率をｎ、前記媒質の入射面から前記集光手段が有する焦点距離における焦点までの深さをｄ、前記媒質によって発生する縦収差の最大値をΔｓと定義すると、前記レーザ光の集光点が、前記媒質の入射面からｎ×ｄ−Δｓより大きく、ｎ×ｄより小さい範囲に位置するように、前記レーザ光の収差を補正することによって、収差を補正しないときに前記媒質内部で縦収差が存在する範囲の間に位置するように、前記レーザ光の収差を補正するための補正波面であって、前記媒質内部の複数の観察位置にそれぞれ対応する複数の当該補正波面と、前記媒質内部の複数の観察位置にそれぞれ対応する複数の媒質表面から媒質がないときの集光点の位置までの距離とを求める第１の補正波面生成ステップと、
   前記複数の媒質表面から媒質がないときの集光点の位置までの距離の高次多項式近似を行うことによって第１の高次多項式を求める第１の多項式近似ステップと、
   前記複数の補正波面の高次多項式近似をそれぞれ行うことによって複数の第２の高次多項式を求める第２の多項式近似ステップと、
   前記複数の第２の高次多項式における同一次数項の係数からなる複数の係数列の高次多項式近似をそれぞれ行うことによって、観察位置をパラメータとする複数の第３の高次多項式を求める第３の多項式近似ステップと、
   前記第１の高次多項式における複数の次数項の係数と、前記複数の第３の高次多項式における複数の次数項の係数とを記憶する記憶ステップと、
   前記第１の高次多項式における複数の次数項の係数と、前記第１の高次多項式と、前記複数の第３の高次多項式における複数の次数項の係数及び前記複数の第３の高次多項式を用いて、前記複数の第２の高次多項式に相当する任意の観察位置の第２の高次多項式を求め、当該第２の高次多項式を用いて当該任意の観察位置の補正波面を求める第２の補正波面生成ステップと、
   を含み、
   前記レーザ照射装置は、前記集光手段としての集光レンズと、前記レーザ光の収差を補正するための空間光変調器とを備えており、
   前記集光手段、前記雰囲気媒質、及び、前記媒質の間に空気層が介在していない、
   ことを特徴とする、収差補正方法。
8. 光透過性を有する媒質内部にレーザ光を集光するレーザ照射装置のための収差補正装置において、
   前記レーザ照射装置は、前記媒質内部にレーザ光を集光するための集光手段であって、当該集光手段の雰囲気媒質の屈折率が前記媒質の屈折率より大きい当該集光手段を備えており、
   前記媒質の屈折率をｎ、前記媒質の入射面から前記集光手段が有する焦点距離における焦点までの深さをｄ、前記媒質によって発生する縦収差の最大値をΔｓと定義すると、前記レーザ光の集光点が、前記媒質の入射面からｎ×ｄ−Δｓより大きく、ｎ×ｄより小さい範囲に位置するように、前記レーザ光の収差を補正することによって、収差を補正しないときに前記媒質内部で縦収差が存在する範囲の間に位置するように、前記レーザ光の収差を補正するための補正波面であって、前記媒質内部の複数の観察位置にそれぞれ対応する複数の当該補正波面と、前記媒質内部の複数の観察位置にそれぞれ対応する複数の媒質表面から媒質がないときの集光点の位置までの距離とを求める第１の補正波面生成手段と、
   前記複数の媒質表面から媒質がないときの集光点の位置までの距離の高次多項式近似を行うことによって第１の高次多項式を求める第１の多項式近似手段と、
   前記複数の補正波面の高次多項式近似をそれぞれ行うことによって複数の第２の高次多項式を求める第２の多項式近似手段と、
   前記複数の第２の高次多項式における同一次数項の係数からなる複数の係数列の高次多項式近似をそれぞれ行うことによって、観察位置をパラメータとする複数の第３の高次多項式を求める第３の多項式近似手段と、
   前記第１の高次多項式における複数の次数項の係数と、前記複数の第３の高次多項式における複数の次数項の係数とを記憶する記憶手段と、
   前記第１の高次多項式における複数の次数項の係数と、前記第１の高次多項式と、前記複数の第３の高次多項式における複数の次数項の係数及び前記複数の第３の高次多項式を用いて、前記複数の第２の高次多項式に相当する任意の観察位置の第２の高次多項式を求め、当該第２の高次多項式を用いて当該任意の観察位置の補正波面を求める第２の補正波面生成手段と、
   を備え、
   前記レーザ照射装置は、前記集光手段としての集光レンズと、前記レーザ光の収差を補正するための空間光変調器とを備えており、
   前記集光手段、前記雰囲気媒質、及び、前記媒質の間に空気層が介在していない、
   ことを特徴とする、収差補正装置。
9. 光透過性を有する媒質内部にレーザ光を集光するレーザ照射装置のための収差補正プログラムにおいて、
   前記レーザ照射装置は、前記媒質内部にレーザ光を集光するための集光手段であって、当該集光手段の雰囲気媒質の屈折率が前記媒質の屈折率より大きい当該集光手段を備えており、
   コンピュータを、
   前記媒質の屈折率をｎ、前記媒質の入射面から前記集光手段が有する焦点距離における焦点までの深さをｄ、前記媒質によって発生する縦収差の最大値をΔｓと定義すると、前記レーザ光の集光点が、前記媒質の入射面からｎ×ｄ−Δｓより大きく、ｎ×ｄより小さい範囲に位置するように、前記レーザ光の収差を補正することによって、収差を補正しないときに前記媒質内部で縦収差が存在する範囲の間に位置するように、前記レーザ光の収差を補正するための補正波面であって、前記媒質内部の複数の観察位置にそれぞれ対応する複数の当該補正波面と、前記媒質内部の複数の観察位置にそれぞれ対応する複数の媒質表面から媒質がないときの集光点の位置までの距離とを求める第１の補正波面生成手段と、
   前記複数の媒質表面から媒質がないときの集光点の位置までの距離の高次多項式近似を行うことによって第１の高次多項式を求める第１の多項式近似手段と、
   前記複数の補正波面の高次多項式近似をそれぞれ行うことによって複数の第２の高次多項式を求める第２の多項式近似手段と、
   前記複数の第２の高次多項式における同一次数項の係数からなる複数の係数列の高次多項式近似をそれぞれ行うことによって、観察位置をパラメータとする複数の第３の高次多項式を求める第３の多項式近似手段と、
   前記第１の高次多項式における複数の次数項の係数と、前記複数の第３の高次多項式における複数の次数項の係数とを記憶する記憶手段と、
   前記第１の高次多項式における複数の次数項の係数と、前記第１の高次多項式と、前記複数の第３の高次多項式における複数の次数項の係数及び前記複数の第３の高次多項式を用いて、前記複数の第２の高次多項式に相当する任意の観察位置の第２の高次多項式を求め、当該第２の高次多項式を用いて当該任意の観察位置の補正波面を求める第２の補正波面生成手段と、
   として機能させ、
   前記レーザ照射装置は、前記集光手段としての集光レンズと、前記レーザ光の収差を補正するための空間光変調器とを備えており、
   前記集光手段、前記雰囲気媒質、及び、前記媒質の間に空気層が介在していない、
   収差補正プログラム。
10. 光透過性を有する媒質内部に照射光を集光する光照射装置の収差補正方法において、
    前記光照射装置は、前記媒質内部に照射光を集光するための集光手段であって、当該集光手段の雰囲気媒質の屈折率が前記媒質の屈折率より大きい当該集光手段を備えており、
    前記媒質の屈折率をｎ、前記媒質の入射面から前記集光手段が有する焦点距離における焦点までの深さをｄ、前記媒質によって発生する縦収差の最大値をΔｓと定義すると、
    前記照射光の集光点が、前記媒質の入射面からｎ×ｄ−Δｓより大きく、ｎ×ｄより小さい範囲に位置するように、前記照射光の収差を補正することによって、前記媒質内部に発生する収差範囲の間に位置するように、前記照射光の収差を補正し、
    前記光照射装置は、前記集光手段としての集光レンズと、収差を補正するための空間光変調器とを備えており、
    前記集光手段、前記雰囲気媒質、及び、前記媒質の間に空気層が介在していない、
    ことを特徴とする、
    収差補正方法。

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