JP4554174B2 - 顕微鏡システム、顕微鏡の制御方法、及びプログラム - Google Patents

Description

本発明は顕微鏡に関し、特に、観察像に生じ得る光学的な歪みを低減させる技術に関する。

共焦点顕微鏡は、ピンホールを光路上の試料注目部位と光学的に共役な位置に設置することで、光学的断層像を取得することのできる顕微鏡であり、フレアが少なくコントラストの良好な像を得ることができる。

例えば特許文献１には、このような共焦点顕微鏡において、対物レンズの浸漬媒体の屈折率と試料が封入されている封入媒体の屈折率とに基づいて対物レンズの焦点位置を補正することによって、歪みの少ない断層像を得る技術が提案されている。

一方、例えば特許文献２には、カバーガラスや透過性の標本保持部材などの厚さに起因して発生する収差を対物レンズの有する収差補正機能（補正環）を使用して補正した際に、その補正量に基づいて算出される焦点位置のずれ量に応じて準焦手段を駆動させることによって、この収差補正を行っても合焦状態を保つ技術が開示されている。
特開平７−１９９０７３号公報 特開２００２−１６９１０１号公報

前掲の特許文献１に開示されているような断層像の歪み補正では、試料の深さ方向に焦点を移動した際に光軸方向に生じる、カバーガラスや透過性の標本保持部材などの厚さに起因して発生する収差を補正することはできなかった。従って、この収差の劣化による共焦点光学系での受光効率が改善されないため、深さ方向の観察には限界があった。

また、前掲の特許文献２に開示されているような、対物レンズの補正環による収差の補正量に基づいた準焦手段の制御方法では、逆に、準焦手段を駆動させて焦点位置を変化させたときに生じる収差の補正ずれの補償を行うことはできなかった。

本発明は上述した問題に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、対物レンズの焦点の試料に対する位置を変化させても、カバーガラスや透過性の試料保持部材の厚さに起因する光学的な収差が適切に補正されるようにすることである。

本発明の態様のひとつである顕微鏡システムは、顕微鏡に配置された観察対象の試料を保護するカバーガラスの厚み、顕微鏡の対物レンズ先端から前記カバーガラス又は前記保持部材の対物レンズ側の面までの液状のイマージョン媒質の厚み、及び前記カバーガラス又は前記保持部材の前記試料側の面から前記対物レンズの焦点位置までの試料又は当該試料を封入する封入剤の厚みの変化に起因する光学的な収差に対する補正量を、前記試料と前記対物レンズとの間の距離に基づいて決定する補正量決定手段と、当該収差を補正する補正手段を当該補正量に基づいて制御する補正制御手段と、を有することを特徴とするものである。

従来、顕微鏡に備えられている当該収差を補正する補正手段、例えば補正環、は観察者によって操作され、カバーガラスの厚さに応じてその補正手段をおおまかに調整した状態で観察者が試料像を観察し、その試料像のコントラストが最良となるようにその補正手段を微調整して収差の補正を行っていた。

これに対し、上述した本発明に係る構成では、補正量決定手段が、当該試料と当該対物レンズとの間の距離に基づいてカバーガラスや保持部材の厚みに起因する光学的な収差に対する補正量を決定し、補正制御手段がその決定された補正量に基づいて補正手段を制御して当該収差の補正を行わせる。従って、この構成によれば、当該試料と当該対物レンズとの間の距離を変化させて対物レンズの焦点位置を変化させても、観察者に煩わしい調整操作を強いることなく、当該収差が適切に補正された標本像を得ることができる。

なお、上述した本発明に係る顕微鏡システムにおいて、顕微鏡は共焦点顕微鏡であってもよい。

また、前述した本発明に係る顕微鏡システムにおいて、試料の位置においての対物レンズの焦点位置の光軸方向の位置の変化量に対応する前述した距離の変化量を算出する算出手段を更に有るようにしてもよい。

こうすることにより、補正量決定手段は、対物レンズの焦点位置の光軸方向の位置に基づいて前述した補正量を決定することができるようになり、例えば試料の断層像を光軸方向に所定の間隔で取得する場合に、取得位置の各々で適切な収差補正のなされた断層像を得ることができる。

なお、このとき、算出手段が、前述したイマージョン媒質の屈折率、または試料の屈折率若しくは当該試料を封入する封入剤の屈折率に基づいて前述した距離の変化量を算出するようにしてもよい。

こうすることにより、屈折率の異なるイマージョン媒質、試料、若しくは封入剤を用いても、補正量決定手段が前述した補正量を適切に決定することができる。

また、前述した本発明に係る顕微鏡システムにおいて、前述した距離を所定の間隔で逐次変化させる制御を行う距離制御手段と、この距離が変化する度に、当該試料についての顕微鏡による観察像を取得することにより、当該試料の異なる観察深さの画像群を取得する観察像取得手段と、を更に有するようにしてもよい。

こうすることにより、前述した収差が適切に補正された試料の断層像を光軸方向に所定の間隔で自動的に取得することができ、観察者の手を煩わすことがない。

また、前述した本発明に係る顕微鏡システムにおいて、前述した補正手段として対物レンズには補正環が設けられているものであってもよい。

補正環を有する対物レンズは、前述した収差を補正する機能を有しているので、補正手段とみなすことができる。従って、この構成によれば、補正制御手段がこの対物レンズを制御する、より具体的には、補正環の回転角度を制御することにより、当該試料と当該対物レンズとの間の距離を変化させても当該収差が適切に補正された標本像を得ることができる。

なお、このとき、補正量決定手段は、予め得られている、対物レンズの光軸方向の位置と当該位置における補正環の適切な回転角度との関係に基づいて、当該補正環の回転角度を補正量として決定するようにしてもよい。

この構成は補正量決定手段の具体的な構成の一例を示すものであり、補正量決定手段をこのように構成することにより、当該試料と当該対物レンズとの間の距離に基づいて当該収差に対する補正量を決定することができる。

また、前述した本発明に係る顕微鏡システムにおいて、補正手段は、例えば伝播する光の波面を変換する波面変換素子であってもよく、特に、この波面変換素子は例えば可変形状ミラーであってもよい。

このような波面変換素子は、後述するように用いることにより前述した収差を補正することができるので、この構成によれば、補正制御手段がこの波面変換素子、例えば可変形状ミラー、の形状を制御することにより、当該試料と当該対物レンズとの間の距離を変化させても当該収差が適切に補正された標本像を得ることができる。

なお、本発明の別の態様のひとつである顕微鏡の制御方法は、顕微鏡に配置された観察対象の試料と当該顕微鏡の有する対物レンズとの間の距離に基づいて、当該試料を保護するカバーガラスの厚み又は当該試料を保持する透過性を有する保持部材の厚み、顕微鏡の対物レンズ先端から前記カバーガラス又は前記保持部材の対物レンズ側の面までの液状のイマージョン媒質の厚み、及び前記カバーガラス又は前記保持部材の前記試料側の面から前記対物レンズの焦点位置までの試料又は当該試料を封入する封入剤の厚みの変化に起因する光学的な収差に対する補正量を決定し、当該顕微鏡に備えられている当該収差を補正する補正部を当該補正量に基づいて制御する顕微鏡の制御方法も本発明に係るものであり、このような制御を当該顕微鏡に対して行うことにより、前述した本発明に係る顕微鏡システムと同様の作用を生じさせる。

また、顕微鏡に配置された観察対象の試料と当該顕微鏡の有する対物レンズとの間の距離に基づいて、当該試料を保護するカバーガラスの厚み又は当該試料を保持する透過性を有する保持部材の厚み、顕微鏡の対物レンズ先端から前記カバーガラス又は前記保持部材の対物レンズ側の面までの液状のイマージョン媒質の厚み、及び前記カバーガラス又は前記保持部材の前記試料側の面から前記対物レンズの焦点位置までの試料又は当該試料を封入する封入剤の厚みの変化に起因する光学的な収差に対する補正量を決定する処理と、当該顕微鏡に備えられている当該収差を補正する補正部を当該補正量に基づいて制御する処理と、をコンピュータに行わせるためのプログラムであっても、このプログラムを当該コンピュータで実行させることにより、上述した本発明に係る方法と同様の作用を生じさせる。

なお、ここで、当該収差の補正量を決定する処理は、例えば、予め実験により求められている、当該試料から対物レンズまでの距離に関するデータと、当該距離において最適な当該収差の補正量に関するデータとが対応付けられて記憶装置に格納されているデータベースを参照し、当該処理の実行時における当該距離に対応付けられている当該収差の補正量をこのデータベースから得る処理とすることにより実現可能である。

上述した態様のいずれによっても、本発明によれば、対物レンズの焦点の試料に対する位置を変化させたときに、観察者に煩わしい調整操作を強いることなく、カバーガラスや透過性の試料保持部材の厚さに起因する光学的な収差が適切に補正された試料の観察像を得ることができる。

以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。

まず図１について説明する。同図は本発明を実施する共焦点顕微鏡システムの構成を示している。

図１に示す共焦点顕微鏡１００において、光源１０２から射出された光はダイクロイックミラー１０３を透過し、対物レンズ１０４によって試料１０５において収束される。

一方、試料１０５から反射して対物レンズ１０４を透過した光のうち、所定の波長領域を有するもののみがダイクロイックミラー１０３により反射され、共焦点ピンホール１０７を通過した後に画像取得装置１０８へ取り込まれる。

このような共焦点顕微鏡１００としては、例えば、光源１０２からレーザ光が発せられ、試料１０５からの光が光電変換素子において集光されるようなレーザ走査型共焦点顕微鏡や、光源１０２からの光をニポウ・ディスク（Nipkow disk ）のようなスキャンディスクを介して試料を走査しＣＣＤ（Charge Coupled Device ：電荷撮像素子）カメラで観察する、ディスクスキャンタイブの共焦点顕微鏡等を利用することができる。

画像取得装置１０８からの出力である画像信号は共焦点顕微鏡１００に接続されたＰＣ（パーソナル・コンピュータ）１１０へと入力される。

ＰＣ１１０は、入力された画像信号で表現されている画像（試料１０５の断層像）を画像モニタ１１４に表示させる。

なお、試料１０５は、例えばグリセリン、ＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline ：リン酸緩衝生理食塩水）などの封入媒体に封入された状態で共焦点顕微鏡１００のステージ１０６上に戴置されている。

ステージ１０６または対物レンズ１０４は、駆動源としてモータまたはピエゾ素子を有しており、ＰＣ１１０から送られてくる指示に応じて位置制御コントローラ１０９がこの駆動源の動作を制御することにより、電動で光軸方向に駆動してステージ１０６と対物レンズ１０４との相対的な距離、すなわち試料１０５における対物レンズ１０４の焦点位置を変化させることができる。なお、ステージ１０６は、ＰＣ１１０からの指示により水平方向（光軸に対して垂直な方向）にも電動で駆動可能であってもよい。

対物レンズ１０４には、試料の深さ方向に焦点を移動した際に光軸方向に生じる、カバーガラスや透過性の標本保持部材などの厚さに起因して発生する球面収差を補正するための補正環が備えられており、この補正環を回転することにより、焦点位置を上下に微動させることができる。

なお、この補正環による補正量の調整は、例えばモータ等の駆動機構（図示せず）により電動で行うことができ、その調整量はＰＣ１１０から送られてくる指示に応じて補正環制御コントローラ１０１がこの駆動機構の動作を制御することにより、ＰＣ１１０による制御が可能なように構成されている。更に、この補正環の現在の調整位置は、ＰＣ１１０によって取得することが可能なように構成されている。

ＰＣ１１０には、例えばキーボードやマウス等のマンマシンインタフェース１１３が接続されており、図１に示す顕微鏡システムを使用する観察者がマンマシンインタフェース１１３を通じてＰＣ１１０へ各種の指示を行うことができる。特に、共焦点顕微鏡１００の対物レンズ１０４が浸漬されているイマージョン媒質（例えば、空気または水または油）の屈折率ｎ1 と、試料１０５の保持に使用されるカバーガラス（図示せず）の屈折率ｎ2 と、及び試料１０５の封入に使用されている封入剤若しくは試料１０５自身の屈折率ｎ3 とを示す情報は、観察者がマンマシンインタフェース１１３を通じて入力することにより、ＰＣ１１０の内部に備えられている記憶装置１１２に格納可能である。

なお、ＰＣ１１０は、ごく標準的な構成のもの、すなわち、制御プログラムの実行によってＰＣ１１０の動作制御を司るＣＰＵ（中央処理装置）１１１と、このＣＰＵ１１１が必要に応じてワークメモリとして使用するメインメモリ（不図示）と、画像取得装置１０８から送られてくる画像信号やマンマシンインタフェース１１３からの各種情報等の受信及び共焦点顕微鏡１００の動作を制御するための指示信号等の位置制御コントローラ１０９等への送信といった各種データの授受を管理するインタフェースユニット（不図示）と、各種のプログラムや制御データなどを記憶して保存しておく例えばハードディスク装置など記憶装置１１２と、画像信号で表現されている画像や各種の情報を画像モニタ１１４に表示させる制御を行う表示制御部（不図示）とを有しているコンピュータを利用することができる。

次に、この図１に示した顕微鏡システムを使用して球面収差の補正された画像を取得する手順について、図２に示す画像取得処理の処理内容を示すフローチャートを参照しながら説明する。

この処理は、ＰＣ１１０の有するＣＰＵ１１１が所定の制御プログラムを実行することによって行うものであり、図１に示す顕微鏡システムを使用する観察者による画像取得処理の実行を示す指示がマンマシンインタフェース１１３を通じてＰＣ１１０へなされたことが検出されると開始される。

まず、観察者によって対物レンズ１０４に使用するイマージョン媒質の屈折率ｎ₁ 、カバーガラスの屈折率ｎ₂ 、及び封入剤若しくは試料１０５自身の屈折率ｎ₃ の設定がマンマシンインタフェース１１３を通じてＰＣ１１０に入力されると、これらの屈折率ｎ₁ 、ｎ₂ 、及びｎ₃ を記憶装置１１２の所定の記憶領域に格納する処理がＣＰＵ１１１によって行われる（Ｓ１）。なお、本実施形態においては、屈折率ｎ₂ の値は直接使用しない。

次いで、観察者は、画像モニタ１１４を参照しながら、そこに表示されている断層像のうち観察すべき切片部分をインターフェース１１３の操作により指定すると共に、このときに最も画質の良好な断層像が得られるように収差の補正機構、すなわち対物レンズ１０４の補正環を操作して調整する。ＣＰＵ１１１では、この切片部分の指定位置と補正機構の現在の調整状態とを取得する処理が行われる（Ｓ２）。

ここで図３について説明する。同図は、対物レンズ１０４における、補正環の調整状態と焦点位置の距離との関係の例をグラフで示している。同図において、横軸θはθ₀ を基準としたときの補正環の回転角度を示しており、縦軸Ｚは、その回転角度における対物レンズから焦点位置までの距離を示している。なお、本実施形態の説明において、対物レンの焦点位置とは、イマージョン媒質、カバーガラス、及び封入剤若しくは観察対象の試料がステージ１０６上に載置された状態における焦点位置をいうものとする。

この図３のグラフで示されている、補正環の回転角度と焦点位置の距離との関係は、同一観察条件の下で観察対象である試料１０５の代わりに標準試料を用いたときのこの関係を試料１０５の観察の前に実験的に求めておき、ＰＣ１１０の記憶装置１１２に、対物レンズの種類毎にデータベース化されて格納されているものとする。

標準試料を用いて行うこの関係データの取得では、まず、標準試料が配置された状態でカバーガラス底面に焦点を合わせたときにおける対物レンズと焦点面との間の距離Ｚ₀ とその状態で最適に補正されたときの収差の補正値（補正環の回転角度θ₀ ）との関係を取得し、この関係を初期状態とする。その後、対物レンズ１０４を移動し、対物レンズ１０４の焦点位置の距離Ｚと収差補正の補正値θとの関係を断層像の取得間隔に応じて取得し、図３のグラフに示すような関係データを得る。なお、共焦点顕微鏡１００であれば、収差が最適に補正されたときには、観察される像が最も明るくなる。

この図３に示した関係を用いることにより、例えば、観察者による前述した調整のための操作によって補正環がθ₁ の回転角度にされている場合には、対物レンズ１０４の焦点位置の距離は、Ｚ₁ に調整されていることが分かる。

ＣＰＵ１１１では、記憶装置１１２に格納されている上述したデータベースを参照し、補正環の現在の回転角度に対応付けられている焦点位置の距離を補正機構の現在の調整状態として取得する処理が行われる。

続いて、観察者は、試料１０５における観察のために取得する断層像の取得間隔ΔＺ’及び取得枚数をインターフェース１１３の操作によりＰＣ１１０へ設定する。ＣＰＵ１１１ではこの断層像の取得間隔ΔＺ’及び取得枚数の設定を取得する処理が行われる（Ｓ３）。

ここで、ＣＰＵ１１１は、前述した処理によって記憶装置１１２に格納していた屈折率の値を読み出し、この値を利用してステージ１０６と対物レンズ１０４との相対的な移動量と、収差補正機構の調整量とを決定する処理が行われる（Ｓ４）。この決定処理について説明する。

ステージ１０６（試料１０５）と対物レンズ１０４との相対的な距離をΔＺだけ変化させたときにおける焦点位置の移動量ΔＺ’は下記の［１］式によって算出される。

ΔＺ’＝ΔＺ×ｎ₃ ／ｎ₁ ・・・［１］
なお、上記［１］式の導出については後述する。

上記の［１］式を変形すると、焦点位置を断層像の取得間隔ΔＺ’だけ移動させたいときには、ステージ１０６と対物レンズ１０４との相対的な距離ΔＺを
ΔＺ＝ΔＺ’×ｎ₁ ／ｎ₃ ・・・［２］
だけ変化させるようにすればよいことが分かる。ＣＰＵ１１１では上記の［２］式の計算を実行することによって、指定された取得間隔で断層像を取得するためのステージ１０６と対物レンズ１０４との相対的な移動量を算出する。

また、ここで、移動前の対物レンズ１０４の焦点位置の距離がＺ₁ であるとすると、ステージ１０６と対物レンズ１０４との相対的な距離をΔＺだけ移動させた後の対物レンズ１０４の焦点位置の距離Ｚ₂ が下記の式［３］によって算出されることは、対物レンズ１０４の焦点位置の関係を図示した図４を参照すれば明らかである。

Ｚ₂ ＝Ｚ₁ ＋ΔＺ’−ΔＺ・・・［３］
ＣＰＵ１１１では、上記の［３］式の計算を実行することによってＺ₂ を算出した後、記憶装置１１２に格納されている、図３にグラフで示した補正環の調整状態と対物レンズ１０４の焦点位置との関係が表されているデータベースを参照し、このデータベースでこのＺ₂ に対応付けられている補正環の回転角度θ₂ を取得する処理が行われる。このθ₂ が収差補正機構の調整量の決定の結果となる。

次に、ＣＰＵ１１１では、前述したようにして決定された変化量ΔＺだけステージ１０６と対物レンズ１０４との相対的な距離を変化させる指示を共焦点顕微鏡１００の位置制御コントローラ１０９に与える処理が行われる（Ｓ５）。位置制御コントローラ１０９は、この指示に従い、対物レンズ１０４若しくはステージ１０６を光軸方向に移動量ΔＺだけ移動させる。

続いて、ＣＰＵ１１１では、前述したようにして取得された収差補正機構の調整量を共焦点顕微鏡１００に与えて反映させる処理が行われる。すなわち、モータ等の駆動機構を制御して補正環を駆動させ、前述したようにして取得された回転角度θ₂ とする処理が行われる（Ｓ６）。

その後、ＣＰＵ１１１では、共焦点顕微鏡１００内の画像取得装置１０８を制御してこのときに得られる試料１０５の断層像の取り込み処理を行わせ、その結果として画像取得装置１０８から送られてくる映像信号で表現されている断層像を画像モニタ１１４に表示させると共に、この断像像を表現している画像データを記憶装置１１２の所定の記憶領域に格納する処理が行われる（Ｓ７）。

ここで、ＣＰＵ１１１では、この画像取得処理の実行を開始してから現在までの断層像の取得枚数と、前述したようにして取得した断層像の取得枚数についての観察者の設定とを比較し、観察者の設定した取得枚数の断層像の取得を完了したか否かを判定する処理が行われる（Ｓ８）。ここで、設定された枚数の断層像の取得を完了したと判定したとき（Ｓ８の判定結果がＹｅｓのとき）には、この画像取得処理を終了する。一方、設定された枚数の断層像の取得を未だ完了していないと判定したとき（Ｓ８の判定結果がＮｏのとき）には、この画像取得処理を終了する。

以上までの処理が画像取得処理であり、この処理を図１に示す顕微鏡システムのＣＰＵ１１１が実行することにより、光軸方向の位置の異なる断層像の連続取得のために焦点位置を変化させても球面収差の補正が常に適切になされた断層像が自動的に取得される。

次に、前述した式［１］の導出について、図５を用いて説明する。

図５において、スネルの法則により、
ｎ₁ ・sin θ＝ｎ₂ ・sin θ'
ｎ₂ ・sin θ' ＝ｎ₃ ・sin θ''
が成立するので、これより、
ｎ₁ ・sin θ＝ｎ₃ ・sin θ''・・・［i ］
が成立する。

ここで、観察面を光軸方向にΔＺだけ移動させた場合には、
ΔＺ＝ｄ・tan θ
ΔＺ' ＝ｄ・tan θ''
が成立するので、これより、
ΔＺ' ＝ΔＺ・tan θ''／tan θ・・・［ii］
と表すことができる。

ここで、θ及びθ''が十分に小さい場合（近軸領域）には、
sin θ≒θ
sin θ''≒θ''
tan θ≒θ
tan θ''≒θ''
が成立するので、上記［i ］式より、
ｎ₁ ・θ＝ｎ₃ ・θ''
従って、上記［ii］式より、
ΔＺ' ＝ΔＺ・ｎ₃ ／ｎ₁
となり、前述した式［１］が導出される。

なお、以上までに説明した実施形態においては、収差補正を行う際の補正環の回転角度θ₂ の決定をするために使用される、補正環の回転角度と焦点位置の距離との関係を、同一観察条件の下で観察対象である試料１０５の代わりに標準試料を用いたときのこの関係を試料１０５の観察の前に実験的に求めるようにしていたが、この代わりに、イマージョン媒質の屈折率ｎ₁ を例えば１．０としたときにおけるこの関係を示す基準補正データ群や、封入剤若しくは試料１０５自身の屈折率ｎ₃ の設定を例えば１．０としたときにおけるこの関係を示す基準補正データ群を前もって実験的に求めておき、実際の試料１０５の断層像の取得の際には、この取得時における屈折率ｎ₁ 及びｎ₃ の値からこれらの値が１．０であるときの焦点位置の距離を換算し、この換算結果に対応する補正環の回転角度を上述した基準補正データ群から取得して収差補正を行うようにしてもよい。

また、以上までに説明した実施形態においては、球面収差の補正のために対物レンズ１０４に備わっている補正環を用いていたが、この補正環の代わりに波面変調素子を利用して球面収差の補正を行うようにしてもよい。

例えば波面変調素子として、図６に示すように、可変形状ミラー（Deformable Mirror ）２０１を、図１におけるダイクロイックミラー１０３と対物レンズ１０４との間の光路上に配置する。

対物レンズ１０４を透過した光線は、対物レンズ１０４の光軸中心からの距離に応じて焦点位置が光軸方向にずれる。従って、可変形状ミラー２０１を変形させて対物レンズ１０４に入射する光線に位相差を予め発生させるようにすることにより、光軸方向の焦点の位置を上下に微動させることができるので、球面収差の補正に使用することができる。

なお、波面変調素子としては、この他に、例えば透過型液晶などの、光の波面を自在に変換できる素子を用いることができる。

ところで、以上までに説明した実施形態では、特に共焦点顕微鏡を用いたものを提示したが、一般の蛍光顕微鏡観察においても本発明に係る対物レンズの補正環駆動による収差補正を行うことができることはいうまでもない。このような実施形態の例として、図７のようなＰＣ制御の電動である蛍光顕微鏡システムで本発明を実施する場合を簡単に説明する。

同図において、図１に示したものと同様の構成要素には同一の符号を付している。図７において図１と異なる部分は、試料１０５から反射して対物レンズ１０４を透過した光のうち、所定の波長領域を有するもののみがダイクロイックミラー１０３により反射された後、特定の波長領域を有する光のみが吸収フィルタ３０１によって吸収されずに透過し、画像取得装置または接眼部３０２で結像する部分である。

観察者がＰＣ１１０に前述した屈折率ｎ₁ 、ｎ₂ 、及びｎ₃ を設定した上で、一つの観察位置において対物レンズ１０４の補正環を手動で操作して球面収差をまず補正する。

以降、焦点位置を変化させるための対物レンズ１０４若しくはステージ１０６の光軸方向への移動に応じて対物レンズ１０４の補正環を駆動させる制御を前述した実施形態と同様に行うことにより、常に球面収差を補正した観察像を取得することができ、また、光軸方向に深い位置に焦点位置を配しても明るい観察像が得られ、試料のより深い位置での観察が容易に行えるようになる。

ところで、図２にフローチャートで示した処理を、前述したような標準的なコンピュータのＣＰＵに行わせるための制御プログラムを作成してコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録させておき、そのプログラムを記録媒体からコンピュータに読み込ませてＣＰＵで実行させるようにすると、このコンピュータをＰＣ１１０として機能させることができる。記録させた制御プログラムをコンピュータで読み取ることの可能な記録媒体としては、例えば、コンピュータに内蔵若しくは外付けの付属装置として備えられるＲＯＭやハードディスク装置などの記憶装置、フレキシブルディスク、ＭＯ（光磁気ディスク）、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭなどといった携帯可能記録媒体等が利用できる。

また、記録媒体は通信回線を介してコンピュータと接続される、プログラムサーバとして機能するコンピュータが備えている記憶装置であってもよい。この場合には、制御プログラムを表現するデータ信号で搬送波を変調して得られる伝送信号を、プログラムサーバから伝送媒体である通信回線を通じてコンピュータへ伝送するようにし、コンピュータでは受信した伝送信号を復調して制御プログラムを再生することでこの制御プログラムをＣＰＵで実行できるようになる。

なお、本発明は、上述した実施形態に限定されることなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内で種々の改良・変更が可能である。

本発明を実施する共焦点顕微鏡システムの構成を示す図である。 画像取得処理の処理内容を示すフローチャートである。 対物レンズにおける補正環の調整状態と焦点位置との関係の例をグラフで示した図である。 対物レンズの焦点位置の関係を示す図である。 焦点位置の移動量の補正値の算出式の導出に用いる図である。 波面変調素子を用いた収差補正を説明する図である。 本発明を実施する蛍光顕微鏡システムの構成を示す図である。

符号の説明

１００ 共焦点顕微鏡
１０１ 補正環コントローラ
１０２ 光源
１０３ ダイクロイックミラー
１０４ 対物レンズ
１０５ 試料
１０６ ステージ
１０７ 共焦点ピンホール
１０８ 画像取得装置
１０９ 位置制御コントローラ
１１０ ＰＣ
１１１ ＣＰＵ
１１２ 記憶装置
１１３ マンマシンインタフェース
１１４ 画像モニタ
２０１ 可変形状ミラー
３０１ 吸収フィルタ
３０２ 画像取得装置または接眼部

Claims (17)

1. 顕微鏡に配置された観察対象の試料を保護するカバーガラスの厚み又は当該試料を保持する透過性を有する保持部材の厚み、顕微鏡の対物レンズ先端から前記カバーガラス又は前記保持部材の対物レンズ側の面までの液状のイマージョン媒質の厚み、及び前記カバーガラス又は前記保持部材の前記試料側の面から前記対物レンズの焦点位置までの試料又は当該試料を封入する封入剤の厚みの変化に起因する光学的な収差に対する補正量を、前記試料と前記対物レンズとの間の距離に基づいて決定する補正量決定手段と、
   前記収差を補正する補正手段を前記補正量に基づいて制御する補正制御手段と、
   を有することを特徴とする顕微鏡システム。
2. 前記距離を所定の間隔で逐次変化させる制御を行う距離制御手段と、
   前記距離が変化する度に、前記試料についての前記顕微鏡による観察像を取得することにより、前記試料の異なる観察深さの画像群を取得する観察像取得手段と、
   を更に有することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡システム。
3. 前記顕微鏡は共焦点顕微鏡であることを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡システム。
4. 前記補正量決定手段は、前記試料の位置においての前記対物レンズの焦点位置の光軸方向の位置の変化量に対応する前記距離の変化量を算出する算出手段を更に有することを特徴とする請求項１から３のうちのいずれか一項に記載の顕微鏡システム。
5. 前記算出手段は、前記イマージョン媒質の屈折率、または前記試料の屈折率若しくは前記封入剤の屈折率に基づいて前記距離の変化量を算出することを特徴とする請求項４に記載の顕微鏡システム。
6. 前記対物レンズには、前記補正手段として補正環が設けられていることを特徴とする請求項１から３のうちのいずれか一項に記載の顕微鏡システム。
7. 前記補正制御手段は前記補正環の回転角度の制御を行うことを特徴とする請求項６に記載の顕微鏡システム。
8. 前記補正量決定手段は、予め得られている、前記対物レンズの光軸方向の位置と当該位置における前記補正環の適切な回転角度との関係に基づいて、当該補正環の回転角度を前記補正量として決定することを特徴とする請求項７に記載の顕微鏡システム。
9. 前記補正手段は、伝播する光の波面を変換する波面変換素子であることを特徴とする請求項１から３のうちのいずれか一項に記載の顕微鏡システム。
10. 前記波面変換素子は可変形状ミラーであることを特徴とする請求項９に記載の顕微鏡システム。
11. 顕微鏡に配置された観察対象の試料と当該顕微鏡の有する対物レンズとの間の距離に基づいて、当該試料を保護するカバーガラスの厚み又は当該試料を保持する透過性を有する保持部材の厚み、顕微鏡の対物レンズ先端から前記カバーガラス又は前記保持部材の対物レンズ側の面までの液状のイマージョン媒質の厚み、及び前記カバーガラス又は前記保持部材の前記試料側の面から前記対物レンズの焦点位置までの試料又は当該試料を封入する封入剤の厚みの変化に起因する光学的な収差に対する補正量を決定し、
    前記顕微鏡に備えられている前記収差を補正する補正部を前記補正量に基づいて制御する、
    ことを特徴とする顕微鏡の制御方法。
12. 顕微鏡に配置された観察対象の試料と当該顕微鏡の有する対物レンズとの間の距離に基づいて、当該試料を保護するカバーガラスの厚み又は当該試料を保持する透過性を有する保持部材の厚み、顕微鏡の対物レンズ先端から前記カバーガラス又は前記保持部材の対物レンズ側の面までの液状のイマージョン媒質の厚み、及び前記カバーガラス又は前記保持部材の前記試料側の面から前記対物レンズの焦点位置までの試料又は当該試料を封入する封入剤の厚みの変化に起因する光学的な収差に対する補正量を決定する処理と、
    前記顕微鏡に備えられている前記収差を補正する補正部を前記補正量に基づいて制御する処理と、をコンピュータに行わせるためのプログラム。
13. 液状のイマージョン媒質を観察対象の試料との間に満たして観察する対物レンズと、この対物レンズと前記試料との間の距離を変化させる距離調節手段と、前記試料を保護するカバーガラスの厚み又は前記試料を保持する透過性を有する保持部材の厚みに起因する光学的な収差を補正可能な補正手段とを備える顕微鏡において、
    前記距離調節手段により調節される前記距離に基づいて、前記対物レンズの焦点位置の前記試料の表面からの深さの変化に起因する光学的な収差の変化を補正するため前記補正手段における補正量を決定する補正量決定手段と、前記補正手段を前記補正量に基づいて制御する補正制御手段と、
    を有することを特徴とする顕微鏡システム。
14. 液状のイマージョン媒質を観察対象の試料との間に満たして観察する対物レンズと、
    この対物レンズと前記試料との間の距離を変化させる距離調節手段と、
    前記距離を所定間隔で変化させるように前記距離調節手段を制御する距離制御手段と、
    前記距離の変化に基づく対物レンズ焦点位置の試料表面からの深さの変化に起因する光学的な収差の変化を補正する補正手段と、
    前記距離に基づいて前記補正手段における補正量を決定する補正量決定手段と、
    前記補正手段を前記補正量に基づいて制御する補正制御手段と、
    を有し、
    前記距離の変化の度に、当該変化した距離に基づく前記補正量決定手段及び前記補正制御手段が前記補正量の決定及び前記補正手段の制御を行い、その後に前記試料の観察像を取得することにより前記試料の異なる観察深さの画像群を取得することを特徴とする顕微鏡システム。
15. 前記補正量決定手段は、前記試料として標準試料を使用して当該標準試料と前記対物レンズの焦点位置を変化させながら、当該対物レンズの焦点位置とその位置において取得される画像が最適に補正されたときの前記補正手段の補正量との関係を予め取得して記憶し、この記憶された関係に基づいて前記距離に対応する前記補正手段の補正量を決定することを特徴とする請求項１、２、１３又は１４のいずれかに記載の顕微鏡システム。
16. 前記補正量決定手段は、前記対物レンズに使用される液状のイマージョン媒質の屈折率又は前記試料若しくはこの試料を封入する封入剤の屈折率を所定の値としたときの、前記対物レンズの焦点位置と前記補正手段の補正量との関係を示す基準補正データ群を予め取得して記憶し、
    前記基準補正データ群の取得時の前記イマージョン媒質の屈折率又は前記試料若しくはこの試料を封入する封入剤の屈折率の値と、前記観察対象の試料の観察時におけるイマージョン媒質の屈折率又は前記試料若しくはこの試料を封入する封入剤の屈折率の値とから得られる換算結果に基づいて、前記基準補正データ群から前記補正手段の補正量を取得することを特徴とする請求項１、２、１３又は１４のいずれかに記載の顕微鏡システム。
17. 前記標準試料の観察において取得される画像が最適に補正されたときの前記補正手段の補正量は、その焦点位置において取得される画像が最も明るくなる場合のものであることを特徴とする請求項１５または１６に記載の顕微鏡システム。

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