JP2017215546A - 共焦点顕微鏡 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、落射照明を利用して光透過性物体を撮像する共焦点位相差顕微鏡に関するものである。
本発明の別の目的は、生体細胞や生体組織を生きた状態で観察できる共焦点顕微鏡を実現することにある。
さらに、本発明の目的は、生体細胞の正確な断面画像を撮像できる共焦点顕微鏡を提供することにある。
照明ビームを発生する照明光源、及び、照明ビームをスポット状に集束して観察すべき試料に向けて投射する対物レンズを有する照明光学系と、
前記照明ビームにより試料を主走査方向及びこれと直交する副走査方向に2次元走査する走査機構と、
反射面を有し、反射面上に観察すべき試料を保持する試料保持手段と、
前記試料を透過し前記反射面で反射し、対物レンズにより集光された光を受光する光検出手段、及び対物レンズにより集光された光をピンホール手段を介して光検出手段上に結像する結像レンズを含む結像光学系と、
前記光検出手段からの出力信号を用いて試料の共焦点画像を形成する信号処理装置とを具え、
前記結像レンズは、その結像点が光軸方向にそって変位可能に構成され、
前記対物レンズ又は試料を保持する反射面は光軸方向に変位可能に構成され、対物レンズ又は反射面の光軸方向の変位に応じて結像レンズの結像点の位置が光軸方向に沿って調整されることを特徴とする。
照明ビームを発生する照明光源、及び、照明ビームをスポット状に集束して観察すべき試料に向けて投射する対物レンズを有する照明光学系と、
前記照明ビームにより試料を主走査方向及びこれと直交する副走査方向に2次元走査する走査機構と、
反射面を有し、反射面上に観察すべき試料を保持する試料保持手段と、
前記試料を透過し前記反射面で反射し、前記対物レンズにより集光された光を受光する光検出手段、前記対物レンズにより集光された光をピンホール手段を介して光検出手段上に結像する結像レンズ、及び光路中に挿脱可能に配置され、照明光と同一の波長域の光を選択的に遮光するフィルタ手段を含む結像光学系と、
前記光検出手段からの出力信号を用いて試料の共焦点画像を形成する信号処理装置とを具え、
前記結像レンズは、その結像点が光軸方向にそって変位可能に構成され、
前記対物レンズ又は反射面は光軸方向に変位可能に構成され、対物レンズ又は反射面の光軸方向の変位に応じて結像レンズの結像点が光軸方向に沿って調整され、
試料として蛍光性物体を用いる場合、フィルタ手段を光路中に挿入することにより試料の蛍光像を撮像する共焦点蛍光顕微鏡として機能し、
試料として光透過性物体を用いる場合、フィルタ手段を光路から外すことにより光透過性試料の共焦点透過像を撮像する共焦点顕微鏡として機能することを特徴とする。
照明ビームを発生する照明光源、及び、照明ビームをスポット状に集束して観察すべき試料に向けて投射する対物レンズを有する照明光学系と、
反射面を有し、反射面上に観察すべき試料を保持する試料保持手段と、
前記照明ビームにより試料を主走査方向及びこれと直交する副走査方向に2次元走査する走査機構と、
前記試料を透過し前記反射面で反射し、対物レンズにより集光された光を2分割して第1及び第2のサブビームを形成するビーム分割素子、第1及び第2のサブビームをそれぞれ受光する第1及び第2の光検出手段、及び第1及び第2のサブビームをピンホール手段を介して第1及び第2の光検出手段上にそれぞれ結像する第1及び第2の結像レンズを含む結像光学系と、
前記第1及び/又は第2の光検出手段から出力される画像信号を用いて試料の共焦点画像を形成する信号処理装置とを具え、
前記結像レンズは、その結像点が光軸方向にそって変位可能に構成され、
前記対物レンズ又は反射面は光軸方向に変位可能に構成され、対物レンズ又は反射面の光軸方向の変位に応じて前記第1及び第2の結像レンズの結像点が光軸方向に沿って調整されることを特徴とする。
照明ビームを発生する照明光源、及び、照明ビームをスポット状に集束して観察すべき試料に向けて投射する対物レンズを有する照明光学系と、
反射面を有し、反射面上に観察すべき試料を保持する試料保持手段と、
前記照明ビームにより試料を主走査方向及びこれと直交する副走査方向に2次元走査する走査機構と、
前記試料を透過し前記反射面で反射し、前記対物レンズにより集光された光を2分割して第1及び第2のサブビームを形成するビーム分割素子、第1及び第2のサブビームをそれぞれ受光する第1及び第2の光検出手段、第1及び第2のサブビームをピンホール手段を介して第1及び第2の光検出手段上にそれぞれ結像する第1及び第2の結像レンズ、及び、光路中に挿脱可能に配置され、照明光と同一の波長域の光を選択的に遮光するフィルタ手段を含む結像光学系と、
前記光検出手段からの出力信号を用いて試料の共焦点画像を形成する信号処理装置とを具え、
前記結像レンズは、その結像点が光軸方向にそって変位可能に構成され、
前記対物レンズ又は反射面は光軸方向に変位可能に構成され、対物レンズ又は反射面の光軸方向の変位に応じて結像レンズの結像点が光軸方向に沿って調整され、
試料として蛍光性物体を用いる場合、フィルタ手段を光路中に挿入することにより試料の蛍光像を撮像する共焦点顕微鏡として機能し、
試料として光透過性物体を用いる場合、フィルタ手段を光路から外すことにより光透過性試料の共焦点透過像を撮像する共焦点顕微鏡として機能することを特徴とする。
さらに、生体細胞を試料保持手段上に固定し、培養液に浸漬した状態で撮像できるので、生体細胞の透過像を生きた状態で撮像することができる。
さらに、本発明では、対物レンズ又は試料を保持する反射面が光軸方向に変位しても、これらの変位に対応して結像光学系の結像点の位置が調整されるので、所望の高さ位置における共焦点断面画像を撮像することができる。
2 集束性レンズ
3 ビームスプリッタ
4 ガルバノミラー
5,6 リレーレンズ
7 1/4波長板
8 対物レンズ
9 試料
10シリコン保持手段
11 固定膜
12 容器
13 生体細胞
14 培養液
15 ステージ
16 モーター
17 位置センサ
18 信号処理装置
19 空間フィルタ
20 帯域フィルタ
21 結像レンズ
22 ピンホール手段して
23 光検出手段
前記照明ビームにより試料を主走査方向及びこれと直交する副走査方向に2次元走査する走査機構と、
反射膜を有し、反射膜上に観察すべき試料を保持する試料保持手段と、
前記試料から出射すると共に前記反射膜で反射し、前記対物レンズにより集光された光を受光する光検出手段、光検出手段と対物レンズとの間の光路中に配置され、微小な光通過エリアを有する第1の空間フィルタ、及び、前記対物レンズにより集光された光を集束して第1の空間フィルタの光通過エリアに向けて投射する結像レンズを含む観察光学系と、
前記光検出手段からの出力信号を用いて試料の共焦点画像を形成する信号処理装置とを具え、
前記第1の空間フィルタ及び/又は結像レンズは、光軸方向にそって移動可能に設定されていることを特徴とする。
照明ビームを発生する照明光源、及び、照明ビームをスポット状に集束して観察すべき試料に向けて投射する対物レンズを有する照明光学系と、
前記照明ビームにより試料を主走査方向及びこれと直交する副走査方向に2次元走査する走査機構と、
反射面を有し、反射面上に観察すべき試料を保持する試料保持手段と、
前記試料を透過し前記反射面で反射し、前記対物レンズにより集光された光を受光する光検出手段、及び前記対物レンズにより集光された光をピンホール手段を介して光検出手段上に結像する結像レンズを含む結像光学系と、
前記対物レンズと光検出手段との間の光路中に配置され、光路の片側半分のエリアを遮光する空間フィルタと、
前記光検出手段からの出力信号を用いて試料の共焦点画像を形成する信号処理装置とを具え、
前記結像レンズは、その結像点が光軸方向にそって変位可能に構成され、
前記対物レンズ又は反射面は光軸方向に変位可能に構成され、対物レンズ又は反射面の光軸方向の変位に応じて結像レンズの結像点が光軸方向に沿って調整されることを特徴とする。一例として生体細胞が一種の凸レンズと同様に作用する場合について説明する。この場合、照明ビームの主走査方向に見て生体細胞の先端側に入射した光と後端側に入射した光では、屈折後の進行方向が互いに反対方向となる。この場合において、片側半分のエリアを遮光する空間フィルタを配置すれば、例えば生体細胞の先端側(主走査方向の先端側)の部位から出射した透過光は空間フィルタにより遮光されず、生体細胞の後端側から出射した透過光は空間フィルタにより遮光される。この結果、生体細胞の前側半分のエリアは高輝度画像を形成し、残りの半分のエリアは低輝度画像を形成し、明暗の輝度画像が形成される。すなわち、光路の半分のエリアを遮光する空間フィルタは、生体細胞における屈折によるコントラストを一層増強する作用を果たす。従って、空間フィルタを導入することにより、コントラストが一層増強された共焦点透過像を撮像することができる。
照明ビームを発生する照明光源、及び、照明ビームをスポット状に集束して観察すべき試料に向けて投射する対物レンズを有する照明光学系と、
前記照明ビームにより試料を主走査方向及びこれと直交する副走査方向に2次元走査する走査機構と、
反射面を有し、反射面上に観察すべき試料を保持する試料保持手段と、
前記試料を透過し前記反射面で反射し、前記対物レンズにより集光された光を受光する光検出手段、前記対物レンズにより集光された光をピンホール手段を介して光検出手段上に結像する結像レンズ、及び光路中に挿脱可能に配置され、照明光と同一の波長域の光を選択的に遮光するフィルタ手段を含む結像光学系と、
前記対物レンズと光検出手段との間の光路中に配置され、光路の片側半分のエリアを遮光する空間フィルタと、
前記光検出手段からの出力信号を用いて試料の共焦点画像を形成する信号処理装置とを具え、
前記結像レンズは、その結像点が光軸方向にそって変位可能に構成され、
前記対物レンズ又は反射面は光軸方向に変位可能に構成され、対物レンズ又は反射面の光軸方向の変位に応じて結像レンズの結像点が光軸方向に沿って調整され、
試料として蛍光性物体を用いる場合、フィルタ手段を光路中に挿入することにより試料の蛍光像を撮像する共焦点顕微鏡として機能し、
試料として光透過性物体を用いる場合、フィルタ手段を光路から外すことにより光透過性試料の共焦点透過像を撮像する共焦点顕微鏡として機能することを特徴とする。
Claims (11)
- 光透過性物体の共焦点透過像を撮像する共焦点顕微鏡であって、
照明ビームを発生する照明光源、及び、照明ビームをスポット状に集束して観察すべき試料に向けて投射する対物レンズを有する照明光学系と、
前記照明ビームにより試料を主走査方向及びこれと直交する副走査方向に2次元走査する走査機構と、
反射面を有し、反射面上に観察すべき試料を保持する試料保持手段と、
前記試料を透過し前記反射面で反射し、前記対物レンズにより集光された光を受光する光検出手段、及び前記対物レンズにより集光された光をピンホール手段を介して光検出手段上に結像する結像レンズを含む結像光学系と、
前記光検出手段からの出力信号を用いて試料の共焦点画像を形成する信号処理装置とを具え、
前記結像レンズは、その結像点が光軸方向にそって変位可能に構成され、
前記対物レンズ又は反射面は光軸方向に変位可能に構成され、対物レンズ又は反射面の光軸方向の変位に応じて結像レンズの結像点が光軸方向に沿って調整されることを特徴とする共焦点顕微鏡。 - 請求項1に記載の共焦点顕微鏡において、前記対物レンズと光検出手段との間の光路中に、光路の片側半分のエリアを遮光する空間フィルタが配置されていることを特徴とする共焦点顕微鏡。
- 光透過性物体の共焦点透過像又は蛍光性物体の共焦点蛍光像を選択的に撮像する共焦点顕微鏡であって、
照明ビームを発生する照明光源、及び、照明ビームをスポット状に集束して観察すべき試料に向けて投射する対物レンズを有する照明光学系と、
前記照明ビームにより試料を主走査方向及びこれと直交する副走査方向に2次元走査する走査機構と、
反射面を有し、反射面上に観察すべき試料を保持する試料保持手段と、
前記試料を透過し前記反射面で反射し、前記対物レンズにより集光された光を受光する光検出手段、前記対物レンズにより集光された光をピンホール手段を介して光検出手段上に結像する結像レンズ、及び光路中に挿脱可能に配置され、照明光と同一の波長域の光を選択的に遮光するフィルタ手段を含む結像光学系と、
前記光検出手段からの出力信号を用いて試料の共焦点画像を形成する信号処理装置とを具え、
前記結像レンズは、その結像点が光軸方向にそって変位可能に構成され、
前記対物レンズ又は反射面は光軸方向に変位可能に構成され、対物レンズ又は反射面の光軸方向の変位に応じて結像レンズの結像点が光軸方向に沿って調整され、
試料として蛍光性物体を用いる場合、フィルタ手段を光路中に挿入することにより試料の蛍光像を撮像する共焦点顕微鏡として機能し、
試料として光透過性物体を用いる場合、フィルタ手段を光路から外すことにより光透過性試料の共焦点透過像を撮像する共焦点顕微鏡として機能することを特徴とする共焦点顕微鏡。 - 光透過性物体の共焦点透過像を撮像する共焦点顕微鏡であって、
照明ビームを発生する照明光源、及び、照明ビームをスポット状に集束して観察すべき試料に向けて投射する対物レンズを有する照明光学系と、
反射面を有し、反射面上に観察すべき試料を保持する試料保持手段と、
前記照明ビームにより試料を主走査方向及びこれと直交する副走査方向に2次元走査する走査機構と、
前記試料を透過し前記反射面で反射し、前記対物レンズにより集光された光を2分割して第1及び第2のサブビームを形成するビーム分割素子、第1及び第2のサブビームをそれぞれ受光する第1及び第2の光検出手段、及び第1及び第2のサブビームをピンホール手段を介して第1及び第2の光検出手段上にそれぞれ結像する第1及び第2の結像レンズを含む結像光学系と、
前記第1及び/又は第2の光検出手段から出力される画像信号を用いて試料の共焦点画像を形成する信号処理装置とを具え、
前記結像レンズは、その結像点が光軸方向にそって変位可能に構成され、
前記対物レンズ又は反射面は光軸方向に変位可能に構成され、対物レンズ又は反射面の光軸方向の変位に応じて前記第1及び第2の結像レンズの結像点が光軸方向に沿って調整されることを特徴とする共焦点顕微鏡。 - 請求項4に記載の共焦点顕微鏡において、前記信号処理装置は、第1の光検出手段から出力される画像信号と第2の光検出手段から出力される画像信号との差分を形成する差分形成手段を有し、暗視野の背景中に透過像が形成された暗視野画像を出力することを特徴とする共焦点顕微鏡。
- 光透過性物体の共焦点透過像又は蛍光性物体の共焦点蛍光像を選択的に撮像する共焦点顕微鏡であって、
照明ビームを発生する照明光源、及び、照明ビームをスポット状に集束して観察すべき試料に向けて投射する対物レンズを有する照明光学系と、
反射面を有し、反射面上に観察すべき試料を保持する試料保持手段と、
前記照明ビームにより試料を主走査方向及びこれと直交する副走査方向に2次元走査する走査機構と、
前記試料を透過し前記反射面で反射し、前記対物レンズにより集光された光を2分割して第1及び第2のサブビームを形成するビーム分割素子、第1及び第2のサブビームをそれぞれ受光する第1及び第2の光検出手段、第1及び第2のサブビームをピンホール手段を介して第1及び第2の光検出手段上にそれぞれ結像する第1及び第2の結像レンズ、及び、光路中に挿脱可能に配置され、照明光と同一の波長域の光を選択的に遮光するフィルタ手段を含む結像光学系と、
前記光検出手段からの出力信号を用いて試料の共焦点画像を形成する信号処理装置とを具え、
前記結像レンズは、その結像点が光軸方向にそって変位可能に構成され、
前記対物レンズ又は反射面は光軸方向に変位可能に構成され、対物レンズ又は反射面の光軸方向の変位に応じて結像レンズの結像点が光軸方向に沿って調整され、
試料として蛍光性物体を用いる場合、フィルタ手段を光路中に挿入することにより試料の蛍光像を撮像する共焦点顕微鏡として機能し、
試料として光透過性物体を用いる場合、フィルタ手段を光路から外すことにより光透過性試料の共焦点透過像を撮像する共焦点顕微鏡として機能することを特徴とする共焦点顕微鏡。 - 請求項1から6までのいずれか1項に記載の共焦点顕微鏡において、前記対物レンズ又は試料が固定された反射面並びに結像レンズの光軸方向の位置を調整することにより、試料の所望の高さ位置における共焦点断面透過像が撮像されることを特徴とする共焦点顕微鏡。
- 請求項1から7までのいずれか1項に記載の共焦点顕微鏡において、前記結像レンズとして、入力信号に応じて焦点距離が変化する焦点可変レンズ、又は焦点可変レンズと焦点固定レンズとの組合せが用いられることを特徴とする共焦点顕微鏡。
- 請求項8に記載の共焦点顕微鏡において、前記信号処理装置は、対物レンズの基準位置からの変位量と前記結像レンズの結像点の基準位置からの変位量との関係を規定したデータ表を有し、
対物レンズが変位した場合、その変位に応じて結像光学系の結像点が光検出手段上に位置するように、結像レンズの焦点距離が制御されることを特徴とする共焦点顕微鏡。 - 請求項1から9までのいずれか1項に記載の共焦点顕微鏡において、前記試料保持手段として表面研磨されたシリコン基板を用い、当該シリコン基板の研磨表面を反射面として利用し、当該反射面上に試料を固定する試料固定層が形成され、試料固定層上に観察すべき試料が固定されることを特徴とする共焦点顕微鏡。
- 請求項1から10までのいずれか1項に記載の共焦点顕微鏡において、前記試料として生体試料が用いられ、前記試料保持手段は生体試料が生存する培養液を収容する容器中に浸漬され、生きた状態の生体試料の共焦点画像を撮像することを特徴とする共焦点顕微鏡。
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