JP2015069202A - 顕微鏡システム - Google Patents

Abstract

【課題】画像取り込み開始までにかかる時間を短縮し、所望の観察タイミングの確保および観察位置間における観察の同時性の確保を図る。
【解決手段】電動ステージ１１と、スキャナ１５と、対物レンズ２１Ａ，２１Ｂと、レボルバ２２と、画像取得部２３と、対物レンズ２１Ａ，２１Ｂの合焦位置を検出可能なオートフォーカス部と、低倍対物レンズ２１Ａのいずれかの合焦位置を基準位置として記憶する第１記憶部と、低倍対物レンズ２１Ａの基準位置を基準にして画像を取得する合焦位置を設定する合焦位置設定部と、部分画像の取得位置を設定する取得位置設定部と、設定された合焦位置の部分画像に基づきマップ画像を生成するマップ画像生成部とを備え、オートフォーカス部が、マップ画像上で設定された観察位置において、低倍対物レンズ２１Ａの基準位置を基準にして高倍対物レンズ２１Ｂの合焦位置を検出する顕微鏡システム１を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、顕微鏡システムに関するものである。

従来、一定時間間隔ごとに試料を撮影してその画像を取得するいわゆるタイムラプス観察を行う顕微鏡システムが知られている（例えば、特許文献１参照。）。特許文献１に記載の顕微鏡システムは、観察開始前あるいは観察開始時において、広範囲にわたるＺ軸方向、すなわち光軸方向に対して焦点面を移動させながら対物レンズごとに基準となるＺ位置を独立して検出し、使用する対物レンズに応じて基準となるＺ位置を変更しながらタイムラプス観察を行うようになっている。

特開２０１１−２３７８１８号公報

しかしながら、特許文献１に記載の顕微鏡システムは、広範囲にわたるＺ軸方向の検索範囲内で対物レンズの基準となるＺ位置を検出するため検出時間がかかり、タイムラプス観察する場合に観察したい所望のタイミングを逃してしまう可能性がある。また、複数の観察位置をタイムラプス観察する場合に、観察位置間における観察の同時性を図ることが困難という不都合がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、画像取り込み開始までにかかる時間を短縮し、所望の観察タイミングの確保および観察位置間における観察の同時性の確保を図ることができる顕微鏡システムを提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、標本が載置され、該標本の位置を調節可能な電動ステージと、該電動ステージ上に載置された前記標本に照射するレーザ光を走査するスキャナと、該スキャナにより走査されたレーザ光を前記標本に集光させる低倍対物レンズおよび該低倍対物レンズよりも倍率が高い高倍対物レンズと、これらの対物レンズをレーザ光の光路上に選択的に配置可能に支持するレボルバと、レーザ光が照射されることより前記標本から戻る戻り光を検出して該標本の画像を取得する画像取得部と、前記戻り光の輝度に基づいて前記レボルバと前記電動ステージとの間の光軸方向の距離を調整し、前記低倍対物レンズおよび前記高倍対物レンズの合焦位置を検出可能なオートフォーカス部と、該オートフォーカス部により検出された前記低倍対物レンズのいずれかの合焦位置を該低倍対物レンズの基準位置として記憶する記憶部と、該記憶部に記憶されている前記低倍対物レンズの基準位置を基準にして、前記画像取得部により画像を取得する前記合焦位置を設定する合焦位置設定部と、前記画像取得部により所定の視野範囲ごとに分割して取得する前記標本の部分画像の前記光軸に交差する方向の取得位置を設定する取得位置設定部と、前記合焦位置設定部により設定された前記合焦位置において、前記電動ステージにより前記取得位置に前記視野範囲を移動させて前記画像取得部により前記部分画像を取得させ、取得した前記部分画像を前記取得位置に従い配列してマップ画像を生成するマップ画像生成部とを備え、前記オートフォーカス部が、前記マップ画像上で設定された観察位置において、前記記憶部に記憶されている前記低倍対物レンズの基準位置を基準にして、前記高倍対物レンズの前記合焦位置を検出する顕微鏡システムを提供する。

本発明によれば、電動ステージに標本を載置してレボルバにより低倍対物レンズを光路上に配置し、スキャナおよび低倍対物レンズを介して標本にレーザ光を照射すると、オートフォーカス部により、標本から戻るレーザ光の戻り光に基づいて低倍対物レンズの合焦位置が検出される。そして、合焦位置設定部により、記憶部に記憶させた低倍対物レンズの合焦位置の基準位置を基準に画像取得の合焦位置が設定され、取得位置設定部により、その合焦位置において標本の部分画像の取得位置が設定される。

また、マップ画像生成部により、画像取得部の視野範囲を移動させて各取得位置において部分画像が取得され、これらの部分画像により標本のマップ画像が生成される。そして、マップ画像上で設定された観察位置において、オートフォーカス部により高倍対物レンズの合焦位置が検出されて画像取得部により画像が取得される。これにより、より広い観察範囲上で選択した所望の観察位置をより詳細に観察することができる。

この場合において、オートフォーカス部が、低倍対物レンズの基準位置を基準にして高倍対物レンズの合焦位置を検出することで、合焦位置の検出範囲を有効な範囲に制限して検出に要する時間を短縮することができる。したがって、画像取り込み開始までにかかる時間を短縮して所望の観察タイミングを確保するとともに、観察位置が複数ある場合に観察位置間における観察の同時性を確保することができる。

上記構成においては、前記オートフォーカス部が、前記画像取得部により所定の時間間隔で前記観察位置の画像を取得するタイムラプス観察中に検出した前記高倍対物レンズの合焦位置が変動した場合に、その合焦位置を補正することとしてもよい。
タイムラプス観察中には、温度変化等の原因によりフォーカスドリフト（フォーカスの位置ずれ。）が生じる場合があるが、このように構成することで、オートフォーカス部により、合焦位置を一定にしてタイムラプス観察を続けることができる。

上記構成においては、前記オートフォーカス部が、前記低倍対物レンズの同焦距離と前記高倍対物レンズの同焦距離のずれを補正する補正量を加味して前記高倍対物レンズの前記合焦位置を検出することとしてもよい。
このように構成することで、低倍対物レンズと高倍対物レンズの同焦距離の相違による誤差の影響を受けずに済み、高倍対物レンズの合焦位置をより高精度に検出することができる。

上記構成においては、前記電動ステージに載置された前記標本を覆う薄いガラス板状のカバーガラスを備え、前記高倍対物レンズが、前記カバーガラスの厚さに応じた収差を補正可能な補正環を備え、前記オートフォーカス部が、前記補正環による前記カバーガラスの厚さに応じた補正量を加味して前記高倍対物レンズの前記合焦位置を検出することとしてもよい。
このように構成することで、補正環によるカバーガラスの厚さに応じた収差の補正による誤差の影響を受けずに済み、高倍対物レンズの合焦位置をより高精度に検出することができる。

上記構成においては、前記記憶部が、前記オートフォーカス部により検出された前記低倍対物レンズのレーザ光の光軸に交差する方向に異なる少なくとも３箇所の合焦位置をそれぞれ基準位置として記憶し、前記オートフォーカス部が、該記憶部に記憶されている前記低倍対物レンズの少なくとも３箇所の基準位置に基づいて、前記高倍対物レンズの前記合焦位置を検出することとしてもよい。

このように構成することで、３箇所以上の基準位置により、標本におけるレーザ光の光軸に交差する方向に分布する低倍対物レンズの複数の合焦位置の傾きが分かる。したがって、標本が傾いていたり標本の存在位置が低倍対物レンズの光軸方向に分布していたりする場合であっても、高倍対物レンズの合焦位置をより精度よく検出し、詳細な観察を正確に行うことができる。

本発明によれば、画像取り込み開始までにかかる時間を短縮し、所望の観察タイミングの確保および観察位置間における観察の同時性の確保を図ることができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡システムを示すブロック図である。 図１の顕微鏡システムにおけるサンプルホルダとサンプルホルダに搭載された容器の一例を示す斜視図である。 図１の顕微鏡システムの制御装置を示すブロック図である。 (ａ）はカバーガラスの下面における低倍対物レンズの合焦位置を検出する様子を示し、（ｂ）はカバーガラスの厚さ分だけ低倍対物レンズを移動させる様子を示し、（ｃ）は試料における低倍対物レンズの合焦位置を検出する様子を示す図である。 (ａ）はタイムラプス観察の１周期目にカバーガラスの下面における高倍対物レンズの合焦位置を検出する様子を示し、（ｂ）はタイムラプス観察の２周期目にカバーガラスの下面における高倍対物レンズの合焦位置を検出する様子を示す図である。 高倍対物レンズによるタイムラス観察を説明する図である。

以下、本発明の一実施形態に係る顕微鏡システムについて、図面を参照して説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１は、図１に示されるように、レーザ走査型顕微鏡３と、レーザ走査型顕微鏡３を制御する制御装置５とを備えている。

レーザ走査型顕微鏡３は、試料（標本、図４（ａ）等参照。）Ｓが載置される電動ステージ１１と、レーザ光を出射するレーザ光源部１３と、レーザ光源部１３からのレーザ光を２次元的に走査するスキャナ１５と、スキャナ１５により走査されたレーザ光を集光する瞳投影レンズ１７および結像レンズ１９と、結像レンズ１９により集光されたレーザ光を試料Ｓに照射する対物レンズ２１Ａ，２１Ｂと、レーザ光が照射されることにより試料Ｓにおいて発生する蛍光を検出して試料Ｓの画像を取得する画像取得部２３と、これらを収容する暗箱２５とを備えている。

暗箱２５は、電動ステージ１１を収容する上方の上方領域２５ａと、レーザ光源部１３や画像取得部２３等を収容する下方の下方領域２５ｂとに内部が区画されている。上方領域２５ａには、ヒータ２７が設けられており、ヒータ２７により上方領域２５ａ内の温度を所定の培養条件（例えば、２７℃±０．５℃）に調整することができるようになっている。

電動ステージ１１は、例えば、３個のモータ１２を備えており、これらのモータ１２により相互に直交するＸ，Ｙ，Ｚ方向の移動軸に沿って独立して移動することができるようになっている。また、電動ステージ１１は、図２に示すように、試料Ｓを収容する複数の容器２９を保持するサンプルホルダ３１を搭載し、サンプルホルダ３１により保持された容器２９を３次元方向に移動させることができるようになっている。

サンプルホルダ３１は、電動ステージ１１に設けられたセンサ３２によりその種別が検出されるようになっている。また、サンプルホルダ３１は、貫通穴３３ａを有する平板状のプレート部３３と、プレート部３３上に容器２９を位置決め状態に固定するホルダ部３５とを備えている。

ホルダ部３５は、プレート部３３の貫通穴３３ａごとに設けられており、貫通穴３３ａを閉塞するようにその上に配置した容器２９をプレート部３３との間に挟んで位置決め状態に固定することができるようになっている。

容器２９は、例えば透明なシャーレ等であり、底面がカバーガラス（図４（ａ）等参照。）２９ａにより形成されている。また、容器２９は、簡易型インキュベータ３７内に収容されてその培養条件（例えば、湿度１００％およびＣＯ_２濃度０．５％）が維持されるようになっている。図１において、符号３９は位相差観察用の位相差コンデンサである。図４（ａ）等において符合Ｌは培養液を示している。

レーザ光源部１３は、図１に示すように、異なる波長のレーザ光を発生する複数のレーザダイオード４１と、これら複数のレーザダイオード４１から発せられるレーザ光を単一の光路に合流させるミラー４３およびダイクロイックミラー４５とを備えている。
スキャナ１５は、例えば、相互に直交する軸線回りに揺動可能な２枚のガルバノミラーを対向させて配置したいわゆる近接ガルバノミラーであり、Ｘ，Ｙ方向にレーザ光を走査することができるようになっている。

対物レンズ２１Ａ，２１Ｂは、例えば、倍率が低い低倍対物レンズ２１Ａと、低倍対物レンズ２１Ａよりも倍率が高い高倍対物レンズ２１Ｂとに分けられる。低倍対物レンズ２１Ａは例えば１０倍の倍率を有し、高倍対物レンズ２１Ｂは例えば６０倍の倍率を有しているものとする。これらの対物レンズ２１Ａ，２１Ｂは、レボルバ２２により、レーザ光の光路上に選択的に配置可能に支持されている。レボルバ２２には、電動ステージ１１との間の光軸方向（Ｚ方向）の距離を調整する焦準機構２４が設けられている。

画像取得部２３は、レーザ光が照射されることにより試料Ｓや容器２９から対物レンズ２１Ａ，２１Ｂ、結像レンズ１９、瞳投影レンズ１７およびスキャナ１５を介して戻る蛍光やレーザ光の反射光等を含む戻り光をレーザ光の光路から分岐するビームスプリッタ５１と、レーザ光の光路から分岐された戻り光を集光するコンフォーカルレンズ５３と、コンフォーカルレンズ５３により集光された戻り光の光束を制限する可変ピンホール５５と、可変ピンホール５５を通過した戻り光を略平行光に変換するコリメートレンズ５７と、略平行光に変換された戻り光を回折させて波長ごとに分離するグレーティング５９とを備えている。

また、画像取得部２３には、グレーティング５９により分離された戻り光を集光する集光レンズ６１と、集光レンズ６１により集光された戻り光を波長ごとに分岐するビームスプリッタ６３と、分岐された戻り光の光束を制限するピンホール６５と、ピンホール６５を通過した戻り光をそれぞれ検出する光検出器６７とが備えられている。

可変ピンホール５５は、対物レンズ２１Ａ，２１Ｂの焦点位置と光学的に共役な位置関係に配置されている。可変ピンホール５５を十分に絞っておくことにより、対物レンズ２１Ａ，２１Ｂの焦点位置から発生した戻り光のみを通過させて光検出器６７により検出させる共焦点検出を行い、ブレのない鮮明な共焦点蛍光画像を取得することができるようになっている。

制御装置５は、図３に示すように、対物レンズ２１Ａ，２１Ｂの合焦位置を検出可能なオートフォーカス部７１と、オートフォーカス部７１により検出された低倍対物レンズ２１Ａのいずれかの合焦位置を低倍対物レンズ２１Ａの基準位置として記憶する第１記憶部７３と、サンプルホルダ３１上の容器２９の搭載位置をサンプルホルダ３１の種別に対応づけて記憶する第２記憶部７５と、低倍対物レンズ２１Ａ，２１Ｂにより画像を取得する合焦位置を設定する合焦位置設定部７７と、試料Ｓの部分画像を取得する取得位置を設定する取得位置設定部７９と、レーザ走査型顕微鏡３を制御して試料Ｓの部分画像を取得させる制御部（マップ画像生成部）８１と、部分画像に基づいてマップ画像を生成するマップ画像生成部８３とを備えている。

オートフォーカス部７１は、レボルバ２２の焦準機構２４と電動ステージ１１のうち少なくとも一方をレーザ光の光軸に沿う方向（Ｚ方向）に移動させる制御を行うようになっている。このオートフォーカス部７１は、レボルバ２２と電動ステージ１１との間の光軸方向の距離を変化させながら、共焦点検出手段である光検出器６７から得られる戻り光の強度信号を取得し、その信号強度が最も大きくなる位置を探す動作を行うことで、対物レンズ２１Ａ，２１Ｂの合焦位置を検出して合焦させることができるようになっている。この際、Ｚ方向の各位置（Ｚ位置）でスキャナ１５によりレーザ光をＸ，Ｙ方向に走査しその戻り光の平均的な強度を得ることで、異物などの影響を回避し正確な合焦を行うことができる。

また、オートフォーカス部７１は、高倍対物レンズ２１Ｂの合焦位置を検出する場合において、第１記憶部７３に記憶されている低倍対物レンズ２１Ａの基準位置を基準にするようになっている。また、オートフォーカス部７１は、タイムラプス観察中に高倍対物レンズ２１Ｂの合焦位置が経時的に変動した場合に、初めに設定された高倍対物レンズ２１Ｂの基準位置に基づいてその合焦位置を補正する補正機能を有している。

第２記憶部７５は、例えば、サンプルホルダ３１のプレート部３３に設けられた貫通穴３３ａの中心位置等を搭載位置として記憶するようになっている。

取得位置設定部７９は、センサ３２によって検出されたサンプルホルダ３１の種別に対応づけて第２記憶部７５に記憶されている容器２９の搭載位置に基づいて、各容器２９内の領域を複数の分割領域に分割して部分画像のＸ，Ｙ方向の取得位置を設定するようになっている。例えば、サンプルホルダ３１のプレート部３３の各貫通穴３３ａの中心位置を基準にして、例えば、相互に隣接する５×５＝２５枚の部分画像の取得位置を設定するようになっている。部分画像のＸ，Ｙ方向の取得位置は、電動ステージ１１のＸ，Ｙ方向の移動に基づいて変わるものである。

制御部８１は、取得位置設定部７９により設定された部分画像の取得位置に合せて電動ステージ１１およびスキャナ１５により画像取得部２３の視野範囲やレーザ光の走査位置を移動させ、画像取得部２３により各取得位置の部分画像を取得させるようになっている。部分画像の取得位置の移動順序、すなわち部分画像の取得順序は、ユーザが設定することとしてもよいし、取得位置設定部７９により設定されることとしてもよい。

マップ画像生成部８３は、画像取得部２３により取得された部分画像をそれぞれの取得位置に従って配列し、容器２９のほぼ全体領域を覆う２次元的なマップ画像Ｇを生成するようになっている。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡システム１の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１により試料Ｓを観察するには、試料Ｓを収容した複数の容器２９をサンプルホルダ３１に設置し、そのサンプルホルダ３１を電動ステージ１１上に搭載する。

電動ステージ１１に設けられたセンサ３２によりサンプルホルダ３１の種別が検出される。そして、取得位置設定部７９により、センサ３２によって検出されたサンプルホルダ３１の種別に基づいて、第２記憶部７５に記憶されている容器２９の位置情報が読み出される。

レーザ走査型顕微鏡３においては、レーザ光源部１３からレーザ光を出射させると、レーザ光はビームスプリッタ２６、スキャナ１５、瞳投影レンズ１７、結像レンズ１９および低倍対物レンズ２１Ａ（または高倍対物レンズ２１Ｂ）を介して容器２９の底面側からカバーガラス２９ａを介して試料Ｓに照射される。

レーザ光が照射されることによりカバーガラス２９ａにおいてレーザ光の一部が反射し、また、レーザ光の照射位置において試料Ｓ内に存在している蛍光物質が励起されて蛍光が発生すると、これら反射光や蛍光等を含む戻り光が、低倍対物レンズ２１Ａ（または高倍対物レンズ２１Ｂ）、結像レンズ１９、瞳投影レンズ１７およびスキャナ１５を介して光路を戻り、ビームスプリッタ５１によりレーザ光の光路から分岐されて画像取得部２３に入射する。

画像取得部２３に入射した戻り光はコンフォーカルレンズ５３によって集光され、可変ピンホール５５を通過した戻り光のみがコリメートレンズ５７によって略平行光に変換される。そして、コリメートレンズ５７を透過した戻り光は、グレーティング５９によって分光され、集光レンズ６１およびビームスプリッタ６３を介して各光検出器６７により波長毎に検出される。

このレーザ走査型顕微鏡３において、初めに、レボルバ２２によりレーザ光の光路上に低倍対物レンズ２１Ａを配置し、試料Ｓのマッピング画像を生成する。
まず、オートフォーカス部７１により、６３５ｎｍのレーザ光の反射光に基づいて、図４（ａ）に示すように、その平均輝度が最大となるカバーガラス２９ａの下面が検出され、カバーガラス２９ａの下面に低倍対物レンズ２１Ａが合焦させられる。検出されたカバーガラス２９ａの下面における合焦位置（図中の×印、以下、図４（ｂ）、（ｃ）、図５（ａ），（ｂ）において、合焦位置をＸ印で示す。）は、低倍対物レンズ２１Ａの基準位置として第１記憶部７３に記憶される。

続いて、オートフォーカス部７１により、図４（ｂ）に示すように、カバーガラス２９ａの下面における合焦位置から上側が検索され、カバーガラス２９ａの上面に対する合焦が行われる。

そして、オートフォーカス部７１により、先に決定されたカバーガラス２９ａの上面から上側に検出が開始され、図４（ｃ）に示すように、戻り光のうち試料Ｓにおいて発生した蛍光の輝度が最大となる位置が検出されて、その位置に低倍対物レンズ２１Ａが合焦させられる。合焦位置設定部７７により、この試料Ｓにおける合焦位置が画像取得部２３によって画像を取得する低倍対物レンズ２１Ａの合焦位置として設定される。

次に、取得位置設定部７９により、合焦位置設定部７７によって設定された試料Ｓにおける低倍対物レンズ２１Ａの合焦位置において、第２記憶部７５から読み出した容器２９の搭載位置に基づいて、各容器２９内の領域を相互に隣接する５×５の分割領域に分割した部分画像のＸ，Ｙ方向の取得位置が設定される。

次いで、制御部８１により電動ステージ１１が制御され、取得位置設定部７９によって設定された部分画像の取得位置に画像取得部２３の視野範囲が順に移動させられる。そして、取得位置ごとに、レーザ光が走査されて試料Ｓに照射され、画像取得部２３により試料Ｓからの蛍光が検出されて部分画像が取得される。

次いで、マップ画像生成部８３により、画像取得部２３により取得された部分画像がそれぞれの取得位置に従って配列される。これにより、容器２９のほぼ全体領域を覆う２次元的なマップ画像が生成される。生成されたマップ画像はモニタ７に表示される。

次に、レボルバ２２により低倍対物レンズ２１Ａに代えて高倍対物レンズ２１Ｂを光路上に配置し、試料Ｓのタイムラプス観察を行う。
まず、スキャナ１５によりリピートスキャン（スキャナ１５によるＸＹ走査画像の取得を繰り返して行い続けること）を行い、高倍対物レンズ２１Ｂにより取得した試料Ｓのライブ画像をモニタ７に表示させる。ユーザが詳細に観察したい位置をマップ画像上で指定すると、制御部８１により、その指定された位置に電動ステージ１１が移動させられ、指定位置の高倍画像がモニタ７にライブ表示される。

ユーザは、詳細に観察したいＸＹ位置（観察位置、ＸＹ観察位置）をマップ画像上で決め、そのＸＹ位置においてＺ方向の範囲を手動調整し、詳細に観察するＺ範囲の上端と下端、すなわち、観察開始位置と観察終了位置を決定する。また、ユーザは、高倍対物レンズ２１Ｂによりタイムラプス観察するタイムラプス条件として時間間隔と繰り返し回数を設定する。

ユーザがタイムラプス観察の実行を指示すると、オートフォーカス部７１により、マップ画像上で指定されたＸＹ位置において、第１記憶部７３に記憶されている低倍対物レンズ２１Ａの基準位置を基準にして、荒調整と微調整の２段階で高倍対物レンズ２１Ｂの合焦位置が検出される。

荒調整では、オートフォーカス部７１により、６３５ｎｍのレーザ光の反射光に基づいて、低倍対物レンズ２１Ａの基準位置を中心とした所定範囲がＸＹＺスキャンのＺ範囲として設定される。荒調整でのＺ方向の検索範囲（μｍ）は、例えば、下記の式により設定される。
低倍対物レンズ２１Ａの基準位置±カバーガラス２９ａの厚さ／２

そして、図５（ａ）に示すように、上記式により設定される範囲内で大きいステップ（例えば、基準位置±８０μｍの範囲を２μｍ／ｓｔｅｐ。）で、戻り光（反射光）の平均輝度が最大となる容器２９のカバーガラス２９ａの下面が検出され、高倍対物レンズ２１Ｂが荒く合焦させられる。図５（ａ）において符合ｍは液浸媒体を示している。図５（ｂ）において同様である。

次いで、微調整では、オートフォーカス部７１により、荒調整により検出されたカバーガラス２９ａの下面の合焦位置を中心とした所定範囲がＺ検索範囲として設定される。そして、その範囲内で小さいステップ（例えば、基準位置±３μｍの範囲を０．２μｍ／ｓｔｅｐ。）で、戻り光（反射光）の平均輝度が最大となるカバーガラス２９ａの下面が検出されて、高倍対物レンズ２１Ｂが精密に合焦させられて、第１記憶部７３に高倍対物レンズ２１Ｂによる基準位置として記憶される。

続いて、高倍対物レンズ２１Ｂによる１周期目の詳細なタイムラプス観察が開始される。１周期目のタイムラプス観察では、先に設定したＸＹ観察位置およびＺ方向の観察範囲に従い、画像取得部２３により所定の時間間隔で繰り返し画像が取得される。これにより、より広い観察範囲上で選択した所望の観察位置をより詳細に観察することができる。

次いで、タイムラプス条件に従い、２周期目以降の詳細な観察が実行される。
２周期目以降の詳細な観察においても、まず、第１記憶部７３に記憶されている高倍対物レンズ２１Ｂの基準位置を検索範囲の中心に設定して、オートフォーカス部７１によりカバーガラス２９ａの下面が改めて検出される。２周期目以降でも、１回目と同じように荒調整と微調整の２段階で検出動作を行うが、例えば、荒調整における検索範囲を基準位置±２０μｍに狭めるように条件を変更してもよい。

そして、検出したカバーガラス２９ａの下面を基準にして、１周期目と同様に、画像取得部２３により所定の時間間隔で繰り返し画像が取得される。

ここで、図６に示すように、タイムラプス観察の２周期目以降にフォーカスドリフト（フォーカスの位置ずれ。）が生じて、オートフォーカス部７１により検出されるカバーガラス２９ａの下面における高倍対物レンズ２１Ｂの合焦位置が変動することがある。その場合は、オートフォーカス部７１により、第１記憶部７３に記憶されている高倍対物レンズ２１Ｂの基準位置との差分でドリフト量が算出され、ＸＹＺの取り込み開始位置および終了位置がドリフト量だけ補正される。これにより、合焦位置を一定にしてタイムラプス観察を続けることができる。

以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡システムによれば、マップ画像生成部８３により生成した試料Ｓのマップ画像上で指定した所望の観察位置において、オートフォーカス部７１により高倍対物レンズ２１Ｂの合焦位置を検出し、画像取得部２３により画像を取得することで、より広い観察範囲上で選択した所望の観察位置をより詳細に観察することができる。

この場合において、オートフォーカス部７１が、低倍対物レンズ２１Ａの基準位置を基準にして高倍対物レンズ２１Ｂの合焦位置を検出することで、合焦位置の検出範囲を有効な範囲に制限して検出に要する時間を短縮することができる。したがって、画像取り込み開始までにかかる時間を短縮して所望の観察タイミングを確保するとともに、観察位置が複数ある場合に観察位置間における観察の同時性を確保することができる。

本実施形態は以下のように変形することができる。
第１変形例としては、高倍対物レンズ２１Ｂにより、マップ画像上の１箇所を詳細にタイムラプス観察することに代えて、例えば、マップ画像上の複数箇所を詳細にタイムラプス観察することとしてもよい。

この場合、ユーザが詳細に観察したい複数のＸＹ位置をマップ画像上で決めて、そのＸＹ位置ごとにＺ方向の範囲を手動調整し、詳細に観察するＺ範囲の上端と下端を決定するとともにタイムラプス条件を設定したら、詳細に観察したい位置を示すＲＯＩ（Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）をマップ画像上の各ＸＹ位置に表示することとすればよい。そして、ＲＯＩが表示された各ＸＹ位置について、高倍対物レンズ２１Ｂによるタイムラプス観察を行うこととすればよい。この場合、各ＸＹ位置において高倍対物レンズ２１Ｂによる合焦動作を行うが、高倍対物レンズ２１Ｂでの合焦位置検索範囲を決める基準位置として、低倍対物レンズ２１Ａを用いて設定された１つの基準位置を全てのＸＹ位置に対して共通して用いる。

第２変形例としては、オートフォーカス部７１が、低倍対物レンズ２１Ａの同焦距離と高倍対物レンズ２１Ｂの同焦距離のずれを補正する同焦補正量を加味して高倍対物レンズ２１Ｂの合焦位置の検出範囲を設定することとしてもよい。この場合、下記に示すように、上記式に補正量を加えることとすればよい。
低倍対物レンズ２１Ａの基準位置±カバーガラス２９ａの厚さ／２＋同焦補正量

このようにすることで、低倍対物レンズ２１Ａと高倍対物レンズ２１Ｂの同焦距離の相違による誤差の影響を受けずに済み、高倍対物レンズ２１Ｂの合焦位置をより高精度に検出することができる。

第３変形例としては、高倍対物レンズ２１Ｂが、容器２９のカバーガラス２９ａの厚さに応じた収差を補正可能な補正環９１を備え、補正環９１を駆動するモータ９３が接続されていることとしてもよい。また、オートフォーカス部７１が、補正環９１によるカバーガラス２９ａの厚さに応じた補正量を加味して高倍対物レンズ２１Ｂの合焦位置の検出範囲を設定することとしてもよい。

この場合、オートフォーカス部７１が、低倍対物レンズ２１Ａによる合焦位置の検出時にカバーガラス２９ａの下面と共に上面も検出し、下面位置と上面位置からカバーガラス２９ａの厚さを算出して、補正環をカバーガラス２９ａの厚さに応じた補正量に自動調節することとすればよい。そして、下式に示すように、補正環の補正により生じるフォーカス変化量を高倍対物レンズ２１ＢによるＺ方向の検索範囲に上乗せすることとすればよい。
低倍対物レンズ２１Ａの基準位置±カバーガラス２９ａの厚さ／２＋フォーカス変化量

このようにすることで、補正環によるカバーガラス２９ａの厚さに応じた収差の補正による誤差の影響を受けずに済み、高倍対物レンズ２１Ｂの合焦位置をより高精度に検出することができる。
フォーカス変化量は、オートフォーカス部７１がテーブルにより有することとしてもいいし、算出式により算出することとしてもよい。

第４変形例としては、オートフォーカス部７１が低倍対物レンズ２１Ａを用いて合焦動作を行う際に、電動ステージ１１を移動させてレーザ光の光軸に交差する方向に異なる少なくとも３箇所（異なる３点以上のＸＹ位置）においてそれぞれ合焦位置を検出することとしてもよい。また、第１記憶部７３がその検出された少なくとも３箇所での合焦位置をそれぞれ基準位置として記憶することとしてもよい。そして、オートフォーカス部７１が、第１記憶部７３に記憶されている低倍対物レンズ２１Ａの少なくとも３箇所の基準位置に基づいて、高倍対物レンズ２１Ｂの合焦位置の検出範囲を設定することとしてもよい。

この場合、例えば、低倍対物レンズ２１Ａによる少なくとも３箇所の基準位置を含む仮想平面に基づいて、各ＸＹ位置に対応した仮想基準位置のＺ座標を表したフォーカスマップを作成し、フォーカスマップに基づいて基準位置を設定して高倍対物レンズ２１Ｂの合焦位置の検出範囲を設定することとしてもよい。あるいは、ＸＹ平面上の距離が近い基準位置どうしを用いてその傾きから目的とするＸＹ位置での基準位置を補間して求めることとしてもよい。

このようにすることで、３箇所以上の基準位置により、試料Ｓにおけるレーザ光の光軸に交差する方向に分布する低倍対物レンズ２１Ａの複数の合焦位置の傾きが分かる。したがって、例えば、容器２９のカバーガラス２９ａが傾いていたり、試料Ｓの存在位置が低倍対物レンズ２１Ａの光軸方向に分布していたりする場合であっても、高倍対物レンズ２１Ｂの合焦位置の検出範囲をより精度よく設定し、詳細な観察を正確に行うことができる。
本変形例においては、マップ画像上の１箇所を詳細にタイムラプス観察することとしてもよいし、上述した第１変形例と同様にしてマップ画像上の複数箇所を詳細にタイムラプス観察することとしてもよい。

また、第５変形例としては、レーザ走査型顕微鏡３が、オートフォーカス部７１により対物レンズ２１Ａ，２１Ｂによる合焦位置を検出するための光を発生するオートフォーカス用光源と、オートフォーカス用光源からの光が照射されることによってカバーガラス２９ａおよび試料Ｓから戻る戻り光を検出するオートフォーカス用検出器とを備えることとしてもよい。

このようにすることで、オートフォーカス用光源およびオートフォーカス用検出器により、対物レンズ２１Ａ，２１Ｂによる合焦位置をより速く検出することができ、所望の観察位置のタイムラプス観察を迅速に行うことができる。

また、第６変形例としては、マップ画像上で詳細に観察したいＸＹ位置をユーザが設定するのではなく、例えば、画像処理により、マップ画像上で詳細に観察したいＸＹ位置を自動的に抽出することができるようにしてもよい。

１ 顕微鏡システム
１１ 電動ステージ
１５ スキャナ
２１Ａ 低倍対物レンズ
２１Ｂ 高倍対物レンズ
２２ レボルバ
２３ 画像取得部
２９ａ カバーガラス
７１ オートフォーカス部
７３ 第１記憶部（記憶部）
７９ 取得位置設定部
８１ 制御部（マップ画像生成部）
８３ マップ画像生成部
Ｓ 標本

Claims (5)

1. 標本が載置され、該標本の位置を調節可能な電動ステージと、
   該電動ステージ上に載置された前記標本に照射するレーザ光を走査するスキャナと、
   該スキャナにより走査されたレーザ光を前記標本に集光させる低倍対物レンズおよび該低倍対物レンズよりも倍率が高い高倍対物レンズと、
   これらの対物レンズをレーザ光の光路上に選択的に配置可能に支持するレボルバと、
   レーザ光が照射されることより前記標本から戻る戻り光を検出して該標本の画像を取得する画像取得部と、
   前記戻り光の輝度に基づいて前記レボルバと前記電動ステージとの間の光軸方向の距離を調整し、前記低倍対物レンズおよび前記高倍対物レンズの合焦位置を検出可能なオートフォーカス部と、
   該オートフォーカス部により検出された前記低倍対物レンズのいずれかの合焦位置を該低倍対物レンズの基準位置として記憶する記憶部と、
   該記憶部に記憶されている前記低倍対物レンズの基準位置を基準にして、前記画像取得部により画像を取得する前記合焦位置を設定する合焦位置設定部と、
   前記画像取得部により所定の視野範囲ごとに分割して取得する前記標本の部分画像の前記光軸に交差する方向の取得位置を設定する取得位置設定部と、
   前記合焦位置設定部により設定された前記合焦位置において、前記電動ステージにより前記取得位置に前記視野範囲を移動させて前記画像取得部により前記部分画像を取得させ、取得した前記部分画像を前記取得位置に従い配列してマップ画像を生成するマップ画像生成部とを備え、
   前記オートフォーカス部が、前記マップ画像上で設定された観察位置において、前記記憶部に記憶されている前記低倍対物レンズの基準位置を基準にして、前記高倍対物レンズの前記合焦位置を検出する顕微鏡システム。
2. 前記オートフォーカス部が、前記画像取得部により所定の時間間隔で前記観察位置の画像を取得するタイムラプス観察中に、検出した前記高倍対物レンズの合焦位置が変動した場合にその合焦位置を補正する請求項１に記載の顕微鏡システム。
3. 前記オートフォーカス部が、前記低倍対物レンズの同焦距離と前記高倍対物レンズの同焦距離のずれを補正する補正量を加味して前記高倍対物レンズの前記合焦位置を検出する請求項１または請求項２に記載の顕微鏡システム。
4. 前記電動ステージに載置された前記標本を覆う薄いガラス板状のカバーガラスを備え、
   前記高倍対物レンズが、前記カバーガラスの厚さに応じた収差を補正可能な補正環を備え、
   前記オートフォーカス部が、前記補正環による前記カバーガラスの厚さに応じた補正量を加味して前記高倍対物レンズの前記合焦位置を検出する請求項１または請求項２に記載の顕微鏡システム。
5. 前記記憶部が、前記オートフォーカス部により検出された前記低倍対物レンズのレーザ光の光軸に交差する方向に異なる少なくとも３箇所の合焦位置をそれぞれ基準位置として記憶し、
   前記オートフォーカス部が、該記憶部に記憶されている前記低倍対物レンズの少なくとも３箇所の基準位置に基づいて、前記高倍対物レンズの前記合焦位置を検出する請求項１から請求項４のいずれかに記載の顕微鏡システム。
   

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