DE102017217192A1

DE102017217192A1 - Immersionsmatrix, dessen Verwendung und Immersionsvorrichtung

Info

Publication number: DE102017217192A1
Application number: DE102017217192.8A
Authority: DE
Inventors: Thomas Ohrt; Thomas KALKBRENNER
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2017-09-27
Filing date: 2017-09-27
Publication date: 2019-03-28
Also published as: CN109557654A; US11119301B2; CN109557654B; US20190094512A1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Immersionsmatrix (5), ausgebildet zur Anpassung optischer Eigenschaften an Grenzflächen optischer Anordnungen, aufweisend eine Porosität mit Poren (7) wenigstens einer Porengröße ausgewählt aus einem Bereich von >20 nm bis 200 µm und/oder Nanoporen (8) in dem Material (6) der Immersionsmatrix (5), wobei die Nanoporen (8) wenigstens eine mittlere Porengröße ausgewählt aus einem Bereich von 0,5 nm bis 20 nm besitzen, und einem Elastizitätsmodul E ausgewählt aus einem Bereich von 0,1 - 100 MPa.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der Immersionsmatrix (5), eine Anordnung mit der Immersionsmatrix (5) sowie eine Immersionsvorrichtung.

Description

Die Erfindung betrifft eine Immersionsmatrix, eine Anordnung mit einer Immersionsmatrix, deren Verwendung sowie eine Immersionsvorrichtung.
Insbesondere in der Lebendzell-Mikroskopie ist der genaue Brechungsindex der Probe meist unbekannt. Das betrifft nicht (nur) das Einbettmedium und/oder den verwendeten Puffer, sondern vor allem das Innere der Probe, die beispielsweise durch Zellen, (Tumor-) Spheroide, Gewebeschnitte oder ganze Organismen gegeben sein kann.
Da diese Proben üblicherweise in wässrigen Lösungen (Pufferlösungen) aufbewahrt und untersucht werden, werden - auch historisch bedingt - meistens Wasserimmersionsobjektive eingesetzt. Diese sind für einen Brechungsindex von n = 1,33 (Brechungsindex von Wasser) optimiert. Der Brechungsindex von Lebendzell-Proben weicht jedoch von n = 1,33 ab (siehe z.B. Liu, P. Y. et al. (2016): Cell refractive index for cell biology and disease diagnosis: past, present and future; Lab on a Chip, 16: 634-644).
So liegt z.B. der Brechungsindex des Cytosols typischer Zellen im Bereich von 1,36 - 1,39 und weicht damit deutlich vom Brechungsindex des Wassers ab. Eine daraus resultierende Fehlanpassung optischer Anordnungen führt zu Aberrationen, die die optische Leistung des Mikroskops, insbesondere die Eindringtiefe, einschränken. Ein Ausgleich dieser Aberrationen ist - wenn überhaupt möglich - aufwändig und teuer und kann beispielsweise mittels adaptiver Optiken, z.B. deformierbarer Spiegel, erfolgen.
Dies gilt insbesondere für Mikroskopsysteme, die wenigstens eine optische Achse aufweisen, welche nicht senkrecht zu einem Deckglas steht. Das Deckglas, das bei inverser Mikroskopie auch durch den Boden einer Probenhalterung, beispielsweise einer Petrischale, eine (Mikro-)Titerplatte oder einer transparenten Platte gebildet sein kann, wird von einer zu erfassenden Detektionsstrahlung unter einem Winkel ungleich 90°, also schräg, durchlaufen.
Bei auftretenden Fehlern in der Anpassung des Brechungsindex kann es zu unsymmetrischen Aberrationen wie Astigmatismus, Koma, und weitere Fehler höherer Ordnung (z. B. Dreiblatt, Vierblatt) kommen. Diese sind noch weniger tolerierbar als symmetrische Aberrationen, die bei konventionellen Anordnungen mit Auflicht auftreten können und vor allem als sphärische Aberrationen auftreten. Solche symmetrischen Fehler sind zwar zunächst durch den Anwender leichter tolerierbar, führen aber letztendlich dennoch zu einer deutlichen Einschränkung z. B. der optischen Eindringtiefe des Mikroskops.
Zur Reduzierung von Aberrationen, die infolge des Durchgangs einer Beleuchtungsstrahlung und/oder einer Detektionsstrahlung bedingt sind, können geeignete Immersionsmedien verwendet werden.
Gängige Immersionsmedien sind beispielsweise Wasser, Silikonöl, Glycerol und Öl, die zusammen mit einem entsprechend ausgebildeten Immersionsobjektiv verwendet werden. In der Mikroskopie bietet der Einsatz von Immersionsobjektiven zahlreiche Vorteile, die sich alle letztendlich aus den höheren erzielbaren numerischen Aperturen der Objektive ergeben. Diese Vorteile sind zum Beispiel eine höhere räumliche Auflösung, eine höhere Lichtsammeleffizienz, ein verbessertes Signal-Rausch- bzw. Signal-Hintergrund-Verhältnis, kürzere Belichtungszeiten und bessere zeitliche Auflösung sowie eine reduzierte Phototoxizität.
Da die Proben unterschiedlich eingebettet und fixiert sein können, gibt es verschiedene Klassen von Immersionsmedien, um möglichst nahe am refraktiven Index der Probe arbeiten zu können. Typische Immersionsmedien sind Wasser, organische Ersatzmedien für Wasser (z.B. ZEISS Immersol W), Glycerin (z.B. ZEISS Immersol G) und spezielle Immersionsöle (z.B. ZEISS Immersol F, Immersol HI). Alle diese Immersionsmedien sind bei gebräuchlicher Temperatur flüssig. Nur wenn das Immersionsmedium exakt die gleichen optischen Parameter der Probe besitzt, wird eine optimale Bildqualität, maximale Signalintensität und Eindringtiefe erreicht (vgl. Hell, S. et al. (1993): Aberrations in confocal fluorescence microscopy induced by mismatches in refractive index. Journal of microscopy, 169: 391-405).
Grundsätzlich kann die numerische Apertur durch Verwendung von Immersionsmedien mit möglichst hohem Brechungsindex maximiert werden, wobei eine sinnvolle Obergrenze durch den Brechungsindex des Deckglases gegeben ist. Bei perfekt angepasstem Brechungsindex (n_Immersion = n_Deckglas ) ist das Deckglas optisch nicht mehr wirksam. Eine solche Situation, die typischerweise bei Ölimmersionsobjektiven erreicht wird, ist schematisch in 1a dargestellt.
Dargestellt ist eine Probe 1, ein Probenhalter 2 in Form eines Deckglases 2 und ein Objektiv 3 sowie ein Immersionsmedium 4 zwischen Deckglas 2 und Objektiv 3. Der Verlauf fokussierter Beleuchtungsstrahlung ist vereinfacht als unterbrochene Volllinie gezeigt.
Bei biologischen Proben tritt oft der Fall auf, dass der Brechungsindex des Probenmediums von dem des Deckglases 2 und der Immersion (Immersionsmedium 4) abweicht. In dieser Situation kann mit Ölimmersionsobjektiven nur relativ nahe an der Deckglasoberfläche optimal gearbeitet werden. Grund hierfür ist, dass durch den Brechungsindexsprung Aberrationen, insbesondere sphärische Aberrationen, auftreten, die umso stärker werden, je weiter man in die Probe eindringt. Für die Mikroskopie insbesondere an lebenden Zellen sind daher Wasserimmersionsobjektive besser geeignet (1b und 1c). Da sich die Zellen in wässriger Umgebung befinden, sind die Brechungsindizes von Immersionsflüssigkeit und Probenmedium sehr ähnlich, lediglich das Deckglas 2 selbst weicht ab. Wenn dieses optisch auskorrigiert ist, treten keine sphärischen Aberrationen beim tieferen Eindringen in die Probe auf (1c). Allerdings funktioniert diese Korrektur nur für eine bekannte und bestimmte Deckglasdicke und Glassorte. Deshalb besitzen Wasserimmersionsobjektive meist eine Korrekturfunktion, bei der durch Verschieben einer Linse oder Linsengruppe im Objektiv 3 (z. B. Korrektur-Ring, „Korr-Ring“) unvermeidbare Deckglasdickenschwankungen korrigiert werden können, wie dies durch den Doppelpfeil angedeutet ist (1b und 1c).
Neben den oben genannten Vorteilen für die maximal erzielbare Bildqualität durch den Einsatz oben genannter Immersionsmedien ergeben sich jedoch auch zahlreiche Nachteile. Da alle Immersionsmedien bei gebräuchlicher Temperatur flüssig sind, ergeben sich daraus oft Probleme, die als Einschränkungen der Anwendungsmöglichkeiten und der Handhabung sowie als Auftreten technischer Risiken klassifiziert werden können. Einschränkungen der Anwendungsmöglichkeiten bestehen beispielsweise darin, dass große Arbeitsabstände nicht realisiert werden können. Dies betrifft beispielsweise die Gebiete der Elektro-Physiologie, der Stereo-Mikroskopie und der Makroskopie. In Multipositionenexperimenten kann das Immersionsmedium über den Probenboden oder ein Deckglas verschmiert werden, wodurch bei jedem Ändern der Fokusposition beispielsweise in einer X-Y-Ebene das Immersionsmedium reduziert wird und zum Abreißen führen kann sowie die Probe beziehungsweise das Mikroskopsystem verschmutzt wird. Des Weiteren wird viel Immersionsmedium verbraucht. Durch Verdunstung kann sich bei Langzeitexperimenten der Brechungsindex des Immersionsmediums verändern, beispielsweise wenn eine Komponente des Immersionsmediums leichter flüchtig ist als eine andere Komponente des Immersionsmediums. Eine Automatisierung des Immersionsvorgangs ist nur mit hohem Aufwand realisierbar.
Die Handhabung von klassischen Immersionen mit Immersionsflüssigkeiten ist recht kompliziert und es kommt oft zu einem Verlust einer bereits identifizierten und beispielsweise in das Sichtfeld (field of view = FOV) gestellten interessierenden Region (region of interest = ROI), wenn beispielsweise von einem Übersichtsobjektiv auf ein Messobjektiv mit Immersion und zurück gewechselt wird. Nicht selten ist der Zugang zu einem Probenraum, in dem die zu beobachtende Probe angeordnet wird, stark eingeschränkt und schwer zu reinigen. Weist das Immersionsmedium eine hohe Viskosität auf, kann es zudem zu einem ungewollten Ablösen des Deckglases kommen. Als technische Risiken sind mögliche Objektiv- und Geräteschäden durch eindringende Immersionsflüssigkeit anzusehen.
Die Immersionsflüssigkeit wird gemäß dem Stand der Technik ohne eine räumliche Eingrenzung auf dem Objektiv platziert. Unter ungünstigen Bedingungen kann die Immersionsflüssigkeit dabei vom Objektiv abfließen, so dass neu immergiert werden muss. Auch bei Fahrten in Z-Richtung, also bei einer Abstandsänderung von Objektiv und Deckglas, kann es insbesondere bei einer Vergrößerung des Abstands zu einem Abreißen des Immersionsmediums von dem Deckglas kommen. Besonders bei der Autoimmersion ist das Ablaufen der Immersionsflüssigkeit immer ein Risiko für das Mikroskopsystem, da sich die Flüssigkeitsmengen verteilen und zum Beispiel in das Stativ des Mikroskops eindringen können.
Viele dieser oben genannten Probleme können mit einer Elastomerimmersion umgangen werden. Bei dieser Art der Immersion nutzt man nicht-toxische Elastomere als Immersionsmedien. Solche Elastomere sind beispielsweise elastisch verformbare Kunststoffe z. B. Siloxane wie PDMS, PMMA, PE-Gele und/oder natürliche Polymere wie Gelatine, Agarose oder Pektin, deren Glasübergangspunkt sich unterhalb der Einsatztemperatur befindet. Die Elastomere können sich bei Zug- und Druckbelastung elastisch verformen ( US 2015/0241682 A1 ).
Probleme bei der Verwendung der Elastomerimmersion können bei einem seitlichen Verschieben der Probe auftreten. Auch schnelle und starke Bewegungen in Z-Richtung, beispielsweise während der Fokussierung, führen zu Deformationen des Immersionskörpers und können hohe Kräfte auf das Deckglas und/oder die Probe ausüben. Dabei kann die Probe verschoben werden. Veränderungen der XYZ-Koordinaten führen bei Multipositionsexperimenten zu Problemen beim Wiederanfahren bis hin zu einer Zerstörung der Probe bei einem ungewollten Verschieben des Deckglases infolge einer Scherung des Einbettmediums und/oder einem Zerreißen der Probe. Eine weitere Schwierigkeit liegt darin, geeignete Polymere mit passendem Brechungsindex für verschiedenste Proben und Objektive herzustellen. Außerdem kann eine Elastomerimmersion Verschmutzungen sammeln, die sich dann negativ auf die Bildqualität auswirken können.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Möglichkeit zur Immersion vorzuschlagen, durch die aus dem Stand der Technik bekannte Nachteile verringert oder vermieden werden.
Die Aufgabe wird durch eine Immersionsmatrix mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Nebengeordnete Ansprüche betreffen die Verwendung der Immersionsmatrix sowie eine Immersionsvorrichtung. Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
Die Aufgabe wird durch eine Immersionsmatrix gelöst, die zur Anpassung optischer Eigenschaften, insbesondere des Brechungsindex, an Grenzflächen optischer Anordnungen ausgebildet ist. Die Immersionsmatrix besitzt eine Porosität, wobei die Poren wenigstens eine Porengröße aufweisen. Diese wenigstens eine Porengröße ist aus einem Bereich von mehr als 20 nm bis 200 µm ausgewählt.
Die mittlere Porengröße ist beispielsweise ein mittlerer Durchmesser, gegebenenfalls zu- bzw. abzüglich einer einfachen oder einer doppelten Standardabweichung, der in der Immersionsmatrix ausgebildeten Hohlräume (Poren). Die Poren sind wenigstens teilweise von Wänden und Stegen aus dem Material der Immersionsmatrix begrenzt.
Der zentrale Gedanke der Erfindung besteht in einer Kombination einer elastischen Struktur in Form einer Immersionsmatrix, die auch als ein Immersionsschwamm oder Schaum angesehen werden kann, mit einer Immersionsflüssigkeit. Die Immersionsmatrix kann flüssige Immersionsmedien aufnehmen, wobei die optischen Wirkungen der Immersionsmatrix an die der aufgenommenen Flüssigkeit angepasst werden.
Die Immersionsmatrix dient im Sinne eines strukturgebenden Speichers oder Containers dazu, dem Immersionsmedium eine größere mögliche Dimension (Arbeitsabstand) zu geben und dabei das Immersionsmedium räumlich einzugrenzen und festzuhalten.
Die Immersionsmatrix kann unterschiedlich geformt sein. Grundsätzlich ist die Funktion der Immersionsmatrix an keine spezifische Form gebunden. Allerdings können im Zusammenwirken der Immersionsmatrix beispielsweise mit einem Objektiv und/oder mit einem Deckglas oder einer Probe durch unterschiedliche Formgebungen vorteilhafte Wirkungen erreicht werden. Die Immersionsmatrix kann als ein Quader oder ein Zylinder geformt sein. Die Immersionsmatrix kann ferner in Form eines Konus oder eines Prismas ausgebildet sein. Dabei besitzt eine erste Seitenfläche eine erste flächige Ausdehnung. Eine gegenüberliegende zweite Seitenfläche besitzt eine zweite Ausdehnung, wobei die Ausdehnung der zweiten Seitenfläche größer als die Ausdehnung der ersten Seitenfläche ist. Eine solche Form ist beispielsweise vorteilhaft, wenn Objektive mit großer Numerischer Apertur und/oder ein großer Arbeitsabstandsbereich verwendet werden. Die zweite Seitenfläche mit der größeren Ausdehnung wird dann der Probe beziehungsweise dem Deckglas zugewandt verwendet.
Eine langgestreckte Form, beispielsweise eine Zylinderform, unterstützt große Änderungen des Arbeitsabstands ohne das Immersionsmedium abreißen zu lassen. Es können ferner Kombinationen der genannten Formen der Immersionsmatrix realisiert sein, so dass die Immersionsmatrix beispielsweise als Kegelstumpf, Konus oder Pyramidenstumpf ausgebildet ist.
In weiteren Ausführungen kann die Immersionsmatrix Poren mit wenigstens einer Porengröße aufweisen, die aus einem Bereich von mehr als 200 nm bis 200 µm, beispielsweise aus einem Bereich von 1 µm bis 100 µm oder 1 µm bis 200 µm ausgewählt ist.
Das Material der Immersionsmatrixweist vorzugsweise einen Brechungsindex n_Mat ausgewählt aus einem Bereich von 1,40 bis 1,8 auf und kann beispielsweise aus der Stoffgruppe der Polyurethane, Polyesterurethane, Polyimide ausgewählt sein. Das Material kann in weiteren Ausführungen eine Mischung von Polyurethan und Siliziumdioxid sein. Als Grundelemente des Materials können organische und/oder anorganische Stoffe und Verbindungen sowie Mischungen oder Verbünde dieser dienen. Es können sogenannte Aerogele verwendet werden. Diese werden beispielsweise gemäß bekannten Sol-Gel-Verfahren hergestellt und können rein organisch Bestandteile, rein anorganische Bestandteile oder Mischungen dieser aufweisen. Beispielsweise besteht eine Mischung organischer und anorganischer Bestandteile gänzlich oder überwiegend aus Polyurethan und Siliziumdioxid.
Weitere Materialien der Immersionsmatrix können beispielsweise Polymerschäume sein. Diese können unter hohem Druck expandiert sein und Schäume bilden, die ein 10 bis 70-fach, insbesondere 20 bis 50-fach, größeres Volumen als das entsprechende Ausgangsmaterial aufweisen. Beispiele hierfür sind Polystyrol (PS) als Ausgangsmaterial und expandiertes Polystyrol (EPS). Ein weiteres mögliches Material der Immersionsmatrix ist Polymethylmethacrylat (PMMA) in unterschiedlichen Verarbeitungszuständen. Ebenfalls sind geschäumte Polyurethane und Polyesterurethane mögliche Materialien.
Das Elastizitätsmodul E der erfindungsgemäßen Immersionsmatrix ist vorteilhaft geringer als 1,5 GPa. Vorteilhaft ist das Elastizitätsmodul E der Immersionsmatrix aus einem Bereich von 0,1 - 800 MPa, besser aus einem Bereich von 0,1 - 400 MPa, bevorzugt aus einem Bereich von 0,1 - 100 MPa ausgewählt. Das Elastizitätsmodul E wird nach der EN ISO 527-1 bestimmt. Das Elastizitätsmodul E soll die vorstehenden Werte erfüllen, wenn die Immersionsmatrix mit einer Immersionsflüssigkeit gefüllt ist. Kombination von Immersionsmatrix und Immersionsflüssigkeit, die ein resultierendes Elastizitätsmodul E von 1,5 GPa und mehr aufweisen, erfüllen die zu lösende Aufgabe nicht.
Die Immersionsmatrix ohne Füllung mit einer Immersionsflüssigkeit weist einen Elastizitätsmodul E von 0,1 - 1200 MPa, insbesondere aus einem Bereich von 0,1 - 800 MPa besser aus einem Bereich von 0,1 - 400 MPa, bevorzugt aus einem Bereich von 0,1 - 100 MPa auf.
Die Poren der Immersionsmatrixkönnen geschlossene Poren (geschlossene Porosität, geschlossenporig) oder offene Poren (offene Porosität, offenporig) sein. Bei der offenen Porosität sind mehr als 50% der Poren offen, stehen miteinander in Verbindung und kommunizieren beispielsweise im Sinne kommunizierender Röhren hydraulisch miteinander.
Das Material der Immersionsmatrixkann zusätzlich oder alternativ nanoporiert sein. Es enthält Nanoporen, die wenigstens eine mittlere Porengröße ausgewählt aus einem Bereich von 0,5 nm bis 20 nm, vorzugsweise 0,5 nm bis 10 nm besitzen. Die Nanoporen reduzieren die (optische) Kompaktheit des Materials der Immersionsmatrix, indem diese in den Wänden und Stegen des Materials ausgebildet sind.
Ein Anteil ausgewählt aus einem Bereich von 50% bis 98%, vorzugsweise aus einem Bereich von 70 % bis 98 %, des Volumens der Immersionsmatrix ist durch die Poren beziehungsweise durch die Poren und die Nanoporen gebildet.
Die optionale Nanoporierung führt zu einer verbesserten optischen Anpassung des Materials der Immersionsmatrix und der Immersionsflüssigkeit. Ein nützlicher Nebeneffekt der nanoporierten Immersionsmatrix besteht in seiner sehr geringen Wärmeleitfähigkeit. Dadurch wird ein optional vorhandenes und mit der Immersionsmatrix in Kontakt stehendes Objektiv als Wärmesenke von einer zu beobachtenden Probe thermisch entkoppelt. Dies ist für die Temperaturstabilisierung der Probe beispielsweise bei Inkubationsanwendungen (Live Cell Imaging, 37°C) von Vorteil.
Die Immersionsmatrix weist vorteilhaft eine Füllung der Poren und vorhandener Nanoporen mit einer Immersionsflüssigkeit auf.
Von Vorteil ist es, wenn die Immersionsflüssigkeit und/oder die Größe, Verteilung und der Anteil der Nanoporen derart gewählt ist, dass die gefüllte Immersionsmatrix einen resultierenden oder effektiven Brechungsindex n_res mit einem Wert in einem Bereich von 1,3 bis 1,7 besitzt.
Es ist in einer weiteren Ausführung der Erfindung möglich, dass die Immersionsmatrix Poren unterschiedlicher Porengrößen in einem Bereich von 0,5 nm bis 200 µm aufweist. Eine solche auch als fraktale Immersionsmatrix bezeichnete Immersionsmatrix vereinigt die Vorteile der Poren und der Nanoporen. Es sind dabei nicht nur Poren lediglich eines oder weniger mittlerer Durchmesser, sondern Poren und Nanoporen mit einer Vielzahl verschiedener Durchmesser vorhanden.
Da die Immersionsmatrix in offener und geschlossener Porosität ausgeführt sein kann und zudem das Material der Immersionsmatrix entweder nanoporös oder nicht-nanoporös sein kann, ergeben sich eine Reihe von Ausführungsmöglichkeiten. Die erfindungsgemäße Immersionsmatrix kann beispielsweise:

- geschlossenporig und mit Immersionsflüssigkeit befüllt sein,
- geschlossenporig sein und geschlossenporiges Material (nicht vorteilhaft) aufweisen,
- geschlossenporig sein und offenporiges Material aufweisen,
- offenporig sein (nur Poren, keine Nanoporen im Material),
- offenporig sein und geschlossenporiges Material aufweisen, oder
- offenporig sein und offenporiges Material aufweisen.

Die offenporigen Varianten bieten sowohl für die poröse Immersionsmatrix insgesamt als auch für das nanoporöse Material den Vorteil, dass die Immersionsflüssigkeit bei Kontakt mit einem Probenhalter wie einem Deckglas und/oder bei Kontakt mit einer Frontlinse eines Objektivs diese benetzt und so die Grenzfläche optisch eliminiert. Bei einem mechanischen Kontakt kann die Immersionsmatrix gestaucht werden und die Immersionsflüssigkeit kann leicht aus dem Immersionsschwamm austreten. Bei einer Relaxation der Immersionsmatrix, z. B. infolge des Zurückziehens des Objektivs, nimmt die Immersionsmatrix die Immersionsflüssigkeit wieder auf. Die Elastizität der Immersionsmatrix reduziert zudem vorteilhaft die Gefahr einer Beschädigung des Probenhalters, des Objektivs und/oder der Probe, da bei einer zu starken Zustellung, beispielsweise des Objektivs an den Probenhalter, die Immersionsmatrix gestaucht wird.
Wenn die Immersionsmatrix zwar porös, d.h. offenporig, aber ohne Nanoporen ausgebildet ist und aus einem Material besteht, dessen Brechungsindex nahe an dem der zu verwendenden Immersionsflüssigkeit liegt, werden die bereits erwähnten Vorteile wie räumliche Eingrenzung der Immersion und mechanische Flexibilität erreicht. Die Immersionsflüssigkeit kann jedoch nur in Grenzen frei gewählt werden. In diesem Fall ist es von Vorteil, wenn die Volumenfraktion des Materials, aus dem die Immersionsmatrix besteht, möglichst klein ist (bevorzugt 2 - 30%, entsprechend beträgt der Volumenanteil der Poren und/oder Nanoporen 98 - 70%).
Die zulässige Abweichung des Brechungsindex der Immersionsflüssigkeit vom Brechungsindex des Matrix-Materials ist unter diesen Umständen erhöht und beträgt beispielsweise 4% - 30%. Beispielsweise ist eine effektive Indexabweichung von 0,02 noch tolerierbar, wenn zum Beispiel der Brechungsindex von Wasser (n_Imm = 1,33) eingestellt werden soll und der erreichte Brechungsindex n_Mat = 1,35 beträgt.
Die Abweichung des Brechungsindex des Materials (n_Mat ) vom Brechungsindex der Immersionsflüssigkeit (n_Imm ) darf dabei größer sein als bei Immersionsmitteln, die sich nahe eines Fokus einer optischen Anordnung befinden. Das erfindungsgemäße Immersionssystem, insbesondere die mit Immersionsflüssigkeit gefüllte Immersionsmatrix, wird vorzugsweise weit außerhalb des Fokus der Abbildung angeordnet. Auftretende Streuung kann besser toleriert werden, wenn sie entfernt von der Bildebene auftritt.
Ist das Material der Immersionsmatrix selbst nanoporös, bietet diese Ausführung zusätzlich den Vorteil, dass die Immersionsflüssigkeit freier gewählt werden kann. Da auch die Wände und Stege der Schwammstruktur selbst nanoporös sind und die Immersionsflüssigkeit aufnehmen können, gleicht sich der Brechungsindex des Materials der Immersionsmatrix weiter an den Brechungsindex der Immersionsflüssigkeit an.
Um zum Beispiel eine Inkubation der Probe während eines Beobachtungszeitraums oder andere zusätzliche Anwendungen zu ermöglichen, kann die Immersionsmatrix ein Heizelement aufweisen oder mit einem solchen in Wirkkontakt stehen. Das Heizelement bedeckt die Immersionsmatrixbeispielsweise auf mindestens einer ihrer Seiten und kann beispielsweise eine Heizkeramik, ein Heizdraht oder eine Heizplatte sein. Eine solche Ausführung ist beispielsweise für direkte in-vivo-Beobachtungen ohne Deckglas oder Trennsystem verwendbar.
Das Heizsystem kann für eine zu verwendende Beleuchtungsstrahlung und/oder eine zu erfassende Detektionsstrahlung transparent sein. Das Heizelement beziehungsweise die Heizelemente können als Trennsystem zwischen Immersionsmatrix und Probe fungieren und die Funktion eines Deckglases übernehmen. Die Heizelemente können als Einmalprodukt konzipiert sein. Mit einer solchen Lösung ist eine lokale Inkubation der Probe ermöglicht und zugleich wird deren Kontamination vermieden.
Wie bereits oben erwähnt, kann die Immersionsmatrixbei der Mikroskopie einer Probe verwendet werden. Dabei sind wenigstens eine Beleuchtungsstrahlung und/oder eine Detektionsstrahlung durch die Immersionsmatrix gerichtet. Um auftretende Verluste der Immersionsflüssigkeit ausgleichen zu können, kann die Immersionsmatrix Teil einer Immersionsvorrichtung sein, die neben der Immersionsmatrixeinen Vorratsbehälter zur Bevorratung und Bereitstellung der Immersionsflüssigkeit sowie eine Medienleitung zur Zuführung der Immersionsflüssigkeit zur Immersionsmatrixumfasst. Die Zufuhr von Immersionsflüssigkeit zu der Immersionsmatrix kann gesteuert erfolgen. Dazu kann die Immersionsvorrichtung eine Steuereinheit und eine Pumpe umfassen, wobei die Pumpe durch die Steuereinheit ansteuerbar ist. Ferner können Sensoren zur Erfassung von Verlusten und/oder der Zufuhrmenge der Immersionsflüssigkeit
In weiteren Ausführungen der Immersionsvorrichtung ist es auch möglich, dass die Zufuhr der Immersionsflüssigkeit aus dem Vorratsbehälter zu der Immersionsmatrix passiv erfolgt und beispielsweise durch eine Höhendifferenz zwischen Vorratsbehälter und Immersionsmatrix und/oder durch Druckunterschiede zwischen Vorratsbehälter und Immersionsmatrix bewirkt sein. So kann verdunstende Immersionsflüssigkeit zu einer Sogwirkung in der Medienleitung führen und Immersionsflüssigkeit nachgesogen werden. Verluste von Immersionsflüssigkeit - insbesondere durch einen Verbleib von Anteilen der Immersionsflüssigkeit an einem Probenhalter („Schneckenspur“) bei Verschieben von Probenhalter und Immersionsmatrix relativ zueinander - können mit einer geeigneten Beschichtung verhindert oder verringert werden.
Eine solche Beschichtung kann auf der Seitenfläche des Probenhalters vorhanden sein, die mit der Immersionsmatrix in direktem Kontakt tritt. Geeignete Beschichtungen sind aus dem Stand der Technik bekannt (z. B. L. Yoa et al. (2014), „Recent progress in antireflection and selfcleaning technology - from surface engineering to functional surfaces", Progress in Materials Science 61: 94-143). Entsprechende Repellenzwirkungen können auch mittels Laserstrahlbearbeitung von Oberflächen erreicht werden (Van Duong Ta et al. (2016), Laser textured superhydrophobic surfaces and their applications for homogeneous spot deposition, Applied Surface Science 365: 153 - 159).
Da eine Immergierung (Immersion) mit einer erfindungsgemäßen Immersionsmatrix, insbesondere wenn diese mit Immersionsflüssigkeit getränkt ist, gut automatisierbar ist, stellt diese in Kombination mit beschichteten Oberflächen beispielsweise des Probenhalters eine wesentlich verbesserte Immergierung dar. Sie vereint die Vorteile der klassischen Immergierung und der Elastomerimmersion und reduziert deren Nachteile.
Grundsätzlich ist die Erfindung nicht nur auf eine Verwendung in der Mikroskopie beschränkt. Es lassen sich damit Räume zwischen optischen Elementen beziehungsweise zwischen Grenzflächen optischer Elemente überbrücken. Solche Abstände können Luftspalte sein. Mit der Erfindung ist vorteilhaft eine Variation des Abstandes der Grenzflächen möglich. Beispiele für Anwendungen jenseits der Mikroskopie sind eine Prismenkopplung, z. B. zur Refraktometrie an dünnen Schichten oder eine Innenfokussierung innerhalb von Kittgliedern oder die Verwendung von Kittgliedern mit variablem Arbeitsabstand. Weiterhin ist mittels der erfindungsgemäßen Immersionsmatrix eine Verbindung von Lichtleitern möglich.
Mit einer erfindungsgemäßen Immersionsmatrixlassen sich solche Abstände in optischen Anordnungen überwinden, bei denen sonst das Immersionsmedium den Kontakt mit einer Grenzfläche verliert und abreißt, so also ein nachteiliger Luftspalt entsteht. Die Umsetzung größerer Abstände ist insbesondere für Objektive wichtig, die weit in die Probe hinein fokussiert werden müssen, also einen dementsprechend großen mechanischen Arbeitsabstand benötigen. Solche Objektive oder Optiken werden verwendet, wenn mit diesen beispielsweise in flüssigkeitsgefüllte Kammern hineinfokussiert werden soll. Solche Kammern sind zum Beispiel die Probenkammer eines Lichtblattmikroskops oder Spektrometerküvetten.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und Abbildungen näher erläutert. Es zeigen:

1a eine schematische Darstellung des Standes der Technik eines Objektivs in Form eines Immersionsobjektivs, eines Deckglases und einer Probe, wobei sich zwischen Objektiv und Deckglas ein Medium in Form eines Immersionsmediums befindet, wobei die Brechungsindizes optimal aufeinander abgestimmt sind;
1b eine schematische Darstellung des Standes der Technik eines Objektivs in Form eines Immersionsobjektivs, eines Deckglases und einer Probe, wobei sich zwischen Objektiv und Deckglas ein Medium in Form eines Immersionsmediums befindet, wobei durch das Deckglas Aberrationen verursacht sind;
1c eine schematische Darstellung des Standes der Technik eines Objektivs in Form eines Immersionsobjektivs, eines Deckglases und einer Probe, wobei sich zwischen Objektiv und Deckglas ein Medium in Form eines Immersionsmediums befindet, wobei Aberrationen mittels einer Korrekturfunktion reduziert sind;
2 eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels einer Anordnung einer erfindungsgemäßen Immersionsmatrix, eines Objektivs, eines Probenhalters und einer Probe sowie einer vergrößerter Detaildarstellung des erfindungsgemäßen nanoporösen Immersionsschwamms;
3 eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels einer Anordnung einer erfindungsgemäßen Immersionsmatrix, eines Objektivs, eines Probenhalters und einer Probe sowie einer vergrößerter Detaildarstellung des zweiten Ausführungsbeispiels der nanoporösen Immersionsmatrix; und
4a eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Immersionsmatrix in Form eines Quaders,
4b eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Immersionsmatrix in Form eines Prismas oder Konus,
4c eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Immersionsmatrix in Form eines Zylinders,
5 eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Immersionsvorrichtung.

Die bereits zu den 1a bis 1c eingeführten Elemente finden sich auch in den Ausführungsbeispielen der Erfindung. Gleiche technische Elemente sind mit gleichen Bezugszeichen versehen.
In der 2 ist als Immersionsmedium 4 eine erfindungsgemäße Immersionsmatrix 5 aus einem elastischen Material 6 mit einem E-Modul ausgewählt aus einem Bereich von 0,1 - 100 MPa gezeigt, die zwischen einem Objektiv 3 einer nicht näher dargestellten optischen Anordnung M, z. B. eines Mikroskops, und einem Probenträger 2 in Form eines Deckglases angeordnet ist. Eine erste Seitenfläche 5.1 der Immersionsmatrix 5 steht mit dem Probenhalter 2 in Kontakt, während eine gegenüberliegende zweite Seitenfläche 5.2 mit dem Objektiv 3 in direktem Kontakt steht. Das Material 6 besitzt einen Brechungsindex n_Mat . Die Immersionsmatrix 5 steht mit einer seiner Seitenflächen mit dem Probenträger 2 und mit der gegenüberliegenden Seitenfläche mit dem Objektiv 3 in direktem Kontakt. Der Probenträger 2 überdeckt eine in einem Einbettungsmedium enthaltene Probe 1, die hier vereinfachend als Probe 1 bezeichnet werden. Die Immersionsmatrix 5 ist mit einer Immersionsflüssigkeit 9 gefüllt, die einen Brechungsindex n_Imm besitzt und weist einen resultierenden oder effektiven Brechungsindex n_res von 1,4 auf.
Die mit der Immersionsmatrix 5 in Kontakt stehende beziehungsweise die zum In-Kontakt-Bringen mit der Immersionsmatrix 5 vorgesehene Oberfläche des Probenträgers 2 ist mit einer Beschichtung 10 versehen, die ein Anhaften der Immersionsmatrix 5 und der Immersionsflüssigkeit 9 an dem Probenhalter 2 verhindert oder zumindest reduziert.
In der vergrößerten Detaildarstellung sind die Poren 7 zu sehen, die von dem Material 6 begrenzt sind. Das Material 6 ist offenporig, d. h. die Mehrheit der Poren 7 steht miteinander in Verbindung. Es ist zu beachten, dass die Detaildarstellung lediglich einen Schnitt durch eine Ebene zeigt und somit nicht alle Verbindungen der Poren 7 untereinander zu sehen sind.
In den durch das Material 6 der Immersionsmatrix5 gebildeten Wänden und Stegen sind Nanoporen 8 vorhanden, die ebenfalls mit der Immersionsflüssigkeit 9 gefüllt sind.
In der Detaildarstellung der 3 ist eine Immersionsmatrix5 in einer Ausführung als fraktale Immersionsmatrix 5 gezeigt. Es sind Poren 7 und Nanoporen 8 unterschiedlicher mittlerer Durchmesser in dem Material 6 verteilt.
Die erfindungsgemäße Immersionsmatrix 5 kann für eine Verwendung in unterschiedlichen Formen ausgeführt sein. In den 4a bis 4c sind Beispiele möglicher Formgestaltungen gezeigt. Eine quaderförmige Immersionsmatrix 5 ist in der 4a dargestellt. Die Immersionsmatrix 5 weist eine erste Seitenfläche 5.1 und eine gegenüberliegende zweite Seitenfläche 5.2 auf. Die beiden Seitenflächen 5.1 und 5.2 sind dazu vorgesehen, um mit dem Probenhalter 2 beziehungsweise mit dem Objektiv 3 in Kontakt gebracht zu werden (siehe 2, 3 und 5). Eine Immersionsmatrix 5 mit dieser Form ist vielseitig verwendbar.
Die 4b zeigt schematisch eine erfindungsgemäße Immersionsmatrix 5 in Form eines Konus oder Prismas. Die Ausdehnung der zweiten Seitenfläche 5.2 ist größer als die der ersten Seitenfläche 5.1. Diese Form begünstigt eine Verwendung mit Objektiven 3 hoher Numerischer Apertur und/oder größeren Arbeitsabstandsbereichen.
Eine in 4c dargestellte Immersionsmatrix 5 ist zylinderförmig gestaltet und eignet sich beispielsweise bei großen Arbeitsabstandsbereichen.
Eine in 5 dargestellte Immersionsvorrichtung umfasst neben der Immersionsmatrix 5 einen Vorratsbehälter 11 zur Bevorratung von Immersionsflüssigkeit 9. Der Vorratsbehälter 11 ist mittels einer Medienleitung 12 mit der Immersionsmatrix 5 verbunden, so dass Immersionsflüssigkeit 9 aus dem Vorratsbehälter 11 zu der Immersionsmatrix 5 geleitet werden kann. Die Zufuhr der Immersionsflüssigkeit 9 kann passiv erfolgen und beispielsweise durch einen sich entwickelnden Unterdruck in der Immersionsmatrix5 bewirkt sein. In dem dargestellten Ausführungsbeispiel ist eine Steuereinheit 13 vorgesehen, mit der eine Pumpe 14 zur aktiven Förderung von Immersionsflüssigkeit 9 aus dem Vorratsbehälter 11 zu der Immersionsmatrix 5 ansteuerbar ist.
Das Objektiv 3 kann relativ zur beschichteten Seitenfläche des Deckglases beziehungsweise Probenhalters 2 in einer durch die Achsen x und y eines kartesischen Koordinatensystems aufgespannten Ebene XY bewegt werden. Dazu kann ein nicht dargestellter Antrieb vorhanden sein, der wiederum mittels der Steuereinheit 13 ansteuerbar sein kann.
Diese direkte Kopplung der Immersionsmatrix 5 an den Vorratsbehälter 11 ist geeignet, um flüchtige Immersionsflüssigkeiten 9 zu ersetzen, Langzeitbeobachtungen durchzuführen und/oder große Verfahrwege des Objektivs 3 relativ zu dem Probenhalter 2 zu erlauben, indem dabei auftretende Verluste an Immersionsflüssigkeit 9 ausgeglichen werden. In diesen Anwendungen besteht im Stand der Technik das Problem, dass die Immersionsflüssigkeit 9 evaporiert und/oder am Probenhalter 2 zurückbleibt. Konventionell wird hier mit Pumpensystemen und Schläuchen über eine entsprechende Düse der Raum zwischen Objektiv/Frontlinse und Probenhalter 2 mit Immersionsflüssigkeit befüllt.
Die erfindungsgemäße Immersionsmatrix 5 bietet zweierlei Vorteile: zum Einen wird die Evaporation bereits durch die Immersionsmatrix 5 reduziert und zum Anderen kann eine Medienleitung 12, beispielsweise in Form eines Schlauchs oder einer Röhre, mit entsprechender Verjüngung und angepasst an den Arbeitsabstand direkt in die Immersionsmatrix 5 münden. Da hier eine hydraulische Verbindung vorliegt, können Verluste der Immersionsflüssigkeit 9 selbstständig ausgeglichen werden.
Die Immersionsmatrix 5 ist mit wenigstens einem Heizelement 15 an einer seiner Seitenflächen versehen, welches elektrisch betrieben und mittels der Steuereinheit 13 ansteuerbar ist. Das Heizelement 15 ermöglicht ein Erwärmen bzw. Kühlen der Immersionsmatrix 5 und optional ein lokales Erwärmen bzw. Kühlen der Probe 1.
In einer weiteren Ausführung der Immersionsvorrichtung kann ein Sensor (nicht gezeigt), insbesondere ein Temperatursensor vorhanden sein. Dieser Sensor erfasst eine aktuelle Temperatur der Immersionsmatrix 5 und/oder der Probe 1 als Messwerte. Die erfassten Messwerte werden der Steuereinheit 13 zur Verfügung gestellt, sodass eine Feedback-Regelung des Heizelements/ Kühlelements 15 ermöglicht wird.
Bezugszeichenliste

1: Probe
2: Probenhalter
3: Objektiv
4: Immersionsmedium
5: Immersionsmatrix
5.1: erste Seitenfläche
5.2: zweite Seitenfläche
6: Material (der Immersionsmatrix 5)
7: Poren
8: Nanoporen
9: Immersionsflüssigkeit
10: Beschichtung
11: Vorratsbehälter
12: Medienleitung
13: Steuereinheit
14: Pumpe
15: Heizelement/Kühlelement
n_Mat: Brechungsindex (des Materials 6)
n_Imm: Brechungsindex (der Immersionsflüssigkeit 9)
n_res: resultierender Brechungsindex
M: Mikroskop

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 2015/0241682 A1 [0016]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Liu, P. Y. et al. (2016): Cell refractive index for cell biology and disease diagnosis: past, present and future; Lab on a Chip, 16: 634-644 [0003]
Hell, S. et al. (1993): Aberrations in confocal fluorescence microscopy induced by mismatches in refractive index. Journal of microscopy, 169: 391-405 [0009]
L. Yoa et al. (2014), „Recent progress in antireflection and selfcleaning technology - from surface engineering to functional surfaces“, Progress in Materials Science 61: 94-143 [0048]
Van Duong Ta et al. (2016), Laser textured superhydrophobic surfaces and their applications for homogeneous spot deposition, Applied Surface Science 365: 153 - 159 [0048]

Claims

Immersionsmatrix (5) zur Anpassung optischer Eigenschaften an Grenzflächen optischer Anordnungen, aufweisend eine Porosität mit Poren (7) wenigstens einer mittleren Porengröße ausgewählt aus einem Bereich von mehr als 20 nm bis 200 µm und/oder Nanoporen (8) in dem Material (6) der Immersionsmatrix (5), wobei die Nanoporen (8) wenigstens eine mittlere Porengröße ausgewählt aus einem Bereich von 0,5 nm bis 20 nm besitzen.
Immersionsmatrix (5) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Porengröße aus einem Bereich von mehr als 50 nm bis 200 µm ausgewählt ist.
Immersionsmatrix (5) nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Porengröße aus einem Bereich von 1 µm bis 200 µm , ausgewählt ist.
Immersionsmatrix (5) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die mittlere Porengröße der Nanoporen aus einem Bereich von mehr als 0,5 nm bis 10 nm ausgewählt ist.
Immersionsmatrix (5) nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch einen Elastizitätsmodul E der mit einer Immersionsflüssigkeit (9) gefüllten Immersionsmatrix (5) kleiner 1,5 GPa, insbesondere ausgewählt aus einem Bereich von 0,1 - 800 MPa, vorzugsweise ausgewählt aus einem Bereich von 0,1 - 100 MPa.
Immersionsmatrix (5) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch ein Material (6) mit einem Brechungsindex n_Mat ausgewählt aus einem Bereich von 1,4 bis 1,8.
Immersionsmatrix (5) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch geschlossene Poren (7).
Immersionsmatrix (5) nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch offene Poren (7).
Immersionsmatrix (5) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine erste Ausdehnung an einer ersten Seitenfläche (5.1) und einer zweiten Ausdehnung an einer zweiten Seitenfläche (5.2), wobei die Ausdehnung der zweiten Seitenfläche (5.2) größer als eine Ausdehnung der ersten Seitenfläche (5.1) ist.
Immersionsmatrix (5) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Füllung der Poren (7) und vorhandener Nanoporen (8) mit einer Immersionsflüssigkeit (9).
Immersionsmatrix (5) nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Immersionsflüssigkeit (9) derart gewählt ist, dass die gefüllte Immersionsmatrix (5) einen resultierenden Brechungsindex (n_res) mit einem Wert in einem Bereich von 1,3 bis 1,7 besitzt.
Immersionsmatrix (5) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch ein Heizelement/ Kühlelement (15), das die Immersionsmatrix (5) auf mindestens einer seiner Seiten bedeckt.
Verwendung einer Immersionsmatrix (5) nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Mikroskopie einer Probe (1), wobei wenigstens eine Beleuchtungsstrahlung und/oder eine Detektionsstrahlung durch die Immersionsmatrix (5) gerichtet ist beziehungsweise gerichtet sind.
Anordnung einer Immersionsmatrix (5) nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zwischen Grenzflächen optischer Elemente.
Anordnung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass, wenigstens eine Grenzfläche, die mit der Immersionsmatrix (5) in Kontakt gebracht ist oder in Kontakt gebracht werden kann, eine Oberfläche aufweist, die nicht-adhäsiv für die Immersionsmatrix (5) und/oder die Immersionsflüssigkeit ist.
Immersionsvorrichtung umfassend eine Immersionsmatrix (5) nach einem der Ansprüche 1 bis 12, einen Vorratsbehälter (11) zur Bevorratung und Bereitstellung einer Immersionsflüssigkeit (9) sowie eine Medienleitung (12) zur Zuführung der Immersionsflüssigkeit (9) zur Immersionsmatrix (5).