JP5616824B2 - 顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は、顕微鏡装置に関し、特に、位相変調型空間光変調器を用いた顕微鏡装置に関する。

生物顕微鏡の分野では、蛍光イメージングと、光刺激による標本操作（例えば、フォトアクチベーション、フォトコンバージョン、細胞機能抑制、活性化）とを組み合わせて生体機能を解明する蛍光観察法が知られている。この蛍光観察法では、生体深部の観察が可能であり、且つ、生体へのダメージが小さいという特徴から、しばしば、レーザ光を用いた２光子励起が用いられている。

上記の蛍光観察法では、標本やアプリケーションに合わせて、標本に照射する光のパターン（形状、サイズ、スポット数など）やその照射位置を任意に且つ高速に変更する機能が求められる。この機能は、対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置（以降、瞳共役位置と記す。）に配置された位相変調型の空間光変調器（ＳＬＭ：Spatial Light Modulator、以降、ＳＬＭと記す。）を用いることで実現することが可能であり、このような技術に関連する装置は、例えば、特許文献１及び特許文献２に開示されている。

対物レンズの瞳共役位置に配置された位相変調型ＳＬＭを含む光学装置によれば、位相変調型ＳＬＭが瞳共役位置で位相を変調して波面を制御することにより、フーリエ変換レンズとして機能する対物レンズを介して、標本面上に任意の光のパターンを形成することができる。さらに、対物レンズの光軸方向への照射位置の調整や対物レンズの収差補正を行うことも可能である。

特開２００６−７２２８０号公報 米国特許第７７３３５６４号明細書

ところで、蛍光観察法では、蛍光物質に応じて励起光としてさまざまな波長のレーザ光が使用されるが、レーザ光源では、射出する波長や個体差により、ダイバージェンス（拡がり角）やビームウェスト位置が変化する。ダイバージェンスやビームウェスト位置の変化は、対物レンズの瞳位置におけるビーム径やレーザ光の収斂度合いに影響を及ぼすため、瞳径に対してビーム径が大き過ぎることによる光量損失、ビーム径が小さすぎることによる分解能の低下、レーザ光の収斂度合いの変動による照射位置の変化など、さまざまな好ましくない事態を生じさせる。

また、蛍光観察法では、観察対象などに応じてさまざまな対物レンズが使用されるが、対物レンズの収差特性や瞳径は、対物レンズ毎に異なる。対物レンズの収差特性や瞳径の相違は、不十分な収差補正による集光性能の低下、瞳径に対してビーム径が大き過ぎることによる光量損失、ビーム径が小さすぎることによる分解能の低下など、さまざまな好ましくない事態を生じさせる。

このように、蛍光観察法に用いられる顕微鏡装置では、所望の性能を発揮するためには、使用する対物レンズやレーザ光源（又はその波長）の特性を十分に考慮する必要がある。

しかしながら、特許文献１及び特許文献２に開示される装置では、レーザ光源の個体差、レーザ光の波長、対物レンズの収差特性、及び、対物レンズの瞳径など（以降、装置条件と記す。）については、全く考慮されていない。また、特許文献１及び特許文献２に開示される装置では、上述した装置条件の違いによって生じ得る性能低下を防止することは、その構成上非常に困難である。従って、特許文献１及び特許文献２に開示される装置では、実際には、ある特定の装置条件下でしか十分な性能を発揮することができない。

以上のような実情を踏まえて、本発明では、さまざまな装置条件下で、標本に照射する光のパターンやその照射位置を、高い光の利用効率で任意に変更する顕微鏡装置を提供することを目的する。

本発明の第１の態様は、レーザ光を射出するレーザ光源と、標本に前記レーザ光を照射する対物レンズと、前記レーザ光源と前記対物レンズの間で、且つ、前記対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置に配置された位相変調型ＳＬＭと、前記レーザ光源と前記位相変調型ＳＬＭとの間に配置されて、前記位相変調型ＳＬＭに入射するレーザ光のビーム径を可変するビーム径可変手段と、前記ビーム径可変手段及び前記位相変調型ＳＬＭを制御する制御部と、対物レンズに関する第１の情報と、レーザ光の波長に関する第２の情報であって少なくともレーザ光の波長及び前記レーザ光源が当該波長のレーザ光を射出するときのレーザ光のダイバージェンスを含む第２の情報とに関連付けて、前記制御部のパラメータを記憶する記憶部と、を含み、前記制御部は、前記対物レンズに対応する前記第１の情報と、前記レーザ光源から射出される前記レーザ光の波長に対応する前記第２の情報とに関連付けられた、前記記憶部に記憶された前記制御部の前記パラメータに従って、前記位相変調型ＳＬＭに入射するレーザ光のビーム径が変更されるように前記ビーム径可変手段を制御し、且つ、前記対物レンズの瞳位置における前記レーザ光のビーム径及びダイバージェンスが調整されるように前記ビーム径可変手段及び前記位相変調型ＳＬＭを制御する、顕微鏡装置を提供する。

本発明の第２の態様は、第１の態様に記載の顕微鏡装置において、前記第１の情報は、対物レンズの瞳径であり、前記第２の情報は、波長、ビーム径、及び、ダイバージェンスである顕微鏡装置を提供する。

本発明の第３の態様は、第２の態様に記載の顕微鏡装置において、前記制御部は、前記対物レンズと前記レーザ光源から射出される前記レーザ光の波長とに応じて、前記位相変調型ＳＬＭを制御し、前記位相変調型ＳＬＭは、前記制御部による制御に従って、前記レーザ光の位相を変調する顕微鏡装置を提供する。

本発明の第４の態様は、第３の態様に記載の顕微鏡装置において、さらに、前記位相変調型ＳＬＭと前記対物レンズの間に配置されて、前記対物レンズの光軸と直交する方向に前記標本を走査するように、前記レーザ光を偏向する光偏向手段を含む顕微鏡装置を提供する。

本発明の第５の態様は、第４の態様に記載の顕微鏡装置において、さらに、第２のレーザ光源と、前記位相変調型ＳＬＭと前記対物レンズの間に配置されて、前記レーザ光源から射出されるレーザ光と前記第２のレーザ光源から射出されるレーザ光とを合成して前記対物レンズの光軸方向に導く光路合成手段と、を含み、前記レーザ光源から射出されたレーザ光が前記標本上で集光する第１のフォーカス面と前記第２のレーザ光源から射出されたレーザ光が前記標本上で集光する第２のフォーカス面とが一致するように、前記制御部は前記ビーム径可変手段及び前記位相変調型ＳＬＭを制御する顕微鏡装置を提供する。

本発明の第６の態様は、第１の態様から第５の態様のいずれか１つに記載の顕微鏡装置において、前記ビーム径可変手段は、光軸方向に移動可能に配置された、屈折力を有する１群の光学素子からなる顕微鏡装置を提供する。

本発明の第７の態様は、第１の態様から第５の態様のいずれか１つに記載の顕微鏡装置において、前記ビーム径可変手段は、少なくとも一方が光軸方向に移動可能に配置された、２群の光学素子からなる顕微鏡装置を提供する。

本発明の第８の態様は、第１の態様から第６の態様のいずれか１つに記載の顕微鏡装置において、前記ビーム径可変手段は、位相変調型ＳＬＭである顕微鏡装置を提供する。

本発明によれば、さまざまな装置条件下で、標本に照射する光のパターンやその照射位置を、高い光の利用効率で任意に変更する顕微鏡装置を提供することができる。

実施例１に係る顕微鏡装置について説明するための図である。 実施例２に係る顕微鏡装置の構成を例示した図である。 実施例３に係る顕微鏡装置の構成を例示した図である。

図１は、本実施例に係る顕微鏡装置について説明するための図である。図１（ａ）では、本実施例に係る顕微鏡装置の構成が例示されている。図１（ｂ）では、図１（ａ）に例示される顕微鏡装置に含まれるビーム径可変光学系の作用の具体例が示されている。

図１（ａ）に例示される本実施例に係る顕微鏡装置１は、レーザ光源であるチタンサファイアレーザ２から射出された赤外線領域の超短パルスレーザ光により、２光子過程を利用して標本面ＳＰ上の図示しない標本を励起して、その励起により生じた蛍光を検出する２光子励起顕微鏡装置である。

顕微鏡装置１は、超短パルスレーザ光を射出するチタンサファイアレーザ２と、チタンサファイアレーザ２からのレーザ光のビーム径を可変する手段であるビーム径可変光学系３と、プリズム型ミラー４と、対物レンズ１３の瞳共役位置でレーザ光の位相を変調して波面を制御する位相変調型ＳＬＭ５と、瞳リレーレンズ６と、対物レンズ１３の光軸に直交するＸＹ平面内で標本を２次元に走査するようにレーザ光を偏向する光偏向手段であるＸＹスキャナ７と、瞳リレーレンズ８と、ミラー９と、結像レンズ１０と、ミラー１１と、チタンサファイアレーザ２から射出されたレーザ光を透過させて蛍光を反射する波長特性を有するダイクロイックミラー１２と、標本面ＳＰ上の標本にレーザ光を照射する対物レンズ１３と、を含んでいる。

ここで、位相変調型ＳＬＭ５は、チタンサファイアレーザ２と対物レンズ１３の間で、且つ、対物レンズ１３の瞳共役位置に配置されている。また、ＸＹスキャナ７は、位相変調型ＳＬＭ５と対物レンズ１３の間で、且つ、対物レンズ１３の瞳共役位置に配置されている。即ち、顕微鏡装置１では、位相変調型ＳＬＭ５とＸＹスキャナ７と対物レンズ１３の瞳位置は、光学的に共役な関係にある。従って、瞳リレーレンズ６は、位相変調型ＳＬＭ５をＸＹスキャナ７に投影し、瞳リレーレンズ８及び結像レンズ１０は、ＸＹスキャナ７を対物レンズ１３の瞳位置に投影するように構成されている。

位相変調型ＳＬＭ５としては、例えば、反射型の液晶位相変調器、ミラーの駆動により光路長差を生じさせる反射型ミラー位相変調器、デフォーマブルミラーなどを用いることができる。図１では、位相変調型ＳＬＭ５が反射型のデバイスである場合が例示されているが、位相変調型ＳＬＭ５は反射型のデバイスに限られず、例えば、透過型の液晶位相変調器などの透過型のデバイスであってもよい。また、ＸＹスキャナ７としては、例えば、ガルバノミラーや、音響光学偏向素子（ＡＯＤ：Acoustic Optical Deflector）などを用いることができる。

チタンサファイアレーザ２と位相変調型ＳＬＭ５との間に配置されたビーム径可変光学系３は、図１（ａ）に例示されるように、２群の光学素子（レンズ群３ａ、レンズ群３ｂ）から構成されている。ビーム径可変光学系３は、光軸方向に移動可能に配置されたレンズ群３ｂの光軸方向への移動によってレンズ群３ａとレンズ群３ｂの間隔を変化させることで、位相変調型ＳＬＭ５に入射するレーザ光のビーム径を可変することができる。即ち、ビーム径可変光学系３は、レンズ群３ｂの移動量及び移動方向に応じてレーザ光のビーム径を変更するビーム径可変手段であり、例えば、図１（ｂ）に例示されるように、レーザ光が照射される位相変調型ＳＬＭ５上の領域を照射領域Ｒ１から照射領域Ｒ２に広げることも、また反対に、照射領域Ｒ２から照射領域Ｒ１に狭めることもできる。

なお、図１（ａ）では、レンズ群３ｂが光軸方向に移動することにより、レンズ群３ａとレンズ群３ｂの間隔を変化させる例が示されているが、レンズ群３ａが光軸方向に移動することにより間隔を変化させてもよい。つまり、ビーム径可変光学系３は、ビーム径可変光学系３を構成する２群のレンズ群のうち少なくとも一方が光軸方向に移動可能に配置されていればよい。

顕微鏡装置１は、さらに、蛍光を反射するダイクロイックミラー１２の反射光路上に、リレーレンズ１４と、赤外領域の波長の光を遮断するＩＲカットフィルタ１５と、蛍光を電気信号に変換する光検出器である光電子増倍管１６（ＰＭＴ：Photomultiplier、以降、ＰＭＴと記す。）と、を含んでいる。

ＰＭＴ１６は、対物レンズ１３の瞳位置と光学的に共役な位置近傍に配置されることが望ましい。顕微鏡装置１では、ＰＭＴ１６は、リレーレンズ１４により対物レンズ１３の瞳が投影される位置近傍に配置されているため、標本１３の任意の領域から生じる蛍光を検出することができる。

顕微鏡装置１は、さらに、顕微鏡装置１を制御する制御部１７と、記憶部１８と、演算部１９と、利用者からの指示が入力される入力部２０とを含んでいる。入力部２０に入力される利用者からの指示内容としては、例えば、標本に照射する光のパターン、照射位置、使用する対物レンズ、使用するレーザ光の波長などが挙げられる。

制御部１７は、図１（ａ）に例示されるように、記憶部１８と演算部１９と入力部２０に加えて、チタンサファイアレーザ２とビーム径可変光学系３と位相変調型ＳＬＭ５に電気的に接続されていて、これらを制御する。

記憶部１８には、顕微鏡装置１で使用される対物レンズ（対物レンズ１３を含む）に関する情報として、対物レンズの瞳径、収差特性、焦点距離などが記憶されている。また、顕微鏡装置１で使用されるレーザ光源（チタンサファイアレーザ２を含む）から射出されるレーザ光の波長に関する情報として、波長、その波長のレーザ光を射出するときのビーム径及びダイバージェンスなどが記憶されている。なお、複数のレーザ光源が切り換えて用いられる場合には、レーザ光源毎に、レーザ光源から射出されるレーザ光の波長に関する情報が記憶されている。

さらに、記憶部１８には、ビーム径可変光学系３を制御するための制御部１７のパラメータが記憶されている。制御部１７のパラメータは、例えば、レンズ群３ｂが基準位置にある場合における、レンズ群３ｂを移動させる図示しないステッピングモータに入力するパルス数、または、レンズ群３ｂの光軸方向への移動距離である。なお、制御部１７のパラメータは、対物レンズに関する情報のうちの対物レンズの瞳径（第１の情報）と、レーザ光源から射出されるレーザ光の波長に関する情報のうちの波長、その波長のレーザ光を射出するときのビーム径及びダイバージェンス（第２の情報）とに、関連付けて記憶されている。

以下、顕微鏡装置１の制御部１７による各種制御について、具体的に説明する。
制御部１７によるチタンサファイアレーザ２の制御は、入力部２０に入力された使用する波長に応じて行われる。チタンサファイアレーザ２は、制御部１７による制御に従って、射出するレーザ光の波長を入力部２０に入力された波長に変更する。

制御部１７によるビーム径可変光学系３の制御は、入力部２０に入力された使用する対物レンズ（ここでは、対物レンズ１３）と、使用するレーザ光源（ここでは、チタンサファイアレーザ２）から射出されるレーザ光の波長と、に応じて行われる。

より具体的には、制御部１７は、対物レンズ１３の瞳径と、チタンサファイアレーザ２が射出するレーザ光の波長、その波長のレーザ光を射出するときのビーム径及びダイバージェンスと、に関連付けられた制御部１７の制御パラメータを記憶部１８から読出して、読出した制御パラメータに基づいてビーム径可変光学系３を制御する。そして、ビーム径可変光学系３は、制御部１７による制御に従って、ビーム径可変光学系３のレンズ群３ｂを光軸方向に移動させることで、位相変調型ＳＬＭ５に入射するレーザ光のビーム径を変更する。

このように、制御部１７は、使用する対物レンズと使用するレーザ光源から射出されるレーザ光の波長とに応じてビーム径可変光学系３を制御する。これにより、顕微鏡装置１は、対物レンズの瞳径、レーザ光の波長、光源から射出されるときのレーザ光のビーム径及びダイバージェンスが異なるさまざまな装置条件下で、使用する対物レンズの瞳径に合わせた最適なビーム径のレーザ光を対物レンズの瞳位置に入射させることができる。このため、瞳径に対してビーム径が大き過ぎることによる光量損失やビーム径が小さすぎることによる分解能の低下を防止することができる。

制御部１７による位相変調型ＳＬＭ５の制御は、入力部２０に入力された使用する対物レンズ（ここでは、対物レンズ１３）と、使用するレーザ光源（ここでは、チタンサファイアレーザ２）から射出されるレーザ光の波長と、入力部２０に入力された光パターン及び照射位置と、に応じて行われる。

より具体的には、制御部１７は、対物レンズ１３に関する情報（瞳径、収差特性、焦点距離など）と、チタンサファイアレーザ２から射出されるレーザ光の波長に関する情報（波長、その波長のレーザ光を射出するときのビーム径及びダイバージェンスなど）を記憶部１８から読出して、それらの情報を、入力部２０に入力された光パターン及び照射位置に関する情報とともに、演算部１９に送信する。演算部１９は、制御部１７から送信された情報に基づいて、入力部２０に入力された光パターンを入力部２０に入力された照射位置に形成する位相変調型ＳＬＭ５の変調パターンを算出して、算出された変調パターンに関する情報を制御部１７へ送信する。制御部１７は、演算部１９から送信された変調パターンに関する情報に従って、位相変調型ＳＬＭ５を制御し、位相変調型ＳＬＭ５は、制御部１７による制御に従って、変調パターンを変更してレーザ光の位相を変調する。

このように、制御部１７は、入力部２０に入力された光パターン及び照射位置に加えて、使用する対物レンズと使用するレーザ光源から射出されるレーザ光の波長とに応じて位相変調型ＳＬＭ５を制御する。これにより、顕微鏡装置１は、対物レンズの瞳径、収差特性、焦点距離、光源から射出されるレーザ光の波長、その波長のレーザ光を射出するときのビーム径及びダイバージェンスなどが異なるさまざまな装置条件下で、使用する対物レンズの瞳位置におけるレーザ光のダイバージェンスを最適に調整し、且つ、標本面上での収差を良好に補正することができる。このため、不十分な収差補正による集光性能の低下やレーザ光の収斂度合いの変動による照射位置の変化を防止して、所望の光パターンを所望の照射位置に形成することができる。なお、演算部１９は、変調パターンの算出に当たり、さらに、ビーム径可変光学系３の制御で使用された制御部１７の制御パラメータを、ビーム径可変光学系３から射出されるビーム径に関する情報として使用しても良い。

本実施例に係る顕微鏡装置１によれば、使用する対物レンズと使用するレーザ光源から射出されるレーザ光の波長に応じてビーム径可変光学系３及び位相変調型ＳＬＭ５を制御することで、さまざまな装置条件下で、標本に照射する光のパターンやその照射位置を高い光の利用効率で任意に変更することができる。

また、本実施例に係る顕微鏡装置１では、使用する対物レンズの瞳径に合わせてビーム径を最適化するビーム径可変光学系３は、２群の光学素子から構成されている。このため、顕微鏡装置１によれば、装置構成を過度に複雑にすることなく簡単な構成で、対物レンズの瞳径が異なるさまざまな装置条件に対応することができる。その他、２群の光学素子から構成されたビーム径可変光学系３では、ビーム径の変更に伴うレーザ光のダイバージェンスの増大を抑えることができるため、位相変調型ＳＬＭ５でのダイバージェンスの補正量を抑えることできる。また、小さな移動量で比較的大きくビーム径を変更することができるため、ビーム径を比較的高速に変更することができる。

また、本実施例に係る顕微鏡装置１では、光学素子の光軸方向の移動によりビーム径を変更するビーム径可変光学系３は、使用する対物レンズの瞳径に対してビーム径を最適化するものであり、主に光の利用効率の改善に寄与している。一方で、標本に照射する光のパターンやその照射位置の変更は、主に、光学素子の移動に比べて高速な動作が可能な位相変調型ＳＬＭ５により実現される。このため、顕微鏡装置１によれば、標本に照射する光のパターンやその照射位置の高速な変更を実現することができる。

なお、図１（ａ）では、顕微鏡装置１の光源として、２光子励起用のチタンサファイアレーザ２を例示したが、光源はチタンサファイアレーザ２に限られない。コヒーレンス性を有するレーザ光源であればよく、例えば、可視光レーザであってもよい。
また、特定のレーザ光源から射出される特定の波長のレーザ光のみを使用する顕微鏡装置の場合には、制御部１７は、使用する対物レンズに応じてビーム径可変光学系３を制御してもよい。また、特定の対物レンズのみを使用する顕微鏡装置の場合には、制御部１７は、チタンサファイアレーザ２から射出されるレーザ光の波長に応じて、ビーム径可変光学系３を制御してもよい。

図２は、本実施例に係る顕微鏡装置の構成を例示した図である。図２に例示される本実施例に係る顕微鏡装置２１は、蛍光イメージングと光刺激による標本操作とを同時行うための２光子励起顕微鏡装置である。

顕微鏡装置２１は、刺激用の照明手段Ｌ１に加えて蛍光イメージング用の照明手段Ｌ２を含む点、刺激用の照明手段Ｌ１がビーム径可変光学系３の代わりにビーム径可変光学系２２を含む点、照明手段Ｌ１からのレーザ光を反射し照明手段Ｌ２からのレーザ光を透過するダイクロイックミラー２３を含む点、制御部１７の代わりに制御部２８を含む点が、図１（ａ）に例示される実施例１に係る顕微鏡装置１と異なっている。その他の構成は、実施例１に係る顕微鏡装置１の構成と同様である。図２では、顕微鏡装置１と同一の構成要素には同一の符号を付している。

以降では、顕微鏡装置１との相違点を中心に顕微鏡装置２１について説明する。
照明手段Ｌ２は、蛍光イメージング用の照明手段であり、チタンサファイアレーザ２とは異なる波長の赤外線レーザ光を射出するチタンサファイアレーザ２４（第２のレーザ光源）と、レーザ光のビーム径を所定の大きさに変更するビームエクスパンダ２５と、対物レンズ１３の光軸に直交するＸＹ平面内で標本を２次元に走査するようにレーザ光を偏向する光偏向手段であるＸＹスキャナ２６と、瞳リレーレンズ２７と、を含んでいる。

ＸＹスキャナ２６は、対物レンズ１３の瞳共役位置に配置されている。即ち、顕微鏡装置１では、ＸＹスキャナ２６と対物レンズ１３の瞳位置は、光学的に共役な関係にある。従って、瞳リレーレンズ２７及び結像レンズ１０は、ＸＹスキャナ２６を対物レンズ１３の瞳位置に投影するように構成されている。なお、ＸＹスキャナ２６としては、ＸＹスキャナ７と同様に、例えば、ガルバノミラーや、音響光学偏向素子（ＡＯＤ：Acoustic Optical Deflector）などを用いることができる。

照明手段Ｌ１は、ビーム径可変光学系３の代わりにビーム径可変光学系２２を含む点を除き、顕微鏡装置１に含まれる照明手段と同様に構成されている。チタンサファイアレーザ２と位相変調型ＳＬＭ５との間に配置されたビーム径可変光学系２２は、図２に例示されるように、光軸方向に移動可能に配置された屈折力を有する１群の光学素子（レンズ群２２ａ）から構成されている。

ビーム径可変光学系２２は、レンズ群２２ａの光軸方向への移動によってレンズ群２２ａと位相変調型ＳＬＭ５との間での光学的光路長を変化させることで、位相変調型ＳＬＭ５に入射するレーザ光のビーム径を可変することができる。即ち、ビーム径可変光学系２２は、レンズ群２２ａの移動量及び移動方向に応じてレーザ光のビーム径を変更するビーム径可変手段であり、図１（ａ）に例示されるビーム径可変光学系３と同様に、例えば、図１（ｂ）に例示されるように、レーザ光が照射される位相変調型ＳＬＭ５上の領域を照射領域Ｒ１から照射領域Ｒ２に広げることも、また反対に、照射領域Ｒ２から照射領域Ｒ１に狭めることもできる。

ダイクロイックミラー２３は、位相変調型ＳＬＭ５と対物レンズ１３の間に配置されて、照明手段Ｌ１からのレーザ光を反射し照明手段Ｌ２からのレーザ光を透過する波長特性を有するダイクロイックミラーである。ダイクロイックミラー２３は、チタンサファイアレーザ２から射出されるレーザ光とチタンサファイアレーザ２４から射出されるレーザ光とを合成して対物レンズ１３の光軸方向に導く光路合成手段として機能する。これにより、蛍光イメージングと光刺激による標本操作との同時実行を実現している。

制御部２８は、複数のレーザ光源（チタンサファイアレーザ２、チタンサファイアレーザ２４）に接続されている点が、実施例１に係る顕微鏡装置１に含まれる制御部１７と異なっている。また、制御部２８は、使用する対物レンズと使用するレーザ光源から射出されるレーザ光の波長に応じてビーム径可変光学系２２及び位相変調型ＳＬＭ５を制御する点は、実施例１に係る顕微鏡装置１に含まれる制御部１７と同様である。ただし、制御部２８は、さらに、チタンサファイアレーザ２から射出されたレーザ光が標本上で集光するフォーカス面（第１のフォーカス面）とチタンサファイアレーザ２４から射出されたレーザ光が標本上で集光するフォーカス面（第２のフォーカス面）とが一致するように、ビーム径可変光学系２２及び位相変調型ＳＬＭ５を制御する点が異なっている。

このため、記憶部１８には、チタンサファイアレーザ２４から射出されたレーザ光が標本上で集光するフォーカス面（第２のフォーカス面）を算出するために、チタンサファイアレーザ２から射出されるレーザ光の波長に関する情報だけではなく、チタンサファイアレーザ２４から射出されるレーザ光の波長に関する情報も記憶されていることが望ましい。

本実施例に係る顕微鏡装置２１によれば、使用する対物レンズと使用するレーザ光源から射出されるレーザ光の波長に応じてビーム径可変光学系２２及び位相変調型ＳＬＭ５を制御することで、実施例１に係る顕微鏡装置１と同様の効果を得ることができる。即ち、さまざまな装置条件下で標本に照射する光のパターンやその照射位置を高い光の利用効率で任意に変更することができる。また、標本に照射する光のパターンやその照射位置の高速な変更を実現することができる。

また、本実施例に係る顕微鏡装置２１によれば、照明手段Ｌ１のフォーカス面と照明手段Ｌ２のフォーカス面を正確に一致させることができるため、照明手段Ｌ２により蛍光イメージング処理を行いながら、蛍光イメージング処理がされている面に照明手段Ｌ１により光刺激を与えることができる。その際、フォーカス面を変更することなく光刺激に使用する波長を変更することもできる。例えば、蛍光イメージング処理中に、照明手段Ｌ１により、７２０ｎｍの波長のレーザ光を用いてアンケージによるグルタミン酸解除を実施し、その後、同一平面に対して８００ｎｍの波長のレーザ光を用いてフォトコンバージョンを発生させることができる。

また、本実施例に係る顕微鏡装置２１では、使用する対物レンズの瞳径に合わせてビーム径を最適化するビーム径可変光学系２２は、１群の光学素子から構成されている。このため、顕微鏡装置２１によれば、実施例１に係る顕微鏡装置１と比べてより簡単な構成で、対物レンズの瞳径が異なるさまざまな装置条件に対応することができる。その他、１群の光学素子から構成されたビーム径可変光学系２２では、レンズ枚数が少ないため、ビーム径可変光学系２２で生じる光量損失を抑えることができる。

なお、図２では、顕微鏡装置２１の照明手段Ｌ１及び照明手段Ｌ２の光源として、２光子励起用のチタンサファイアレーザを例示したが、光源はチタンサファイアレーザに限られない。コヒーレンス性を有するレーザ光源であればよく、例えば、可視光レーザであってもよい。

また、図２では、照明手段Ｌ１を光刺激の手段として使用し、照明手段Ｌ２を蛍光イメージングの手段として使用する例を示したが、照明手段Ｌ１及び照明手段Ｌ２の用途はこれに限られない。照明手段Ｌ１を蛍光イメージングの手段として使用し、照明手段Ｌ２を光刺激の手段として使用してもよい。また、照明手段Ｌ１及び照明手段Ｌ２の両方を、光刺激の手段または蛍光イメージングの手段として使用しても良い。
また、実施例１の場合と同様に、制御部２８は、使用する対物レンズに応じてビーム径可変光学系２２を制御してもよく、また、チタンサファイアレーザ２及びチタンサファイアレーザ２４から射出されるレーザ光の波長に応じてビーム径可変光学系２２を制御してもよい。

図３は、本実施例に係る顕微鏡装置の構成を例示した図である。図３に例示される本実施例に係る顕微鏡装置３１は、蛍光イメージングと光刺激による標本操作とを同時行うための２光子励起顕微鏡装置である。

顕微鏡装置３１は、刺激用の照明手段Ｌ１の代わりに蛍光イメージング用の照明手段Ｌ３を含む点、蛍光イメージング用の照明手段Ｌ２の代わりに蛍光イメージング用の照明手段Ｌ４を含む点、ダイクロイックミラー２３と対物レンズ１３の間にＸＹスキャナ３６及び瞳リレーレンズ３７を含む点、制御部１７の代わりに制御部３８を含む点が、図２に例示される実施例２に係る顕微鏡装置２１と異なっている。その他の構成は、実施例２に係る顕微鏡装置２１の構成と同様である。図３では、顕微鏡装置２１と同一の構成要素には同一の符号を付している。

以降では、顕微鏡装置２１との相違点を中心に顕微鏡装置３１について説明する。
照明手段Ｌ３は、超短パルスレーザ光を射出するチタンサファイアレーザ２と、ミラー３２と、位相変調型ＳＬＭ３３と、対物レンズ１３の瞳共役位置でレーザ光の位相を変調して波面を制御する位相変調型ＳＬＭ５と、瞳リレーレンズ６と、ミラー３５と、を含んでいる。

照明手段Ｌ３は、ダイクロイックミラー２３の光源（チタンサファイアレーザ２）側に設けられていたＸＹスキャナ７及び瞳リレーレンズ８が省略されている点と、ビーム径可変光学系３の代わりにビーム径可変手段として機能する位相変調型ＳＬＭ３３が含まれる点が、実施例２に係る顕微鏡装置２１に含まれる照明手段Ｌ１と異なっている。

照明手段Ｌ４は、ダイクロイックミラー２３の光源（チタンサファイアレーザ２４）側に設けられていたＸＹスキャナ２６及び瞳リレーレンズ２７が省略されている点が、実施例２に係る顕微鏡装置２１に含まれる照明手段Ｌ２と異なっている。

なお、顕微鏡装置３１では、ダイクロイックミラー２３と対物レンズ１３の間に配置されたＸＹスキャナ３６及び瞳リレーレンズ３７が、照明手段Ｌ３及び照明手段Ｌ４で省略されたＸＹスキャナ及び瞳リレーレンズの代わりに使用される。

制御部３８は、複数の位相変調型ＳＬＭ（位相変調型ＳＬＭ５、位相変調型ＳＬＭ３３）に接続されている点が、実施例２に係る顕微鏡装置２１に含まれる制御部２８と異なっている。

本実施例に係る顕微鏡装置３１によれば、使用する対物レンズと使用するレーザ光源から射出されるレーザ光の波長に応じて位相変調型ＳＬＭ３３及び位相変調型ＳＬＭ５を制御することで、実施例２に係る顕微鏡装置２１と同様の効果を得ることができる。即ち、さまざまな装置条件下で標本に照射する光のパターンやその照射位置を高い光の利用効率で任意に変更することができる。また、標本に照射する光のパターンやその照射位置の高速な変更を実現することができる。また、照明手段Ｌ３のフォーカス面と照明手段Ｌ４のフォーカス面を正確に一致させることができる。

また、本実施例に係る顕微鏡装置３１によれば、照明手段Ｌ３及び照明手段Ｌ４がＸＹスキャナ３６を共通に使用しているため、チタンサファイアレーザ２からのレーザ光とチタンサファイアレーザ２４からのレーザ光を同じ位置に同じタイミングで照射することができる。従って、照明手段Ｌ３及び照明手段Ｌ４による完全に同期した２波長検出を実現することができる。

また、本実施例に係る顕微鏡装置３１では、使用する対物レンズの瞳径に合わせてビーム径を最適化するビーム径可変手段は、レンズではなく位相変調型ＳＬＭ３３である。このため、顕微鏡装置３１によれば、実施例２に係る顕微鏡装置２１と比べてよりコンパクトな構成とすることが可能である。また、レンズの移動を伴わないため、比較的高速にビーム径を変更することができる。

なお、図３では、顕微鏡装置３１の照明手段Ｌ１及び照明手段Ｌ２の光源として、２光子励起用のチタンサファイアレーザを例示したが、光源はチタンサファイアレーザに限られない。コヒーレンス性を有するレーザ光源であればよく、例えば、可視光レーザであってもよい。

また、図３では、照明手段Ｌ３及び照明手段Ｌ４を蛍光イメージングの手段として使用する例を示したが、照明手段Ｌ３及び照明手段Ｌ４の用途はこれに限られない。照明手段Ｌ３と照明手段Ｌ４のいずれかを光刺激の手段として使用してもよい。また、照明手段Ｌ３と照明手段Ｌ４の両方を光刺激の手段として使用してもよい。
また、実施例１の場合と同様に、制御部３８は、使用する対物レンズに応じて位相変調型ＳＬＭ３３を制御してもよく、また、チタンサファイアレーザ２及びチタンサファイアレーザ２４から射出されるレーザ光の波長に応じて位相変調型ＳＬＭ３３を制御してもよい。

１、２１、３１・・・顕微鏡装置、２、２４・・・チタンサファイアレーザ、３、２２・・・ビーム径可変光学系、３ａ、３ｂ、２２ａ・・・レンズ群、４・・・プリズム型ミラー、５、３３・・・位相変調型ＳＬＭ、６、８、２７、３７・・・瞳リレーレンズ、７、２６、３６・・・ＸＹスキャナ、９、１１、３２、３５・・・ミラー、１０・・・結像レンズ、１２、２３・・・ダイクロイックミラー、１３・・・対物レンズ、１４・・・リレーレンズ、１５・・・ＩＲカットフィルタ、１６・・・ＰＭＴ、１７、２８、３８・・・制御部、１８・・・記憶部、１９・・・演算部、２０・・・入力部、２５・・・ビームエクスパンダ、ＳＰ・・・標本面、Ｒ１、Ｒ２・・・照射領域、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４・・・照明手段

Claims (8)

1. レーザ光を射出するレーザ光源と、
   標本に前記レーザ光を照射する対物レンズと、
   前記レーザ光源と前記対物レンズの間で、且つ、前記対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置に配置された位相変調型ＳＬＭと、
   前記レーザ光源と前記位相変調型ＳＬＭとの間に配置されて、前記位相変調型ＳＬＭに入射するレーザ光のビーム径を可変するビーム径可変手段と、
   前記ビーム径可変手段及び前記位相変調型ＳＬＭを制御する制御部と、
   対物レンズに関する第１の情報と、レーザ光の波長に関する第２の情報であって少なくともレーザ光の波長及び前記レーザ光源が当該波長のレーザ光を射出するときのレーザ光のダイバージェンスを含む第２の情報とに関連付けて、前記制御部のパラメータを記憶する記憶部と、
   を含み、
   前記制御部は、前記対物レンズに対応する前記第１の情報と、前記レーザ光源から射出される前記レーザ光の波長に対応する前記第２の情報とに関連付けられた、前記記憶部に記憶された前記制御部の前記パラメータに従って、
   前記位相変調型ＳＬＭに入射するレーザ光のビーム径が変更されるように前記ビーム径可変手段を制御し、且つ、
   前記対物レンズの瞳位置における前記レーザ光のビーム径及びダイバージェンスが調整されるように前記ビーム径可変手段及び前記位相変調型ＳＬＭを制御する
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
2. 請求項１に記載の顕微鏡装置において、
   前記第１の情報は、対物レンズの瞳径であり、
   前記第２の情報は、波長、ビーム径、及び、ダイバージェンスである
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
3. 請求項２に記載の顕微鏡装置において、
   前記制御部は、前記対物レンズと前記レーザ光源から射出される前記レーザ光の波長とに応じて、前記位相変調型ＳＬＭを制御し、
   前記位相変調型ＳＬＭは、前記制御部による制御に従って、前記レーザ光の位相を変調する
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
4. 請求項３に記載の顕微鏡装置において、さらに、
   前記位相変調型ＳＬＭと前記対物レンズの間に配置されて、前記対物レンズの光軸と直交する方向に前記標本を走査するように、前記レーザ光を偏向する光偏向手段を含む
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
5. 請求項４に記載の顕微鏡装置において、さらに、
   第２のレーザ光源と、
   前記位相変調型ＳＬＭと前記対物レンズの間に配置されて、前記レーザ光源から射出されるレーザ光と前記第２のレーザ光源から射出されるレーザ光とを合成して前記対物レンズの光軸方向に導く光路合成手段と、を含み、
   前記レーザ光源から射出されたレーザ光が前記標本上で集光する第１のフォーカス面と前記第２のレーザ光源から射出されたレーザ光が前記標本上で集光する第２のフォーカス面とが一致するように、前記制御部は前記ビーム径可変手段及び前記位相変調型ＳＬＭを制御する
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
6. 請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の顕微鏡装置において、
   前記ビーム径可変手段は、光軸方向に移動可能に配置された、屈折力を有する１群の光学素子からなる
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
7. 請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の顕微鏡装置において、
   前記ビーム径可変手段は、少なくとも一方が光軸方向に移動可能に配置された、２群の光学素子からなる
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
8. 請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の顕微鏡装置において、
   前記ビーム径可変手段は、位相変調型ＳＬＭである
   ことを特徴とする顕微鏡装置。