WO2015185341A1 - Verfahren zur mikroskopischen abbilding von proben in töpfchen einer mikrotiterplatte - Google Patents

Verfahren zur mikroskopischen abbilding von proben in töpfchen einer mikrotiterplatte Download PDF

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WO2015185341A1
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Thorsten Kues
Peter Schön
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Carl Zeiss Microscopy Gmbh
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Definitions

  • the invention relates to a method of microscopically imaging samples adhering to trays of pots in a microtiter plate having a plurality of pots filled with fluid, said pots being sequentially spaced from a top surface opposite the trays from a transmitted light source along a bottom surface Illuminated optical axis and the thus illuminated from the top soils of the pots from the bottom forth individually magnifying.
  • microscopy of living cells plays an important role. These are often cultivated in microtiter plates.
  • the cells are located at the bottom of the vessel and are surrounded by a nutrient medium. They are usually microscoped with an inverted microscope; In this case, the lens is the bottom of the sample vessel bottom.
  • the illumination of the sample can be done by reflected light or transmitted light.
  • transmitted light images a light is placed above the sample vessel.
  • biological cells contain only low-absorbing components, bright-field transmitted light images are typically only very slightly contrasted. With the help of various naturallichtkontrastmaschine such.
  • the small refractive index difference of the individual cell components relative to one another and to the surrounding medium can be converted into an intensity difference, which then provides a contrasted transmitted light image.
  • the invention is concerned with transmitted light microscopy of samples adhering to the bottom of a microtiter plate.
  • the floors are illuminated in transmitted light and imaged in high resolution in a microscope.
  • This type of microscopy differs from the conventional image of an entire microtiter plate used in other applications in other applications, as is the case for example in DE 10200541 A1. If the floors are magnified individually or in small groups in transmitted light, the quality requirements of transmitted light illumination are many times higher. This applies in particular with regard to the aforementioned transmitted-light contrast method.
  • the field of the invention is also delineated against so-called fluorescence readers, which check whether or how much the liquid fluoresces in a well of a microtiter plate. Again, there is usually a detection of all pots of a microtiter plate simultaneously. In addition, the quality of the floor lighting is irrelevant in these applications.
  • US 6074614 is concerned with such a use of microtiter plates and provides a cover plate which, matching the microtiter plate, has a plurality of cylindrical protrusions which dip into the potentially fluorescent liquid of the microtiter plate. The goal is to ensure the most uniform path length of the radiation through the pots of the microtiter plate in the fluorescence excitation and readout. The question of lighting the bottom of a microtiter plate does not matter.
  • Contrast method is used as homogeneous as possible illumination over the entire object field detected by the lens, d. H. of the whole soil.
  • this is realized via a Köhler illumination, which guarantees that all points of the object field are illuminated not only approximately with the same intensity, but also with an approximately equal angular spectrum, which is described by the numerical aperture (NA) of the illumination.
  • NA numerical aperture
  • this NA should be slightly smaller than the NA of the
  • microtiter plates are a problem in this respect.
  • microtiter plates are used as an example for small sample containers. These have z. B. 96 individual pots on. The pots are typically about 1 1 mm high and have a diameter of about 7 mm. Thus, the upper edge of the potty truncates the cone of light of the transmitted light illumination, which reaches a certain point of the bottom of the potty and is caught by the lens after passing through it.
  • the usable light cone is another, d. H. every point of the potty bottom "sees" another illumination NA area. If the lens NA is large enough to accommodate all the different illumination cones and the illumination in each of these cones provides approximately equal intensity, the illumination of the potty bottom remains homogeneous although the potty edge prunes the illumination light.
  • a plate may also be placed which preferably absorbs the illumination light to reduce reflections. Such plates are not useful for the area presented here, since they would interfere with the transmitted light illumination, which is why no
  • absorbing layers can be brought into the beam path.
  • a lid for microtiter plates is disclosed, which may be formed flat or with bulges and serves to create the same conditions in different pots of a microtiter plate, so that measurements such.
  • Fluorescence spectrum of a fluorescent solution in different pots are comparable to each other. This application has no relation to microscopy,
  • the invention is therefore based on the object, a method for the microscopic imaging of samples which adhere to a bottom of the wells in a microtiter plate having a plurality of fluid-filled pots, the pots successively from a top surface opposite the bottoms of a Illuminated transmitted-light source along an optical axis and the so-lit from the top bottoms of the pots from the bottom are shown individually enlarging to indicate at the lighting of the floor is even without the use of imaging optics with high numerical aperture uniform.
  • the edge illumination at the bottom is improved by engaging within the potty which destroys the meniscus in the optically relevant region by placing the homogenizing element between the transmitted light source and the potty having a part immersed in the fluid, one in the fluid lying end face.
  • These can be z. B. made of glass or plastic. If they have a plane surface perpendicular to the optical axis at both the top and bottom ends, the meniscus effect is suppressed and a parallel illumination beam remains parallel after passing the potty.
  • the invention may be embodied as a simple lid for a microtiter plate, wherein at the position of each potty a cylinder is formed, which protrudes into the potty.
  • This lid may rest or be spaced on the well edges of the microtiter plate.
  • Microtiter plates are available with different potty numbers, z. B. 24, 96 or 384 pots. For plates with 96 pots, there are also two variants, the standard variant with a potty diameter of about 7 mm, and one with half volume at one
  • Potty diameter of about 5 mm can be a lid after construct the above description with cylinders projecting into the liquid. It does not have to be a circular cylinder.
  • Wells are usually not round but square with rounded corners. A corresponding shape may also have the immersing elements of the lid. Also, the lid does not have to cover the entire plate. Also cover that only parts of
  • Cover microtiter plate for example, the central area or only every n-th potty are possible in the context of this invention.
  • cylinders other geometric shapes may be formed, for. As cones or truncated cones and the like. For the sake of simplicity, however, the following will be discussed in part only by cylinders, without this being limiting.
  • Sample material is, it is advantageous if the homogenizing element can be cleaned well.
  • the protruding cylinders can create many hard to reach areas. To facilitate cleaning, corners and edges can be rounded.
  • the lid according to the invention consists of materials that are autoclavable, ie z. As glass or autoclavable plastic.
  • Microtiter plates are i. d. R. designed as disposable vessels.
  • the execution of the cover described as a disposable or consumable material is conceivable.
  • Illumination sensitive If only a single cylinder is used, this problem can be solved by repeated insertion. If, however, a lid with many cylinders is used, a repetition does not lead to the goal, since in each case under some cylinders air bubbles will find. To eliminate this problem, several options are available.
  • the underside of the cylinders can be slightly curved or chamfered so that air bubbles can be directed to the side and then escape between the cylinder and the wall of the potty. In this case, however, it must be ensured that the curvature or slope is not too strong and again a meniscus or a breaking edge at the interface cylinder liquid is generated, which has a negative effect on the illumination, if that
  • Cylinder material does not have a liquid-like refractive index.
  • the cylinder may have a smaller diameter than the potty, so that there is sufficient space between the cylinder and the potty edge, thus Air bubbles can escape.
  • the cylinder diameter should not be too small, because otherwise the meniscus is only destroyed in the potty center, while it forms again around the cylinder. With a potty diameter of 7 mm, cylinders with a diameter of 5 mm are suitable. When inserting almost never create air bubbles and the illumination is very good up to the potty edge.
  • intensity modulation of these rings is significantly less than the drop in intensity edge without the use of the lid. If the cylinder is centered on the potty, these rings are concentric with the potty. If the cylinder is slightly eccentric, the rings are also off-center. If the cylinders are equal to the pots after each insertion, the ring structure is always the same relative to the pots. To prevent the cylinder move relative to the pots, the lid z. B. made to fit the outer dimensions of the microtiter plate. Alternatively, locking or
  • Positioning possibilities are provided laterally on the edge of the lid, with the aid of which the lid is brought into a defined position to the microtiter plate. That then makes that possible
  • the ring structure is usually quite blurred because it comes from planes that are relatively far away from the observation plane. This makes it possible in many cases to calculate the ring structure out of the image by means of a Fourier analysis. For this purpose, a high-pass filter is applied to the image, which filters out low frame rates. In particular, if the sample structures are very small-sized, ie have high-frequency components, this approach is advantageous. As already mentioned, it is preferable that the part immersed in the fluid has the shape of a general straight cylinder.
  • the end face to the optical axis have an angle of inclination or tangent angle which is between 80 and 90 degrees and to prevent air bubbles from degrading the edge illumination of the bottom again.
  • the end face to the optical axis have an angle of inclination or tangent angle which is between 80 and 90 degrees and to prevent air bubbles from degrading the edge illumination of the bottom again.
  • the edge illumination is particularly good when the shape of the end face in plan view along the optical axis is similar to the shape of the cross section of the potty.
  • a gap of at least 1 mm and a maximum of 3 mm between the edge of each end face and the inner wall of the associated potty allows air bubbles to escape. At the same time the edge illumination is not disturbed.
  • a further development provides for the following steps in the method for microscopically imaging a sample which adheres in a potty to the bottom of the potty:
  • a brightness correction indication is determined from the reference image, the brightness correction indication indicating a brightness variation as a function of the location on the bottom of the test potty,
  • a sample vessel-related shading which is firmly connected to the reference system of the sample vessel, is not recognized by the described methods and consequently can not be corrected.
  • a sample container-related shading is present when the structure of the sample vessel itself leads to shading. This occurs z. B. in small vessels (ikrotiterplatten), as described below. If the sample is moved, this shading wanders with it. It is thus always in the same place of a sample container-related reference system, but can not be assigned to a fixed position of a beam path-related reference system.
  • Microtiter plates are sample vessels which are used in particular in live cell observation. These are plates that are filled with a defined number of pots, z. B. 24,96 or 384, are equipped at regular intervals. In each of these pots, a sample can be introduced, for. As cells or embryos. For microscopic observation, the pots with a transparent bottom of z. As polystyrene or glass provided. The optical properties of the pots disturb the
  • the 96 pots have a height of 1 1 mm and a diameter of 7 mm.
  • the top edge of the potty trims the light cone of the transmitted light illumination, which reaches a certain point of the bottom of the potty and which is caught by the lens after passing the bottom.
  • the usable light cone is another, d. H. every point of the
  • Potty bottom is lit with a different numerical aperture. This can already lead to a sample vessel-dependent shading, the effect is the greater, the more the illumination light cone is trimmed by the potty and the unevenly the illumination intensity is distributed to the different illumination angles. On the other hand, if the numerical aperture of the objective is large enough to accommodate all the different illumination cones and the illumination in each of these cones provides approximately equal intensity, the illumination of the pedestal base remains homogeneous, although the
  • the aqueous medium in which the sample is present forms a meniscus on its surface.
  • the interface between air and medium is therefore curved. The radius of the
  • Meniscus depends on the type of fluid, wall material and coating of the pots, as well as the filling method, ie whether dry or already wet pots were filled, whether they were stirred etc. In most cases, the liquid along the potty wall retreats slightly above, while the liquid level is lower in the potty center.
  • n the refractive index of the medium between the objective and the sample. In the case of weakly magnifying objectives, this is usually air, that is to say n -1. All illumination beams that are refracted through the meniscus to larger angles than the limit angle defined by the objective NA thus do not enter the objective. Even if so
  • the meniscus effect produces an inhomogeneously illuminated image, since the light from the sample depends on the
  • Entry angle does not get into the lens in equal proportions.
  • the captured image thus has a bright potty center and dark border areas.
  • a sample vessel-based shading arises, which can not be remedied by the known methods for shading correction.
  • the invention uses a brightness correction indication that is a function of the location on the bottom of the potty.
  • the term "potty" is used herein to refer to a sample vessel, which may be both a single vessel and a well of a microtiter plate, so far as reference is made in the following description to the singular (“potty") the use of a single vessel as well as the reference to a single well of a microtiter plate.
  • the test potty corresponds to the vessel containing the sample except for the difference that no sample is present in the test potty. If the sample adhering to the bottom of the potty is in a nutrient solution, i.
  • the task of the test potty is precisely those optical conditions, i. to make the influence of the illumination radiation, which also prevails in the potty - but without a sample.
  • the brightness correction indication which was determined from the test potty, is a function of the location at the bottom of the potty, can be determined from the test potty and then used to correct an uneven brightness distribution when imaging the sample in the potty.
  • the brightness correction specification can be provided in various ways: In a first embodiment, the bottom of the test potty is replaced by several
  • the brightness correction indication is then essentially the brightness distribution over the entire bottom of the test potty, i. H. via the reference picture.
  • the image of a potty with sample provides a sample image.
  • the position of the sample image is determined on the ground.
  • a corresponding cutout in the reference image then provides the required brightness correction data for the sample image.
  • Brightness distribution in the reference image For each location at the bottom of the reference image of the test potty (eg, for each pixel) a correction factor is determined that reflects an additive or multiplicative deviation from a uniform brightness distribution. The correction of the sample image is then carried out by determining the position of the cutout on the ground, reading the corresponding correction factors for this layer from the
  • Brightness correction indication and applying the correction factors (either additive or multiplicative, depending on the design of the factors).
  • the brightness correction indication includes a correction factor (again either additive or multiplicative) which depends solely on the distance from the center of the bottom of the test potty. It is therefore sufficient for this embodiment to obtain in the reference measurement of step (d) only images covering only an area to the left of a radial coordinate from the center of the bottom of the test potty to its edge.
  • the brightness correction of the sample image is performed in step (f) in this embodiment by the radial coordinate of the pixels of the image, i. the distance from the center of the bottom of the potty is determined.
  • Fig. 2 shows five schematics similar to Fig. 1 to illustrate the importance of the interaction between the numerical aperture of the lighting and the
  • Fig. 3 is a schematic view similar to Fig. 1 illustrating a first
  • Fig. 4 is a sectional view through a microtiter plate and a cover plate for
  • Fig. 5 is a schematic representation of a microscope for imaging of samples that are on
  • FIG. 7 is a flow chart for explaining the general principle of correcting uneven illumination of the bottom of a potty
  • FIG. 8 is a schematic diagram for explaining the correction according to FIG. 7,
  • FIG. 9 is a flowchart for explaining another embodiment of the correction
  • FIG. 10 is a schematic diagram for explaining another embodiment of the correction.
  • Fig. 1 shows schematically a sectional view through a potty 1 of a microtiter plate, which is illuminated by an illumination beam 2 along an optical axis OA.
  • a sample not shown, for example, a cell culture.
  • a fluid 4 for example, a nutrient medium for cell culture, which forms a meniscus 5 on its surface.
  • the illumination beam 2 is incident in the representation of FIG. 1 from above.
  • the thus illuminated bottom 3 is received in transmitted light with a lens, the one
  • Collecting cone 6 has.
  • the sample in the potty 1 is typically in an aqueous environment, e.g. A simple buffer or nutrient medium to allow live cell observation.
  • This liquid 4 forms on its surface the meniscus 5, the
  • the radius of the meniscus' 5 depends on the type of liquid 4, wall material and coating of the potty 1, as well as the history of filling, so whether dry or already wet pots 1 were filled, whether they were stirred, etc. In most Cases, the liquid 4 moves along the potty wall slightly upwards, while the liquid level is lower in the potty center.
  • all illumination beams which are refracted through the meniscus 5 to larger angles than the limit angle defined by the objective NA do not enter the objective.
  • Fig. 1 is based on the idealized situation of a parallel incident
  • NA numerical aperture
  • Homogenizing element 7 is used, which dips into the liquid 4 at least with a part 7a.
  • the homogenizing element 7 is made of a material suitable for the
  • Illuminating beam 2 is transparent. Since the homogenizing element with the part 7a is below the level of the liquid 4, there is an end face 8 of the part 7a and the homogenizing element 7 in the liquid 4.
  • the end face 8 is flat in a first variant of the first embodiment and is perpendicular to the optical axis OA. The refraction effect through the meniscus 5 is thus turned off, and the
  • Illuminating beam is radiated onto the floor 3 in such a way that a uniform illumination takes place and, in particular, edge areas are illuminated as evenly as possible.
  • the homogenization element has at its part 7b, which is located outside the liquid 4, an upper side which is also perpendicular to the optical axis OA.
  • the homogenizing element is formed in the illustrated first embodiment as a generally straight cylinder.
  • Homogenizing elements 7 are combined in the form of a cover plate 12, which has a flat upper side 13.
  • the top 13 is associated with the illumination beam source 16, which emits the illumination beam 2 on the potty 1, the sample 14 is currently being microscopically.
  • the microscope not shown in FIG. 4 is designed such that each potty 1 is individually microscoped. It has one Drive, which shifts the microtiter plate 1 1 with lying cover plate 12 suitable and aligns the optical axis OA of lighting and imaging.
  • the homogenizing elements 7 may have the shape of a general cylinder, i. H. it does not necessarily have to be a circular cylinder. Rectangular cross sections are equally possible for the homogenizing element 7 as a realization of a general cylinder.
  • the end face 8 can be designed flat in one embodiment and lie at an angle between 80 and 90 degrees to the optical axis OA and thus at an angle of 0 to 10 degrees to the flat bottom 3. This facilitates the removal of air bubbles.
  • the end face 8 can be formed convexly curved.
  • the tangent angle of the curved face 8 is between 80 and 90 degrees to the optical axis OA and between 0 and 10 degrees to the plane of the bottom 3. This also facilitates the discharge of air bubbles to the side.
  • the homogenizing element 7 is not formed in one embodiment as a solid body, but as a hollow body or pot-shaped. For the equalization of the edge illumination of the bottom 3, it is only necessary that the end face 8 is located in the fluid 4.
  • Homogenizing element 7 can thus be designed either as a hollow body or cup-shaped.
  • the homogenizing element 7 or the cover plate 12 is in one
  • Embodiment of an autoclavable material for. As glass or an autoclavable plastic.
  • the cover plate 12 is designed as a disposable material.
  • 5 shows schematically a microscope for the high-resolution imaging of samples on 14 trays 3 of pots of a microtiter plate 11. The homogenizing element is not shown for the sake of simplicity. Already described elements and components are provided in Fig. 5 with the same reference numerals in order to avoid repetition of the description.
  • the microscope has an illumination beam source 16, which the
  • Illuminating beam 2 along the optical axis OA on the microtiter plate 1 1 outputs. This is so aligned to the optical axis OA that a potty that one to
  • Illuminating beam 2 is located. From an underside 15 of the microtiter plate 11, the sample 14 thus illuminated in transmitted light is imaged. This is located under the
  • Microtiter plate 1 1 a corresponding imaging beam path of the microscope, of the example, an objective 17 and a receiver 18 are shown.
  • an objective 17 and a receiver 18 are shown.
  • Imaging beam path is on the optical axis OA, i. an illumination beam path which emits the illumination beam 2 by means of the illumination beam source 16 lies on the same optical axis OA as the imaging beam path.
  • a controller 19 reads the data from the receiver 18. In order to be able to individually image the pots of the microtiter plate 11, this lies with its underside 15 on a sample table 20 which is adjustable via a drive 21 controlled by the control unit 19 in such a way that the individual pots of the microtiter plate 11 can be aligned with the optical axis OA ,
  • a reference image is generated. This is done on a test potty.
  • One of the pots of the microtiter plate 1 1 is formed as the test potty 22. It corresponds to the rest
  • FIG. 6 shows this by way of example in a diagram in which the intensity I of the illumination, ie the brightness on the floor 3, decreases as a function of the distance from the center of the potty 1.
  • the center of the potty for example, the location of the optical Correspond to axis OA.
  • the edge of the potty is located on a radius n. Due to the idealized circular cylindrical shape of the potty, only the radial coordinate r is of importance. At the edge of the potty, ie at n the illumination intensity is minimal, z. B. zero. The intensity I remains almost constant with increasing distance r from the optical axis OA over a longer time point and drops to the edge of the potty, ie at the radial coordinate n.
  • This intensity profile of the illumination in the exemplary illustrated example of FIG. 5, a transmitted light is, of course, affects the detection of a sample 14.
  • the intensity drop to the edge is referred to in the specialist literature as "shading.” It is not generated by the beam path of the microscope, but by the sample vessel.To correct a ray-related Shading all known in the literature methods in question, which therefore not here again.
  • the sample vessel creates a sample vessel based shading, it may be removed from the sample image in the ways described below In all of these methods (and not as described below) the beampath related shading is preferably and optionally first removed, so that only the sample vessel-based remains.
  • test potty 22 is placed in the beam path of the microscope. There is a
  • a reference receptacle 24 of the bottom 3 is through the plurality of individual images 23a, for example in the form of a tile receptacle.
  • the brightness distribution in the reference image 24 is determined. This provides a brightness correction indication because the deviation from ideal homogeneous illumination can be easily determined. The deviations depend on the location on the bottom 3 of the potty 22.
  • Steps S1 and S2 serve to determine a brightness correction indication. In the embodiment of FIG. 7, they are preceded by further steps S3 and S4, of which S3 is used for microscoping the sample (s) and step S4 is a brightness correction. However, steps S1 and S2 do not necessarily have to be performed before step S3. It is quite possible to execute the generation of the brightness correction specification by the steps S1 and S2 and the brightness correction in step S4 also at a later time and possibly even only when it has been found that the image of the samples 14 is not sufficient without such a correction is possible. In step S3, a potty 1 is shown, on the bottom 3 sample 14 is located.
  • a correction is made using the brightness correction indication; Step S4 thus assumes that steps S1 and S2 have been carried out.
  • the correction takes place in that it is determined where the sample image 23b was located at the bottom 3 in step S3.
  • the brightness correction information that applies to this location of the bottom 3 is determined, and the sample image 23b generated in step S3 is improved to a corrected sample image 23c.
  • the improved sample image 23c contains a homogenized illumination of the bottom 3, which is adjusted for influences of the sample vessel-based shading.
  • the complete sample vessel - for microtiter plates z. B. a potty 1 - scanned, z. B. in the form of a tile shot with individual images 23a.
  • a test potty 22 without sample 14 is used. If it is in the
  • Sample vessel is a vessel in which the sample is in a liquid medium, preferably the medium is also in the test potty 22 before.
  • Reference image 24 thus contains the sample vessel based shading.
  • elements of the sample vessel-based shading can be detected in the sample image 23b. Is in the sample image 23b z. B. a portion of the edge of the potty 1 visible, the current object associated with a corresponding section 25 of the reference image 24 and the shading can be calculated from the sample image 23b out.
  • the simplest method is to divide the intensity values of the pixels of the sample image 23b by the intensity values of the pixels of the matching section 25 of the reference image 24, and then to renormalize the result. This calculation is also used in many methods for beam path based shading correction.
  • the fundamental difference here is that the appropriate reference image 24 is only determined from a larger overview image as a function of the observation position. In this way, a corrected sample image 23c is obtained, which is corrected with respect to the sample image 23b by influences of the sample vessel-based shading.
  • the case may arise that a clear localization of the position of the sample image 23b on the bottom 3 and thus the choice of the cutout 25 is not clearly possible. If one recognizes, for example no unique vial edge in the sample image 23b, because the sample field is no longer detecting the edge, the sample vial-based shading may still be pronounced without it being apparent which is the matching portion of the reference image 24 used for the shading correction should. But even in this case, a correction is possible if the drive 21 of the sample table 20 has a position feedback of the sample positioning. This allows to store the xy coordinates of each point at which a frame 23a was taken for the reference frame 24, i. the xy positions of each point in the reference image 24 are known.
  • the matching section 25 can be determined from the reference image 24 and the correction can be carried out as described above.
  • a step S1.1 the test potty 22 is searched for the center point (xo, yo). Subsequently, the reference image 24 of the bottom 3 of the test potty 22, z. B. won by a tile recording.
  • step S3 the brightness distribution of the reference image 24 in a
  • Brightness correction indication for example, the deviation from a mean brightness value in the form of an additive or multiplicative correction factor converted.
  • Brightness correction specification depends on the coordinate (x, y) in reference image 24.
  • the step S2 provides the recording of the sample image 23b at certain coordinates (x, y).
  • a corresponding correction specification for the determined section 25 in the brightness correction specification is determined for this distance vector r.
  • step S4.3 provides the correction of the sample vessel based shading by applying the brightness correction indication for the region defined by the distance vector r with respect to its center.
  • the brightness correction indication may be either the shape of the reference image 24 or the shape of a correction value image calculated therefrom that has a uniform brightness when linked to the reference image (either additive or multiplicative). Do you see the
  • Brightness correction indication as a reference image 24 before the determination of the correction factors from the brightness distribution of the corresponding section 25, which was extracted from the reference image 24, in the correction step S4 must follow.
  • the brightness correction specification already contains the correction factors, that is, if the determination of the correction factors has already been carried out on the reference image 24, this need not be repeated in step S4.
  • the terms reference image 24 and brightness correction specification are thus either identical (first option), or the reference image 24 represents a precursor of the brightness correction specification (second option) the conversion is a simple mathematical operation (eg determining the multiplicative or additive deviation from a mean, etc.).
  • FIG. 10 shows the procedure in the embodiment of FIG. 9.
  • the reference image 24 is shown as a brightness correction specification.
  • FIG. 10 shows the sequence of FIG. 9 again with reference to the reference image 24.
  • the center 26 is known.
  • the distance vector r is known. It designates the center of the sample image 23b.
  • the reference image 24 is now searched for the cutout 25 having the same distance vector r to the center and the same dimensions as the sample image 23b.
  • the section 25 is then the section from the reference image (or the
  • Brightness correction indication to be used for the correction.
  • the pots are circular, it may be sufficient in a simplified embodiment to determine only the amount of the distance vector r. For an improvement of this
  • the amount of the distance vector is determined not only for the center but for each pixel.
  • Brightness correction indication) in absolute pixel coordinates of the reference image 24 indicate, these pixel coordinates z. B. be obtained by evaluating the position feedback of the drive 21 of the sample table 20. For a sample image 23b that is to be corrected, then only the location coordinates of the pixels in the sample image 23b are determined, these location information referring to the reference image 24 (or the brightness correction specification). The location information then makes it possible to read from the reference image 24 (or the brightness correction specification) the corresponding correction factors for each pixel and apply.
  • the reference image 24 does not have to be present as a composite image. It is also sufficient to store the corresponding individual images 23a and to calculate the appropriate correction image for the sample image 23b from them as required.
  • the process shown does not necessarily have to be processed in this order.
  • the reference image 24 can only be recorded later in order to undertake the shading correction of the sample images 23b at a later time. So far, the case has been described in which only one part of the potty is imaged onto the detector 18 and therefore a plurality of individual images 23a are necessary for complete generation of the reference image 24. With sufficiently weakly magnifying lenses and sufficiently small sample vessels or pots 1, however, the entire bottom 3 can also be imaged with a single image; a tile recording is no longer necessary. Otherwise, the procedure described above remains valid.
  • the correction value k (r) is applied to the sample image 23b for each pixel directly, or a complete reference image 24 is first generated, with which the sample image is then calculated, does not matter. In both variants, the sample vessel-based shading can be removed from the sample image.
  • the reference image 24 may consist of a large number of individual images 23a, the recording of which requires a great deal of time and the storage or processing of which much storage space is required.
  • different lenses will show different degrees of sample-dependent shading. This can be well illustrated by means of a potty 1 of a microtiter plate 1 1.
  • the liquid meniscus 5 in the potty 1 ensures that incident rays are refracted towards higher angles, in particular those that pass through the bottom 3 in the vicinity of the potty edge.
  • a lens 17 with a weak NA can often no longer use this light, the potty edge appears much darker than the center.

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Abstract

Es wird beschrieben ein Verfahren zur mikroskopischen Abbildung von Proben (14), die in einer Mikrotiterplatte (11), welche eine Vielzahl von mit Fluid (4) befüllten Töpfchen (1) aufweist, an Böden (3) der Töpfchen (1) anhaften, wobei die Töpfchen (1) nacheinander von einer den Böden (3) gegenüberliegenden Oberseite her aus einer Durchlichtbeleuchtungsquelle (16) längs einer optischen Achse (OA) mit Beleuchtungsstrahlung (2) beleuchtet und die derart von der Oberseite beleuchteten Böden (3) der Töpfchen (1) von der Unterseite (15) her einzeln vergrößernd abgebildet werden, wobei zur Verbesserung einer Randausleuchtung des Bodens (3) bei jedem beleuchteten Töpfchen (1) zwischen dem Töpfchen (1) und der Durchlichtbeleuchtungsquelle (16) ein Homogenisierungselement (7) angeordnet wird, das von der Durchlichtbeleuchtungsquelle (16) beleuchtet wird, für die Beleuchtungsstrahlung (2) transparent ist, und einen in das Töpfchen (1) und dort in das Fluid (4) eintauchenden Teil (7a) aufweist, welcher eine im Fluid (4) liegende Stirnfläche (8) hat.

Description

VERFAHREN ZUR MIKROSKOPISCHEN ABBILDING VON PROBEN IN TÖPFCHEN EINER
MIKROTITERPLATTE
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur mikroskopischen Abbildung von Proben, die in einer Mikrottterpiatte, welche eine Vielzahl von mit Fluid befüllten Töpfchen aufweist, an Böden der Töpfchen anhaften, wobei die Töpfchen nacheinander von einer den Böden gegenüberliegenden Oberseite her aus einer Durchlichtbeleuchtungsquelle längs einer optischen Achse beleuchtet und die derart von der Oberseite beleuchteten Böden der Töpfchen von der Unterseite her einzeln vergrößernd abgebildet werden.
In den Biowissenschaften spielt die Mikroskopie lebender Zellen eine wichtige Rolle. Diese werden häufig in Mikrotiterplatten kultiviert. Die Zellen befinden sich am Gefäßboden und sind von einem Nährmedium umgeben. Mikroskopiert werden sie in der Regel mit einem inversen Mikroskop; bei diesem befindet sich das Objektiv unterhalt des Probengefäßbodens. Die Beleuchtung der Probe kann über Auflicht oder Durchlicht erfolgen. Für Durchlichtbilder wird eine Leuchte oberhalb des Probengefäßes angebracht. Da aber biologische Zellen nur wenig absorbierende Bestandteile enthalten, sind Hellfeld-Durchlichtbilder typischerweise nur sehr schwach kontrastiert. Mit Hilfe diverser Durchlichtkontrastverfahren wie z. B. Phasenkontrast, DIC u. a. lässt sich der geringe Brechzahlunterschied der einzelnen Zellbestandteile zueinander und zum umgebenden Medium in einen Intensitätsunterschied umwandeln, der dann ein kontrastiertes Durchlichtbild liefert.
Die Erfindung befasst sich also mit der Durchlicht-Mikroskopie von Proben, die am Boden einer Mikrotiterplatte anhaften. Die Böden werden im Durchlicht beleuchtet und hochauflösend in einem Mikroskop abgebildet. Diese Art der Mikroskopie unterscheidet sich von der im Stand der Technik in anderen Anwendungen gebräuchlichen Abbildung einer gesamten Mikrotiterplatte, wie es beispielsweise in der DE 10200541 A1 erfolgt. Werden die Böden einzeln oder in kleinen Gruppen vergrößernd im Durchlicht abgebildet, sind die Anforderungen an die Qualität der Durchlichtbeleuchtung um ein Vielfaches höher. Dies gilt insbesondere hinsichtlich der genannten Durchlichtkontrastverfahren.
Das Gebiet der Erfindung ist auch abzugrenzen gegen sogenannte Fluoreszenzreader, die überprüfen ob bzw. wie stark die Flüssigkeit in einem Töpfchen einer Mikrotiterplatte fluoresziert. Auch hier erfolgt in der Regel eine Erfassung aller Töpfchen einer Mikrotiterplatte gleichzeitig. Zudem ist die Qualität der Beleuchtung der Böden bei diesen Anwendungen irrelevant. Die US 6074614 befasst sich mit einem solchen Einsatz von Mikrotiterplatten und sieht eine Abdeckplatte vor, welche passend zur Mikrotiterplatte eine Vielzahl von zylindrischen Vorsprüngen hat, die in die potentiell fluoreszierende Flüssigkeit der Mikrotiterplatte eintauchen. Das Ziel ist es, bei der Fluoreszenzanregung und -auslesung eine möglichst gleichmäßige Weglänge der Strahlung durch die Töpfchen der Mikrotiterplatte zu gewährleisten. Die Frage der Beleuchtung des Bodens einer Mikrotiterplatte spielt keine Rolle.
Eine Voraussetzung für qualitativ gute Durchlichtbilder, unabhängig davon welches
Kontrastverfahren verwendet wird, ist eine möglichst homogene Beleuchtung über das ganze vom Objektiv erfasste Objektfeld, d. h. des ganzen Bodens. Üblicherweise wird diese über eine Köhlersche Beleuchtung realisiert, die garantiert, dass alle Punkte des Objektfeldes nicht nur in etwa mit derselben Intensität beleuchtet werden, sondern auch mit einem annähernd gleichen Winkelspektrum, welches durch die numerische Apertur (NA) der Beleuchtung beschrieben wird. Der klassischen Lehre zufolge sollte diese NA etwas kleiner sein als die NA des
Objektives bzw. der Detektion. Diese Bedingungen lassen sich für Proben, die sich zwischen einem Objektträger und einem Deckglas befinden, sowie für Proben in Petrischalen meist problemlos erfüllen. Kleine Probengefäße, wie z. B. Mikrotiterplatten stellen in dieser Hinsicht jedoch ein Problem dar. Im Folgenden werden als Beispiel für kleine Probengefäße Mikrotiterplatten herangezogen. Diese weisen z. B. 96 einzelne Töpfchen auf. Die Töpfchen sind typischerweise ca. 1 1 mm hoch und haben einen Durchmesser von etwa 7 mm. Damit beschneidet der obere Rand des Töpfchens den Lichtkegel der Durchlichtbeleuchtung, der einen bestimmten Punkt des Töpfchenbodens erreicht und nach dessen Passieren vom Objektiv aufgefangen wird. Je nachdem, ob dieser Bodenpunkt im Töpfchenzentrum oder eher am Rand liegt, ist auch der nutzbare Lichtkegel ein anderer, d. h. jeder Punkt des Töpfchenbodens "sieht" einen anderen Beleuchtungs-NA-Bereich. Sofern die Objektiv-NA groß genug ist, alle unterschiedlichen Beleuchtungskegel aufzunehmen und die Beleuchtung in jedem dieser Kegel eine annähernd gleiche Intensität zur Verfügung stellt, bleibt die Ausleuchtung des Töpfchenbodens homogen, obwohl der Töpfchenrand das Beleuchtungslicht beschneidet.
Ein Ansatz, den Effekt des Flüssigkeitsmeniskus' zu kompensieren, ist in US 623891 1 beschrieben. Dort wird oberhalb der Mikrotiterplatte ein Linsenarray eingebracht, welches dafür sorgt, dass sich das Bild der Beleuchtungspupille nicht lateral zum Bild der Detektionspupille verschiebt. Unter dieser Voraussetzung lässt sich auch in Mikrotiterplatten ein klassischer Phasenkontrast realisieren. Dieses Linsenarray lässt sich auch so einbringen, dass die Linsenwölbung in Richtung Probe zeigt bzw. die Linse selbst teilweise innerhalb des Töpfchens liegt. Diese Ausführung verbessert die Randausleuchtung jedoch nur unter sehr speziellen Umständen. Ein Abweichen von diesen Bedingungen führt sogar zu einer schlechteren Ausleuchtung, als ohne einen solchen Linsenarray. Bei Dunkelfeld-Streulichtuntersuchungen ist der Meniskus störend. Dieses Problem wird in US 2007171417 dadurch gelöst, dass auf die Flüssigkeit, die die Probe enthält, eine weitere Flüssigkeit, wie z. B. ein Öl gegeben wird, die den Meniskus in seiner Stärke reduziert.
Zusätzlich kann auch eine Platte aufgelegt werden, die vorzugsweise das Beleuchtungslicht absorbiert, um Reflexe zu vermindern. Solche Platten sind für das hier vorgestellte Gebiet nicht zu gebrauchen, da sie die Durchlichtausleuchtung stören würden, weshalb keine
absorbierenden Schichten in den Strahlengang gebracht werden können.
In WO 02087763 ist ein Deckel für Mikrotiterplatten offenbart, der flach oder mit Auswölbungen ausgebildet sein kann und dazu dient, in verschiedenen Töpfchen einer Mikrotiterplatte gleiche Bedingungen zu schaffen, so dass Messungen, wie z. B. das Messen eines
Fluoreszenzspektrums einer fluoreszierenden Lösung, in unterschiedlichen Töpfchen miteinander vergleichbar sind. Diese Anmeldung hat keinen Bezug zur Mikroskopie,
Ausleuchtungen und deren Optimierung spielen keine Rolle. In US 2010197004 dient ein Deckel für Mikrotiterplatten mit Auswölbungen dazu, bei einer Flüssigkeit mit homogen darin verteilten Zellen dafür zu sorgen, dass nach einer
Sedimentierung dieser Zellen am Ende alle Teile des Töpfchenbodens dieselbe Zelldichte aufweisen. Der Deckel verhindert, dass sich nahe des Randes mehr Zellen ansammeln als im Zentrum. Dieser Deckel dient also der Probenpräparierung, nicht der Beobachtung.
Keine der Veröffentlichungen im Stand der Technik, die Deckel für Mikrotiterplatten mit zylindrischem Auswölbungen beschreibt, befasst sich mit der Frage der Durchlichtbeieuchtung, d. h. mit einem Verfahren zum vergrößerten Abbilden von Proben am Boden eines durchlichtbeleuchteten Töpfchens einer Mikrotiterplatte. Da die zitierten Druckschriften und insbesondere auch die US 6074614 andere Mikroskopieverfahren betreffen, sind die dort zu behebenden Probleme andere, als bei der vorliegenden Erfindung.
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur mikroskopischen Abbildung von Proben, die in einer Mikrotiterplatte, welche eine Vielzahl von mit Fluid befüllten Töpfchen aufweist, an Böden der Töpfchen anhaften, wobei die Töpfchen nacheinander von einer den Böden gegenüberliegenden Oberseite her aus einer Durchlichtbeleuchtungsquelle längs einer optischen Achse beleuchtet und die derart von der Oberseite beleuchteten Böden der Töpfchen von der Unterseite her einzeln vergrößernd abgebildet werden, anzugeben, bei dem die Beleuchtung des Bodens auch ohne Verwendung von Abbildungsoptiken mit hoher numerischer Apertur gleichmäßig ist.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst mit einem Verfahren zur mikroskopischen
Abbildung von Proben, die in einer Mikrotiterplatte, welche eine Vielzahl von mit Fluid befüllten Töpfchen aufweist, an Böden der Töpfchen anhaften, wobei die Töpfchen nacheinander von einer den Böden gegenüberliegenden Oberseite her aus einer Durchlichtbeleuchtungsquelle längs einer optischen Achse beleuchtet und die derart von der Oberseite beleuchteten Böden der Töpfchen von der Unterseite her einzeln vergrößernd abgebildet werden, bei dem zur Verbesserung einer Randausleuchtung des Bodens bei jedem beleuchteten Töpfchen zwischen dem Töpfchen und der Durchlichtbeleuchtungsquelle ein Homogenisierungselement angeordnet wird, das von der Durchlichtbeleuchtungsquelle beleuchtet wird und einen in das Töpfchen und dort in das Fluid eintauchenden Teil aufweist, welcher eine im Fluid liegende Stirnfläche hat.
Erfindungsgemäß wird die Randausleuchtung am Boden verbessert, indem ein Eingriff innerhalb des Töpfchens erfolgt, der den Meniskus im optisch relevanten Bereich zerstört, indem das Homogenisierungselement zwischen der Durchlichtbeleuchtungsquelle und dem Töpfchen angeordnet wird, das einen in das Fluid eintauchenden Teil aufweist, welcher eine im Fluid liegende Stirnfläche hat.
Als zweckmäßig erweisen sich dazu z. B. transparente Zylinder, die in die Töpfchen eintauchen. Diese können z. B. aus Glas oder aus Kunststoff gefertigt sein. Verfügen sie sowohl am oberen als auch am unteren Ende über eine ebene, zur optischen Achse senkrechte Fläche, wird der Meniskuseffekt unterbunden und ein paralleles Beleuchtungsstrahlenbündel bleibt parallel, nachdem es das Töpfchen passiert hat.
Um möglichst viele Töpfchen auf diese Art ausleuchten zu können, kann die Erfindung als einfacher Deckel für eine Mikrotiterplatte ausgeführt sein, bei dem an der Position jedes Töpfchens ein Zylinder ausgebildet ist, der in das Töpfchen hineinragt.
Dieser Deckel kann auf den Töpfchenrändern der Mikrotiterplatte aufliegen oder beabstandet sein. Dazu können z. B. an den Ecken des Deckels Stützelemente angebracht sein, die den Deckel relativ zur oberen Fläche der Mikrotiterplatte halten oder relativ zu ihrer Aufstellfläche. Mikrotiterplatten gibt es mit unterschiedlichen Töpfchenzahlen, z. B. 24, 96 oder 384 Töpfchen. Bei Platten mit 96 Töpfchen existieren ebenso zwei Varianten, die Standardvariante mit einem Töpfchendurchmesser von etwa 7 mm, sowie eine mit halbem Volumen bei einem
Töpfchendurchmesser von etwa 5 mm. Für alle diese Varianten lässt sich ein Deckel nach obiger Beschreibung mit in die Flüssigkeit ragenden Zylindern konstruieren. Dabei muss es sich nicht um Kreiszylinder handeln. Insbesondere die Töpfchen in Mikrotiterplatten mit 384
Vertiefungen sind meist nicht rund, sondern quadratisch mit abgerundeten Ecken ausgeführt. Eine entsprechende Form können auch die eintauchenden Elemente des Deckels haben. Auch muss der Deckel nicht die gesamte Platte abdecken. Auch Deckel, die nur Teile der
Mikrotiterplatte bedecken, beispielsweise dessen Zentralbereich oder nur jedes n-te Töpfchen, sind im Sinne dieser Erfindung möglich. Statt Zylindern können auch andere geometrische Formen ausgebildet sein, z. B. Kegel oder Kegelstümpfe und dergleichen. Der Einfachheit halber wird jedoch im Weiteren zum Teil nur von Zylindern gesprochen, ohne dass dies einschränkend zu verstehen ist.
Da die Flüssigkeiten in Mikrotiterplatten häufig Nährlösungen sind, in denen sich das
Probenmaterial befindet, ist es vorteilhaft, wenn das Homogenisierungselement sich gut reinigen lässt. Durch die hervorstehenden Zylinder können viele schwer zugängliche Bereiche entstehen. Zur Erleichterung der Reinigung können Ecken und Kanten abgerundet ausgeführt werden. Üblicherweise geschieht eine Reinigung bzw. Sterilisierung von Probengefäßen mittels Autoklavieren. Deshalb ist es vorteilhaft, wenn auch der erfindungsgemäße Deckel aus Materialien besteht, die autoklavierbar sind, also z. B. Glas oder autoklavierbarer Kunststoff. Mikrotiterplatten sind i. d. R. als Einweggefäße konzipiert. Analog dazu ist auch die Ausführung des beschriebenen Deckels als Einweg- bzw. Verbrauchsmaterial denkbar.
Wenn der Zylinder in das Töpfchen einer Mikrotiterplatte eingesetzt wird, kann es passieren, dass unterhalb des Zylinders eine Luftblase verbleibt. Diese stört die Homogenität der
Ausleuchtung empfindlich. Sofern nur ein einziger Zylinder benutzt wird, kann dieses Problem durch wiederholtes Einsetzen behoben werden. Falls jedoch ein Deckel mit vielen Zylindern zum Einsatz kommt, führt eine Wiederholung nicht zum Ziel, da sich jeweils unter einigen Zylindern Luftblasen finden werden. Um dieses Problem zu beseitigen, stehen mehrere Möglichkeiten zur Verfügung. Zum einen kann die Unterseite der Zylinder leicht gewölbt oder abgeschrägt ausgeführt werden, so dass Luftblasen zur Seite geleitet werden und dann zwischen Zylinder und Töpfchenwand entweichen können. Hierbei ist jedoch darauf zu achten, dass die Wölbung bzw. Schräge nicht zu stark ist und erneut ein Meniskus bzw. eine Brechkante an der Grenzfläche Zylinder- Flüssigkeit erzeugt wird, der sich negativ auf die Ausleuchtung auswirkt, sofern das
Zylindermaterial nicht einen der Flüssigkeit ähnlichen Brechungsindex besitzt.
Zum anderen kann der Zylinder einen kleineren Durchmesser als das Töpfchen aufweisen, so dass zwischen Zylinder und Töpfchenrand ausreichend Platz zur Verfügung steht, damit Luftblasen entweichen können. Allerdings sollte der Zylinderdurchmesser auch nicht zu klein gewählt sein, da sonst nur im Töpfchenzentrum der Meniskus zerstört wird, während er sich rund um den Zylinder erneut ausbildet. Bei einem Töpfchendurchmesser von 7 mm eignen sich Zylinder mit einem Durchmesser von 5 mm. Beim Einsetzen entstehen fast nie Luftblasen und die Ausleuchtung ist bis zum Töpfchenrand sehr gut. Bei Zylindern mit 6 mm Durchmesser entstehen fast immer Luftblasen, die nicht entweichen können und bei Zylindern mit einem Durchmesser von 4 mm oder kleiner verschlechtert sich die Ausleuchtung substanziell aufgrund des Meniskus' im Bereich zwischen Zylinder und Töpfchenwand. Da diese Zylinder, wie bereits beschrieben, einen kleineren Durchmesser haben sollten als die Töpfchen selbst, bildet sich zwischen Zylinder und Töpfchenrand ein kleiner Meniskus heraus. Durch geschickte Wahl des Zylinderdurchmessers kann dessen Effekt auf die Ausleuchtung zwar minimiert werden, er äußert sich aber dennoch in einer Ringstruktur im Bild. Die
Intensitätsmodulation dieser Ringe ist jedoch deutlich geringer als der Intensitätsrandabfall ohne Verwendung des Deckels. Steht der Zylinder mittig zum Töpfchen sind diese Ringe konzentrisch zum Töpfchen. Steht der Zylinder leicht außermittig, sind die Ringe ebenfalls außermittig. Wenn die Zylinder nach jedem Einsetzen gleich zu den Töpfchen stehen, ist auch die Ringstruktur relativ zu den Töpfchen immer gleich. Um zu verhindern, dass sich die Zylinder relativ zu den Töpfchen verschieben, kann der Deckel z. B. passgenau zu den Außenmaßen der Mikrotiterplatte gefertigt werden. Alternativ können auch Arretier- oder
Positioniermöglichkeiten seitlich am Deckelrand vorgesehen werden, mit deren Hilfe der Deckel in eine definierte Position zur Mikrotiterplatte gebracht wird. Das ermöglicht dann das
Herausrechnen dieser Ringe mittels einer geeigneten Software. Die Ringstruktur ist in der Regel recht unscharf, da sie aus Ebenen herrührt, die relativ weit von der Beobachtungsebene entfernt liegen. Das ermöglicht es in vielen Fällen, die Ringstruktur mittels einer Fourieranalyse aus dem Bild herauszurechnen. Dazu wird auf das Bild ein Hochpass angewendet, der niedrige Bildfrequenzen herausfiltert. Insbesondere wenn die Probenstrukturen sehr kleinteilig sind, also hochfrequente Anteile aufweisen, ist dieser Weg vorteilhaft. Wie bereits erwähnt, ist es bevorzugt, dass der in das Fluid eintauchende Teil die Form eines allgemeinen geraden Zylinders hat.
Luftblasen, die an der Stirnfläche des in das Fluid eintauchenden Teils anhaften, stören die Beleuchtung erheblich. Es ist deshalb bevorzugt, dass die Stirnfläche zur optischen Achse einen Neigungswinkel oder Tangentenwinkel hat, der zwischen 80 und 90 Grad liegt und zu verhindern, dass Luftblasen die Randausleuchtung des Bodens wieder verschlechtern. Bei einer gekrümmten Stirnfläche ist es zu bevorzugen, diese so auszugestalten, dass sie einen Tangentenwinkel hat, der zwischen 80° und 90° liegt, d. h. dass kein kleinerer Tangentenwinkel im optisch relevanten Bereich auftritt. Eine Anfasung oder Abrundung am Rand schließt das jedoch nicht aus.
Die Randausleuchtung ist besonders gut, wenn die Form der Stirnfläche in Draufsicht längs der optischen Achse der Form des Querschnitts des Töpfchens gleicht.
Ein Spalt von mindestens 1 mm und maximal 3 mm zwischen Rand jeder Stirnfläche und der Innenwand des zugeordneten Töpfchens erlaubt es, dass Luftblasen entweichen. Zugleich wird die Randausleuchtung davon nicht störend beeinträchtigt.
Eine Weiterbildung sieht beim Verfahren zur mikroskopischen Abbildung einer Probe, die in einem Töpfchen am Boden des Töpfchens anhaftet, die folgenden Schritte vor:
(a) das Töpfchen wird mit Beleuchtungsstrahlung beleuchtet und
(b) der beleuchtete Boden des Töpfchens wird von der Unterseite der Mikrotiterplatte vergrößernd abgebildet und ein Bild des beleuchteten Bodens aufgenommen, wobei eine töpfchenverursachte Ungleichmäßigkeit der Beleuchtung des Bodens ausgeglichen wird, indem
(c) ein probenloses Test-Töpfchen bereitgestellt wird, das bis auf die fehlende Probe dem zu mikroskopierenden Töpfchen entspricht,
(d) an dem Test-Töpfchen wird eine Referenzmessung mittels der Schritte (a) und (b) durchgeführt, wobei ein Referenzbild aufgenommen wird, das den gesamten beleuchteten
Boden zeigt,
(e) anhand des Referenzbildes wird eine Helligkeitskorrekturangabe ermittelt, wobei die Helligkeitskorrekturangabe eine Helligkeitsschwankung als Funktion des Ortes auf dem Boden des Test-Töpfchens angibt,
(f) das Bild des Bodens des probenenthaltenden Töpfchens wird mittels der
Helligkeitskorrekturangabe korrigiert, wobei die Lage des Bildes am Boden ermittelt und der zu dieser Lage gehörende Wert der Helligkeitskorrekturangabe verwendet wird.
Die Weiterbildung geht von folgender Erkenntnis aus: Ein probengefäßbezogenes Shading, welches fest mit dem Bezugssystem des Probengefäßes verbunden ist, wird von den beschriebenen Verfahren nicht erkannt und kann folglich nicht korrigiert werden.
Ein probengefäßbezogenes Shading liegt dann vor, wenn die Struktur des Probengefäßes selbst zu einem Shading führt. Das tritt z. B. bei kleinen Gefäßen auf ( ikrotiterplatten), wie weiter unten beschrieben wird. Wird die Probe bewegt, wandert dieses Shading mit. Es ist also immer an derselben Stelle eines probengefäßbezogenen Bezugssystems, kann aber keiner festen Position eines strahlengangbezogenen Bezugssystems zugeordnet werden.
Helligkeitsgradienten treten insbesondere bei der Durchlichtbeleuchtung von Mikrotiterplatten auf. Mikrotiterplatten sind Probengefäße, die insbesondere in der Lebendzellbeobachtung eingesetzt werden. Dabei handelt es sich um Platten, die mit einer definierten Anzahl von Töpfchen, z. B. 24,96 oder 384, in regelmäßigen Abständen ausgestattet sind. In jedes dieser Töpfchen kann eine Probe eingebracht werden, z. B. Zellen oder Embryonen. Für die mikroskopische Beobachtung sind die Töpfchen mit einem transparenten Boden aus z. B. Polystyrol oder Glas versehen. Die optischen Eigenschaften der Töpfchen stören die
Ausleuchtung im Durchlicht erheblich. Im Folgenden wird dieser Effekt anhand einer
Mikrotiterplatte erläutert, deren 96 Töpfchen eine Höhe von 1 1 mm und einen Durchmesser von 7 mm besitzen.
Der obere Rand des Töpfchens beschneidet den Lichtkegel der Durchlichtbeleuchtung, der einen bestimmten Punkt des Töpfchenbodens erreicht und der nach Passieren des Bodens vom Objektiv aufgefangen wird. Je nachdem, ob dieser Bodenpunkt im Töpfchenzentrum oder eher am Rand liegt, ist auch der nutzbare Lichtkegel ein anderer, d. h. jeder Punkt des
Töpfchenbodens wird mit einer unterschiedlichen numerischen Apertur beleuchtet. Das kann bereits zu einem probengefäßabhängigen Shading führen, dessen Effekt umso größer ist, je stärker der Beleuchtungslichtkegel vom Töpfchen beschnitten wird und je ungleichmäßiger die Beleuchtungsintensität auf die verschiedenen Beleuchtungswinkel verteilt ist. Sofern hingegen die numerische Apertur des Objektivs groß genug ist, alle unterschiedlichen Beleuchtungskegel aufzunehmen und die Beleuchtung in jedem dieser Kegel eine annähernd gleiche Intensität zur Verfügung stellt, bleibt die Ausleuchtung des Töpfchenbodens homogen, obwohl der
Töpfchenrand das Beleuchtungslicht beschneidet.
Das wässrige Medium, in dem sich die Probe befindet, bildet aber an seiner Oberfläche einen Meniskus aus. Die Grenzfläche zwischen Luft und Medium ist also gewölbt. Der Radius des
Meniskus' hängt von der Art der Flüssigkeit, von Wandmaterial und Beschichtung der Töpfchen, sowie vom Befüllungsverfahren ab, also ob trockene oder bereits feuchte Töpfchen befüllt wurden, ob sie umgerührt wurden etc. In den meisten Fällen zieht sich die Flüssigkeit entlang der Töpfchenwand etwas nach oben, während der Flüssigkeitsspiegel in der Töpfchenmitte tiefer liegt.
Das führt dazu, dass ein paralleles einfallendes Strahlenbündel nach Passieren des Meniskus' divergiert. Diese Divergenz ist umso ausgeprägter, je kleiner der Radius des Meniskus' ausgebildet ist. Bei Objektiven mit einer hohen NA stellt das kein Problem dar, weil auch die divergierenden Strahlen aufgefangen werden können. Zahlreiche Applikationen erfordern jedoch schwach vergrößernde Objektive, die ein großes Feld abbilden und somit eine
Übersichtsaufnahme der Probe ermöglichen. So kann zum Beispiel mit nur einem Bild eines 2,5x-vergrößernden Objektivs fast ein komplettes Töpfchen einer Mikrotiterplatte mit 96 Töpfchen abgebildet werden.
Typischerweise verfügen jedoch schwach vergrößernde Objektive nur über eine geringe NA, z. B. 0,08 oder 0,12. Die NA (NA = n*sin(a)) beschreibt den maximalen Winkel a, den ein Strahl mit der optischen Achse bilden kann, um noch vom Objektiv zur Abbildung gebracht zu werden. Hierbei ist n der Brechungsindex des Mediums zwischen Objektiv und Probe. Bei schwach vergrößernden Objektiven ist dies in der Regel Luft, also n - 1. Alle Beleuchtungsstrahlen, die durch den Meniskus zu größeren Winkeln hin gebrochen werden als dem durch die Objektiv-NA festgelegten Grenzwinkel, gelangen somit nicht in das Objektiv. Selbst wenn also
Beleuchtungslicht jeden Teil des Töpfchenbodens erreicht, erzeugt der Meniskus-Effekt ein inhomogen ausgeleuchtetes Bild, da das Licht aus der Probe in Abhängigkeit vom
Eintrittswinkel nicht zu gleichen Anteilen ins Objektiv gelangt. Das aufgenommene Bild weist somit ein helles Töpfchenzentrum und dunkle Randbereiche auf. Es entsteht also ein probengefäßbasiertes Shading, welches von den bekannten Verfahren zur Shading-Korrektur nicht behoben werden kann.
Die Erfindung verwendet eine Helligkeitskorrekturangabe, die eine Funktion des Ortes auf dem Boden des Töpfchens bezogen ist. Der Begriff „Töpfchen" wird dabei zur Bezeichnung eines Probengefäßes verwendet. Es kann sich sowohl um ein einzelnes Gefäß handeln, als auch um ein Töpfchen einer Mikrotiterplatte. Soweit in der nachfolgenden Beschreibung auf den Singular („Töpfchen") bezuggenommen wird, ist damit sowohl die Verwendung eines einzelnen Gefäßes als auch der Bezug auf einzelnes Töpfchen einer Mikrotiterplatte gemeint. Das Test-Töpfchen entspricht dem Gefäß, welches die Probe enthält, bis auf den Unterschied, dass im Test-Töpfchen keine Probe vorhanden ist. Ist die am Boden des Töpfchens anhaftende Probe in einer Nährlösung, d.h. befindet sich im Töpfchen zusätzlich eine Flüssigkeit, ist es bevorzugt, diese Flüssigkeit auch im Test-Töpfchen vorzusehen. Letztlich ist es Aufgabe des Test-Töpfchens genau diejenigen optischen Bedingungen, d.h. diejenige Beeinflussung der Beleuchtungsstrahlung herzustellen, die auch im Töpfchen herrscht - jedoch ohne Probe.
Dadurch kann die Helligkeitskorrekturangabe, die anhand des Test-Töpfchens ermittelt wurde, eine Funktion des Ortes am Boden des Töpfchens ist, anhand des Test-Töpfchens bestimmt werden und dann zur Korrektur einer ungleichmäßigen Helligkeitsverteilung bei der Abbildung der Probe im Töpfchen verwendet werden.
Die Helligkeitskorrekturangabe kann dabei auf verschiedene Weise bereitgestellt werden : In einer ersten Ausführungsform wird der Boden des Test-Töpfchens durch mehrere
Einzelbilder abgebildet und ein Referenzbild gewonnen. Die Helligkeitskorrekturangabe ist dann im Wesentlichen die Helligkeitsverteilung über den gesamten Boden des Test-Töpfchens, d. h. über das Referenzbild. Die Abbildung eines Töpfchens mit Probe liefert ein Probenbild. Zur Korrektur des Probenbildes des Töpfchens, das aufgrund der vergrößerten Abbildung nur einen Ausschnitt des Bodens des Töpfchens zeigt, wird die Lage des Probenbildes am Boden ermittelt. Ein entsprechend gelegter Ausschnitt im Referenzbild liefert dann die erforderlichen Helligkeitskorrekturdaten für das Probenbild. In einer zweiten Ausführungsform erfolgt eine funktionale Beschreibung der
Helligkeitsverteilung im Referenzbild. Es wird für jeden Ort am Boden des Referenzbildes des Test-Töpfchens (beispielsweise für jedes Pixel) ein Korrekturfaktor ermittelt, der eine additive oder multiplikative Abweichung von einer gleichmäßigen Helligkeitsverteilung wiedergibt. Die Korrektur des Probenbildes erfolgt dann durch Ermittlung der Lage dessen Ausschnitt am Boden, Auslesen der entsprechenden Korrekturfaktoren für diese Lage aus der
Helligkeitskorrekturangabe und Anwenden der Korrekturfaktoren (entweder additiv oder multiplikativ, je nach Ausgestaltung der Faktoren).
In einer dritten Ausführungsform, die besonders bei Töpfchen zur Anwendung kommen kann, die einen kreisförmigen Querschnitt haben, umfasst die Helligkeitskorrekturangabe einen Korrekturfaktor (wieder entweder additiv oder multiplikativ), der ausschließlich vom Abstand vom Zentrum des Bodens des Test-Töpfchens abhängt. Es genügt für diese Ausführungsform also, in der Referenzmessung des Schrittes (d) lediglich Bilder zu gewinnen, die lediglich einen Bereich links einer radialen Koordinate vom Zentrum des Bodens des Test-Töpfchens bis zu dessen Rand abdecken. Die Helligkeitskorrektur des Probenbildes erfolgt in Schritt (f) in dieser Ausführungsform dadurch, dass die radiale Koordinate der Bildpunkte des Bildes, d.h. der Abstand vom Zentrum des Bodens des Töpfchens ermittelt wird. Durch Auslesen der entsprechenden Korrekturwerte aus der Helligkeitskorrekturangabe durch Anwendung dieser Korrekturwerte ist dann die Helligkeitskorrektur erreicht.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen
Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen: Fig. 1 zwei Schemadarstellungen zur Verdeutlichung der Bedeutung der numerischen Apertur eines Objektivs bei der Durchlichtmikroskopie von Proben, die am Boden einer Mikrotiterplatte angeordnet sind,
Fig. 2 fünf Schemadarstellungen ähnlich der Fig. 1 zur Verdeutlichung der Bedeutung des Zusammenwirkens zwischen numerischer Apertur der Beleuchtung und der
Abbildung,
Fig. 3 eine Schemadarstellung ähnlich der Fig. 1 zur Veranschaulichung einer ersten
Ausführungsform der Erfindung,
Fig. 4 eine Schnittdarstellung durch eine Mikrotiterplatte und eine Abdeckplatte zur
Veranschaulichung einer zweiten Ausführungsform der Erfindung,
Fig. 5 eine Schemadarstellung eines Mikroskops zum Abbilden von Proben, die sich an
Böden von Töpfchen einer Mikrotiterplatte befinden,
Fig. 6 eine Funktion zur Verdeutlichung der Intensitätsverteilung am Boden eines Töpfchens, welche durch Einflüsse des Töpfchens auf die Beleuchtung verursacht wird,
Fig. 7 ein Flussdiagramm zur Erläuterung des allgemeinen Prinzips der Korrektur einer ungleichmäßigen Ausleuchtung des Bodens eines Töpfchens,
Fig. 8 eine Schemadarstellung zur Erläuterung der Korrektur gemäß Figur 7,
Fig. 9 ein Flussdiagramm zur Erläuterung einer weiteren Ausführungsform der Korrektur und Fig. 10 eine schematische Darstellung zur Erläuterung einer weiteren Ausführungsform der Korrektur.
Fig. 1 zeigt schematisch eine Schnittdarstellung durch ein Töpfchen 1 einer Mikrotiterplatte, das von einem Beleuchtungsstrahlenbündel 2 längs einer optischen Achse OA beleuchtet wird. An einem Boden 3 des Töpfchens befindet sich eine nicht weiter dargestellte Probe, beispielsweise eine Zellkultur. Im Töpfchen ist ein Fluid 4, beispielsweise ein Nährmedium für die Zellkultur, das an seiner Oberfläche einen Meniskus 5 ausbildet.
Das Beleuchtungsstrahlenbündel 2 fällt in der Darstellung der Fig. 1 von oben ein. Der derart beleuchtete Boden 3 wird in Durchlicht mit einem Objektiv aufgenommen, das einen
Auffangkegel 6 aufweist.
Die Probe in dem Töpfchen 1 befindet sich in der Regel in einer wässrigen Umgebung, z. B. einem einfachen Puffer oder einem Nährmedium, um eine Lebendzellbeobachtung zu ermöglichen. Diese Flüssigkeit 4 bildet an ihrer Oberfläche den Meniskus 5 aus, die
Grenzfläche zwischen Luft und Medium ist also gewölbt. Der Radius des Meniskus' 5 hängt von der Art der Flüssigkeit 4, von Wandmaterial und Beschichtung des Töpfchens 1 , sowie von der Vorgeschichte der Befüllung ab, also ob trockene oder bereits feuchte Töpfchen 1 befüllt wurden, ob sie umgerührt wurden etc. In den meisten Fällen zieht sich die Flüssigkeit 4 entlang der Töpfchenwand etwas nach oben, während der Flüssigkeitsspiegel in der Töpfchenmitte tiefer liegt.
Das führt dazu, dass ein paralleles einfallendes Beleuchtungsstrahlenbündel 2 nach Passieren des Meniskus' 5 divergiert. Diese Divergenz ist umso ausgeprägter, je kleiner der Radius des Meniskus' 5 ausgebildet ist. Bei Objektiven mit einer hohen NA, also einem großen
Auffangkegel 6, stellt das kein Problem dar, weil auch die divergierenden Strahlen aufgefangen werden können. Zahlreiche Applikationen erfordern jedoch schwach vergrößernde Objektive, die ein großes Feld abbilden und somit einen Übersichtseindruck eines Bodens ermöglichen sollen. So kann zum Beispiel mit nur einem Bild eines 2,5x-vergrößernden Objektivs fast ein kompletter Boden 3 des Töpfchens 1 einer Mikrotiterplatte mit 96 Töpfchen 1 abgebildet werden.
Typischerweise verfügen jedoch schwach vergrößernde Objektive nur über eine geringe NA, z. B. 0,08 oder 0,12. Die NA beschreibt den maximalen Winkel α des Auffangkegel 6, den ein Strahl mit der optischen Achse OA bilden kann, um noch vom Objektiv zur Abbildung gebracht zu werden, NA = n*sin(a). Hierbei ist n der Brechungsindex des Mediums zwischen Objektiv und Probe. Bei schwach vergrößernden Objektiven ist dies in der Regel Luft, also n = 1. Alle Beleuchtungsstrahlen, die durch den Meniskus 5 zu größeren Winkeln hin gebrochen werden als dem durch die Objektiv-NA festgelegten Grenzwinkel, gelangen somit nicht in das Objektiv. Selbst wenn also Beleuchtungslicht jeden Teil des Bodens 3 erreicht (wie im linken Teil der Fig. 1 ), erzeugt der Meniskus- Effekt ein inhomogenes Bild, da die Durchlichtbeleuchtung in Abhängigkeit vom Eintrittswinkel nicht zu gleichen Anteilen ins Objektiv gelangt. Fig. 1 geht von der idealisierten Situation eines parallel einfallenden
Beleuchtungsstrahlenbündels 2 aus.
Eine typische Durchlichtbeleuchtung bietet allerdings ein deutlich breiteres Winkelspektrum an, und zwar bis zu dem Winkel, der durch die numerische Apertur (NA) der Beleuchtung beschrieben wird. Strahlenbündel anderer Einfallswinkel weisen für das oben erwähnte Objektiv mit NA = 0,12 die in Fig. 2 dargestellten Ausleuchtungsmuster auf. In den fünf Darstellungen der Fig. 2 ist die numerische Apertur der Beleuchtung 0,05; 0,1 ; 0,15; 0,2 und 0,25.
Für jeden Einfallswinkel auf den Boden 3 ist das Ausleuchtungsmuster unterschiedlich. Bei allen Geometrien gilt jedoch, dass die Randbereiche nie oder weniger von für das Objektiv nutzbaren Strahlen erreicht werden. Das aufgenommene Bild entsteht aus der Summierung aller dieser einzelnen Strahlbündel. Es wird somit effektiv ein helles Töpfchenzentrum und dunkle Ränder aufweisen. Diese Überlegung gilt unabhängig von der Art der Durchlichtbeleuchtung, also gleich ob es sich um Köhlersche, kritische oder eine anders geartete Beleuchtung handelt. Egal was oberhalb des Töpfchens 1 unternommen wird, der beschriebene Effekt bleibt bestehen. In einer ersten Ausführungsform, die in Fig. 3 gezeigt ist, wird deshalb ein
Homogenisierungselement 7 verwendet, das zumindest mit einem Teil 7a in die Flüssigkeit 4 eintaucht. Das Homogenisierungselement 7 ist aus einem Material, welches für das
Beleuchtungsstrahlenbündel 2 transparent ist. Da das Homogenisierungselement mit dem Teil 7a unter das Niveau der Flüssigkeit 4 einsteht, befindet sich eine Stirnseite 8 des Teils 7a und des Homogenisierungselementes 7 in der Flüssigkeit 4. Die Stirnseite 8 ist in einer ersten Variante der ersten Ausführungsform eben und steht senkrecht zur optischen Achse OA. Der Brechungseffekt durch den Meniskus 5 ist damit ausgeschaltet, und das
Beleuchtungsstrahlenbündel wird auf den Boden 3 so eingestrahlt, dass eine gleichmäßig Ausleuchtung erfolgt und insbesondere Randbereiche möglichst gleichmäßig ausgeleuchtet werden.
Damit das Beleuchtungsstrahlenbündel 2 an der Stirnseite 8 so austritt, dass eine gleichmäßige Ausleuchtung des Bodens 3 erreicht ist, wiest das Homogenisierungselement an seinem Teil 7b, der sich außerhalb der Flüssigkeit 4 befindet, eine Oberseite auf, die ebenfalls senkrecht zur optischen Achse OA liegt. Das Homogenisierungselement ist in der dargestellten ersten Ausführungsform als allgemeiner gerader Zylinder ausgebildet.
Zwischen einer Außenwand 9 des Homogenisierungselementes, die in dieser Bauweise zusammenfällt mit der Stirnfläche 8, wenn diese in einer Draufsicht längs der optischen Achse OA betrachtet wird, und einer Innenwand 10 des Töpfchens 1 ist ein Spalt zwischen und 1 und 3 mm gelassen, um zu verhindern, dass Luft an der Stirnseite 8 eingeschlossen wird, wenn das Homogenisierungselement 7 mit seinem Teil 7a in die Flüssigkeit eingetaucht wird. Solche Luftblasen würden die gleichmäßige Ausleuchtung des Bodens 3 stark beeinträchtigen. Fig. 4 zeigt eine zweite Ausführungsform, bei der nicht ein einzelnes Homogenisierungselement 7 verwendet wird, sondern mehrere Homogenisierungselemente 7 zusammengefasst werden. Die Töpfchen 1 sind in einer Mikrotiterplatte 1 1 ausgebildet, und die
Homogenisierungselemente 7 sind in Form einer Abdeckplatte 12 zusammengefasst, die eine ebene Oberseite 13 aufweist. Die Oberseite 13 ist der Beleuchtungsstrahlenquelle 16 zugeordnet, welche das Beleuchtungsstrahlenbündel 2 auf das Töpfchen 1 abgibt, dessen Probe 14 aktuell mikroskopiert wird. Das in Fig. 4 nicht weiter dargestellte Mikroskop ist so ausgebildet, dass jedes Töpfchen 1 individuell mikroskopiert wird. Es verfügt dazu über einen Antrieb, welcher die Mikrotiterplatte 1 1 mit daraufliegender Abdeckplatte 12 geeignet verschiebt und zur optischen Achse OA der Beleuchtung und der Abbildung ausrichtet.
An der der Oberseite 13 gegenüberliegenden Unterseite der Abdeckplatte 12 weist diese zylindrische Vorsprünge auf, die in Ausbildung und Funktion dem Homogenisierungselement 7 der Fig. 3 entsprechen - allerdings mit dem Unterschied, dass die Homogenisierungselemente 7 der Platte 12 eine gemeinsame Oberseite 13 haben.
Die im allgemeinen Teil der Beschreibung erläuterten Ausgestaltungsmöglichkeiten für die Abdeckplatte, die dort auch als„Deckel" bezeichnet ist, kommen für die zweite
Ausführungsform gemäß Fig. 4 in Frage.
Die Ausführungsformen können durch folgende Merkmale ergänzt oder abgewandelt werden, die einzeln oder in Kombination angewendet werden können, soweit nichts gegenteiliges dazu gesagt ist:
Die Homogenisierungselemente 7 der können die Form eines allgemeinen Zylinders haben, d. h. es muss sich nicht notwendigerweise um einen Kreiszylinder handeln. Rechteckige Querschnitte sind für das Homogenisierungselement 7 als Verwirklichung eines allgemeinen Zylinders gleichermaßen möglich.
Die Stirnseite 8 kann in einer Ausführungsform eben ausgestaltet sein und in einem Winkel zwischen 80 und 90 Grad zur optischen Achse OA und damit entsprechend in einem Winkel von 0 bis 10 Grad zum ebenen Boden 3 liegen. Dies erleichtert das Abführen von Luftblasen.
In einer anderen Ausführungsform kann die Stirnseite 8 konvex gekrümmt ausgebildet werden. In diesem Fall ist der Tangentenwinkel der gekrümmten Stirnseite 8 zwischen 80 und 90 Grad zur optischen Achse OA bzw. zwischen 0 und 10 Grad zur Ebene des Bodens 3. Auch dies erleichtert das Abführen von Luftblasen zur Seite.
Das Homogenisierungselement 7 ist in einer Ausführungsform nicht als Vollkörper, sondern als Hohlkörper oder topfförmig ausgebildet. Für die Vergleichmäßigung der Randausleuchtung des Bodens 3 ist es lediglich erforderlich, dass die Stirnfläche 8 im Fluid 4 liegt. Das
Homogenisierungselement 7 kann damit entweder als Hohlkörper oder auch topfförmig gestaltet sein. Das Homogenisierungselement 7 bzw. die Abdeckplatte 12 ist in einer
Ausführungsform aus einem autoklavierbaren Material, z. B. Glas oder einem autoklavierbaren Kunststoff. In einer anderen Ausführungsform ist die Abdeckplatte 12 als Einwegmaterial ausgelegt. Fig. 5 zeigt schematisch ein Mikroskop zum hochauflösenden Abbilden von Proben an 14 Böden 3 von Töpfchen einer Mikrotiterplatten 1 1 . Das Homogenisierungselement ist zur Vereinfachung nicht eingezeichnet. Bereits beschriebene Elemente und Bauteile sind in Fig. 5 mit denselben Bezugszeichen versehen, um eine Wiederholung der Beschreibung zu vermeiden.
Das Mikroskop weist eine Beleuchtungsstrahlenquelle 16 auf, welche das
Beleuchtungsstrahlenbündel 2 längs der optischen Achse OA auf die Mikrotiterplatte 1 1 abgibt. Diese ist so zur optischen Achse OA ausgerichtet, dass ein Töpfchen, das eine zu
mikroskopierende Probe 14 enthält, passend im Beleuchtungsstrahlengang, d. h. im
Beleuchtungsstrahlenbündel 2 liegt. Von einer Unterseite 15 der Mikrotiterplatte 1 1 her wird die derart im Durchlicht beleuchtete Probe 14 abgebildet. Dazu befindet sich unter der
Mikrotiterplatte 1 1 ein entsprechender Abbildungsstrahlengang des Mikroskops, von dem exemplarisch ein Objektiv 17 sowie ein Empfänger 18 eingezeichnet sind. Der
Abbildungsstrahlengang liegt auf der optischen Achse OA, d.h. ein Beleuchtungsstrahlengang, der mittels der Beleuchtungsstrahlenquelle 16 das Beleuchtungsstrahlenbündel 2 abgibt, liegt auf derselben optischen Achse OA wie der Abbildungsstrahlengang. Ein Steuergerät 19 liest die Daten vom Empfänger 18 aus. Um die Töpfchen der Mikrotiterplatte 11 einzeln abbilden zu können, liegt diese mit ihrer Unterseite 15 auf einem Probentisch 20 auf, der über einen vom Steuergerät 19 angesteuerten Antrieb 21 so verstellbar ist, dass die einzelnen Töpfchen der Mikrotiterplatte 11 zur optischen Achse OA ausgerichtet werden können.
Um zusätzlich zur Verbesserung der Beleuchtung, die durch das Homogenisierungselement erreicht wird, das probengefäßbasierte Shading noch weitergehender zu unterdrücken, wird ein Referenzbild erzeugt. Dies geschieht an einem Test-Töpfchen. Eines der Töpfchen der Mikrotiterplatte 1 1 ist als das Test-Töpfchen 22 ausgebildet. Es entspricht den übrigen
Töpfchen der Mikrotiterplatte 1 1 mit dem einzigen Unterschied, dass sich am Boden 3 des Test- Töpfchens 22 keine Probe 14 befindet. Dies führt dazu, dass die Ausleuchtung des Bodens 3 des Test-Töpfchens 22 genau denselben Bedingungen unterliegt, wie die Ausleuchtung der Böden 3 der Töpfchen, welche Proben 14 enthalten. Wie bereits erläutert, hat ein Töpfchen 1 Auswirkung darauf, wie der Boden 3 des Töpfchens ausgeleuchtet wird. Fig. 6 zeigt dies exemplarisch in einem Diagramm, in dem Intensität I der Beleuchtung, d.h. die Helligkeit auf dem Boden 3 als Funktion des Abstands vom Zentrum des Töpfchens 1 abnimmt. Das Zentrum des Töpfchens kann beispielsweise der Lage der optischen Achse OA entsprechen. Dort liegt eine maximale Helligkeit, d.h. eine Intensität h vor. Der Rand des für Fig. 6 exemplarisch als Kreiszylinder angenommenen Töpfchens befindet sich auf einem Radius n. Aufgrund der idealisiert angenommenen Kreiszylinderform des Töpfchens ist ausschließlich die radiale Koordinate r von Bedeutung. Am Rand des Töpfchens, d.h. bei n ist die Beleuchtungsintensität minimal, z. B. Null. Die Intensität I bleibt mit zunehmendem Abstand r von der optischen Achse OA über einen längeren Zeitpunkt nahezu konstant und fällt zum Rand des Töpfchens ab, d.h. bei der radialen Koordinate n. Dieser Intensitätsverlauf der Beleuchtung, die im exemplarisch dargestelltem Beispiel der Fig. 5 eine Durchlichtbeleuchtung ist, wirkt sich natürlich auf die Erfassung einer Probe 14 aus. Ein ähnlicher Intensitätsverlauf stellt sich im Übrigen auch bei einer Auflichtbeleuchtung ein, wenn die Beobachtungsebene nicht direkt am Töpfchenboden liegt, sondern etwas weiter in die Probe hineingeschaut wird, so dass die hier gegebene Beschreibung durchgängig auch für Mikroskope mit Auflichtbeleuchtung Gültigkeit hat. Der Intensitätsabfall zum Rand wird in der Fachliteratur als„Shading" bezeichnet. Er ist nicht durch den Strahlengang des Mikroskops, sondern durch das Probengefäß erzeugt. Für die Korrektur eines strahlengangbezogenen Shadings kommen alle in der Literatur bekannten Verfahren in Frage, die deshalb hier nicht erneut beschrieben werden. Erzeugt jedoch das Probengefäß ein probengefäßbasiertes Shading, kann dieses auf die im folgenden beschriebenen Arten und Weisen aus dem Probenbild entfernt werden. Bei all diesen Verfahren wird (ohne dass dies nachfolgend beschrieben ist) bevorzugt und optional zunächst das strahlengangbezogene Shading entfernt, so dass nur noch das probengefäßbasierte verbleibt.
Das probengefäßbasierte Shading wird mit einem Verfahren entfernt, das als Ablaufdiagramm schematisch in Fig. 7 gezeigt ist. Fig. 8 zeigt die einzelnen Bilder. In einem Schritt S1 wird das Test-Töpfchen 22 in den Strahlengang des Mikroskops gestellt. Es erfolgt eine
Referenzaufnahme des Bodens 3 des Test-Töpfchens 22, d.h. ohne Probe 14. Die Auflösung durch das Objektiv 17 ist derart, dass das Objektfeld des Objektivs 17 nicht den gesamten Boden 3 erfassen kann. Die Abbildung erfolgt deshalb in Einzelbildern 23a, indem der Boden z. B. in Form einer Kachelaufnahme gescannt wird. Für diese Aufnahmen wird das Test- Töpfchen 22 senkrecht zur optischen Achse OA und parallel zum Boden 3 verschoben. Durch diese Aufnahmetechnik ändert sich bei jeder Stellung der Einfluss des Test-Töpfchens 22 auf die Ausleuchtung des Bodens 3. Dies verdeutlicht, dass es sich bei dem zu korrigierenden Shading um ein probengefäßbasiertes Shading handelt und nicht um ein Shading, das durch den Beleuchtungsstrahlengang selbst herbeigeführt ist. Ein solches wäre völlig unabhängig von der Positionierung des Töpfchens 22. Die Einzelbilder 23a beim Abscannen des Bodens 3 enthalten damit Variationen der
Beleuchtung des Bodens 3, die für die Lage des Einzelbildes 23a am Boden 3 charakteristisch ist. Am Ende des Schrittes S1 steht eine Referenzaufnahme 24 des Bodens 3 durch die mehreren Einzelbilder 23a, beispielsweise in Form einer Kachelaufnahme.
In einem nachfolgenden Schritt S2 wird die Helligkeitsverteilung im Referenzbild 24 ermittelt. Dies liefert eine Helligkeitskorrekturangabe, da die Abweichung von einer idealen homogenen Ausleuchtung einfach ermittelt werden kann. Die Abweichungen hängen vom Ort am Boden 3 des Töpfchens 22 ab.
Die Schritte S1 und S2 dienen dazu, eine Helligkeitskorrekturangabe zu ermitteln. Sie sind in der Ausführungsform der Fig. 7 weiteren Schritten S3 und S4 vorgeordnet, von denen S3 zum Mikroskopieren der Probe (n) dient und Schritt S4 eine Helligkeitskorrektur ist. Die Schritte S1 und S2 müssen jedoch nicht zwangsläufig vor dem Schritt S3 ausgeführt werden. Es ist durchaus möglich, die Erzeugung der Helligkeitskorrekturangabe durch die Schritte S1 und S2 und die Helligkeitskorrektur in Schritt S4 auch zu einem späteren Zeitpunkt und gegebenenfalls sogar erst dann auszuführen, wenn sich herausgestellt hat, dass die Abbildung der Proben 14 ohne eine solche Korrektur nicht ausreichend möglich ist. Im Schritt S3 wird ein Töpfchen 1 abgebildet, auf dessen Boden 3 sich Probe 14 befindet.
In einem Schritt S4 erfolgt eine Korrektur unter Verwendung der Helligkeitskorrekturangabe; Schritt S4 setzt also voraus, dass die Schritte S1 und S2 ausgeführt wurden. Die Korrektur geschieht dadurch, dass ermittelt wird, wo am Boden 3 das Probenbild 23b im Schritt S3 lag. Nach Ermitteln dieser Ortsinformation wird die Helligkeitskorrekturangabe, die für diesen Ort des Bodens 3 gilt, ermittelt, und das im Schritt S3 erzeugte Probenbild 23b wird zu einem korrigierten Probenbild 23c verbessert. Das verbesserte Probenbild 23c enthält eine homogenisierte Ausleuchtung des Bodens 3, die um Einflüsse des probengefäßbasierten Shadings bereinigt ist.
In der Ausführungsform wird das komplette Probengefäß - bei Mikrotiterplatten z. B. ein Töpfchen 1 - gescannt, z. B. in Form einer Kachelaufnahme mit Einzelbildern 23a. Idealerweise wird dabei ein Test-Töpfchen 22 ohne Probe 14 verwendet. Sofern es sich bei dem
Probengefäß um ein Gefäß handelt, in dem sich die Probe in einem flüssigen Medium befindet, liegt bevorzugt das Medium auch im Test-Töpfchen 22 vor. Das zusammengesetzte
Referenzbild 24 enthält folglich das probengefäßbasierte Shading. Um das Shading aus einem Probebild 23b mit Probe 14 herauszurechnen, muss bekannt sein, an welcher Stelle des Bodens 3 das Probenbild 23b aufgenommen wurde. Dazu können Elemente des probengefäßbasierten Shadings im Probenbild 23b erkannt werden. Ist im Probenbild 23b z. B. ein Teil des Randes des Töpfchens 1 sichtbar, kann das aktuelle Objekt einem entsprechenden Ausschnitt 25 des Referenzbildes 24 zugeordnet und das Shading aus dem Probenbild 23b heraus gerechnet werden.
Die einfachste Methode besteht darin, die Intensitätswerte der Pixel des Probenbildes 23b durch die Intensitätswerte der Pixel des passenden Ausschnittes 25 des Referenzbildes 24 zu dividieren und anschließend das Ergebnis zu renormieren. Diese Rechnung kommt auch bei vielen Verfahren zur strahlengangbasierten Shading-Korrektur zum Einsatz. Der fundamentale Unterschied besteht hier darin, dass das passende Referenzbild 24 erst aus einem größeren Übersichtsbild in Abhängigkeit von der Beobachtungsposition ermittelt wird. Auf diese Weise wird ein korrigiertes Probenbild 23c erhalten, das gegenüber dem Probenbild 23b um Einflüsse des probegefäßbasierten Shadings korrigiert ist.
In dieser Ausführungsform kann der Fall auftreten, dass eine eindeutige Lokalisierung der Lage des Probenbildes 23b am Boden 3 und damit die Wahl des Ausschnittes 25 nicht eindeutig möglich ist. Erkennt man z.B . keinen eindeutigen Probengefäßrand im Probenbild 23b, weil das Probenfeld den Rand gerade nicht mehr erfasst, kann das probengefäßbasierte Shading nach wie vor stark ausgeprägt sein, ohne dass offensichtlich ist, welcher der passende Ausschnitt des Referenzbildes 24 ist, der für die Shading-Korrektur verwendet werden sollte. Doch auch in diesem Fall ist eine Korrektur möglich, sofern der Antrieb 21 des Probentisches 20 eine Lagenrückmeldung der Probenpositionierung hat. Dies erlaubt es, die xy-Koordinaten jedes Punktes zu speichern, an dem ein Einzelbild 23a für das Referenzbild 24 aufgenommen wurde, d.h. die xy-Positionen eines jeden Punktes im Referenzbild 24 sind bekannt. Wird jetzt das Test-Töpfchen 22 durch das Töpfchen 1 mit Probe 14 ersetzt, ändern sich die xy- Positionen mit Bezug auf das Töpfchen 1 nicht. Egal an welcher Stelle nun das Bild 23b aufgenommen wird, kann der passende Ausschnitt 25 aus dem Referenzbild 24 ermittelt und die Korrektur wie oben beschrieben durchgeführt werden.
Bei Probengefäßen mit mehreren gleichartigen Untereinheiten wie z. B. einer Mikrotiterplatte 1 1 mit vielen gleichen Töpfchen 1 , genügt eine einzelne Untereinheit - also z. B. ein Töpfchen - als Referenzgefäß. Die einzelnen Untereinheiten sind in einem festen Raster angeordnet, das entweder aus den Herstellerangaben bekannt ist oder leicht selbst ausgemessen werden kann. Somit kann an jedem xy-Tischkoordinatenpaar, an dem ein Probenbild 23b aufgenommen wird, direkt auf die Position des Probenfeldes innerhalb des jeweiligen Töpfchens 1 geschlossen werden und der dazu passende Ausschnitt 25 im Referenzbild 24 ausgewählt werden. Ein möglicher Ablauf dazu ist in Fig. 9 am Beispiel einer Mikrotiterplatte 1 1 dargestellt. In Fig. 9 sind Schritte, die dem Ablauf diagram m der Fig. 7 entsprechen, mit demselben Bezugszeichen gekennzeichnet, wobei Unterschritte durch Anhängen eines Suffix
gekennzeichnet sind. In einem Schritt S1.1 wird für das Test-Töpfchen 22 der Mittelpunkt (xo, yo) gesucht. Anschließend wird das Referenzbild 24 des Bodens 3 des Test-Töpfchens 22, z. B. durch eine Kachelaufnahme gewonnen.
Im Schritt S3 wird die Helligkeitsverteilung des Referenzbildes 24 in eine
Helligkeitskorrekturangabe, beispielsweise die Abweichung von einem mittleren Helligkeitswert in Form eines additiven oder multiplikativen Korrekturfaktors umgerechnet. Diese
Helligkeitskorrekturangabe ist abhängig von der Koordinate (x, y) im Referenzbild 24.
Der Schritt S2 sieht die Aufnahme des Probenbildes 23b an bestimmten Koordinaten (x, y) vor.
In einem Schritt S4 wir der Abstandsvektor r vom Zentrum des Probenbildes 23b zum
Mittelpunkt des entsprechenden Töpfchen einberechnet.
In einem Schritt S4.2 wird für diesen Abstandsvektor r eine entsprechende Korrekturangabe für den ermittelten Ausschnitt 25 in der Helligkeitskorrekturangabe ermittelt.
Schritt S4.3 liefert schließlich die Korrektur des probengefäßbasierten Shadings, indem die Helligkeitskorrekturangabe für den Bereich, der durch den Abstandsvektor r hinsichtlich seines Zentrums definiert wurde, angewendet wird.
Die Helligkeitskorrekturangabe kann entweder die Form des Referenzbildes 24 oder die Form eines daraus errechneten Korrekturwertbildes, das bei Verknüpfung mit dem Referenzbild (entweder additiv oder multiplikativ) eine einheitliche Helligkeit hat, haben. Sieht man die
Helligkeitskorrekturangabe als Referenzbild 24 vor, muss die Ermittlung der Korrekturfaktoren aus der Helligkeitsverteilung des entsprechenden Ausschnittes 25, der aus dem Referenzbild 24 extrahiert wurde, im Korrekturschritt S4 folgen. Enthält die Helligkeitskorrekturangabe hingegen bereits die Korrekturfaktoren, wurde also die Ermittlung der Korrekturfaktoren bereits am Referenzbild 24 ausgeführt, muss im Schritt S4 das nicht erneut erfolgen. Hinsichtlich der Bedeutung für die Korrektur des probengefäßbasierten Shadings sind somit die Begriffe Referenzbild 24 und Helligkeitskorrekturangabe entweder identisch (erste Option), oder das Referenzbild 24 stellt eine Vorstufe der Helligkeitskorrekturangabe (zweite Option) dar, wobei die Umrechnung eine einfache mathematische Operation (z. b. Ermittlung der multiplikativen oder additiven Abweichung von einem Mittelwert etc.) ist.
Fig. 10 zeigt das Vorgehen bei der Ausführungsform der Fig. 9. Dargestellt ist das Referenzbild 24 als Helligkeitskorrekturangabe. Fig. 10 zeigt, den Ablauf der Fig. 9 noch einmal anhand des Referenzbildes 24. Im Referenzbild 24 ist das Zentrum 26 bekannt. Für ein Probenbild 23b ist der Abstandsvektor r bekannt. Er bezeichnet das Zentrum des Probenbildes 23b. Für diesen Abstandsvektor r wird nun im Referenzbild 24 der Ausschnitt 25 gesucht, der denselben Abstandsvektor r zum Zentrum und dieselben Ausdehnungen hat, wie das Probenbild 23b. Der Ausschnitt 25 ist dann der Ausschnitt aus dem Referenzbild (oder der
Helligkeitskorrekturangabe), der für die Korrektur heranzuziehen ist.
Sind die Töpfchen kreisförmig, kann es in einer vereinfachten Ausführungsform genügen, für den Abstandsvektor r nur dessen Betrag zu ermitteln. Für eine Verbesserung dieser
Ausführungsform wird der Betrag des Abstandsvektors nicht nur für das Zentrum , sondern für jedes Pixel ermittelt.
Eine weitere mögliche Ausführungsform besteht darin, das Referenzbild 24 (bzw. die
Helligkeitskorrekturangabe) in absoluten Pixelkoordinaten des Referenzbildes 24 anzugeben, wobei diese Pixelkoordinaten z. B. durch Auswertung der Positionsrückmeldung des Antriebs 21 des Probentisches 20 gewonnen werden. Für ein Probenbild 23b, das zu korrigieren ist, werden dann lediglich die Ortskoordinaten der Pixel im Probenbild 23b ermittelt, wobei diese Ortsangaben auf das Referenzbild 24 (bzw. die Helligkeitskorrekturangabe) bezogen sind. Die Ortsangaben erlauben es dann, aus dem Referenzbild 24 (bzw. der Helligkeitskorrekturangabe) die entsprechenden Korrekturfaktoren für jedes Pixel auszulesen und anzuwenden.
Es kommen folgende Abwandlungen und Weiterbildungen für die zusätzliche Korrektur mittels Referenzbild in Frage: Selbstverständlich muss das Referenzbild 24 nicht als zusammengesetztes Bild vorliegen. Es genügt auch, die entsprechenden Einzelbilder 23a abzuspeichern und aus ihnen je nach Bedarf das passende Korrekturbild für das Probenbild 23b zu errechnen.
Der dargestellte Ablauf muss nicht notwendigerweise in dieser Reihenfolge abgearbeitet werden. Beispielsweise kann das Referenzbild 24 erst nachträglich aufgenommen werden, um zu einem späteren Zeitpunkt die Shading-Korrektur der Probenbilder 23b vorzunehmen. Bisher wurde der Fall beschrieben, bei dem auf den Detektor 18 jeweils nur ein Teil des Töpfchens abgebildet wird und deshalb zur vollständigen Generierung des Referenzbildes 24 mehrere Einzelbilder 23a nötig sind. Bei hinreichend schwach vergrößernden Objektiven und hinreichend kleinen Probengefäßen, bzw. Töpfchen 1 kann jedoch auch mit einer einzelnen Aufnahme der komplette Boden 3 abgebildet werden; eine Kachelaufnahme ist nicht mehr nötig. Ansonsten bleibt der oben beschriebene Ablauf weiterhin gültig.
Handelt es sich bei dem Probengefäß um ein rundes Gefäß, ist es nicht nötig, das komplette Gefäß als Referenzbild 24 aufzunehmen, wenn der Effekt des Shadings, hervorgerufen durch den Gefäßrand, korrigiert werden soll. In diesem Fall ist anzunehmen, dass auch das Shading radialsymmetrisch ist, bezogen auf den Mittelpunkt des Gefäßes. Das ist z. B. bei Petrischalen oder kreisrunden Töpfchen 1 einer Mikrotiterplatte 1 1 der Fall. Es genügt dann, zur Referenz eine Linie vom Mittelpunkt des Gefäßes bis zum Rand aufzunehmen, k(r). Um daraus für ein Probenbild das passende Korrekturbild erzeugen zu können, wird noch der Abstand jedes Bildpixels rP = (x,y) vom Töpfchenmittelpunkt r<? benötigt, d.h. r = / rP -ro\. Ob aus diesen
Abständen rfür jedes Pixel direkt der Korrekturwert k(r) auf das Probenbild 23b angewendet wird, oder zunächst ein komplettes Referenzbild 24 erzeugt wird, mit dem das Probenbild dann verrechnet wird, spielt keine Rolle. In beiden Varianten lässt sich das probengefäßbasierte Shading aus dem Probenbild entfernen.
Abhängig von der verwendeten Objektivvergrößerung und der Größe des Probengefäßes kann das Referenzbild 24 aus sehr vielen Einzelbildern 23a bestehen, deren Aufnahme viel Zeit und deren Speicherung bzw. Verarbeitung viel Speicherplatz benötigt. Im allgemeinen werden aber unterschiedliche Objektive ein unterschiedlich ausgeprägtes probenabhängiges Shading zeigen. Das lässt sich anhand eines Töpfchens 1 einer Mikrotiterplatte 1 1 gut veranschaulichen. Wie bereits weiter oben erläutert, sorgt der Flüssigkeitsmeniskus 5 im Töpfchen 1 dafür, dass einfallende Strahlen hin zu höheren Winkeln gebrochen werden, insbesondere diejenigen, die in der Nähe des Töpfchenrandes den Boden 3 passieren. Ein Objektiv 17 mit einer schwachen NA kann dieses Licht häufig nicht mehr verwerten, der Töpfchenrand erscheint deutlich dunkler als das Zentrum. Hingegen sammelt ein Objektiv 17 mit einer höheren NA weit mehr dieses Lichts ein, weshalb die Randabschattung geringer ausfällt, das probengefäßbasierte Shading ist ein anderes. Der Unterschied besteht aber nur in der Stärke des Shadings, nicht in seiner Art. Mit beiden Objektiven misst man diese Shading-Stärke im gleichen Objektfeld, im Prinzip genügt dazu ein Bild in der Mitte des Gefäßes und eines am Rand, um daraus den Faktor zu errechnen, die beiden Shadings voneinander unterscheidet. Anschließend genügt es, mit dem schwächer vergrößernden Objektiv das Referenzbild 24 aufzunehmen und dieses auch für das stärker vergrößernde Objektiv unter Berücksichtigung des entsprechenden
Shadingstärkefaktors zu verwenden. Auf diese Weise kann das Referenzbild 24 aus deutlich weniger Einzelbildern 23 a zusammengesetzt werden, was Zeit und Speicherplatz sowie Rechenleistung spart. Außerdem muss bei einem Objektivwechsel kein neues Referenzbild zur Korrektur des probengefäßbasierten Shadings aufgenommen werden.

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zur mikroskopischen Abbildung von Proben (14), die in einer Mikrotiterplatte (1 1 ), welche eine Vielzahl von mit Fluid (4) befüllten Töpfchen (1 ) aufweist, an Böden (3) der
Töpfchen (1 ) anhaften, wobei die Töpfchen (1 ) nacheinander von einer den Böden (3) gegenüberliegenden Oberseite her aus einer Durchlichtbeleuchtungsquelle (16) längs einer optischen Achse (OA) mit Beleuchtungsstrahlung (2) beleuchtet und die derart von der Oberseite beleuchteten Böden (3) der Töpfchen (1 ) von der Unterseite (15) her einzeln vergrößernd abgebildet werden, dadurch gekennzeichnet, dass zur Verbesserung einer Randausleuchtung des Bodens (3) bei jedem beleuchteten Töpfchen (1 ) zwischen dem Töpfchen (1 ) und der Durchlichtbeleuchtungsquelle (16) ein Homogenisierungselement (7) angeordnet wird, das von der Durchlichtbeleuchtungsquelle (16) beleuchtet wird, für die Beleuchtungsstrahlung (2) transparent ist, und einen in das Töpfchen (1 ) und dort in das Fluid (4) eintauchenden Teil (7a) aufweist, welcher eine im Fluid (4) liegende Stirnfläche (8) hat.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der in das Fluid (4) eintauchende Teil (7a) die Form eines allgemeinen, geraden Zylinders hat.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Stirnfläche (8) zur optischen Achse (OA) einen Neigungswinkel oder Tangentenwinkel hat, der zwischen 80 und 90 Grad liegt.
4. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Form der Stirnfläche (8) in Draufsicht längs der optischen Achse der Form des Querschnitts der
Töpfchen (1 ) gleicht.
5. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem Rand (9) jeder Stirnfläche (8) und einer Innenwand (10) des zugeordneten Töpfchens (1 ) ein Spalt von mindestens 1 mm und höchstens 3 mm gelassen wird, um Luftblasen beim
Eintauchen des Teils (7a) nicht unter der Stirnseite (8) einzusperren, sondern entweichen zu lassen.
6. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Homogenisierungselemente (7) in Form einer Abdeckplatte (12) zusammengefasst werden, an deren Unterseite die in das Fluid eintauchenden Teile (7a) ausgebildet sind und die zum Auflegen auf die Mikrotiterplatte (1 1 ) aufgebildet ist.
7. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei der vergrößernden Abbildung von mindestens einem Boden (3) ein Testbild aufgenommen wird und in einem Korrekturschritt anhand dieses Testbildes ein Wert eines Parameter einer
Unterdrückung einer Ringstruktur einer Helligkeitsverteilung im Testbild optimiert wird und dass bei nachfolgenden Abbildungen weiterer Böden (3) die Ringstruktur der Helligkeitsverteilung mittels des Korrekturschritts unter Verwendung des optimierten Wertes des Parameters unterdrückt wird.
8. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei der vergrößernden Abbildung der Böden (3) zur Unterdrückung einer Ringstruktur einer
Helligkeitsverteilung in Bildern der Böden (3), die Bilder einer Tiefpassfilterung unterzogen werden.
9. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein an dem Test-Töpfchen (22) eine Referenzmessung durchgeführt wird, wobei ein Referenzbild (24) aufgenommen wird, das den gesamten Boden (3) zeigt, im Referenzbild (24) wird eine Helligkeitskorrekturangabe ermittelt, wobei die Helligkeitskorrekturangabe eine
Helligkeitsschwankung als Funktion des Ortes auf dem Boden (3) des Test-Töpfchens (22) angibt, das Bild (23b) des Bodens (3) des probenenthaltenden Töpfchens (1 ) wird mittels der Helligkeitskorrekturangabe korrigiert, wobei die Lage des Bildes (23b) am Boden (3) ermittelt und der zu dieser Lage gehörende Wert der Helligkeitskorrekturangabe verwendet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Einzelbilder (23a) den gesamten Boden (3) des Töpfchens (1 ) abdecken und zu dem Referenzbild
zusammengefügt werden und die Helligkeitskorrekturangabe die Helligkeitsschwankung im Referenzbild (24) als Funktion des Ortes angibt, und für das Bild des Bodens (3) ein im zugeordneter Ausschnitt (25) im Referenzbild (24) und daraus die für diesen Ausschnitt (25) geltende Helligkeitskorrekturangabe ermittelt wird.
1 1 . Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die
Helligkeitskorrekturangabe die Helligkeitsschwankung als Funktion einer Lage zum Zentrum des Bodens (3) angibt.
12. Verfahren nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Töpfchen einen runden Querschnitt hat und dass die Funktion ausschließlich eine radiale Koordinate ist, die den Abstand vom Zentrum des Bodens (3) bezeichnet.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Töpfchen (1 ) bei Abbildung mittels eines Probenverstellmechanismus' (20, 21 ) relativ zu einer optischen Achse (OA) bewegt wird und dass die Helligkeitskorrekturangabe die
Helligkeitsschwankung als Funktion der Einstellung des Probenverstellmechanismus' (20, 21 ) angibt, insbesondere als Funktion einer Koordinate (x,y).
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Helligkeitskorrekturangabe die Helligkeitsschwankung als Funktion eines zur Abbildung verwendeten Objektivs (17) angibt.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass für die Abbildung in Schritt (b) mehrere Objektive (17) mit unterschiedlicher numerischer Apertur zur Verfügung stehen, die Referenzmessung in Schritt (d) mit einem der Objektive (17), bevorzugt dem mit der kleinsten numerischen Apertur, durchgeführt werden und dass die Helligkeitskorrekturangabe die Helligkeitsschwankung als Funktion eines Shadingstärkefaktors angibt, der von der numerischen Apertur des für die Abbildung der probenenthaltenden Töpfchen (1 ) verwendeten Objektivs (17) abhängt.
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