JP5311195B2

JP5311195B2 - 顕微鏡装置

Info

Publication number: JP5311195B2
Application number: JP2008235946A
Authority: JP
Inventors: 広之山宮
Original assignee: Yokogawa Electric Corp
Current assignee: Yokogawa Electric Corp
Priority date: 2008-09-16
Filing date: 2008-09-16
Publication date: 2013-10-09
Anticipated expiration: 2028-09-16
Also published as: JP2010072014A

Description

本発明は、対象物にライン状の照明光を投光する投光光学系と、ライン状の照明光によって生じる光を受光して検出器上に結像させる検出光学系と、ライン状の照明光を走査する走査手段と、を備え、走査手段によりライン状の照明光を走査することで得られる平面上の画像情報を検出器からの信号に基づいて取得する顕微鏡装置に関する。

顕微鏡観察において、生体の深部観察を行う際には、焦点面以外からの戻り光の影響により、画像のSNは劣化する。この現象はたとえ共焦点顕微鏡を用いたとしても充分取り除くことはできていない。

この、問題点を解消するための技術（USP5,973,828、USP5,969,854、USP6,423,956、DE4326473）が提案されている。

これらの技術では、二つの対物レンズを用いて、それぞれの焦点領域が交差するように配置することと共焦点顕微鏡技術を組み合わせるによって、それらの交差領域のみの情報が得られることにより、水平分解能は少々悪くなるが、主として深度方向の分解能を向上させるものである（USP5,973,828の図２参照）。

また、これらの構成を比較的低ＮＡのレンズで構成した場合には次の効果があることが非特許文献２に記載されている。
（１）光軸方向の分解能が向上する。
（２）ＮＡが小さいため、生体深部観察においても収差が発生しにくい。
（３）小さい径のものが製作しやすい。
（４）ＷＤを長くできて深部観察に適する。
（５）二つの光路が別々のため、深部観察を行っても観察面以外からの戻り光などのノイズ光の影響を受けにくい。

また、USP5,973,828の図７には、二つの対物レンズの位置関係を保ったまま焦点位置を走査する走査機構が開示されている。また、非特許文献１、非特許文献２には、対象物をステージ等で移動させて走査する方法が開示されている。
米国特許第5,973,828号明細書米国特許第5,969,854号明細書米国特許第6,423,956号明細書独国特許第4326473号明細書「Confocal microscope with large field and working distance」, Applied Optics, Vol.38, No.22, pp.4870 「Dual-axis confocal microscope for high-resolution in vivo imaging」,Optics Letters,Vol.28,No.6,pp414

しかしながら、角度のついた二つの対物レンズを通る光の焦点の位置関係を保ったまま焦点位置を走査する機構は複雑な上に、走査に時間がかかることが考えられる。また、ステージ等を移動させて走査する方法を適用する場合も、実際には極めて長時間の走査時間がかかると考えられる。

本発明の目的は、照明光を容易に走査でき、生体深部の観察に適した顕微鏡装置を提供することにある。

本発明の顕微鏡装置は、対象物にライン状の照明光を投光する投光光学系と、前記ライン状の照明光によって生じる光を受光して検出器上に結像させる検出光学系と、前記ライン状の照明光を走査する走査手段と、を備え、走査手段により前記ライン状の照明光を走査することで得られる平面上の画像情報を前記検出器からの信号に基づいて取得する顕微鏡装置において、前記投光光学系の対物レンズの主軸と、前記検出光学系の対物レンズの主軸とが一定の角度で交わるとともに、前記検出器は、前記ライン状の照明光によって生じる前記光の当該ライン上における強度分布を検出し、前記投光光学系の対物レンズと前記検出光学系の対物レンズとが共通の駆動部に取り付けられ、前記走査手段は、前記駆動部を走査幅だけ走査方向に移動させることにより、前記投光光学系の対物レンズと前記検出光学系の対物レンズとの相対位置関係を維持するとともに、前記投光光学系の対物レンズの主軸と前記検出光学系の対物レンズの主軸とがなす一定の角度を保持した状態で、前記照明光を走査することを特徴とする。
この顕微鏡装置によれば、投光光学系の対物レンズの主軸と、検出光学系の対物レンズの主軸とが一定の角度で交わるとともに、検出器は、ライン状の照明光によって生じる光の当該ライン上における強度分布を検出するので、照明光を容易に走査でき、生体深部の観察に適した顕微鏡装置を得ることができる。

前記ライン状の照明光によって生じる前記光は前記対象物からの蛍光であってもよい。

前記ライン状の照明光によって生じる前記光は前記対象物からの反射光または散乱光であってもよい。

前記角度が９０度であってもよい。

前記角度が３０度〜１８０度の範囲にあってもよい。

前記投光光学系は近赤外レーザ光を照射してもよい。

前記投光光学系は平行光をシリンドリカルレンズに入射させることで前記ライン状の照明光を投光してもよい。

前記ライン状の照明光が、前記検出光学系の焦点面上にあってもよい。

前記投光光学系はスリットを前記対称物に結像させることによって前記ライン状の照明光を投光してもよい。

前記投光光学系の焦点面と前記検出光学系の焦点面とが交差する線上に前記ライン状の照明光を照射してもよい。

前記走査手段は、前記ライン状の照明光を前記ラインに対して垂直方向に走査してもよい。

前記走査手段は、前記投光光学系および前記検出光学系の全部または一部を移動させることにより前記照明光を走査してもよい。

前記検出光学系の結像面にスリットを配置してもよい。

前記検出器がラインセンサであってもよい。

前記検出器が２次元センサであり、前記走査手段による走査と同期して前記２次元センサを検出光に合わせて移動させてもよい。

本発明の顕微鏡装置によれば、投光光学系の対物レンズの主軸と、検出光学系の対物レンズの主軸とが一定の角度で交わるとともに、検出器は、ライン状の照明光によって生じる光の当該ライン上における強度分布を検出するので、照明光を容易に走査でき、生体深部の観察に適した顕微鏡装置を得ることができる。

以下、本発明による顕微鏡装置の実施形態について説明する。

以下、図１〜図３を参照して実施例１の顕微鏡装置について説明する。

図１は、実施例１の顕微鏡装置の構成を示すブロック図である。

図１に示すように、本実施例の顕微鏡装置の光学ヘッド１には、図示しない光源からの光を導く光ファイバ２が配置されている。ここで光源の光は、生体の深部観察のため近赤外光が望ましく、光ファイバ２はシングルモードファイバのように、コア径が小さいものが望ましい。光ファイバ２の前方にはコリメートレンズ３がある。

さらに、光学ヘッド１には、反射ミラー４、シリンドリカルレンズ５、開口窓６、対物レンズ８、ミラー９、結像レンズ１０が光路に沿って配置されている。

シリンドリカルレンズ５はＹ方向の軸（図１において紙面に垂直な軸）を有する円筒面から構成されている。ここでシリンドリカルレンズ５に対して、その主軸に沿って平行光を導入した際に形成されるライン状の集光７のほぼ中点（ライン幅の中点）に、対物レンズ８の物体側焦点が来るように、各光学部品が配置されている。

対物レンズ８のＮＡは比較的小さいものが使用されている。さらにラインＣＣＤ１１は図１に示すように結像レンズ１０の集光位置に配置されている。ここでラインＣＣＤ１１の画素はＹ方向（図１において紙面に垂直な方向）に配列されている。

図１に示すように、光学ヘッド１は２軸ステージ１２によってＸ方向とＺ方向に移動可能とされている。

さらに、ラインＣＣＤ１１および２軸ステージ１２は破線で示す信号線を介してコントローラ１５に接続されており、またコントローラ１５にはモニタ１６が接続されている。

次に、本実施例の顕微鏡装置の動作について説明する。

光源からの近赤外光は光ファイバ２の先端から発せられた後、コリメータレンズ３で平行光に変換され、ミラー４で反射した後にシリンドリカルレンズ５の作用によって、開口窓６を透過した後にライン状の集光７となる。ここで集光７はＹ方向（図１において紙面に垂直な方向）に延びるライン状となる。

図２は集光点を模式的に示す図である。

図２に示すように、集光７は対物レンズ８の焦点面８Ａ上に位置する。この集光７に生体などの対象物があり、散乱光又は蛍光などが発せられる場合、これらの光は対物レンズ８の作用で平行光に変換される。平行に変換された光はミラー９で反射されて、結像レンズ１０の作用により、ライン状の集光７はラインＣＣＤ１１上に結像され、ラインＣＣＤ１１により集光７のライン上の強度分布が検出される。ラインＣＣＤ１１の画素は十分小さいとみなせるので共焦点光学系となり、焦点面８Ａ以外の光の影響は少なくなる。また、必要に応じて、ラインＣＣＤ１１上にスリットを配置してもよい。

図３は、ライン状の集光７の拡大図である。

図３には、シリンドリカルレンズ５の点像分布関数（ＰＳＦ）によるビームの広がりと、対物レンズ８にその主軸に沿って逆方向から平行光を導入した場合の点像分布関数（ＰＳＦ）によるビームの広がりが示されている。ラインＣＣＤ１１には、図３のハッチングで示した両レンズによるビーム形状の重なっている領域の光のみが投影されることになるので、光軸方向に分解能の良い状態で、集光７のライン上の情報が伝えられる。

なお、集光７からの散乱光を得る場合には図１の構成のままで良いが、対象物からの蛍光情報を得る場合には、ラインＣＣＤ１１の前面付近に図示しない蛍光フィルタを適宜挿入することが望ましい。

ここで、コントローラ１５によって、２軸ステージ１２をＸ方向（図１）に移動させることにより、ライン状の集光７はＸ方向に走査される。この時の各位置でのライン状の集光７の情報は、ラインＣＣＤ１１で撮影される。コントローラ１５は、２軸ステージ１２の位置信号とラインＣＣＤ１１からの信号を用いて、ＸＹ断面画像をモニタ１６に表示させ、あるいは、コントローラ１５内部の記録装置にＸＹ断面画像を記録することが可能である。

また、コントローラ１５によって、２軸ステージ１２をＺ方向（図１）に移動させることにより、ライン状の集光７はＺ方向に走査される。この時の各位置でのライン状の集光７の情報は、ラインＣＣＤ１１で撮影される。コントローラ１５は、２軸ステージ１２の位置信号とラインＣＣＤ１１からの信号を用いて、ＹＺ断面画像をモニタ１６に表示させ、あるいは、コントローラ１５内部の記録装置にＹＺ断面画像を記録することが可能である。

上記実施例では対物レンズとしてシリンドリカルレンズと対物レンズを用いたが、これに限らず同様の作用を有する他のレンズ系でも構わない。また、凹面ミラーのように反射光学系を用いても構わない。

以上のように、本実施例の顕微鏡装置では、投光光学系が集光するライン上に、検出系光学系の対物レンズ８の物体側焦点が位置し、両方の光学系の光軸を角度をつけて配置したため、光軸方向の分解能に優れる状態で、ライン上の情報が得られる。この光軸間の角度は３０度〜１８０度の範囲で選択されることが好ましく、さらにこの角度が９０度であればさらに好ましい。

また、投光光路と集光光路が分離しているため、集光位置以外の光が戻りにくい構成となり、ＳＮ比の良い画像が得られる。

また、投光光学系の対物レンズとしてＮＡの小さいシリンドリカルレンズ５を用いているで、ＷＤが取れる上、収差が少ないので、深部観察に適している。

さらに、上記のようにラインを走査して画像を得る構成としたので、走査方法が容易な上に高速での走査が可能である。

さらにまた、光源に近赤外光を用いたので、深部観察に適した顕微鏡装置を得ることができる。

以下、図４〜図６を参照して実施例２の顕微鏡装置について説明する。

図４は、実施例２の顕微鏡装置の構成を示すブロック図である。

図４に示すように、本実施例の顕微鏡装置の光学ヘッド１Ａには、図示しない光源からの近赤外光を導く光ファイバ２１、コリメータレンズ２２、シリンドリカルレンズ２３、シリンドリカルレンズ２３の集光点に設けられたスリット２４、結像レンズ２５と反射ミラー２６、反射ミラー２７、及び対物レンズ２８が投光光学系の光路に沿って配置されている。

また、対物レンズ２８と対物レンズ３０の物体側焦点２９は一致するように配置されている。また二つの対物レンズの光軸の成す角度は９０度となっている。これらの対物レンズ２８および対物レンズ３０は比較的ＮＡの小さいものが用いられている。なお、この光軸間の角度は９０度でなくてもよいが、３０度〜１８０度の範囲で選択することが好ましい。

さらに反射ミラー３１および反射ミラー３２が、図４に示すように配置されている。

ここで、反射ミラー２７、反射ミラー３１、対物レンズ２８、対物レンズ３０はＸ駆動ユニット３３として一体化されている。Ｘ駆動ユニット３３はＸ駆動ステージ３４でＸ方向に移動可能とされている。また、Ｘ駆動ユニット３３、Ｘ駆動ステージ３４、反射ミラー２６、反射ミラー３２はＺ駆動ユニット３６として一体化されており、Ｚ駆動ステージ３７によってＺ方向に移動可能に構成されている。

さらに、光路には、図１に示すように、結像レンズ３９と、結像レンズ３９の結像位置に設けられたスリット４０と、リレーレンズ４１と、リレーレンズ４２とが配置されている。また、リレーレンズ４２の焦点位置には２次元センサとしての高感度カメラ４３が配置されている。

高感度カメラ４３はＸ駆動ステージ４４でＸ方向に移動可能とされている。

Ｘ駆動ステージ３４、Ｚ駆動ステージ３７、第２のＸ駆動ステージ４４、および高感度カメラ４３は破線で示す信号線を介してコントローラ４６に接続されており、さらに、コントローラ４６にはモニタ４７が接続されている。

次に、本実施例の顕微鏡装置の動作について説明する。

光源からの近赤外光は光ファイバ２１の先端から発せられた後、コリメータレンズ２２で平行光に変換され、シリンドリカルレンズ２３でスリット２４に集光される。スリット２４を通過することのできた光は、結像レンズ２５でスリット２４の位置に応じた平行光に変換される。この平行光は反射ミラー２６、反射ミラー２７で反射した後に、対物レンズ２８を通る。ここで結像レンズ２５と対物レンズ２８の作用で、スリット２４は、結像２９に投影される。

ここでスリット２４はＹ方向（図１において紙面に垂直な方向）に延びており、結像２９もＹ方向に延びるライン状となる。

図５は、対物レンズの位置関係を示す図である。

図５に示すように、対物レンズ２８の焦点面２８Ａと対物レンズ３０の焦点面３０Ａは互いに交差し、この交差部分が作る直線上に対物レンズ２８および対物レンズ３０の焦点が位置するとともに、ライン状の結像２９も、この直線上に位置するようになる。

この結像２９の位置に生体などの対象物があり、散乱光又は蛍光などが発せられる場合、これらの光は対物レンズ３０の作用で平行光に変換される。平行に変換された光はミラー３１およびミラー３２で反射されて、結像レンズ３９の作用により、スリット４０上に集光される。

スリット４０を通過できた光はリレーレンズ４１およびリレーレンズ４２の作用で高感度カメラ４３の画素上に結像する。

図６はライン状の結像２９の拡大図である。

図６には、対物レンズ２８の点像分布関数（ＰＳＦ）によるビームの広がりと、対物レンズ３０に光軸に沿って逆方向から平行光を導入した場合の点像分布関数（ＰＳＦ）によるビームの広がりが示されている。高感度カメラ４３には、図６のハッチングで示した両対物レンズによるビーム形状の重なっている領域の光のみが投影されることになるので、光軸方向に分解能の良いライン状の情報（集光７のライン上の強度分布）が検出される。

なお、結像２９からの散乱光を得る場合には図４の構成のままで良いが、対象物からの蛍光情報を得る場合には、高感度カメラ４３の前面付近に図示しない蛍光フィルタを適宜挿入することが望ましい。

ここで、コントローラ４６によって、Ｘ軸ステージ３４をＸ方向に駆動することにより、ライン状の結像２９がＸ方向に走査される。

このとき、ミラー２６およびミラー２７間の光軸と、ミラー３１およびミラー３２間の光軸がそれぞれ平行光で、かつこれらの光軸がＸ方向にあるため、Ｘ駆動ユニット３３を移動させても、その前後の光学系に影響を与えないようになっている。

また、Ｘ軸ステージ３４による駆動と同時に、対応する位置だけ、Ｘ軸ステージ４４も同期して移動させる。例えば光学系での倍率が１０倍の場合、Ｘ駆動ユニット３３を１μｍ移動させる場合は、同時に移動ステージ４４を１０μｍ移動させる。このようにコントローラ４６は二つのステージの同期を取り、かつこれらの走査に同期して高感度カメラ４３の露光時間の調節を行う。これによって高感度カメラ４３は、ライン状の結像２９をＸ方向に走査してできるＸＹ平面の画像を均一な明るさで撮影し、この画像をコントローラ４６に転送することによって、モニタ４７で観察を行ったりコントローラ４６内部の記録装置に記録を行ったりする。

また、コントローラ４６によって、Ｚ軸ステージ３７をＺ方向に駆動することにより、ライン状の結像２９はＺ方向に走査される。また、ミラー２６と結像レンズ２５間の光軸と、ミラー３２と結像レンズ３９間の光軸がそれぞれ平行光で、かつこれらの光軸が、Ｚ方向にあるため、Ｚ駆動ユニット３６を移動させても、その前後の光学系に影響を与えないようになっている。

また、Ｚ駆動ユニット３６の駆動と同時に対応する位置だけ、Ｘ軸ステージ４４も同期して移動させる。例えば光学系での倍率が１０倍の場合、Ｚ駆動ユニット３６を１μｍ移動させる場合は、同時に移動ステージ４４を１０μｍ移動させる。このようにコントローラ４６は二つのステージの同期を取り、かつこれらの走査に同期して高感度カメラ４３の露光時間の調節を行う。これによって高感度カメラ４３は、ライン状の結像２９をＺ方向に走査してできるＹＺ平面の画像を均一な明るさで撮影し、この画像をコントローラ４６に転送することによって、モニタ４７で観察を行ったりコントローラ４６内部の記録装置に記録を行ったりする。

なお、本実施例では結像に２つの対物レンズを用いたが、これに限らず同様の作用を有する他のレンズ系でも構わない。また、凹面ミラーのように反射光学系を用いても構わない。また、より簡便な構成としては２つのスリット２４およびスリット４０を省略しても良い。

以上のように、本実施例の顕微鏡装置によれば、２つの対物レンズをその焦点位置が一致するように、その光軸に角度をつけて配置したため、光軸方向に分解能良くライン上の情報が得られる。

また、投光光路と集光光路が別になっているため、集光位置以外の光が戻りにくい構成となり、ＳＮ比の良い画像が得られる。

また、対物レンズにＮＡの小さいレンズを用いたので、ＷＤが取れる上、収差が少ないので、深部観察に適している。

さらに、上記のラインを走査して、画像を得る構成としたので、走査方法が容易な上に高速での走査が可能である。

さらに、光源に近赤外光を用いたので、深部観察に適している。

また、必要な光学ユニットのみを走査する構成としたので、より高速化が可能である。

また、投光側、受光側にスリットを挿入して、共焦点光学系としたので、より焦点面のみの情報が得られＳＮが向上する。

さらに、受光に高感度カメラを用い、高感度カメラを相対的に移動させながら撮影する構成としたので、簡便に対象面の画像を得ることができる。

以上説明したように、本発明の顕微鏡装置によれば、投光光学系の対物レンズの主軸と、検出光学系の対物レンズの主軸とが一定の角度で交わるとともに、検出器は、ライン状の照明光によって生じる光の当該ライン上における強度分布を検出するので、照明光を容易に走査でき、生体深部の観察に適した顕微鏡装置を得ることができる。

本発明の適用範囲は上記実施形態に限定されることはない。本発明は、対象物にライン状の照明光を投光する投光光学系と、ライン状の照明光によって生じる光を受光して検出器上に結像させる検出光学系と、ライン状の照明光を走査する走査手段と、を備え、走査手段によりライン状の照明光を走査することで得られる平面上の画像情報を検出器からの信号に基づいて取得する顕微鏡装置に対し、広く適用することができる。

実施例１の顕微鏡装置の構成を示すブロック図。集光点を模式的に示す図。ライン状の集光の拡大図。実施例２の顕微鏡装置の構成を示すブロック図。対物レンズの位置関係を示す図。ライン状の結像の拡大図。

符号の説明

５シリンドリカルレンズ（対物レンズ）
７集光（照明光）
８対物レンズ
８Ａ焦点面
１１ラインＣＣＤ（検出器、ラインセンサ）
１２２軸ステージ（走査手段）
１５コントローラ（走査手段）
２４スリット
３４Ｘ駆動ステージ（走査手段）
３７Ｚ駆動ステージ（走査手段）
４０スリット
２８対物レンズ
２８Ａ焦点面
３０対物レンズ
３０Ａ焦点面
４３高感度カメラ（検出器、２次元センサ）

Claims

対象物にライン状の照明光を投光する投光光学系と、前記ライン状の照明光によって生じる光を受光して検出器上に結像させる検出光学系と、前記ライン状の照明光を走査する走査手段と、を備え、走査手段により前記ライン状の照明光を走査することで得られる平面上の画像情報を前記検出器からの信号に基づいて取得する顕微鏡装置において、
前記投光光学系の対物レンズの主軸と、前記検出光学系の対物レンズの主軸とが一定の角度で交わるとともに、
前記検出器は、前記ライン状の照明光によって生じる前記光の当該ライン上における強度分布を検出し、
前記投光光学系の対物レンズと前記検出光学系の対物レンズとが共通の駆動部に取り付けられ、
前記走査手段は、前記駆動部を走査幅だけ走査方向に移動させることにより、前記投光光学系の対物レンズと前記検出光学系の対物レンズとの相対位置関係を維持するとともに、前記投光光学系の対物レンズの主軸と前記検出光学系の対物レンズの主軸とがなす一定の角度を保持した状態で、前記照明光を走査することを特徴とする顕微鏡装置。
前記ライン状の照明光によって生じる前記光は前記対象物からの蛍光であることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
前記ライン状の照明光によって生じる前記光は前記対象物からの反射光または散乱光であることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
前記角度が９０度であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
前記角度が３０度〜１８０度の範囲にあることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
前記投光光学系は近赤外レーザ光を照射することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
前記投光光学系は平行光をシリンドリカルレンズに入射させることで前記ライン状の照明光を投光することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
前記ライン状の照明光が、前記検出光学系の焦点面上にあることを特徴とする請求項７に記載の顕微鏡装置。
前記投光光学系はスリットを前記対称物に結像させることによって前記ライン状の照明光を投光することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
前記投光光学系の焦点面と前記検出光学系の焦点面とが交差する線上に前記ライン状の照明光を照射することを特徴とする請求項９に記載の顕微鏡装置。
前記走査手段は、前記ライン状の照明光を前記ラインに対して垂直方向に走査することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
前記走査手段は、前記投光光学系および前記検出光学系の全部または一部を移動させることにより前記照明光を走査することを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
前記検出光学系の結像面にスリットを配置したことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
前記検出器がラインセンサであることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
前記検出器が２次元センサであり、前記走査手段による走査と同期して前記２次元センサを検出光に合わせて移動させることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。