JP5601539B2 - ３次元方向ドリフト制御装置および顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は３次元方向ドリフト制御装置および顕微鏡装置に関し、特に、対物レンズと標本との平面方向の相対的な位置のずれをより迅速かつ確実に補正できるようにした３次元方向ドリフト制御装置および顕微鏡装置に関する。

近年、オートフォーカス機能を有する顕微鏡の有用性が、市場において認知されてきている。標本に対して常に合焦し続けるアクティブ制御のオートフォーカス機能を用いれば、長時間のタイムラプス観察時や、容器への試薬投与時に生じる観察画像のぼけや揺れを効果的に除去することが可能となる。

このようなオートフォーカス機能を実現させる方法には、大別してパッシブ方式とアクティブ方式の２種類の方法がある。

例えば、パッシブ方式では、標本の観察画像のコントラストが最大となる対物レンズの位置の変化から観察画像のぼけを検出し、その位置の変化量をステージや対物レンズの駆動部にフィードバックすることで、標本への合焦が維持される。この方式では、対物レンズの光軸方向のみならず、光軸方向と垂直な方向（以下、平面方向と称する）への対物レンズと標本との相対的な位置の変化も求めることができるため、相対的な位置の平面方向へのずれを補正（補償）することが可能である。

これに対して、スリット投影式に代表されるアクティブ方式では、標本を保持するカバーガラスに照射した赤外光の反射光の像の位置の変化から、対物レンズと標本の相対的な位置の光軸方向へのずれが検出されるため、迅速な焦点調節が可能である（例えば、特許文献１参照）。

ところで、近年の超解像技術等の発展により、光学顕微鏡の分解能を超えたナノメートル精度の顕微鏡観察が脚光を浴びつつある。ところが、この分解能領域での観察においては、これまで問題とならなかった装置の機械的なドリフトや、カバーガラスの熱膨張などにより生じる、観察視野内での標本の観察位置の微小な変化が無視できなくなる。そのため、対物レンズと標本との相対的な位置を３次元方向に維持できる技術が求められている。

特開２００８−１２２８５７号公報

しかしながら、上述した技術では、対物レンズと標本との相対的な位置関係にずれが生じた場合に、そのずれを迅速かつ確実に補正することは困難であった。

例えばパッシブ方式では、３次元方向に対物レンズと標本の相対的な位置の変化を補償することができるが、輝度やコントラストが低い標本に対しては画像解析に時間がかかってしまい、焦点調節の遅延やエラーが生じてしまう。また、アクティブ方式では、原理的に、平面方向への対物レンズと標本の相対的な位置の変化を検出することはできなかった。

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、対物レンズと標本との相対的な位置のずれを、より迅速かつ確実に補正することができるようにするものである。

本発明の３次元方向ドリフト制御装置は、対物レンズと、前記対物レンズを介して標本または保持部材に照射光を照射する光源と、一部遮光された前記照射光で照射された前記標本または前記保持部材において正反射した正反射光を、前記対物レンズを介して受光する第１の受光部と、前記第１の受光部が前記正反射光を受光して得られる信号に基づいて、前記対物レンズと前記標本または前記保持部材との光軸方向の相対的な位置ずれを示す第１制御信号を生成する第１の制御部と、前記照射光が前記標本または前記保持部材に照射されて生じた散乱光を、前記対物レンズを介して受光する第２の受光部と、前記標本または前記保持部材から前記第２の受光部に入射する、前記正反射光と前記散乱光の一部とを遮光する第１の遮光部と、前記第２の受光部が前記散乱光を受光して得られる信号に基づいて、前記対物レンズと前記標本または前記保持部材との前記光軸と垂直な方向の相対的な位置ずれを示す第２制御信号を生成する第２の制御部とを備えることを特徴とする。

本発明によれば、対物レンズと標本との相対的な位置のずれを、より迅速かつ確実に補正することができる。

本発明を適用した顕微鏡の一実施の形態の構成例を示す図である。 本発明を適用した顕微鏡の他の実施の形態の構成例を示す図である。 本発明を適用した顕微鏡の他の実施の形態の構成例を示す図である。

以下、図面を参照して、本発明を適用した実施の形態について説明する。

〈第１の実施の形態〉
［顕微鏡の構成］
図１は、本発明を適用した顕微鏡の一実施の形態の構成例を示す図である。

顕微鏡１１は、観察対象の標本１２の拡大像を形成して観察するための光学顕微鏡である。標本１２は、水等の媒質に浸された状態でカバーガラスおよびスライドガラスに挟まれて、ステージ２１上に載置される。なお、標本１２を保持しているカバーガラスやスライドガラスなどを、観察対象以外の保持部材とも称する。

顕微鏡１１には、図示せぬ照明装置が設けられており、照明装置は、照明光である可視光を射出して標本１２を照明する。例えば、照明装置が透過型である場合、照明装置は図中、ステージ２１の上側に配置され、照明装置が落射型である場合、照明装置は図中、ステージ２１の下側に配置される。

照明装置からの照明光が標本１２に照射されると、標本１２は観察光を発し、その観察光は、顕微鏡１１の観察光学系により結像される。すなわち、標本１２からの観察光は、対物レンズ２２、ダイクロイックミラー２３、および赤外光カットフィルタ２４を通ってハーフミラー２５に入射する。

ハーフミラー２５に入射した観察光の一部は、ハーフミラー２５をそのまま透過してカメラ用第２対物レンズ２６により集光され、観察光の像がCCD（Charge Coupled Devices）センサ２７により撮像される。CCDセンサ２７による撮像により得られた標本１２の観察画像は、図示せぬモニタに供給され、観察画像が表示される。

また、ハーフミラー２５に入射した観察光の一部は、ハーフミラー２５において反射されて、接眼用第２対物レンズ２８および接眼レンズ２９により集光され、結像する。この観察光の像は、接眼レンズ２９を覗く検鏡者の観察に供せられる。

このように顕微鏡１１では、対物レンズ２２乃至接眼レンズ２９から構成される観察光学系によって、観察光の像、つまり標本１２の拡大像が形成される。なお、ダイクロイックミラー２３は、観察光のアフォーカル系に配置される。なお、ハーフミラー２５に代えて、入射した観察光を所定の分配比で分離するプリズムが配置されるようにしてもよい。そのような場合、例えば、プリズムに入射した観察光が所定の割合の光量だけ反射されて接眼用第２対物レンズ２８に入射し、残りの観察光がプリズムを透過してカメラ用第２対物レンズ２６に入射する。

また、顕微鏡１１には、対物レンズ２２の焦点位置を、常に標本１２上の特定の位置に維持するためのオートクランプ機構を有している。このオートクランプ機構は、標本１２を保持するカバーガラスの表面に近赤外光を照射する照明光学系、カバーガラス表面に近赤外光が照射されて生じた光を結像する結像光学系、および結像光学系により結像された像を受光して得られた信号に基づきステージ２１を移動させる制御系などからなる。

具体的には、顕微鏡１１には、LED（Light Emitting Diode）などからなる光源３０が設けられており、光源３０から射出された近赤外光は、その断面が円形状となるようにレンズ３１により整形されて、ハーフミラー３２に入射する。ハーフミラー３２に入射した近赤外光は、ハーフミラー３２で反射され、さらにハーフミラー３３において反射される。

なお、ハーフミラー３２とハーフミラー３３との間には、ナイフエッジ３４が設けられており、ハーフミラー３２からハーフミラー３３に入射する近赤外光の一部は、ナイフエッジ３４により遮光される。したがって、ハーフミラー３３に入射する近赤外光は、ナイフエッジ３４により、その断面が半月状となるように整形される。

また、ハーフミラー３３において反射した近赤外光は、複数のレンズからなるオフセットレンズ群３５を通ってダイクロイックミラー２３で反射され、さらに対物レンズ２２により集光されてステージ２１上のカバーガラス等に照射される。ここで、ダイクロイックミラー２３の反射面は、標本１２からの観察光をそのまま透過し、近赤外光を反射するようになされている。

このように、顕微鏡１１では、光源３０乃至オフセットレンズ群３５、ダイクロイックミラー２３、および対物レンズ２２からなる照明光学系により、近赤外光がステージ２１上のカバーガラス等に照射される。なお、図１において、実線は近赤外光の光路を示している。なお、光源３０は、LEDに限らず、レーザなどの他の光源でもよい。また、光源３０から射出された近赤外光の断面は円形だけに限らず長方形であってもよい。

例えば、顕微鏡１１では、近赤外光が、標本１２を保持するカバーガラスの表面や、カバーガラスと標本１２との境界面に結像するようになされている。基本的に、カバーガラスの表面に入射した近赤外光は、その表面において正反射するが、カバーガラスの表面には、通常、微小な傷（凹凸）が複数あるため、近赤外光の一部は、カバーガラスの表面の凹凸で散乱する。

したがって、カバーガラス表面に近赤外光が照射されると、近赤外光の正反射光と散乱光や回折光とが生じて、これらの正反射光および散乱光（以降、散乱光／回折光を総称して散乱光と呼ぶ）が対物レンズ２２に回収される（入射する）ことになる。なお、以下においては、カバーガラスから対物レンズ２２に入射する近赤外光のうち、カバーガラスにおいて正反射した近赤外光を正反射光と呼び、対物レンズ２２に入射する近赤外光のうち、正反射光を除く光を散乱光と呼ぶこととする。

カバーガラスから対物レンズ２２に入射した正反射光は、ダイクロイックミラー２３において反射され、さらにオフセットレンズ群３５を通ってハーフミラー３３に入射する。ハーフミラー３３に入射した正反射光の一部は、ハーフミラー３３において反射され、ナイフエッジ３４により遮光される。したがって、ハーフミラー３３で反射した正反射光がハーフミラー３２に入射することはない。なお、より確実に正反射光を遮光するため、ナイフエッジ３４は、光源３０からの近赤外光が半分よりもやや多い光量だけ遮光されるように配置されることが望ましい。また、より確実に正反射光を遮光するため、ハーフミラー３２とレンズ３８との間にスリットが配置されるようにしてもよい。

また、ハーフミラー３３に入射した正反射光の一部は、そのままハーフミラー３３を透過し、レンズ３６により集光されてラインセンサ３７に入射する。ここで、レンズ３６は、対物レンズ２２と共役な位置に配置されており、正反射光の像（スリット像）を結像させる。正反射光の結像位置、つまり近赤外光の像と共役な位置には、ラインセンサ３７の受光面が配置される。

ラインセンサ３７は、レンズ３６から入射した正反射光を受光して光電変換することにより、電気信号を得る。この電気信号は、対物レンズ２２と標本１２の相対的な位置の対物レンズ２２の光軸方向（以下、ｚ方向と称する）へのずれの補正、つまり対物レンズ２２のオートフォーカス制御に用いられる。

なお、図１において、一点鎖線は、カバーガラスからの正反射光の光路を示している。また、以下、対物レンズ２２と標本１２（カバーガラス）のｚ方向への相対的な位置のずれを、単にｚ方向のずれとも称することとする。さらに、ラインセンサ３７は、CCDやPSD（Position Sensitive Detector）などの位置検出器から構成されるようにしてもよい。

一方、カバーガラスから対物レンズ２２に入射した近赤外光の散乱光は、ダイクロイックミラー２３において反射され、さらにオフセットレンズ群３５を通ってハーフミラー３３に入射する。そして、ハーフミラー３３に入射した散乱光の一部は、ハーフミラー３３において反射され、ハーフミラー３２に入射する。このとき、ハーフミラー３２に入射する散乱光の一部は、ナイフエッジ３４により遮光される。

ハーフミラー３２に入射した散乱光の一部は、ハーフミラー３２をそのまま透過してレンズ３８により集光され、２次元光電変換器３９に入射する。ここで、レンズ３８は、対物レンズ２２と共役な位置に配置され、レンズ３８によって２次元光電変換器３９の受光面上に散乱光の像が結像されるようになされている。この散乱光の像は、カバーガラスの表面の像である。つまり、レンズ３８の結像面上に、散乱光によるカバーガラスの表面の像が結像されることになる。

２次元光電変換器３９は、例えば、CCDなどから構成され、レンズ３８から入射した散乱光を受光して光電変換することにより、電気信号を得る。この電気信号は、カバーガラスの表面における近赤外光の散乱パターンを表す散乱像の画像の画像データである。電気信号は、対物レンズ２２と標本１２の相対的な位置のｚ方向と垂直な方向（以下、ｘｙ方向と称する）へのずれの補正、つまり対物レンズ２２のｘｙ方向のクランプ処理に用いられる。

なお、以下、２次元光電変換器３９から出力される電気信号に基づく画像を、散乱画像とも呼ぶこととする。また、図１において、点線は、散乱光の光路を示している。散乱光は、カバーガラス表面で散乱した光であるため、正反射光と比べると光量は少ないが、散乱光の光束は、正反射光の光束よりも太いものとなっている。さらに、以下、対物レンズ２２と標本１２（カバーガラス）のｘｙ方向への相対的な位置のずれを、単にｘｙ方向のずれとも称することとする。

このように、顕微鏡１１では、対物レンズ２２、ダイクロイックミラー２３、オフセットレンズ群３５乃至ハーフミラー３２、レンズ３６、およびレンズ３８からなる結像光学系により、近赤外光の正反射光の像と、カバーガラス表面の凹凸に起因する近赤外光の散乱像とが結像される。

また、結像光学系において散乱光を２次元光電変換器３９に導く光学系、つまり対物レンズ２２、ダイクロイックミラー２３、オフセットレンズ群３５乃至ハーフミラー３２、およびレンズ３８からなる光学系と、照明光学系とから１つの光学系が構成される。この光学系により、近赤外光がカバーガラス表面に照射され、これにより生じた正反射光および散乱光から、散乱光のみが抽出される。つまり、正反射光および散乱光から、ｘｙ方向のクランプ処理に不要な正反射光が除去される。

さらに、顕微鏡１１のオートクランプ機構を構成するステージ２１の制御系として、顕微鏡１１には、フォーカス制御部４０、クランプ処理部４１、および駆動部４２が設けられている。

フォーカス制御部４０は、ラインセンサ３７から供給された電気信号に基づいて、対物レンズ２２と標本１２のｚ方向への相対的な位置の変化量を検出し、その検出結果に応じて駆動部４２を制御することで、ステージ２１のｚ方向への移動を制御する。また、クランプ処理部４１は、２次元光電変換器３９から供給された電気信号に基づいて、対物レンズ２２と標本１２のｘｙ方向への相対的な位置の変化量を検出し、その検出結果に応じて駆動部４２を制御することで、ステージ２１のｘｙ方向への移動を制御する。

駆動部４２は、フォーカス制御部４０やクランプ処理部４１の制御に従って駆動し、ステージ２１を移動させる。なお、顕微鏡１１では、ステージ２１をｚ方向に移動させることにより、対物レンズ２２と標本１２とのｚ方向への相対的な位置関係を変化させると説明したが、対物レンズ２２がステージ２１に対して移動するようにしてもよい。

［顕微鏡の動作］
次に、顕微鏡１１の動作について説明する。

検鏡者が顕微鏡１１を操作して、標本１２の観察を指示すると、顕微鏡１１の図示せぬ照明装置は、標本１２に照明光を照射する。すると、照明光の照射により標本１２から観察光が発せられ、観察光は対物レンズ２２乃至赤外光カットフィルタ２４を通ってハーフミラー２５に入射する。このとき、標本１２からの光のうち、観察光と波長の異なる光、例えば、光源３０からの近赤外光が赤外光カットフィルタ２４により除去される。

また、ハーフミラー２５に入射した観察光の一部は、ハーフミラー２５を透過してカメラ用第２対物レンズ２６により集光され、CCDセンサ２７に入射する。そして、CCDセンサ２７により撮像された観察画像がモニタに表示される。さらに、ハーフミラー２５に入射した観察光の一部はハーフミラー２５で反射され、接眼用第２対物レンズ２８および接眼レンズ２９により集光されて、結像する。これにより、検鏡者は、モニタに表示される観察画像を見たり、接眼レンズ２９を覗いたりして、標本１２を観察することができる。

なお、このとき顕微鏡１１は、光源３０から近赤外光を射出させる。標本１２の観察開始時においては、光源３０からの近赤外光の集光位置と、対物レンズ２２の焦点位置とは同じ位置となっている。そのため、フォーカス制御部４０によるオートフォーカス制御により、対物レンズ２２の合焦位置は、カバーガラスの表面上となる。

そこで、検鏡者は、標本１２に合焦するように顕微鏡１１を操作し、オフセットレンズ群３５を移動させる。すると、顕微鏡１１は、検鏡者の操作等に応じて、オフセットレンズ群３５を構成するレンズを、オフセットレンズ群３５の光軸（近赤外光の光路）と平行な方向に移動させる。オフセットレンズ群３５のレンズが移動されると、正反射光や散乱光の結像位置は変化せずに、カバーガラスに照射される近赤外光の結像位置だけがｚ方向に移動される。また、この場合において、照明光の結像位置も変化しない。

このようにして、オフセットレンズ群３５が移動されると、近赤外光は、カバーガラスの表面に結像しなくなる。すると、フォーカス制御部４０は、近赤外光の像が継続してカバーガラス上の予め定められた位置に結像されるように、オートフォーカス制御によりステージ２１を移動させる。したがって、検鏡者が適切にオフセットレンズ群３５を移動させると、近赤外光がカバーガラスの表面上に結像し、かつ標本１２に合焦した状態となる。

このようにして、近赤外光がカバーガラスの特定の位置に結像するようになると、顕微鏡１１は、継続してその特定位置に近赤外光が結像するように、対物レンズ２２と標本１２との相対的な位置関係を維持する。

すなわち、光源３０からの近赤外光は、レンズ３１により集光されて整形され、ハーフミラー３２乃至ダイクロイックミラー２３を通って対物レンズ２２に入射する。対物レンズ２２は、ダイクロイックミラー２３からの近赤外光を、対物レンズ２２の前焦点に集光させる。ここで、対物レンズ２２に入射する近赤外光の一部は、ナイフエッジ３４により遮光されるため、カバーガラスは近赤外光により斜光照明されることになる。

近赤外光がカバーガラスの表面に照射されると、近赤外光の正反射光と散乱光が生じ、これらの光は対物レンズ２２、ダイクロイックミラー２３、およびオフセットレンズ群３５を通ってハーフミラー３３に入射する。そして、ハーフミラー３３を透過した正反射光および散乱光は、レンズ３６により集光されてラインセンサ３７に入射する。また、ハーフミラー３３で反射された正反射光と散乱光のうち、正反射光と一部の散乱光は、ナイフエッジ３４により遮光され、残りの散乱光がハーフミラー３２を透過し、レンズ３８により集光されて２次元光電変換器３９に入射する。

ここで、ラインセンサ３７の受光面における正反射光の像の位置は、対物レンズ２２と、カバーガラス表面（標本１２）とのｚ方向の距離に応じて変化する。そこで、フォーカス制御部４０は、近赤外光がカバーガラスの表面上に結像するときの、ラインセンサ３７の受光面上の正反射光の結像位置（以下、基準結像位置と称する）を予め記録しておく。

そして、フォーカス制御部４０は、記録している基準結像位置と、ラインセンサ３７から供給された電気信号とに基づいて、対物レンズ２２のｚ方向のずれを検出する。例えば、対物レンズ２２と標本１２との相対的な位置関係のずれは、標本１２を保持するカバーガラスおよびスライドガラスの位置が、ステージ２１上において僅かにずれたり、傾いたりしたときに生じる。

フォーカス制御部４０は、対物レンズ２２のｚ方向のずれを検出すると、基準結像位置に対して、ラインセンサ３７の受光面における正反射光の像の位置がずれている方向と、そのずれ量とに基づいて、ｚ方向のずれを補正するステージ２１の移動方向および移動量を求める。フォーカス制御部４０は、求めた移動方向および移動量に基づいて、駆動部４２を制御し、ステージ２１をｚ方向に移動させる。これにより、ｚ方向のずれが補正されて、対物レンズ２２からの近赤外光がカバーガラスの表面上に結像するようになる。

なお、ラインセンサ３７には、正反射光だけでなく散乱光の一部も入射するが、散乱光の光量は、正反射光の光量に比べて僅かであるため、正反射光の像の位置の検出に影響を及ぼすことはない。

このように、ｚ方向のずれが補正されると、クランプ処理部４１は、２次元光電変換器３９からの電気信号に基づいて対物レンズ２２のｘｙ方向のずれを検出し、その検出結果に応じてｘｙ方向のずれを補正する。

すなわち、クランプ処理部４１は、撮像時刻の異なる２つの散乱画像を用いてパターンマッチングを行うことにより、対物レンズ２２のｘｙ方向のずれを検出する。例えば、クランプ処理部４１は、現時刻よりも前（過去）に撮像された散乱画像を参照画像として一時的に保持し、パターンマッチングにより、参照画像上の散乱像の位置と、その散乱像の新たに撮像された散乱画像上での位置と特定する。そして、クランプ処理部４１は、散乱像の位置の特定結果から、散乱像のｘｙ平面上での移動方向および移動量をｘｙ方向のずれとして求める。この散乱画像は、カバーガラスの表面の像の画像であるから、クランプ処理部４１では、カバーガラスの表面の像の位置の変化が検出されることになる。

さらに、クランプ処理部４１は、検出されたｘｙ方向のずれに基づいて、そのずれが補正されるステージ２１の移動方向および移動量を求め、駆動部４２を制御して、その移動方向に、求めた移動量だけステージ２１を移動させる。これにより、対物レンズ２２からの近赤外光がカバーガラスの特定位置に結像される状態となる。

このように、ｚ方向のずれが補正されてから、つまり標本１２にピントが合った状態とされてから、ｘｙ方向のずれの検出と補正を行うことで、散乱画像上の散乱像のコントラストが最大の状態でｘｙ方向のずれを検出することができる。したがって、より迅速かつ確実に、ｘｙ方向のずれを検出し、そのずれを補正することができる。

なお、クランプ処理部４１に保持される参照画像は、パターンマッチングを行うごとに、最も新しい時刻に撮像された散乱画像に更新されるようにしてもよいし、標本１２の観察開始時に撮像された散乱画像とされるようにしてもよい。参照画像をある程度の時間間隔で更新すれば、散乱画像上の散乱像が経時変化した場合でも、パターンマッチングの精度の低下を防止することができる。

また、対物レンズ２２のｘｙ方向のずれの補正時において、１度の補正でステージ２１を移動させる量を制限するようにしてもよい。そのような場合、クランプ処理部４１は、予め定められた移動量の範囲内で、ステージ２１を移動させる。これにより、異常なパターンマッチング結果による極端な誤動作を回避することができる。

また、この操作により、ステージ２１の移動量が制限された場合には、クランプ処理部４１は、保持している参照画像を破棄し、新たに撮像された散乱画像を参照画像とする。これにより、パターンマッチングによるｘｙ方向のずれの検出精度の低下を防止することができる。

このようにして、ｘｙ方向のずれが検出されて補正されると、近赤外光がカバーガラスの特定位置に結像される状態となる。顕微鏡１１では、その後、この状態が維持されるように、対物レンズ２２のｚ方向のずれを検出し、その検出結果に基づきｚ方向のずれを補正する処理と、対物レンズ２２のｘｙ方向のずれを検出し、その検出結果に基づきｘｙ方向のずれを補正する処理が交互に繰り返し行われる。

その結果、対物レンズ２２と標本１２との相対的な位置関係が３次元方向に固定維持される。つまり、対物レンズ２２の焦点位置が、常に標本１２の所望の部位に位置することになり、検鏡者は、対物レンズ２２の観察視野内において、長時間、同じ位置で所望する標本１２の部位を観察できるようになる。

以上のように、近赤外光をカバーガラスに照射して生じる正反射光と散乱光をそれぞれ抽出して、対物レンズ２２のｚ方向のずれとｘｙ方向のずれを検出するようにしたので、対物レンズ２２と標本１２の相対的な位置のずれを、より迅速かつ確実に補正することができる。

具体的には、近赤外光の正反射光を抽出することによって、すなわちアクティブ方式によりｚ方向のずれを検出することで、パッシブ方式と比べて、より迅速にｚ方向のずれの検出および補正を行うことができる。

また、近赤外光の散乱光を抽出してｘｙ方向のずれを検出することで、パッシブ方式と比べて、より確実にｘｙ方向のずれの検出を行うことができる。

パッシブ方式では、観察画像を用いてｘｙ方向のずれを検出するため、観察画像の輝度が低い場合など、観察対象の標本自体や標本の観察環境によっては、充分な検出精度を得ることができなくなってしまう。また、スライドガラスに対して標本が動いた場合に、標本自体が動いたのか、スライドガラスが対物レンズに対してずれたのかを判別することができない。

これに対して、顕微鏡１１では、標本１２を保持するカバーガラスの表面の凹凸パターンの移動に基づいて、つまり近赤外光の散乱像の移動に基づいてｘｙ方向のずれを検出するため、標本１２自体や標本１２の観察環境によらず、より確実にずれを検出することができる。しかも、散乱画像のパターンマッチングでｘｙ方向のずれを検出すれば、観察画像自体を用いたパターンマッチングよりも、処理量を減らすことができ、より迅速にずれの検出を行うことができる。また、顕微鏡１１では、常に近赤外光がカバーガラスの定められた位置に集光するように、ステージ２１が移動されるので、標本１２自体が移動したのか、標本１２は移動せずにスライドガラスが対物レンズ２２に対して移動したのかを知ることができる。

なお、カバーガラスのきずなど、表面の凹凸で生じる近赤外光の散乱像を用いてｘｙ方向のずれを検出すると説明したが、カバーガラス表面に、予めクランプのためのマークや散乱物質を設けておき、それらのマークや散乱物質で散乱した近赤外光の像を用いてもよい。また、標本１２がディッシュ等の容器に入れられてステージ２１上に載置される場合には、その容器の底に近赤外光を照射し、近赤外光の正反射光や散乱光を利用して、ｚ方向やｘｙ方向のずれを検出すればよい。

〈第２の実施の形態〉
［顕微鏡の構成］
また、顕微鏡１１において１つの撮像素子により、正反射光の像（スリット像）と、散乱像とが交互に撮像されるようにしてもよい。そのような場合、顕微鏡１１は、図２に示すように構成される。なお、図２において、図１における場合と対応する部分には、同じ符号を付してあり、その説明は適宜省略する。

図２の顕微鏡１１には、図１のレンズ３８、２次元光電変換器３９、およびクランプ処理部４１が設けられておらず、図１のラインセンサ３７に代えて２次元光電変換器７１が設けられている。この２次元光電変換器７１は、例えばCCDなどからなり、カバーガラスに照射される近赤外光の結像位置と共役な位置に配置される。

また、顕微鏡１１において、レンズ３６とハーフミラー３３との間には、ハーフミラー３３から２次元光電変換器７１に入射する正反射光と、散乱光の一部とを遮光するナイフエッジ７２が配置されている。

ナイフエッジ７２は、駆動部７３により駆動されて移動し、レンズ３６とハーフミラー３３の間に配置された状態（以下、挿入状態と称する）、またはレンズ３６とハーフミラー３３の間に配置されない状態（以下、非挿入状態と称する）の何れかの状態とされる。ナイフエッジ７２が挿入状態である場合、ハーフミラー３３からの正反射光と、散乱光の一部とがナイフエッジ７２により遮光される。また、ナイフエッジ７２が非挿入状態である場合、ハーフミラー３３からの正反射光と散乱光は、レンズ３６により集光され、２次元光電変換器７１に入射する。

なお、図２において、実線、一点鎖線、および点線は、それぞれ近赤外光、正反射光、および散乱光の光路を示している。

［顕微鏡の動作］
次に、図２の顕微鏡１１の動作について説明する。

標本１２の観察が開始されると、駆動部７３はナイフエッジ７２を非挿入状態とする。すると、ハーフミラー３３からの正反射光は、レンズ３６により集光されて２次元光電変換器７１の一部の受光面に入射する。

２次元光電変換器７１は、入射した正反射光の像を撮像して、その結果得られた電気信号をフォーカス制御部４０に供給する。フォーカス制御部４０は、供給された電気信号に基づいて、対物レンズ２２のｚ方向のずれを検出するとともに、そのずれに基づいて駆動部４２を制御し、ｚ方向のずれが相殺されるようにステージ２１を移動させる。

ナイフエッジ７２が非挿入状態である場合、正反射光は２次元光電変換器７１の受光面の一部分に入射する。このとき、正反射光が入射する２次元光電変換器７１の受光面が、図１のラインセンサ３７として機能する。

ｚ方向のずれが検出されて補正されると、駆動部７３は、ナイフエッジ７２を移動させて挿入状態とさせる。すると、ハーフミラー３３からの正反射光はナイフエッジ７２により遮光されるので、ハーフミラー３３からの散乱光の一部だけがレンズ３６により集光され、２次元光電変換器７１に入射する。

２次元光電変換器７１は、レンズ３６からの散乱光の像を撮像し、その結果得られた散乱画像の電気信号をフォーカス制御部４０に供給する。フォーカス制御部４０は、２次元光電変換器７１からの散乱画像に基づいて、パターンマッチングにより対物レンズ２２のｘｙ方向のずれを検出し、その検出結果に応じて駆動部４２を制御して、ステージ２１を移動させる。これにより、対物レンズ２２のｘｙ方向のずれが相殺される。なお、このとき、フォーカス制御部４０は、現時刻よりも前に撮像された散乱画像を、パターンマッチングに用いる参照画像として保持し、適宜、参照画像の更新を行う。

このようにして、ｘｙ方向のずれが補正されると、対物レンズ２２の標本１２に対するｚ方向の相対的な位置のずれを検出して、そのずれを補正する処理と、対物レンズ２２の標本１２に対するｘｙ方向の相対的な位置のずれを検出し、そのずれを補正する処理が交互に繰り返し行われる。これにより、近赤外光が継続してカバーガラスの特定位置に結像される状態が維持されることになる。

このようにして、駆動部７３がナイフエッジ７２を駆動して、時分割でｚ方向のずれの検出およびｘｙ方向のずれの検出を交互に行うことでも、対物レンズ２２と標本１２の相対的な位置のずれを、より迅速かつ確実に補正することができる。特に、図２の顕微鏡１１では、図１のレンズ３８や２次元光電変換器３９が不要であるため、顕微鏡１１の小型化を図ることができる。

〈第３の実施の形態〉
［顕微鏡の構成］
なお、ｘｙ方向とｚ方向の各方向のずれを検出するのに、近赤外光を用いる例について説明したが、方向ごとに異なる波長の光が用いられてもよい。そのような場合、顕微鏡１１は、例えば図３に示すように構成される。図３において、図１における場合と対応する部分には、同じ符号を付してあり、その説明は適宜省略する。

図３の顕微鏡１１では、近赤外光を射出する光源３０とは別に、例えば、LD（Laser Diode）などからなり、近赤外光と異なる波長の参照光を射出する光源１０１が設けられている。また、図３の顕微鏡１１には、全反射ミラー１０２およびダイクロイックミラー１０３が設けられている。

ダイクロイックミラー１０３は、オフセットレンズ群３５とハーフミラー３３の間に配置され、参照光と近赤外光とを分離する。すなわち、ダイクロイックミラー１０３は、入射した近赤外光をそのまま透過させ、入射した参照光を反射する。また、全反射ミラー１０２は、光源１０１からの参照光を全反射して、ダイクロイックミラー１０３に入射させる。

さらに、図３の顕微鏡１１では、全反射ミラー１０２とダイクロイックミラー１０３とを結ぶ参照光の光路の延長上にレンズ３８および２次元光電変換器３９が配置される。

なお、図３において、実線、一点鎖線、および点線は、それぞれ近赤外光および参照光、近赤外光の正反射光、並びに参照光の散乱光の光路を示している。

［顕微鏡の動作］
次に、図３の顕微鏡１１の動作について説明する。

標本１２の観察が開始されると、光源３０および光源１０１は、それぞれ近赤外光および参照光を射出する。光源３０からの近赤外光は、レンズ３１乃至ハーフミラー３３を通ってダイクロイックミラー１０３に入射する。そして、近赤外光は、ダイクロイックミラー１０３をそのまま透過して、オフセットレンズ群３５乃至対物レンズ２２を通って、標本１２を保持するカバーガラス上の特定位置に集光される。

カバーガラスにおいて正反射した近赤外光である正反射光は、対物レンズ２２乃至オフセットレンズ群３５を通って、さらにダイクロイックミラー１０３を透過し、ハーフミラー３３に入射する。また、正反射光の一部は、ハーフミラー３３を透過してレンズ３６により集光され、ラインセンサ３７に入射する。フォーカス制御部４０は、ラインセンサ３７が正反射光の像を撮像して得られた電気信号に基づいて、対物レンズ２２のｚ方向のずれを検出し、その検出結果に応じて駆動部４２を制御して、ステージ２１をｚ方向に移動させる。

一方、光源１０１からの参照光は、小さな全反射ミラー１０２において全反射して、ダイクロイックミラー１０３に入射する。そして、参照光はダイクロイックミラー１０３において反射して、オフセットレンズ群３５乃至対物レンズ２２を通って、標本１２を保持するカバーガラスの表面に入射する。例えば、参照光は、平行光となった状態で、カバーガラスの表面に入射する。

このように参照光がカバーガラス表面に入射すると、参照光の一部はその表面において散乱し、残りの参照光は表面において正反射する。カバーガラスの表面で生じた、参照光の正反射光および散乱光は、対物レンズ２２乃至オフセットレンズ群３５を通り、ダイクロイックミラー１０３で反射される。

ここで、近赤外光の場合と同様に、参照光の散乱光は、カバーガラス表面で散乱した光であるため、参照光の正反射光と比べると光量は少ないが、散乱光の光束は、正反射光の光束よりも太いものとなっている。

ダイクロイックミラー１０３で反射された参照光の正反射光は、全反射ミラー１０２で反射される。この参照光の正反射光は、全反射ミラー１０２の位置で集光され、確実に遮光されるようにされている。また、ダイクロイックミラー１０３で反射された参照光の散乱光の一部は、全反射ミラー１０２で反射され、残りの散乱光は、レンズ３８により集光されて２次元光電変換器３９に入射する。つまり、ダイクロイックミラー１０３において反射された、参照光の正反射光と、参照光の散乱光の一部は、全反射ミラー１０２により遮光される。

２次元光電変換器３９は、ダイクロイックミラー１０３において反射した参照光の散乱光の像を撮像し、クランプ処理部４１は、２次元光電変換器３９による撮像で得られた散乱画像を用いてパターンマッチングを行い、対物レンズ２２のｘｙ方向のずれを検出する。そして、クランプ処理部４１は、ｘｙ方向のずれの検出結果に基づいて、駆動部４２を制御し、ｘｙ方向のずれが相殺されるように、ステージ２１を移動させる。なお、ｘｙ方向のずれの検出は、ｚ方向のずれの検出および補正がされた後に行われる。

このようにして、ｘｙ方向のずれが補正されると、対物レンズ２２のｚ方向のずれを検出して、そのずれを補正する処理と、対物レンズ２２のｘｙ方向のずれを検出し、そのずれを補正する処理が交互に繰り返し行われる。

このようにして、互いに波長の異なる近赤外光および参照光を用いて、ｚ方向のずれの検出およびｘｙ方向のずれの検出を行うことで、対物レンズ２２と標本１２の相対的な位置のずれを、より迅速かつ確実に補正することができる。

特に、図３の顕微鏡１１では、ｘｙ方向のずれの検出に、ｚ方向のずれの検出用の近赤外光とは異なる波長の参照光を用いるようにしたので、参照光を任意の光学系とすることができ、よりｘｙ方向のずれの検出精度を向上させることができる。例えば、より大きい散乱画像を得ることができる光学系などを採用することができる。

また、近赤外光とは異なる波長の参照光でｘｙ方向のずれを検出すれば、参照光の光量を任意に変更できることから、散乱光の光量の低下を防止することができるだけでなく、顕微鏡１１における光学系の設計の自由度をより高くすることができる。

なお、図３の顕微鏡１１では、オフセットレンズ群３５が、近赤外光と参照光の共通する光路上に配置されているため、近赤外光および参照光の結像位置を同時に同じ距離だけ、ｚ方向に移動させることができる。

また、以上においては、近赤外光の正反射面と、参照光の散乱面がカバーガラス表面、つまり同一面であると説明したが、必ずしも同一面である必要はない。同様に、図１および図２に示した例においても、近赤外光の正反射面と散乱面が同一面でなくてもよい。例えば、近赤外光の正反射面がカバーガラスと標本１２との境界面とされ、近赤外光の散乱面が、カバーガラスにおける、その境界面とは異なる表面とされてもよい。

また、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。

１１ 顕微鏡， １２ 標本， ２１ ステージ， ２２ 対物レンズ， ３０ 光源， ３３ ハーフミラー， ３４ ナイフエッジ， ３５ オフセットレンズ群， ３７ ラインセンサ， ３９ ２次元光電変換器， ４０ フォーカス制御部， ４１ クランプ処理部， ４２ 駆動部， ７１ ２次元光電変換器， ７２ ナイフエッジ， ７３ 駆動部， １０１ 光源， １０２ 全反射ミラー， １０３ ダイクロイックミラー

Claims (9)

1. 対物レンズと、
   前記対物レンズを介して標本または保持部材に照射光を照射する光源と、
   一部遮光された前記照射光で照射された前記標本または前記保持部材において正反射した正反射光を、前記対物レンズを介して受光する第１の受光部と、
   前記第１の受光部が前記正反射光を受光して得られる信号に基づいて、前記対物レンズと前記標本または前記保持部材との光軸方向の相対的な位置ずれを示す第１制御信号を生成する第１の制御部と、
   前記照射光が前記標本または前記保持部材に照射されて生じた散乱光を、前記対物レンズを介して受光する第２の受光部と、
   前記標本または前記保持部材から前記第２の受光部に入射する、前記正反射光と前記散乱光の一部とを遮光する第１の遮光部と、
   前記第２の受光部が前記散乱光を受光して得られる信号に基づいて、前記対物レンズと前記標本または前記保持部材との前記光軸と垂直な方向の相対的な位置ずれを示す第２制御信号を生成する第２の制御部と
   を備えることを特徴とする３次元方向ドリフト制御装置。
2. 前記正反射光は、前記標本と前記保持部材との境界面、あるいは前記保持部材の表面から生じ、
   前記散乱光は、前記保持部材の表面に存在する凹凸部から生じる
   ことを特徴とする請求項１に記載の３次元方向ドリフト制御装置。
3. 前記第１の制御部および前記第２の制御部は、前記対物レンズと前記標本または前記保持部材との相対的な位置関係のずれを補正するように、前記第１制御信号および前記第２制御信号に基づき、前記位置関係を変化させる
   ことを特徴とする請求項１に記載の３次元方向ドリフト制御装置。
4. 前記第１の遮光部は、前記光源から前記対物レンズに入射する前記照射光の一部を遮光し、
   前記第１の受光部は、前記第１の遮光部により一部遮光された前記照射光が照射された前記標本または前記保持部材において正反射した正反射光を、前記対物レンズを介して受光する
   ことを特徴とする請求項１に記載の３次元方向ドリフト制御装置。
5. 前記第１の受光部を構成する前記正反射光の受光面は、前記第２の受光部を構成する前記散乱光の受光面の一部の領域とされ、
   前記第１の遮光部は、前記対物レンズと前記第２の受光部との間に配置された状態において、前記第２の受光部に入射する、前記正反射光と前記散乱光の一部とを遮光し、
   前記第１の遮光部が前記対物レンズと前記第２の受光部との間に配置された状態、または前記第１の遮光部が前記対物レンズと前記第２の受光部との間に配置されない状態の何れか一方の状態となるように、前記第１の遮光部を移動させる駆動部と、
   前記光源から前記対物レンズに入射する前記照射光の一部を遮光する第２の遮光部と
   をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の３次元方向ドリフト制御装置。
6. 前記光源は、前記対物レンズを介して前記標本または前記保持部材に第１照射光を照射する第１光源と、前記第１照射光とは波長の異なる第２照射光を前記標本または前記保持部材に照射する第２光源とから構成され、
   前記第１光源から前記対物レンズに入射する前記第１照射光の一部を遮光する第２の遮光部をさらに備え、
   前記第１の受光部は、前記第２の遮光部により一部遮光された前記第１照射光が前記標本または前記保持部材に照射されて生じた正反射光を、前記対物レンズを介して受光し、
   前記第１の遮光部は、前記第２照射光が前記標本または前記保持部材に照射されて生じた前記正反射光と前記散乱光の一部とを遮光し、
   前記第２の受光部は、前記第１の遮光部により一部遮光された前記散乱光を受光する
   ことを特徴とする請求項１に記載の３次元方向ドリフト制御装置。
7. １または複数のレンズから構成されるとともに、前記対物レンズに入射する前記第１照射光と前記第２照射光の共通する光路上に配置され、前記対物レンズによる前記第１照射光および前記第２照射光の集光位置を、前記光軸方向に変化させるオフセット部をさらに備える
   ことを特徴とする請求項６に記載の３次元方向ドリフト制御装置。
8. 請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の３次元方向ドリフト制御装置が搭載された顕微鏡装置。
9. 前記保持部材を保持するステージを有し、
   前記第２の制御部は、前記保持部材の表面の像の変化に基づき前記ステージを制御する
   ことを特徴とする請求項８に記載の顕微鏡装置。

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