JP2009109788A - レーザー走査型顕微鏡 - Google Patents

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Abstract

【課題】本発明では多光子励起顕微鏡やSHG顕微鏡等の非線形光学顕微観察方法において、光学素子の切り替えを必要としない方法で透過側からの蛍光／SHG光検出と偏射照明によるコントラスト法を両立することができるレーザー走査型顕微鏡を提供する。
【解決手段】上記課題は、赤外線パルスレーザーと、前記赤外線パルスレーザーからの赤外光を標本上に集光させる対物レンズと、非線形光学効果により前記赤外光よりも短い波長の観察光を集めるために前記標本を挟んで前記対物レンズの反対側に配置されたコンデンサレンズと、前記コンデンサレンズで集められた前記観察光を検出する可視光検出器を備えたレーザー走査型顕微鏡において、前記コンデンサレンズの前側焦点位置近傍に部分的に赤外光の透過特性を変えたＩＲ部分透過フィルタを配置し、前記コンデンサレンズで集められた前記標本からの透過光を、前記ＩＲ部分透過フィルタを通して検出する赤外光検出器を備えることを特徴とするレーザー走査型顕微鏡によって解決される。
【選択図】図１

Description

本発明は顕微鏡の技術分野に関する。
顕微鏡における蛍光観察の手段として、多光子励起を利用した蛍光観察法が知られている。
多光子励起では、吸収波長のほぼ整数倍の波長を持つ波長の光線を同時に蛍光体に照射することにより、本来の吸収波長と同等な励起現象が引き起こされる。この多光子励起現象は非線形現象と呼ばれ、たとえば２光子励起の場合は励起光の強度の２乗に比例した確率で励起現象が起きる。
一方、顕微鏡の対物レンズによる励起光の集光は、焦点面からの距離の２乗に反比例して光密度が低くなる。すなわち、顕微鏡における多光子励起現象は焦点のごく近傍のみに起こり、この部分からのみ蛍光が放射される。
この性質により、通常の共焦点顕微鏡で使われる焦点面以外で起こる蛍光の放射を遮るための検出側の共焦点ピンホールは、多光子励起レーザー走査型顕微鏡においては必要とされない。また、焦点面でのみ励起現象が起きるために、試料内の蛍光の褪色も少なくてすむという利点もある。
また、多光子励起で用いられる励起光は通常よりも長い波長となるために、一般に赤外の領域の光線となる。そして、一般に波長が長い光のほうが散乱しにくいという性質（レイリー散乱）を持つことから、生体試料のような散乱性試料では試料のより深くまで励起光が到達するという性質を持っている。このことは、通常の可視光では観察することができなかった生体の深部まで観察することが可能になることを意味する。
以上のように顕微鏡において多光子励起を利用した蛍光観察は、現在において非常に有効な手段となっている。
また、ＳＨＧ（Second-Harmonic Generation：第２高調波）を利用した顕微鏡も、照射光の半波長に相当する光が検出される。つまり、ＳＨＧ顕微鏡においても、レイリー散乱の影響が少ないことや標本を光侵襲の影響が少ないなどの長所を持つ。
これらの顕微鏡を使って試料を観察する際には、前もって別の観察方法によって試料の下準備を行うことが多い。特に、試料に対してパッチクランプ法を使った観察をする場合には、試料の特定部位に正確に電極を設置しなければいけない。このような場合ではＤＩＣ（微分干渉観察）や偏射照明による観察によってパッチクランプを取り付けた後に、多光子励起観察やＳＨＧ観察を行っていた。
特開平１１−１３３３０８号公報 特許第２９３１２６８号公報
しかしながら、ＤＩＣや偏射照明を使った試料の下準備には大きな問題がある。
DIC観察では、対物レンズの像側にノマルスキープリズムあるいはウォーラストンプリズムを配置する必要があるが、対物レンズに入射されるレーザーがこれらプリズムにより標本位置で僅かに横ズレした２光束に分岐されてスポットを結ぶため、分解能の低下や明るさの低下が問題となる。このため、レーザーによる観察時にはこれらプリズムを光路から外し、透過照明光によるDIC観察時に光路に入れる作業が必要であり、パッチクランプなどの作業を行う際には、僅かな振動により電極が外れるなど問題があった。
また、レーザーによる透過光DICでは消光比の高い直線偏光光が必要であるが、レーザー自体の消光比が低くかつ対物レンズにたどり着くまでの光学系によって偏光が崩れてしまうため、偏光板を通す必要がある。非線形顕微観察方法では、励起効率がレーザー強度の乗数倍に比例するため偏光板による光量ロスは検出感度の低下、散乱体の深部観察深さ限界を下げる原因となる。
偏射照明によるコントラスト方法では、コンデンサレンズの前側焦点位置にスリットを配置して透過照明光に偏りを付けて照明するので、多光子励起観察時やＳＨＧ観察時にはこのスリットを光路から外す必要がある。その場合もやはり、スリットの挿脱時の僅かな振動により電極が外れるなど問題があった。
以上の技術的問題に鑑み、本発明では多光子励起顕微鏡やSHG顕微鏡等の非線形光学顕微観察方法において、光学素子の切り替えを必要としない方法で透過側からの蛍光／SHG光検出と偏射照明によるコントラスト法を両立することができるレーザー走査型顕微鏡を提供する。
本発明の上記の課題は、赤外線パルスレーザーと、前記赤外線パルスレーザーからの赤外光を標本上に集光させる対物レンズと、非線形光学効果により前記赤外光よりも短い波長の観察光を集めるために前記標本を挟んで前記対物レンズの反対側に配置されたコンデンサレンズと、前記コンデンサレンズで集められた前記観察光を検出する可視光検出器を備えたレーザー走査型顕微鏡において、前記コンデンサレンズの前側焦点位置近傍に部分的に赤外光の透過特性を変えたＩＲ部分透過フィルタを配置し、前記コンデンサレンズで集められた前記標本からの透過光を、前記ＩＲ部分透過フィルタを通して検出する赤外光検出器を備えることを特徴とするレーザー走査型顕微鏡によって解決される。
このとき、前記可視光検出器と前記赤外光検出器は光電子増倍管であることが好ましい。
また、本発明の上記の課題は、赤外線パルスレーザーと、前記赤外線パルスレーザーからの赤外光を標本上に集光させる対物レンズと、非線形光学効果により前記赤外光よりも短い波長の観察光を集めるために前記標本を挟んで前記対物レンズの反対側に配置されたコンデンサレンズと、前記コンデンサレンズで集められた前記観察光を検出する可視光検出器を備えたレーザー走査型顕微鏡において、前記コンデンサレンズの前側焦点位置近傍に部分的に赤外光の透過特性を変えたＩＲ部分透過フィルタを配置し、前記コンデンサレンズと前記ＩＲ部分透過フィルタを通じて前記標本を照明する赤外線光源と、前記対物レンズで集められた前記標本からの透過光を検出する赤外光検出器を備えることを特徴とするレーザー走査型顕微鏡によっても解決される。
このとき、前記可視光検出器は光電子増倍管であり、前記赤外光検出器は２次元撮像素子であることが好ましい。
上記構成において、前記ＩＲ部分透過フィルタは、可視光を有効光束径の全領域で透過し、赤外光を有効光束径に対して偏心した領域を透過するように構成することが望ましい。このとき、前記ＩＲ部分透過フィルタは、第１の扇形領域は赤外光を透過せずに可視光を透過し、第２の扇形領域は赤外光と可視光の両方を透過するように構成することが考えられる。
また、前記ＩＲ部分透過フィルタは、第１の光学フィルタと第２の光学フィルタを重ね合わせて構成され、前記第１の光学フィルタと前記第２の光学フィルタの相対的位置を変えることによって偏射照明を可変できる構成も考えられる。
上記構成のレーザー走査型顕微鏡によれば、ＩＲ部分透過フィルタが偏射照明時には部分開口として作用し蛍光／SHG光検出時には部分開口として作用しないので、光学素子の切り替えを必要としない方法で透過側からの蛍光／SHG光検出と偏射照明によるコントラスト法を両立することができるレーザー走査型顕微鏡が提供される。
以下では、図面を参照して本発明の実施の形態の説明を行う。なお、ここでは多光子励起レーザー走査型顕微鏡の例を使って本発明の実施について説明を行うが、本発明の実施はこの例に限らず、ＳＨＧ顕微鏡においても実施することができる。
図１は本発明の実施による多光子励起レーザー走査型顕微鏡の形態例を説明する概略図である。多光子励起レーザー走査型顕微鏡における励起光源は赤外線パルスレーザー１が一般に用いられる。ここでパルスレーザーを用いる理由としては、焦点面での光子密度を効率よく高めることができることが挙げられる。赤外線パルスレーザー１は大きな装置であるので、顕微鏡の外部に備え付けられ、そこからのスキャンユニット２に赤外光（励起光）を導入する。なお、図１におけるスキャンユニット２は顕微鏡３に内蔵されている形態をしているが、この形態に限らずに顕微鏡３の外に設置してもよい。
赤外線パルスレーザー１から発射された赤外光はスキャンユニット２に導入され、スキャンユニット２の内部に配置されたガルバノミラー等の走査手段４によって偏向される。この走査手段は対物レンズ７の瞳位置に配置されているので、ここで偏向された励起光は最終的に試料面上を走査する。走査手段４を通過した励起光は瞳投影レンズ５と結像レンズ６を経由して、対物レンズ７により、赤外光（励起光）が標本８に照射される。
本実施例では多光子励起による蛍光を透過検出するので、標本８から発した蛍光は、コンデンサレンズ９によって集められる。この時、標本８から発した蛍光だけではなく、標本８を透過する赤外光（励起光）もコンデンサレンズ９によって集められることに気を付けたい。
本実施例では、コンデンサレンズ９の前側焦点位置に、図３を用いて後述する部分的に透過特性を変えたＩＲ部分透過フィルタ１０を配置する。そしてＩＲ部分透過フィルタ１０の後段にダイクロイックミラー１１を配置する。そしてダイクロイックミラー１１によって分離された光路のそれぞれに蛍光検出ユニット１２と赤外光検出器１５を配置する。このとき、多光子励起で放射される蛍光は励起光よりも波長が短いので、短い波長の光を蛍光検出ユニット１２に導くような配置にする。本実施例では特に短い波長を反射する構成を図示している。
上記の構成により、試料内から放射された多光子励起による蛍光はコンデンサレンズ９によって集められ、ＩＲ部分透過フィルタ１０を透過し、ダイクロイックミラー１１によって反射され蛍光検出ユニット１２に導かれる。
蛍光検出ユニット１２には赤外線カットフィルタ１３と蛍光検出器１４が備えられ、余分な励起光を除去したものを検出する。このとき、蛍光検出器１４は光電子増倍管であることが望ましい。また、検出器１４は一基ではなく、複数設置してマルチチャンネルで検出してもよい。なお、図１では蛍光検出ユニット１２は顕微鏡３の本体内に配置されるように記述されるが、本発明はこの配置に限定されることはない。例えば、図１の紙面の垂直方向に光路を導き、顕微鏡の外部に備える構成も考えられる。
一方、試料内を透過した赤外光はコンデンサレンズ９によって集められ、ＩＲ部分透過フィルタ１０を透過し、ダイクロイックミラー１１を透過し、赤外光検出器１２に導かれる。図１で示される本実施例では、通常は透過照明に利用される光路を使ってランプハウス部分に赤外光検出器１５を配置した例となっている。
この赤外光検出器１５は、パッチクランプの設置などの試料の下準備のときに、形体観察として利用される。具体的には、赤外線パルスレーザー１の強度を絞った状態で試料８に照射し、その透過光を検出する。このとき、コンデンサレンズ９の前側焦点位置に配置されたＩＲ部分透過フィルタ１０は赤外光を部分的に透過するので、試料８を偏射透過した赤外光のみがダイクロイックミラー１１に到達する。よって、ダイクロイックミラー１１によって分離されて赤外光検出器１５に導かれた赤外光には偏射照明による観察光の成分が検出される。
一方、多光子励起観察における検出光は可視光域にありＩＲ部分透過フィルタ１０の影響を受けないので、多光子励起観察は通常と同様に行える。つまり上記の構成によれば、多光子励起観察と偏射照明観察が光路の切り換えや部材の変更なしに切り変えることができる。
なお、図１中で示される符号１６と１７は光路を制御するためのミラーである。これはプリズムを使って光路を制御してもよい。
以下では、図２を参照しながら他の実施形態による多光子励起レーザー走査型顕微鏡の概略的な全体構成を示す。
実施例２においても、励起光源は赤外線パルスレーザー１が一般的に用いられる。ここで発射された赤外光はスキャンユニット２に導入され、走査手段４と瞳投影レンズ５と結像レンズ６などを通過し、対物レンズ７を通じて標本８に照射される。このとき、スキャンユニット２は顕微鏡３に内蔵される形態をとっても、外部に設置する形態をとっても構わないことは実施例１と同様である。
本実施の形態においても透過光を検出するので、標本８から発した蛍光は、コンデンサレンズ９によって集められる。コンデンサレンズ９を透過した蛍光は、前側焦点位置に置かれた部分的に透過特性を変えたＩＲ部分透過フィルタ１０（詳細は図３を使って後述する）を透過し、ダイクロイックミラー１１によって反射され、蛍光検出ユニット１２に導かれる。なお、図２でも蛍光検出ユニット１２は顕微鏡３の本体内に配置されるように記述されるが、本発明の実施はこの配置に限定されることはない。
蛍光検出ユニット１２には赤外線カットフィルタ１３と蛍光検出器１４が備えられ、余分な励起光を除去したものを検出する。このとき、蛍光検出器１４は光電子増倍管であることが望ましい。また、検出器１４は一基ではなく、複数設置してマルチチャンネルで検出してもよい。
本実施の形態ではダイクロイックミラー１１によって分離された光路のもう一方に赤外線光源１９を備える。この光源はパルスレーザーではなく、例えばハロゲンランプなどの赤外線放射を利用した光源を使ってもよい。図２に記載される例では、赤外線光源１８を通常のランプハウス位置に配置した構成を示している。
赤外線光源１８から発せられた赤外光はダイクロイックミラー１１を透過し、ＩＲ部分透過フィルタ１０によって光束を制限される。このＩＲ部分透過フィルタ１０はコンデンサレンズ９の前側焦点位置に配置されているので、ＩＲ部分透過フィルタ１０を透過した赤外光は偏射照明となって標本８に照射される。
偏射照明された標本８からの透過光は対物レンズ７によって集められ、ダイクロイックミラー１９によって励起光路（赤外線パルスレーザーへ至る光路）と分離され、赤外光撮像装置２０によって撮像される。ここで、赤外光撮像装置２０は赤外線ＣＣＤなどの２次元撮像素子を利用することが望ましい。つまり、不図示の結像レンズをダイクロイックミラー１９と赤外光撮像素子２０の間に配置して、標本８と赤外光撮像装置２０は光学的に共役な位置に配置する。
上記の実施の形態によっても、多光子励起観察と偏射照明観察が光路の切り換えや部材の変更なしに切り変えることができる。
以下では、図３を参照しながら、上記の実施例１と実施例２で利用されたＩＲ部分透過フィルタの実施例を説明する。
図３の（ａ）は、本発明の実施に利用される最も簡単なＩＲ部分透過フィルタ１０の例を示す。この例では、市松模様で示される鈍角扇形領域は赤外光を透過せずに可視光を透過し、残りの鋭角扇形領域は赤外光と可視光の両方を透過するように構成する。この構成によって赤外光を部分的に透過することによって偏射照明を実現する。
図３の（ｂ）は、本発明の実施に利用されるＩＲ部分透過フィルタ１０のもう一つ例を示す。この例では、第１のＩＲ部分透過フィルタ２１と第２のＩＲ部分透過フィルタ２２の二つを重ね合わせることによってＩＲ部分透過フィルタを構成する。例えば図３の（ｂ）に示されるように、第１のＩＲ部分透過フィルタ２１では赤外光と可視光の両方を透過する扇形領域を構成し、第２のＩＲ部分透過フィルタ２２では赤外光を透過せず可視光を透過する勾玉状の領域を構成する。この二つを重ねて角度を調節することによって偏射照明の度合いを調節することができる。
なお、本発明の実施に利用されるＩＲ部分透過フィルタ２１の実施例は上記の例に制限されるものではない。例えば、赤外光を透過させる領域を矩形とした例や、アーチ形とした例など、様々な形状とすることができる。また、赤外光を透過させる領域の形状によって、２枚のＩＲ部分透過フィルタの相対的位置の変化のさせ方を変更することが好ましい。たとえば、赤外光部分透過領域を矩形とした場合は平行移動による相対位置変化の方が好ましい。
本発明実施の第一形態を示す多光子励起レーザー走査型顕微鏡の概略図である。 本発明実施の第二形態を示す多光子励起レーザー走査型顕微鏡の概略図である。 本発明の実施に使われるＩＲ部分透過フィルタの概略図である。
符号の説明
１・・・赤外線パルスレーザー
２・・・スキャンユニット
３・・・顕微鏡
４・・・走査手段
５・・・瞳投影レンズ
６・・・結像レンズ
７・・・対物レンズ
８・・・標本
９・・・コンデンサレンズ
１０・・・ＩＲ部分透過フィルタ
１１・・・ダイクロイックミラー
１２・・・蛍光検出ユニット
１３・・・赤外線カットフィルタ
１４・・・検出器
１５・・・赤外光検出器
１６・・・ミラー
１７・・・ミラー
１８・・・赤外線光源
１９・・・ダイクロイックミラー
２０・・・赤外光撮像素子
２１・・・第１のＩＲ部分透過フィルタ
２２・・・第２のＩＲ部分透過フィルタ

Claims (7)

  1. 赤外線パルスレーザーと、
    前記赤外線パルスレーザーからの赤外光を標本上に集光させる対物レンズと、
    非線形光学効果により前記赤外光よりも短い波長の観察光を集めるために前記標本を挟んで前記対物レンズの反対側に配置されたコンデンサレンズと、
    前記コンデンサレンズで集められた前記観察光を検出する可視光検出器を備えたレーザー走査型顕微鏡において、
    前記コンデンサレンズの前側焦点位置近傍に部分的に赤外光の透過特性を変えたＩＲ部分透過フィルタを配置し、
    前記コンデンサレンズで集められた前記標本からの透過光を、前記ＩＲ部分透過フィルタを通して検出する赤外光検出器を備えることを特徴とするレーザー走査型顕微鏡。
  2. 前記可視光検出器と前記赤外光検出器は光電子増倍管であることを特徴とする請求項１に記載のレーザー走査型顕微鏡。
  3. 赤外線パルスレーザーと、
    前記赤外線パルスレーザーからの赤外光を標本上に集光させる対物レンズと、
    非線形光学効果により前記赤外光よりも短い波長の観察光を集めるために前記標本を挟んで前記対物レンズの反対側に配置されたコンデンサレンズと、
    前記コンデンサレンズで集められた前記観察光を検出する可視光検出器を備えたレーザー走査型顕微鏡において、
    前記コンデンサレンズの前側焦点位置近傍に部分的に赤外光の透過特性を変えたＩＲ部分透過フィルタを配置し、
    前記コンデンサレンズと前記ＩＲ部分透過フィルタを通じて前記標本を照明する赤外線光源と、
    前記対物レンズで集められた前記標本からの透過光を検出する赤外光検出器を備えることを特徴とするレーザー走査型顕微鏡。
  4. 前記可視光検出器は光電子増倍管であり、前記赤外光検出器は２次元撮像素子であることを特徴とする請求項３に記載のレーザー走査型顕微鏡。
  5. 前記ＩＲ部分透過フィルタは、可視光を有効光束径の全領域で透過し、赤外光を有効光束径に対して偏心した領域を透過するように構成することを特徴とする請求項１から請求項４の何れかに記載のレーザー走査型顕微鏡。
  6. 前記ＩＲ部分透過フィルタは、第１の扇形領域は赤外光を透過せずに可視光を透過し、第２の扇形領域は赤外光と可視光の両方を透過するように構成することを特徴とする請求項１から請求項４の何れかに記載のレーザー走査型顕微鏡。
  7. 前記ＩＲ部分透過フィルタは、第１の光学フィルタと第２の光学フィルタを重ね合わせて構成され、前記第１の光学フィルタと前記第２の光学フィルタの相対的位置を変えることによって偏射照明を可変できることを特徴とする請求項１から請求項４の何れかに記載のレーザー走査型顕微鏡。
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