JPH1020198A

JPH1020198A - 近赤外線顕微鏡及びこれを用いた顕微鏡観察システム

Info

Publication number: JPH1020198A
Application number: JP17252996A
Authority: JP
Inventors: Katsuyuki Abe; 勝行阿部
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1996-07-02
Filing date: 1996-07-02
Publication date: 1998-01-23
Also published as: US5966204A

Abstract

(57)【要約】【課題】厚さが２００〜３００μｍに及ぶ生物試料に
おいて、試料表面から１００μｍ以上内部の細胞の観察
が可能であると同時に、可視光線領域の波長を想定した
色収差補正が行われる通常の対物レンズを近赤外線領域
で使用しても結像性能には影響を与えることのない近赤
外線顕微鏡及びこれを用いた顕微鏡観察システムを提供
する。【解決手段】本発明は、照明用光源であるハロゲンラ
ンプ１，近赤外線透過フィルタ２，高分子偏光フィルム
３，ハロゲンランプ１からの光を常光線と異常光線とに
分離する複屈折光学素子４，コンデンサレンズ５，試料
６ａが載置されるステージ６，対物レンズユニット７，
分離された常光線と異常光線とを再合成する複屈折光学
素子８，及び高分子偏光フィルム９からなる近赤外線顕
微鏡１０と、電子撮像素子１１と、画像処理装置１２
と、表示モニタ１３とにより構成されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、透明乃至ほぼ透明
な生物試料の内部観察，計測等に用いられる近赤外線顕
微鏡とこれを用いた顕微鏡観察システムに関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、生物学の研究分野においては、従
来の形態観察から細胞間の情報伝達機構を調べることに
主眼が移りつつある。これに伴い生物試料は可能な限り
生態内に近い状態を維持するために、従来よりも厚く
（例えば、２００〜３００ｎｍ以上）作製されることが
多くなってきている。ところが、試料として用いられる
表面付近の細胞は、生態から切り取られる作業時にダメ
ージを受けており、生態に近い状態とは云い難い。従っ
て、生態に近い状態の細胞を観察，計測するためには、
細胞の表面より約５０ｎｍ以上下層の部分を観察しなけ
ればならない。しかし、透明乃至ほぼ透明な試料を可視
化するために広く用いられる位相差顕微鏡では、試料の
厚さが２００〜３００μｍとなると、ハロと称される位
相差顕微鏡特有の現象が生じてしまい、細胞内部の微細
構造の観察は困難になる。このことは、「光学顕微鏡の
基礎と応用（３）」小松啓，応用物理第６０巻第１０
号（１９９１），１０３０〜１０３４頁に記載されてい
る。又、微分干渉顕微鏡を用いても、試料の厚さによる
光の散乱の影響を強く受け、目視観察では細胞の表面よ
り２０〜３０μｍ程度までの内部観察が限界であった。

【０００３】そこで、最近になって、散乱の影響の少な
い赤外線を微分干渉観察に用い、画像処理によるコント
ラスト増強とを組み合わせて厚い生物細胞の内部を観察
する手法が開発された。この技術内容の詳細は、次の各
文献に記載されている。文献１：Bert Sakmann and Brwin Neher「Single-Chann
el Recording」Second Edition Plenum, New York,P202
-206 文献２：Kettenman H.,Grantyn R. 「Practical electr
ophysiologicalmethod」 Wiley-Liss,New York,P6-10
(Infrared video microscopyof living brain slices) 文献３：Dodt H.U.,Zieglgansberger W.「Visualizing
unstained neurons inliving brain slices by infrare
d DIC-videomicroscopy 」BrainRes 537 (1990), P333-
336 又、特に文献３では、厚さ３００μｍのラット脳スライ
スにおいて、この試料の表面より約５０〜１００μｍ内
部にある神経細胞が観察された旨記載されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】更に、上記の各文献に
おいて、例えば、文献１には、ドイツＳｃｈｏｔｔ社製
の色ガラスフィルタ（商品名：ＲＧ９、分光透過率特性
は図８に示したグラフの通りである）を近赤外線透過フ
ィルタとして用いて細胞の観察を行った結果が記載され
ている。又、文献２には、文献１と同様ドイツＳｃｈｏ
ｔｔ社製のＲＧ９若しくは透過率が最大となる波長が７
５０ｎｍである干渉フィルタにＳｃｈｏｔｔ社製の熱吸
収フィルタ（商品名：ＫＧ４、分光透過率特性は図９に
示したグラフの通りである）を組み合わせたものを近赤
外線透過フィルタとして用いて細胞の観察を行った結果
が記載されている。更に、文献３には、７５０〜１０５
０ｎｍの領域の波長を透過し得る干渉フィルタを近赤外
線透過フィルタとして用いて細胞の観察を行った結果が
記載されている。しかし、これら各文献に記載されてい
る近赤外線透過フィルタは、透過する波長領域が概ね７
００〜１２００ｎｍに亘っており、次のような不具合を
含むものである。

【０００５】まず、顕微鏡の結像光学系、特に対物レン
ズにより発生する色収差の問題がある。一般に、顕微鏡
の対物レンズにおいては、可視光線領域（４５０〜６５
０ｎｍの波長領域）の波長を想定した色収差の補正がな
される。尚、この色収差補正レベルは、アポクロマー
ト，アクロマートといった名称で示される。例えば、ア
ポクロマート対物レンズとしては、特開平６−１６０７
２０号公報に開示されたものが知られている。アポクロ
マート，アクロマートレベルにかかわらず、これらのレ
ベルで色収差補正がなされる対物レンズを近赤外線領域
で使用すると、ある単一波長（例えば８００ｎｍの波
長）においては、結像位置を可視光線を用いた場合より
もずらしさえすれば良好な結像性能を維持し得るものも
あるが、７００〜１２００ｎｍの領域の波長では、色収
差が大きく発生し、試料内部の結像性能の劣化を招く。
この結果、散乱の少ない近赤外線を使用しているにもか
かわらず、従来技術では、試料表面より約５０〜１００
μｍ程度の内部の細胞を観察できるにすぎなかった。

【０００６】又、７００〜１２００ｎｍの領域の波長を
用いると、顕微鏡本体の熱変形，試料の温度上昇を引き
起こす原因ともなり得る。具体的には、ハロゲンランプ
を照明用光源として使用することが多いが、このような
場合には、９００〜１１００ｎｍ付近の放射強度が最も
強くなる。ところで、近年、生物学の顕微鏡分野で広く
用いられているマニピュレータによって、直径数μｍ程
度の微小なガラス電極を細胞膜表面に密着させ、細胞膜
のＣａイオンチャンネルの電気特性を調べる、所謂パッ
チクランプ法と呼ばれる手法が用いられている。しか
し、この場合、試料上に９００〜１１００ｎｍの波長が
到達すると、その熱によって試料がダメージを受けた
り、試料を保存する溶液の状態が安定せず、細胞膜表面
にガラス電極を密着させることが難しくなるという不具
合を生じさせていた。

【０００７】そこで、本発明は上記のような従来技術の
問題点に鑑みなされたものであり、その目的とするとこ
ろは、厚さが２００〜３００μｍに及ぶ生物試料におい
て、試料表面から１００μｍ以上内部の細胞の観察や細
胞に対する操作が安定して行えると同時に、可視光線領
域の波長を想定した色収差補正が行われる通常の対物レ
ンズを近赤外線領域で使用しても結像性能に影響を与え
ることのない近赤外線顕微鏡及びこれを用いた顕微鏡観
察システムを提供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明による近赤外線顕微鏡及びこれを用いた顕微
鏡観察システムは以下のような特徴を備えている。

【０００９】請求項１にかかる発明は、少なくとも赤外
光を発生する光源を有し、この光源の照明によって試料
観察を行う顕微鏡において、前記光源と前記試料との間
に配置された６００〜９００ｎｍの領域の波長のうち任
意の波長を透過し得る波長選択素子と、前記試料にコン
トラストを発生させるコントラスト発生光学系とが備え
られた近赤外線顕微鏡である。

【００１０】請求項２にかかる発明は、可視波長に適用
し得る対物レンズが備えられていることを特徴とする請
求項１に記載の近赤外線顕微鏡である。

【００１１】請求項３にかかる発明は、請求項１又は２
に記載の近赤外線顕微鏡と、この近赤外線顕微鏡による
前記試料の像を撮像する撮像手段と、この撮像手段から
の画像信号をコントラスト強調する画像処理手段を含む
画像処理装置と、画像表示装置とにより構成されている
顕微鏡観察システムである。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明では、透明乃至ほぼ透明な
試料にコントラストを発生させるコントラスト発生光学
系として、照明用光源からの波面を等位相の二波面に分
割する手段と、この分割手段により分割された波面を試
料に向けて照射するコンデンサレンズと、試料を透過た
後の前記分割された二波面を再合成し互いに干渉させる
波面合成手段とから構成されている干渉顕微鏡が用いら
れる。

【００１３】或いは、このような干渉顕微鏡に代わっ
て、前記波面分割手段及び波面合成手段に代えて、前記
照明用光源と前記コンデンサレンズとの間に、矩形状の
スリット，半円形の開口，扇形の開口等を照明系の光軸
中心より偏心させて配置し所謂偏斜照明が可能なように
構成してもよい。更に、コンデンサレンズの前側焦点位
置に光軸中心より偏心させて配置した矩形状のスリット
と、対物レンズの後側焦点位置に配置した前記スリット
からの透過光の透過率を段階的に変化させ振幅変調を与
える変調素子とにより、透明試料にコントラストを発生
させるものである。干渉顕微鏡や偏斜照明を利用した顕
微鏡は、透明試料にコントラストを発生させる光学系と
して従来から用いられている位相差顕微鏡では、厚さ２
００〜３００μｍの試料に対して、前述の如く、位相差
顕微鏡特有のハロと称される現象が強く生じること、
又、観察試料内において多重回折が生じ、回折光の位相
が乱れて試料内部の観察が困難となるので、これらの不
具合を回避するためである。よって、前記コントラスト
発生光学系には、位相差顕微鏡に比べ、試料の厚さの影
響を受けにくい干渉顕微鏡や偏斜照明を用い、且つ、６
００〜９００ｎｍの波長で観察することで、厚い試料で
あっても深い部分までコントラストよく観察することが
できる。

【００１４】更に、本発明に用いられる干渉顕微鏡にお
いて、前記波面分割手段は、前記照明用光源からの光を
所定の方向に偏光させる第１の偏光手段と、これにより
偏光された光を互いに振動方向が直交する常光線と異常
光線とに分離する複屈折光学素子とにより構成されてい
る。又、前記波面合成手段は、前記常光線と異常光線と
を再合成する複屈折光学素子と、これにより合成された
二波面を互いに干渉させる第２の偏光手段とから構成さ
れている。即ち、本発明に用いられる干渉顕微鏡は所謂
ノマルスキー型微分干渉顕微鏡としての構成を有するも
のである。又、特に、前記第１及び第２の偏光手段は、
高分子フィルムに二色性染料を含有，配向させた偏光フ
ィルムにより構成されていることが、コスト，入手性の
観点より好ましい。尚、前述の文献２にも記載されてい
るように、偏光素子として、偏光特性に波長依存性のな
いグラントムソンプリズムを用いることも考えられる
が、前記偏光フィルムに比べてグラントムソンプリズム
は非常に高価であり、入手も困難であることから、現実
的な方法とは云えない。

【００１５】一方、前記偏光フィルムは、一般的に、使
用される波長が８００ｎｍを越えると偏光特性が劣化し
はじめ、波長９００ｎｍ以上ではもはや偏光素子として
の機能は失われてしまう。このため、７００〜１２００
ｎｍの領域の波長を用いて微分干渉観察を行うと、９０
０〜１２００ｎｍの波長領域では微分干渉の効果がみら
れず実質的には明視野観察となってしまううえ、７００
〜９００ｎｍの領域の波長により形成された微分干渉像
にフレアとなって重なり、散乱の少ない波長を用いてい
るにもかかわらず、試料内の結像性能の劣化を招いてし
まう。従って、波長を６００〜９００ｎｍに限定するこ
とによって、安価な偏光フィルムを使用しても偏光特性
が劣化しないので、コントラストのよい観察ができると
いう効果を奏する。

【００１６】このような観点により、本発明において
は、近赤外線透過フィルタを前記照明用光源と前記試料
との間に配置し、而も、この近赤外線透過フィルタを、
６００〜９００ｎｍの領域内の波長より観察に必要とさ
れる最小限の明るさが得られる波長域を任意に選択でき
るように構成した。又、このような近赤外線フィルタを
用いると、ハロゲンランプの放射強度が強い９００〜１
１００ｎｍ付近の波長を使用していないため、試料の温
度上昇を最小限に抑制できることは云うまでもない。

【００１７】更に、前記近赤外線透過フィルタは、７０
０〜８５０ｎｍの領域の波長を透過し、特に、７５０〜
８００ｎｍの領域の波長の平均透過率が８０％以上とな
っていることが好ましい。この条件は、試料内部の観察
において、より一層良好な解像を得るために設けられる
条件である。近赤外線の透過波長領域が７００〜８５０
ｎｍから逸脱して広範囲に亘ると、偏光素子として前記
偏光フィルムが用いられているノマルスキー型微分干渉
顕微鏡においては、８５０ｎｍ以上の波長で前記偏光フ
ィルムの偏光特性劣化が目立ちはじめ、コントラストの
低下を招いてしまう。一方、７５０〜８００ｎｍの領域
の波長において、平均透過率が８０％以下であると、得
られる像が暗くなり、例え画像処理装置によりコントラ
スト増強を行っても、試料内部の微細構造は電気ノイズ
に埋もれてしまい観察できなくなる。

【００１８】更には、前記ノマルスキー型微分干渉顕微
鏡において、前記波面分割手段による常光線と異常光線
との分離量δが、対物レンズの分解能εに対して、以下
に示す条件式を満足していることが好ましい。０．２５ε＜δ＜０．７ε ・・・・（１）但し、分解能εは、５４６．０７ｎｍの波長（ｅ線）に
おける値である。

【００１９】条件式（１）は、厚い生物試料内部の観察
において、より一層良好な解像，立体感を得るために設
定されたものである。前記常光線と異常光線との分離量
δの大小により、微分干渉顕微鏡における解像，立体感
が相反する関係にあることは周知の通りであるが、前述
のように、厚さが２００〜３００μｍの生物試料内部の
細胞に対して前記パッチクランプ法を行う際、細胞膜表
面の視認性のよさが成否の鍵を握っており、そのために
は、解像と立体感とのバランスを図ることが重要であ
る。条件式（１）において、分離量δが０．２５ε以下
になると、試料の厚さによる錯乱の影響は低減され、
又、解像力も向上させることができるが、コントラスト
が低くなりすぎてしまう。これを画像処理装置によるコ
ントラスト増強で補うには、コントラスト増強の原理
上、Ｓ／Ｎ比を高めるために試料への入射光量を必要以
上に増加させねばならず、結果、顕微鏡本体の熱変形，
試料の温度上昇を招くことになり好ましくない。一方、
分離量δが０．７ε以上になると、解像力の低下を招く
ことは勿論、試料の厚さによる錯乱の影響を大きく受
け、本来ならば向上するはずの試料像の立体感まで低下
させてしまう。

【００２０】次に、本発明において用いられる対物レン
ズについて説明する。図１０は前述の特開平６−１６０
７２０号公報に開示されているアポクロマート級顕微鏡
の対物レンズの構成を示す断面図、図１１は図１０に示
された対物レンズにおいて基準波長を５８７．５６ｎｍ
（ｄ線）とした場合の４００〜７００ｎｍの領域の波長
に対する色収差を表すグラフ（縦軸は軸上波面収差の
値、横軸は波長を示している）である。又、図１２は図
１０に示された対物レンズにおいて基準波長を９００ｎ
ｍとした場合の７００〜１２００ｎｍの領域の波長に対
する色収差を表すグラフ、図１３は同様に前記対物レン
ズにおいて基準波長を７５０ｎｍとした場合の７００〜
９００ｎｍの領域の波長に対する色収差を表すグラフで
ある。無収差の目安として、Ｍａｒｅｃｈａｌの判定値
（約０．０７波長）を考えると、図１１に示されたグラ
フより、図１０に示した対物レンズは可視光線領域では
確かにアポクロマート級の色収差補正を行っている。と
ころが、図１２に示されたグラフから分かるように、基
準波長が９００ｎｍの場合、観察に用いる波長の領域が
７００〜１２００ｎｍの広範囲に亘ると、アポクロマー
ト級の対物レンズとはいえ、色収差が大きく発生してい
る。そこで、図１３に示すように、基準波長を７５０ｎ
ｍとし、観察する波長の領域を６００〜９００ｎｍに設
定すれば、色収差の発生が低く抑えられることが分か
る。

【００２１】このように、観察に用いられる波長の領域
が７００〜１２００ｎｍの広範囲に亘る場合には、前記
アポクロマート級の対物レンズでさえも色収差が大きく
発生する。しかしながら、本発明では、前述のように、
６００〜９００ｎｍの波長を透過し得る近赤外線フィル
タを採用しているため、可視光線領域、即ち、約４５０
〜６５０ｎｍの領域の波長において色収差補正がなされ
る通常の顕微鏡の対物レンズをそのまま使用しても色収
差の発生を最小限に抑制することができる。従って、本
発明では、実用上広く用いられているアクロマート級対
物レンズを用いることができるため、コスト面でも有利
である。

【００２２】尚、ここで、可視光線領域から近赤外線領
域までの領域の波長に対して色収差の補正が可能な対物
レンズを新たに設計する方法もある。しかし、近年、生
物学の研究分野においては、Ｃａイオン濃度等を計測す
るために、落射蛍光照明装置を用い、３４０〜３８０ｎ
ｍ付近の紫外線を試料に照射することが頻繁に行われて
いる。よって、対物レンズには紫外線透過率が高いもの
が要求されることになる。しかしながら、このような要
求を全て満たす対物レンズ、即ち、可視光線領域から近
赤外線領域までの領域の波長に対して色収差の補正が可
能で、且つ、紫外線透過率の高い対物レンズの設計，製
作は非常に困難である。又、大きなコスト増にもつなが
るため、適切な解決手段とは云えない。

【００２３】以下、図示した実施例に基づき本発明を具
体的に説明する。

【００２４】第１実施例図１は、本実施例にかかる顕微鏡観察システムの構成を
示す図である。本実施例の顕微鏡観察システムに用いら
れる近赤外線顕微鏡１０は、照明用光源であるハロゲン
ランプ１，近赤外線透過フィルタ２，高分子偏光フィル
ム３，ハロゲンランプ１からの光を常光線と異常光線と
に分離する複屈折光学素子４，コンデンサレンズ５，試
料６ａが載置されるステージ６，対物レンズユニット
７，分離された常光線と異常光線とを再合成する複屈折
光学素子８，及び高分子偏光フィルム９により構成され
ている。

【００２５】この近赤外線顕微鏡１０では、ハロゲンラ
ンプ１から射出された光が近赤外線透過フィルタ２を透
過し、高分子偏光フィルム３により直線偏光とされた
後、コンデンサレンズ５の前側焦点位置に常光と異常光
との分岐点が一致するように配置された複屈折光学素子
４によりコンデンサレンズ５を介して試料６ａ上で常光
と異常光とを分離量δだけ分離させている。そして、試
料６ａを透過した常光と異常光は対物レンズユニット７
を透過した後、複屈折光学素子８により合波され、更に
高分子偏光フィルム９を透過する際に前記常光と異常光
とが互いに干渉し合い、近赤外線顕微鏡１０の結像面に
試料６ａの像を形成するようになっている。

【００２６】ここで、近赤外線顕微鏡１０に用いられて
いる近赤外線透過フィルタ２の分光透過率特性は、図２
に示すように、６００〜９００ｎｍの領域の波長を透過
し得るものであり、対物レンズユニット７の倍率は水侵
４０倍，開口数は０．７、常光線と異常光線との分離量
δは０．３μｍである。更に、本実施例では、複屈折光
学素子４としてウオラストンプリズムを用い、又、複屈
折光学素子８としては対物レンズユニット７の後側焦点
位置が対物レンズユニット７内に存在しているため、ノ
マルスキープリズムと呼ばれる変形ウオラストンプリズ
ムを用いている。

【００２７】更に、本実施例の顕微鏡観察システムで
は、近赤外線顕微鏡１０の結像面上に電子撮像素子１１
の受光面を配置し、この電子撮像素子１１で近赤外線顕
微鏡１０により得られた像を受像し、これを画像信号と
して画像処理装置１２へ送信する。画像処理装置１２に
は、前記画像信号のコントラスト増強を行う画像処理手
段が備えられており、ここでコントラスト増強がなされ
た画像信号は表示モニタ１３へ送信される。

【００２８】第２実施例本実施例にかかる顕微鏡観察システムの構成は図１に示
した第１実施例のものと同様であるため、図は省略す
る。尚、本実施例の顕微鏡観察システムにおいて、近赤
外線透過フィルタ２の分光透過率特性は、図３に示すよ
うに、７００〜８５０ｎｍの領域の波長を透過し得るも
のである。又、対物レンズユニット７の倍率は水浸６０
倍，開口数は１．２、常光線と異常光線との分離量δは
０．０８μｍである。

【００２９】第３実施例図４は、本実施例にかかる顕微鏡観察システムの構成を
示す図である。本実施例の顕微鏡観察システムに用いら
れる近赤外線顕微鏡２０は、照明用光源であるハロゲン
ランプ１，近赤外線透過フィルタ１４，照明系の光軸の
中心より偏心させて配置された矩形状のスリット１５，
コンデンサレンズ１６，試料１７ａを載置するステージ
１７，対物レンズユニット１８，及び矩形状のスリット
１５を透過する光の透過率を段階的に変化させその透過
光に振幅変調を与える変調素子１９により構成されてい
る。

【００３０】この近赤外線顕微鏡２０では、ハロゲンラ
ンプ１から射出された光が近赤外線透過フィルタ１４を
透過し、矩形状のスリット１５及びコンデンサレンズ１
６を経てステージ１７上に載置されている試料１７ａに
入射する。この試料１７ａへ照明光が入射するまでの過
程において、変調素子１９により矩形状のスリット１５
を透過する光の透過率を段階的に変化させその透過光に
振幅変調を与えている。よって、試料１７ａに入射した
光は透明な試料１７ａにコントラストを発生させること
ができる。そして、試料１７ａを透過した光は対物レン
ズユニット１８及び変調素子１９を経て、近赤外線顕微
鏡２０の結像面に試料１７ａの像を形成する。

【００３１】ここで、近赤外線顕微鏡２０に用いられる
近赤外線透過フィルタ１４の分光透過率特性は、図２に
示すように、６００〜９００ｎｍの領域の波長を透過し
得るるものである。対物レンズユニット１８の倍率は水
浸４０倍，開口数は０．７である。矩形状のスリット１
５はコンデンサレンズ１６の前側焦点位置に、変調素子
１９は対物レンズユニット１８の後側焦点位置に夫々配
置されている。又、図５及び図６に、矩形状のスリット
１５及び変調素子１９を夫々上側から見た状態を示す。
尚、図６において、白色部分の光の透過率は約９０％以
上、斜線部分の光の透過率は約１５％、黒色部分の光の
透過率は０％である。

【００３２】更に、本実施例の顕微鏡観察システムにお
いても、第１実施例と同様に、近赤外線顕微鏡２０の結
像面上に電子撮像素子１１の受光面を配置し、この電子
撮像素子１１で近赤外線顕微鏡２０により得られた像を
受像し、これを画像信号として画像処理装置１２へ送信
する。画像処理装置１２には、前記画像信号のコントラ
スト増強を行う画像処理手段が備えられており、ここで
コントラスト増強がなされた画像信号は表示モニタ１３
へ送信される。

【００３３】次に、第２実施例に示した顕微鏡観察シス
テムを用いた具体的な観察方法を示す。近赤外線顕微鏡
１０として使用した微分干渉顕微鏡はオリンパス光学工
業（株）製ＢＨＷＩで、照明光路中に図３に示したよう
な７００〜８５０ｎｍの領域の波長を透過し得る近赤外
線透過フィルタ２を配置し、試料６ａにはラット脳スラ
イスの小脳部分を、対物レンズユニット７には水浸タイ
プのオリンパス光学工業（株）製ＷＰｌａｎＦｌ４０×
ＵＶ（開口数０．７）と２．５倍の拡大レンズとを組み
合わせたものを用いた。又、電子撮像素子１１として
は、浜松ホトニクス（株）製の可視〜近赤外線用テレビ
カメラＣ２７４１−０７ＥＲを、画像処理装置１２には
オリンパス光学工業（株）製の画像処理装置ＸＬ−１０
を、表示モニタ１３には浜松ホトニクス（株）製のテレ
ビモニタＣ１８４０−３を用いた。

【００３４】このようなシステムにより、前記対物レン
ズユニット７を介して電子撮像素子１１に総合倍率１０
０倍で試料６ａの像を投影し、電子撮像素子１１で生成
された画像信号は前記画像処理装置１２を介して表示モ
ニタ１３へ送信され、ここに画像を表示した。更に、こ
の表示モニタ１３上に表示された画像を日立製作所
（株）製のビデオプリンタＶＹ−１００で画像出力した
図を図７に示す。図７は、従来の方法ではなし得なかっ
た試料表面より約１５０μｍ内部にある神経細胞を観察
できたことを示している。尚、ここに示した観察方法で
は、正立型の顕微鏡を用いているが、本発明ではこれに
限られるものではなく、倒立型の顕微鏡を用いても同様
の効果を得ることができる。

【００３５】以上説明したように、本発明による近赤外
線顕微鏡及びこれを用いた顕微鏡観察システムは、特許
請求の範囲に記載された特徴と合わせ、以下の（１）〜
（６）に示された特徴も備えている。

【００３６】（１）照明光源と、この照明光源からの光
により透明乃至ほぼ透明な試料を照明するコンデンサレ
ンズと、前記試料の像を形成する対物レンズを含む結像
光学系と、前記試料の拡大像を撮像する撮像手段と、前
記照明用光源と前記撮像手段との間に配置される前記試
料にコントラストを発生させて可視化する手段と、前記
撮像手段からの画像信号を処理して前記試料像のコント
ラストを強調する画像処理手段とにより構成され、前記
撮像手段は前記結像光学系の結像面に配置された電子撮
像素子を有し、又、前記照明用光源と前記試料との間に
は６００〜９００ｎｍの領域の波長のうち任意の波長を
透過し得る近赤外線透過フィルタが配置されていること
を特徴とする顕微鏡観察システム。

【００３７】（２）前記透明乃至ほぼ透明な試料にコン
トラストを発生させる手段は、前記照明用光源からの波
面を等位相の二波面に分割する手段と、前記分割面にて
試料を照明するコンデンサレンズと、前記試料を透過し
た後の前記分割二波面を再合成し互いに干渉させる波面
合成手段とを備えた干渉顕微鏡で構成されていることを
特徴とする前記（１）に記載の顕微鏡観察システム。

【００３８】（３）前記透明乃至ほぼ透明な試料にコン
トラストを発生させて可視化する手段は、偏斜照明を用
いた手段であることを特徴とする前記（１）に記載の顕
微鏡観察システム。

【００３９】（４）前記波面分割手段は前記照明用光源
からの光を所定の方向に偏光させる第１の偏光手段とこ
れにより偏光された光を互いに振動方向が直交する常光
線と異常光線とに分離する複屈折光学素子とからなり、
又、前記波面合成手段は前記常光線と異常光線とを再合
成する複屈折光学素子とこれにより合成された光を互い
に干渉させる第２の偏光手段とからなっており、前記第
１及び第２の偏光手段は高分子フィルムに二色性染料を
含有，配向させた偏光フィルムで構成されていることを
特徴とする前記（２）に記載の顕微鏡観察システム。

【００４０】（５）前記近赤外線透過フィルタは、７０
０〜８５０ｎｍの領域の波長が透過し、且つ、７５０〜
８００ｎｍの領域の波長の平均透過率が８０％以上であ
ることを特徴とする前記（１）又は（４）に記載の顕微
鏡観察システム。

【００４１】（６）前記波面分割手段による前記常光線
と異常光線との分離量δを、前記対物レンズの分解能ε
に対して以下に示す条件式を満足するようにしたことを
特徴とする前記（４）に記載の顕微鏡観察システム。０．２５ε＜δ＜０．７ε 但し、分解能εは、５４６．０７ｎｍの波長（ｅ線）に
おける値である。

【００４２】

【発明の効果】上述のように、本発明によれば、厚さが
２００〜３００μｍの透明乃至ほぼ透明な生物試料にお
いて、その試料表面から１００μｍ以上内部の細胞が観
察可能であると共に、可視光線領域の波長を想定した色
収差補正を行う通常の対物レンズを近赤外線領域で用い
ても結像性能に影響を及ぼすことのない近赤外線顕微鏡
及びこれを用いた顕微鏡観察システムを提供することが
できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】第１実施例にかかる顕微鏡観察システムの構成
を示す図である。

【図２】第１，第３実施例の顕微鏡観察システムに用い
られる近赤外線透過フィルタの分光透過率特性を示すグ
ラフである。

【図３】第２実施例の顕微鏡観察システムに用いられる
近赤外線透過フィルタの分光透過率特性を示すグラフで
ある。

【図４】第３実施例にかかる顕微鏡観察システムの構成
を示す図である。

【図５】第３実施例の顕微鏡観察システムに用いられる
矩形状のスリット１５の形状を示す図である。

【図６】第３実施例の顕微鏡観察システムに用いられる
変調素子１９の形状を示す図である。

【図７】第２実施例の顕微鏡観察システムを用いて行っ
たラット脳スライス（小脳部分）の観察画像を示す図で
ある。

【図８】ドイツＳｃｈｏｔｔ社製の色ガラスフィルタＲ
Ｇ９の分光透過率特性を示すグラフである。

【図９】ドイツＳｃｈｏｔｔ社製の熱吸収フィルタＫＧ
４の分光透過率特性を示すグラフである。

【図１０】特開平６−１６０７２０号公報に開示されて
いるアポクロマート級顕微鏡の対物レンズの構成を示す
断面図である。

【図１１】図１０に示された対物レンズにおいて、基準
波長を５８７．５６ｎｍ（ｄ線）とした場合の４００〜
７００ｎｍの領域の波長に対する色収差を示すグラフで
ある。

【図１２】図１０に示された対物レンズにおいて、基準
波長を９００ｎｍとした場合の７００〜１２００ｎｍの
領域の波長に対する色収差を示すグラフである。

【図１３】図１０に示された対物レンズにおいて、基準
波長を７５０ｎｍとした場合の７００〜９００ｎｍの領
域の波長に対する色収差を示すグラフである。

【符号の説明】

１ハロゲンランプ２，１４近赤外線フィルタ３，９高分子偏光フィルム４，８複屈折光学素子５，１６コンデンサレンズ６，１７ステージ６ａ，１７ａ試料７，１８対物レンズユニット１０，２０近赤外線顕微鏡１１電子撮像素子１２画像処理装置１３表示モニタ１５矩形状のスリット１９変調素子

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも赤外光を発生する光源を有
し、該光源の照明によって試料観察を行う顕微鏡におい
て、前記光源と前記試料との間に配置された６００〜９００
ｎｍの領域の波長のうち任意の波長を透過し得る波長選
択素子と、前記試料にコントラストを発生させるコント
ラスト発生光学系とが備えられていることを特徴とする
近赤外線顕微鏡。
【請求項２】可視波長に適用し得る対物レンズが備え
られていることを特徴とする請求項１に記載の近赤外線
顕微鏡。
【請求項３】請求項１又は２に記載の近赤外線顕微鏡
と、該近赤外線顕微鏡による前記試料の像を撮像する撮
像手段と、該撮像手段からの画像信号をコントラスト強
調する画像処理手段を含む画像処理装置と、画像表示装
置とにより構成されていることを特徴とする顕微鏡観察
システム。