KR20060111142A - 공초점 어레이 검출기를 이용한 마이크로스코프 - Google Patents

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Abstract

공초점 현미경의 고분해능 원리를 사용하여 스핌의 축상 고분해능 및 면상검출기로 측정시간을 단축할 수 있도록 된 구조의 공초점 어레이 검출기를 이용한 마이크로스코프가 개시되어 있다.
이 개시된 마이크로스코프는 레이저 조명광을 조사하는 광원과; 광경로 상에 배치되어, 조명광이 샘플 방향으로 진행하도록 경로를 변환하는 빔스프리터와; 빔스프리터와 샘플 사이에 배치되어, 입사광을 집속시키는 대물렌즈와; 샘플에서 발생되고 대물렌즈와 빔스프리터를 경유하여 입사된 샘플의 형광을 수광하는 것으로, 대물렌즈의 초점면에서 발생된 형광은 투과시키고 그 이외의 위치에서 발생된 형광을 차단하는 핀홀 어레이와, 핀홀 어레이를 투과한 형광을 수광하는 검출기 어레이를 구비한 공초점 어레이 검출기;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

공초점 어레이 검출기를 이용한 마이크로스코프{Microscope using confocal array detector}
도 1은 일반적인 공초점 마이크로스코프의 광학적 배치를 보인 도면.
도 2는 일반적인 스핌(SPIM)장치의 광학적 배치를 보인 도면.
도 3은 본 발명의 제1실시예에 따른 공초점 어레이 검출기를 이용한 마이크로스코프의 광학적 배치를 보인 도면.
도 4는 본 발명의 제2실시예에 따른 공초점 어레이 검출기를 이용한 마이크로스코프의 광학적 배치를 보인 도면.
* 도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명 *
31, 131...광원 32...집속렌즈
33...빔스프리터 35, 135...대물렌즈
40, 140...공초점 어레이 검출기 41, 141...핀홀 어레이
45, 145...검출기 어레이 133...광시트
본 발명은 공초점 어레이 검출기를 이용한 마이크로스코프에 관한 것으로서, 상세하게는 공초점 현미경의 고분해능 원리를 사용하여 스핌(SPIM; Selective Plane Illumination Microscope)의 축상 고분해능 및 면상검출기로 측정시간을 단축할 수 있도록 된 구조의 공초점 어레이 검출기를 이용한 마이크로스코프에 관한 것이다.
일반적으로, 공초점 마이크로스코프(confocal microscope)는 종래의 형광현미경의 한계를 보완하기 위하여 개발된 것으로, 레이저를 광원으로 이용하고 샘플로부터 발산된 형광 신호를 특수 검출기인 광배율 튜브(PMT; Photomultiplier tube)로 검출한 후, 디지털 영상으로 변환하여 샘플을 관찰한다.
도 1을 참조하면, 종래의 공초점 마이크로스코프는 레이저 광을 조사하는 광원(11)과, 입사광의 진행경로를 변환하는 빔스프리터(13)와, 상기 광원(11)에서 조명된 광을 샘플에 집속시키는 대물렌즈(15) 및, PMT(19)를 포함한다. 또한, 상기 빔스프리터(13)와 상기 PMT(19) 사이에는 초점이 맞는 상만이 상기 PMT(19)로 향하도록 단속하는 어퍼쳐(17)가 배치되어 있다.
상기 광원(11)은 샘플에 표지된 형광물질에 적합한 파장대의 레이저 광을 조사하는 것으로, 상기 형광물질의 발산을 유도한다. 이와 같이 발산된 형광신호는 상기 대물렌즈(15)에 의해 집속되고, 상기 빔스프리터(13)를 경유하여 상기 PMT(19)에 집속된다. 이때, 초점이 맞지 않는 부분의 상은 상기 어퍼쳐(17)에 의하여 차단되므로, 초점이 맞는 형광신호의 상만이 상기 PMT(19)에서 검출된다.
이 공초점 마이크로스코프는 형광현미경에 비하여 초점이 일치하지 않은 부분의 상을 제거함으로써, 형광현미경에 비하여 40%정도의 해상도 향상을 기대할 수 있다. 또한, 시료의 기계적인 절단 없이 레이저 광원(11)을 사용하여 광 절편으로 상을 구성할 수 있으므로, 컴퓨터 상에서 삼차원 구조를 재현 할 수 있으며, 다양한 영상처리가 가능하다는 이점이 있다. 그리고, 살아있는 재료를 대상으로 이온 및 pH의 변화 등을 관찰할 수도 있고, 형광물질의 특성을 최대한 이용하여 세포 내 물질간의 상호 연관성을 분석할 수도 있다.
한편, 상기한 공초점 마이크로스코프는 비균질 시료의 경우 투과 깊이에 제한이 있으며 광축방향과 측면방향의 분해능의 차이가 크다는 단점이 있다.
이러한 축방향의 분해능을 향상시키기 위한 장치로는 공초점 세타(θ) 마이크로스코프(confocal theta microscope)와, 선택면 조명 마이크로스코프(Selective Plane Illumination Microscope; SPIM)가 있다.
공초점 세타 마이크로스코프는 상기한 공초점 마이크로스코프와 유사한 것으로, 레이저를 축방향에서 조사하고 형광신호를 여러 각도에서 측정하기 위해 거울과 프리즘을 사용하는 측정장치이다.
도 2를 참조하면, 상기한 SPIM은 검출장치의 축방향에 수직한 측면방향에 시트(sheet) 형상의 빔을 조사하는 방식으로, 측면에서 입력된 조명광을 샘플(20) 위치에 시트 형상의 빔으로 바꾸어 조명하는 광시트(21)와, 샘플(20)에 표지된 형광신호를 검출하는 것으로 CCD 등의 면형태의 검출기(25)를 포함한다. 상기 광시트(21)는 축방향의 비초점(out-of-focus) 위치에서는 형광이 발생하지 않도록 한다. 이때, 축방향의 분해능은 광시트(21)의 두께에 의해 결정된다. 이 SPIM은 공초점 마이크로스코프와는 달리 샘플 전체를 이미징하기 위해 스테이지를 스캔할 필요가 없으므로, 시트 영역의 이미지를 직접 면형태의 상기 검출기(25)로 측정할 수 있다. 따라서, 이미징하는데 걸리는 시간을 줄일 수 있는 장점이 있다.
한편, SPIM은 빔을 조사하는 방향이 초점면에 수직한 측면방향이므로 수직한 방향으로는 공초점 마이크로스코프 보다 분해능이 저하된다.
또한, 축상의 분해능은 광시트(21)의 두께에 의해 결정된다. 그러므로, 광시트(21)의 두께가 공초점 마이크로스코프의 축상 분해능인 레일리 유닛보다 크다면, 공초점 마이크로스코프와 비교하여 볼 때 스캔을 하지 않아 측정 시간이 단축된다는 이점 이외에는 장점이 없다.
따라서, 본 발명은 상기한 바와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로서, 공초점의 측면방향 분해능과 SPIM의 축상 분해능 및 면상검출기의 측정시간을 단축할 수 있도록 된 구조의 공초점 어레이 검출기를 채용한 마이크로스코프를 제공하는데 목적이 있다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따른 마이크로스코프는, 레이저 조명광을 조사하는 광원과; 광경로 상에 배치되어, 상기 조명광이 샘플 방향으로 진행하도록 경로를 변환하는 빔스프리터와; 상기 빔스프리터와 상기 샘플 사이에 배치되어, 입사광을 집속시키는 대물렌즈와; 상기 샘플에서 발생되고 상기 대물렌즈와 상기 빔스프리터를 경유하여 입사된 샘플의 형광을 수광하는 것으로, 상기 대물렌즈의 초점면에서 발생된 형광은 투과시키고 그 이외의 위치에서 발생된 형광을 차단하는 핀홀 어레이와, 상기 핀홀 어레이를 투과한 형광을 수광하는 검출기 어레이를 구비한 공초점 어레이 검출기;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 마이크로스코프는 레이저 광을 조사하는 광원과; 입사광을 면광으로 변환하여 샘플에 조명하는 광시트와; 상기 샘플에서 발생된 샘플의 형광을 집속시키는 대물렌즈와; 상기 대물렌즈에서 집속된 형광을 수광하는 것으로, 상기 대물렌즈의 초점면에서 발생된 형광은 투과시키고 그 이외의 위치에서 발생된 형광을 차단하는 핀홀 어레이와, 상기 핀홀 어레이를 투과한 형광을 수광하는 검출기 어레이를 구비한 공초점 어레이 검출기;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
이하, 첨부된 도면들을 참조하면서 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 마이크로스코프를 상세히 설명하기로 한다.
도 3은 본 발명의 제1실시예에 따른 공초점 어레이 검출기를 이용한 마이크로스코프의 광학적 배치를 보인 도면이다.
도 3을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로스코프는 레이저 광을 조사하는 광원(31)과, 입사광의 진행경로를 변환하는 빔스프리터(33)와, 입사광을 집속시키는 대물렌즈(35) 및, 공초점 어레이 검출기(40)를 포함한다.
상기 광원(31)은 샘플(30)에 표지된 형광물질에 적합한 파장대의 레이저 광을 조사한다. 즉, 상기 광원(31)에서 조사된 조명광(Lin)은 상기 빔스프리터(33)에서 반사된 후, 상기 대물렌즈(35)에서 집속되어 상기 샘플(30)에 조명된다. 이때, 상기 샘플(30)의 넓은 영역에 조명광(Lin)이 조명될 수 있도록, 상기 광원(31)과 상 기 빔스프리터(33) 사이에는 집속렌즈(32)가 더 구비된 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 광원(31)에서 조사된 조명광(Lin)은 상기 집속렌즈(32)와 상기 대물렌즈(35) 사이의 광경로 상에서 일차적으로 집속된 후, 발산하면서 상기 대물렌즈(35)에 입사된다. 따라서, 상기 대물렌즈(35)에서 집속된 발산광(Lin)은 도시된 바와 같이 넓은 영역에 걸쳐 상기 샘플(30)을 조명한다.
상기 빔스프리터(33)는 상기 광원(31)과, 대물렌즈(35) 및 공초점 어레이 검출기(40) 사이의 광경로 상에 배치되는 것으로, 상기 광원(31) 쪽에서 입사된 광은 반사시켜 상기 샘플(30) 방향으로 진행하도록 하고, 상기 대물렌즈(35) 쪽에서 입사된 광은 투과시켜 상기 공초점 어레이 검출기(40) 방향으로 진행하도록 한다. 상기 빔스프리터(33)는 광량비, 파장 내지는 편광 특성에 따라 입사광을 투과 또는 반사시킴으로써 입사광을 분리하는 것으로, 그 구성 자체는 널리 알려져 있으므로 자세한 설명은 생략하기로 한다.
또한, 본 실시예에 따른 광학적 배치에 있어서, 도 3에 도시된 바와 같이, 상기 광원(31)에서 조명된 광 중 상기 빔스프리터(33)에서 반사된 광을 유용광으로, 상기 샘플(30)에서 반사된 광 중 상기 빔스프리터(33)를 투과한 광을 유용광으로 이용하도록 한 구성에 한정되는 것은 아니다. 즉, 도 3에 도시된 바와 달리, 상기 광원(31)과 상기 공초점 어레이 검출기(40)의 광학적 배치와, 상기 빔스프리터(33)의 광학특성을 변경함으로써, 상기 광원(31)에서 조명된 광 중 상기 빔스프리터를 투과한 광을 유용광으로, 상기 샘플(30)에서 반사된 광 중 상기 빔스프리터에 서 반사된 광을 유용광으로 이용하도록 하는 것도 가능하다.
상기 샘플(30)은 앞서 설명된 바와 같이, 상기 조명광(Lin)에 의해 형광되는 형광물질을 포함한다. 따라서, 상기 샘플(30)에 조명광(Lin)을 조명시, 상기 형광물질에서 발생된 형광이 상기 샘플(30) 주변으로 발산한다. 이 발산된 형광의 일부는 상기 대물렌즈(35)에 의해 집속되고, 상기 빔스프리터(33)를 투과하여 상기 공초점 어레이 검출기(40) 방향으로 진행한다. 여기서, 샘플(30)에서 발생된 형광 중 일부는 점선으로 도시된 바와 같이 대물렌즈(35)의 초점면(P)에서 발생된 것이고, 나머지는 초점면(P)을 벗어난 위치에서 발생된 것이다.
상기 공초점 어레이 검출기(40)는 상기 샘플(30)에서 발생되고 상기 대물렌즈(35)와 상기 빔스프리터(33)를 투과하여 입사된 샘플의 형광을 수광한다. 즉, 입사된 형광 중 초점면(P) 위치에서 발생된 형광(L1)은 검출하고, 그 외의 위치에서 발생된 형광(L2)은 차단한다. 이를 위하여, 상기 공초점 어레이 검출기(40)는 상기 대물렌즈(35)의 초점면(P)에서 발생된 형광(L1)은 투과시키고 그 이외의 위치에서 발생된 형광(L2)을 차단하는 핀홀 어레이(41)와, 상기 핀홀 어레이(41)를 투과한 형광(L1)을 수광하는 검출기 어레이(45)를 구비한다.
상기 핀홀 어레이(41)는 상기 대물렌즈(35)의 초점면(P)에서 발생된 형광(L1)의 진행 경로에 형성된 복수의 핀홀(41a)을 포함한다. 따라서, 상기 핀홀(41a) 이외의 위치로 입사된 형광(L2)은 상기 검출기 어레이(45)로 진행되는 것이 차단된다. 상기 검출기 어레이(45)는 상기 복수의 핀홀(41a) 각각에 대응되는 위치에 형성되어, 상기 핀홀(41a)을 투과한 광을 각각 수광하는 복수의 검출기(45a)를 포함한다. 상기 복수의 검출기(45a)는 2차원 평면 상에 배열된 구조를 가지므로, 상기 샘플(30)의 여러 위치에 대한 정보를 동시에 검출할 수 있다.
도 4는 본 발명의 제2실시예에 따른 공초점 어레이 검출기를 이용한 마이크로스코프의 광학적 배치를 보인 도면이다.
도 4를 참조하면, 본 발명의 다른 실시예에 따른 마이크로스코프는 레이저 광을 조사하는 광원(131)과, 입사광을 면광으로 변환하여 샘플(130)에 조명하는 광시트(133)와, 대물렌즈(135) 및, 공초점 어레이 검출기(140)를 포함한다.
상기 광원(131)은 샘플(130)에 표지된 형광물질에 적합한 파장대의 레이저 광을 상기 광시트(133)의 측면으로 조사한다. 그리고, 상기 광시트(133)는 측면으로 입사된 광을 면광으로 바꾸어 상기 샘플(130)의 소정 영역에 입사되도록 한다. 여기서, 상기 광원(131)과 광시트(133)를 이용하여 상기 샘플(130)에 대해 광을 조명하는 구조는 도 2를 참조하여 설명된 일반적인 SPIM과 실질상 동일하므로 그 자세한 설명은 생략하기로 한다.
상기 샘플(130)은 조명광에 의해 형광되는 형광물질을 포함하는 것으로, 이 샘플(130)에 광을 조명시, 형광물질에서 발생된 형광이 상기 샘플(130) 주변으로 발산한다. 이 발산된 형광의 일부는 상기 대물렌즈(135)에 의해 집속되고, 상기 공 초점 어레이 검출기(140) 방향으로 진행한다. 여기서, 샘플(130)에서 발생된 형광 중 일부는 점선으로 도시된 바와 같이 대물렌즈(135)의 초점면(P)에서 발생된 것이고, 나머지는 초점면(P)을 벗어난 위치에서 발생된 것이다.
상기 공초점 어레이 검출기(140)는 상기 샘플(130)에서 발생되고 상기 대물렌즈(135)를 투과하여 입사된 샘플의 형광을 수광한다. 즉, 입사된 형광 중 초점면(P) 위치에서 발생된 형광(L1)은 검출하고, 그 외의 위치에서 발생된 형광(L2)은 차단한다. 이를 위하여, 상기 공초점 어레이 검출기(140)는 상기 대물렌즈(135)의 초점면(P)에서 발생된 형광(L1)은 투과시키고 그 이외의 위치에서 발생된 형광(L2)을 차단하는 핀홀 어레이(141)와, 상기 핀홀 어레이(141)를 투과한 형광(L1)을 수광하는 검출기 어레이(145)를 구비한다. 이 공초점 어레이 검출기(140)의 자세한 구성 및 동작은 도 3을 참조하여 설명된 일 실시예에 따른 공초점 어레이 검출기(40)와 실질상 동일하므로 그 자세한 설명은 생략하기로 한다.
상기한 바와 같이 구성된 공초점 어레이 검출기를 이용한 마이크로스코프는 공초점 마이크로스코프의 핀홀 원리를 이용한 핀홀 어레이와 및 면상 광을 검출할 수 있도록 된 검출기 어레이로 이루어진 공초점 어레이 검출기를 채용함으로써, 스캐닝 없이 샘플의 여러 부분에 대한 형광정보를 검출할 수 있으므로 측정시간을 단축시킬 수 있다는 이점이 있다. 또한, 광시트를 이용하여 광원에서 조명된 광으로부터 시트 빔을 얻는 경우는 광학적 구성을 단순화 할 수 있고, 핀홀 구조에 의하 여 초점면 이외의 위치에서 발생된 형광을 차단함으로써 축상의 분해능을 높일 수 있다.
상기한 실시예들은 예시적인 것에 불과한 것으로, 당해 기술분야의 통상을 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다. 따라서, 본 발명의 진정한 기술적 보호범위는 하기의 특허청구범위에 기재된 발명의 기술적 사상에 의해 정해져야만 할 것이다.

Claims (4)

  1. 레이저 조명광을 조사하는 광원과;
    광경로 상에 배치되어, 상기 조명광이 샘플 방향으로 진행하도록 경로를 변환하는 빔스프리터와;
    상기 빔스프리터와 상기 샘플 사이에 배치되어, 입사광을 집속시키는 대물렌즈와;
    상기 샘플에서 발생되고 상기 대물렌즈와 상기 빔스프리터를 경유하여 입사된 샘플의 형광을 수광하는 것으로, 상기 대물렌즈의 초점면에서 발생된 형광은 투과시키고 그 이외의 위치에서 발생된 형광을 차단하는 핀홀 어레이와, 상기 핀홀 어레이를 투과한 형광을 수광하는 검출기 어레이를 구비한 공초점 어레이 검출기;를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로스코프.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 광원과 상기 빔스프리터 사이에 배치되어, 상기 광원에서 조사된 광을 집속시키는 집속렌즈를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로스코프.
  3. 레이저 광을 조사하는 광원과;
    입사광을 면광으로 변환하여 샘플에 조명하는 광시트와;
    상기 샘플에서 발생된 샘플의 형광을 집속시키는 대물렌즈와;
    상기 대물렌즈에서 집속된 형광을 수광하는 것으로, 상기 대물렌즈의 초점면에서 발생된 형광은 투과시키고 그 이외의 위치에서 발생된 형광을 차단하는 핀홀 어레이와, 상기 핀홀 어레이를 투과한 형광을 수광하는 검출기 어레이를 구비한 공초점 어레이 검출기;를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로스코프.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핀홀 어레이는 상기 대물렌즈의 초점면에서 발생된 광의 진행 경로에 형성된 복수의 핀홀을 포함하고,
    상기 검출기 어레이는 상기 복수의 핀홀 각각에 대응되는 위치에 형성되어, 상기 핀홀을 투과한 광을 각각 수광하는 복수의 검출기를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로스코프.
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