KR102256255B1 - 실시간 단일 분자 단일 나노입자 동시검출을 위한 이미징 시스템 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 실시간 단일 분자 단일 나노입자 동시 검출을 위한 이미징 시스템에 관한 것으로서, 단일 나노입자 및 단일 분자인 표지물질의 상호작용을 이용하여 단일 나노입자로부터의 산란광 신호, 단일 분자로부터의 광 신호를 분리하여 동시 측정함으로써 단일 나노입자를 높은 정확도로 검출할 수 있는 효과를 제공한다.
Description
본 발명은 단일 나노입자와 합성/생분자와의 실시간 상호작용을 정량적으로 이미징 하는 분광 시스템 및 그 응용에 관한 것이다.
생체분자들은 다양한 상호작용에 의한 분자 인지(molecular recognition), 분자 조합(self-assembly), 흡착 및 탈착(adsorption and desorption)이 이루어지고, 이러한 반응들을 이용한 바이오 센싱 기술에 관한 연구가 진행되고 있다. 그 중에서도 In-situ에서 실시간으로 측정할 수 있는 기술은 바이오 나노 측정 기술의 하나의 중요한 연구 영역이 되고 있다.
특히 단일분자(single molecule) 또는 단일입자(single particle) 수준의 검출을 위하여 형광물질을 결합시키고 형광분광법을 이용하여 분석하는 방법은 폭 넓은 연구분야에서 이용되고 있는 중요한 기술 중 하나이다. 이러한 형광분광법을 이용한 검출은 신호를 증폭시켜 단일분자 또는 단일입자까지 검출할 수 있는 충분한 감도를 제공하지만 형광신호의 변동이나 단일분자가 표지물질로 작용시 비특이적 결합으로 인한 신호 오류 등은 검출 방법에 있어서 정확도를 떨어뜨리는 요인이 될 수 있다.
이에 따라 나노 사이즈의 단일 입자 검출을 위한 방법으로 형광 검출을 대신할 수 있는 소광 검출법 등이 개발되고, 표면증강라만산란, 간접측정반사율, 비색법 등과 같은 비형광 검출방법이 다양하게 시도되고 있다. 하지만 이와 같은 방법은 분석물질에 의한 산란뿐만 아니라 검출 경로 상에 있는 먼지나 벌크 시료 내의 다른 입자에 의해 산란되는 빛까지 관찰되는 단점이 있어, 이 역시 검출 방법에 있어서 정확도를 떨어뜨리는 요인이 될 수 있다.
뿐만 아니라, 나노입자 형태의 단일 바이러스 입자를 검출하거나 바이러스와 상호작용하는 또는 바이러스 유래의 분자를 단일수준에서 측정하는 목적의 다양한 분광학적 방법이 진단의 목적으로 연구, 개발되었으나, 단일 나노입자와 단일 분자를 동시에 검출하여 두 대상 간의 실시간 상호작용이나 특이적 결합양상을 정량적으로 관찰하는 방법의 개발은 두 대상을 동시에 측정할 수 있는 분광학적 장치가 고안되지 않은 탓에 제한적일 수 밖에 없다.
지금까지의 검출 방법들의 경우, 극미량 표적 물질의 검출에 있어서 타겟 신호의 수보다 훨씬 빈번하게 발생하는 비표적 신호들의 존재로 검출 정확도가 크게 영향을 받는다. 이러한 현존하는 검출방법들의 공통된 한계를 극복하고, 상기 단일 나노입자와 단일 분자를 동시에 고정확도로 검출할 수 있는 분광학적 장치의 연구, 개발이 필요한 실정이다. 특히, 감염병 기반의 고위험성의 단일 바이러스 입자의 조기 검출 등 고정확도가 필수적으로 수반되어야 하는 진단 분야에서 그 중요성은 더욱 높을 수밖에 없다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하고자 고안된 것으로서, 표적 단일 나노입자의 정확도 높은 검출을 위하여, 단일 나노입자로부터 방출되는 산란광 및 이에 결합하는 표지물질로부터 방출되는 서로 다른 광신호들을 다중 모드로 동시에 검출하는 분광 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 단일 바이러스 입자에서 발산되는 레일리 산란광 (Rayleigh scattering)과 표지물질의 형광을 동시 측정함으로써 위양성 및 위음성을 배제하고, 바이러스 또는 박테리아 자체를 정밀 진단할 뿐 아니라, 다양한 병원체를 인지하는 단백질, 리간드, 항체, 수용체, 저분자 화합물 등과의 실시간 단일 결합력을 측정하는 분광 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 특정 파장을 조사하는 광원부; 상기 광원부로부터 조사된 광원이 투과 또는 반사되는 광 분할기; 상기 광 분할기로부터의 광을 수집하는 대물 렌즈부; 상기 대물 렌즈부로부터 수집된 입사광과 시료광의 전위 및 초점거리 차이를 극대화시키는 제1렌즈부; 상기 제1렌즈부를 통과한 입사광이 반사되어 분리 및 제거되는 제1미러부; 상기 제1렌즈부를 통과한, 시료 내 표적 단일 나노입자 유래 및 상기 표적 단일 나노입자와 상호작용하는 표지물질 유래의 광을 통합하여 시료광을 수집하는 제2렌즈부; 상기 시료광으로부터 표적 단일입자 유래의 산란광 및 상기 표지물질 유래의 광을 분리하는 광 분리부; 및 검출부; 를 포함하는, 실시간 다중모드 단일 분자 단일 나노입자 동시 검출 시스템을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 실시간 다중모드 단일 분자 단일 나노입자 동시 검출 시스템에 있어서, 상기 표적 단일 나노입자 유래의 산란광은 레일리 산란(Rayleigh scattering)광인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 표지물질 유래의 광은 레일리 산란광보다 장파장의 광으로서, 형광, 발광 및 라만 신호로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 광원의 입사경로는 내부 전반사 조건으로서, 대물 렌즈의 광축을 벗어나 시료 표면에 도달하며 광대역 크기의 검출 영역을 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 제1미러부에서 분리 및 제거되는 입사광의 초점면은 제1미러부에 위치하고, 상기 시료광의 초점면은 제1미러부 후단에 위치하여 입사광 및 시료광의 초점면이 상이한 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 광 분리부는 제1다이크로익 미러, 제3렌즈부 및 제4렌즈부를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 광 분리부는 하나 이상의 미러부 및 제2다이크로익 미러를 더 포함하고, 제2다이크로익 미러는 제1다이크로익 미러로부터 투과된 표지 물질 유래 광 및 상기 미러부로부터 반사된 표적 단일 나노입자의 산란광을 집광하여 하나의 검출부 내 두 이미징 영역으로 보내는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 검출부는 수집된 광신호를 이미징화하는 영상처리부를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 영상처리부에서 획득된 이미지는 단일 나노입자 유래의 레일리 산란광 및 상기 산란광보다 장파장인 표지물질 유래의 광인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 실시간으로 단일 나노입자를 검출하는 방법에 있어서, (S1) 표적 단일 나노입자가 포함된 시료와 표지물질을 접촉시켜 시료 내 표적 단일 나노입자 및 표지물질이 상호작용하여 복합체를 형성하는 단계; (S2) 상기 복합체에 특정 파장의 광원을 조사하는 단계; (S3) 상기 광원이 조사된 복합체의 시료광과 입사광을 공간적으로 분리하는 단계; (S4) 상기 복합체 내 단일 나노입자에서 산란된 광을 분리하여 산란 신호를 검출하는 단계; 및 (S5) 상기 복합체 내 표지물질로부터 유래된 광을 분리하여 광 신호를 검출하는 단계;를 포함하는, 실시간 다중모드 단일 분자 단일 나노입자 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 실시간으로 단일 나노입자를 검출하는 방법은 (S6) 상기 검출된 레일리 산란 신호 및 상기 산란광 신호보다 장파장의 광신호를 분리하여 동시에 이미징화하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, (S7) 상기 산란 신호 및 장파장의 광신호를 동시에 나타내는 스팟의 유무로 표적 단일 나노입자의 존재를 확인하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 표지물질은 단일 나노입자와 상호작용을 하는 것으로서, 항체(antibody), 폴리뉴클레오타이드(Polynucleotide), 수용체(receptor), 생물학적 압타머(biological aptamer), 효소(enzyme), 리간드(ligand) 및 합성분자로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 실시간 다중모드 시스템을 통하여 단일 나노입자의 산란 및 단일 분자의 형광/발광/라만 등의 다양한 광신호를 동시 검출하는 이중적인 검출 시스템을 개발, 궁극적으로 비특이적 결합으로 인한 위양성의 오류를 잡아내고 다중 이미징 분석을 통하여 신뢰도 높은 단일 나노입자-분자 복합체 검출 시스템 및 검출 방법을 제공한다.
본 발명은 다중 모드 시스템을 통하여 진양성(true-positive), 위양성(false-positive) 및 위음성(false-negative)의 식별이 가능하여 검출 정확도를 시각적으로 실시간 확인할 수 있다.
또한, 본 발명은 단일 나노입자의 직접적인 검출 및 간접적인 검출 방법을 결합한 실시간 다중모드 시스템을 도입함으로써, 트레이드 오프(trade-off)의 발생 없이도 극미량의 단일 나노입자를 높은 정확도로 검출하는 것이 가능하다.
본 발명은 단일 나노입자가 방출하는 산란광 및 표지물질이 방출하는 광 신호의 강도(intensity)를 측정하여 단일 나노입자의 정량화 및 나노입자와 결합인자의 결합상태 측정이 가능하다.
도 1은 본 발명에 따른 다중모드 단일 분자 단일 나노입자 동시 이미징 검출 시스템의 원리에 관한 개략도를 나타낸 것이다.
도 2 (A)는 본 발명에 따른 단일 나노입자의 한 예로서 100 nm 나노미터 크기를 가지는 단일 인플루엔자 바이러스들의 직접적인 검출법 및 상기 바이러스와 특이결합을 하는 항체를 통한 간접적인 검출법을 결합한 통합 방법인 본 발명에 따른 다중 모드 이미징 시스템의 개략도를 나타낸 것이다. 도 2 (B)는 형광표지된 항체에 의한 양성반응은 적색 원으로 표시되고(상단 이미지), 바이러스에 의한 산란 양성반응은 파란색 원으로 표시되며(중간 이미지), 진양성 반응은 노란색 원으로 표시(하단 이미지)된 대표 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 실시간 다중모드 단일 인플루엔자 바이러스입자에 결합하는 항체의 숫자를 정량적으로 측정한 이미지와 그래프를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 실시간 다중모드 단일 분자 단일 입자를 동시 검출하는 방법을 단계별로 나타낸 순서도이다.
도 2 (A)는 본 발명에 따른 단일 나노입자의 한 예로서 100 nm 나노미터 크기를 가지는 단일 인플루엔자 바이러스들의 직접적인 검출법 및 상기 바이러스와 특이결합을 하는 항체를 통한 간접적인 검출법을 결합한 통합 방법인 본 발명에 따른 다중 모드 이미징 시스템의 개략도를 나타낸 것이다. 도 2 (B)는 형광표지된 항체에 의한 양성반응은 적색 원으로 표시되고(상단 이미지), 바이러스에 의한 산란 양성반응은 파란색 원으로 표시되며(중간 이미지), 진양성 반응은 노란색 원으로 표시(하단 이미지)된 대표 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 실시간 다중모드 단일 인플루엔자 바이러스입자에 결합하는 항체의 숫자를 정량적으로 측정한 이미지와 그래프를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 실시간 다중모드 단일 분자 단일 입자를 동시 검출하는 방법을 단계별로 나타낸 순서도이다.
이하에서 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 따로 정의하지 않는 경우 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 내용으로 해석되어야 할 것이다. 본 명세서의 도면 및 실시예는 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 쉽게 이해하고 실시하기 위한 것으로 도면 및 실시예에서 발명의 요지를 흐릴 수 있는 내용은 생략될 수 있으며, 본 발명이 도면 및 실시예로 한정되는 것은 아니다.
또한 달리 정의되지 않는 한, 모든 기술적 용어 및 과학적 용어는 본 발명이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자 중 하나에 의해 일반적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다. 본원에서 설명에 사용되는 용어는 단지 특정 실시예를 효과적으로 기술하기 위함이고 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
이하에서 어느 하나의 구성요소가 다른 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 당해 구성요소만으로 이루어지는 것으로 한정되어 해석되지 아니하며, 다른 구성요소들을 더 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에서 "다중모드"란, 단일 나노입자를 검출하기 위하여 하나 또는 바람직하게는 둘 이상의 이미징 분석이 수행되는 것을 의미한다.
본 발명에서 "표지물질"이란, 단일 나노입자를 검출하기 위하여 형광, 발광 또는 라만광을 내는 물질로 표지된 물질로서, 단일 나노입자와 상호작용을 하는 물질을 의미한다.
본 발명은 특정 파장을 조사하는 광원부; 상기 광원부로부터 조사된 광원이 투과 또는 반사되는 광 분할기; 상기 광 분할기 표면에서 반사된 입사광과 시료광을 수집하는 대물 렌즈부; 상기 대물 렌즈부로부터 통과된 입사광과 시료광의 전위 및 초점 거리 차이를 극대화하는 제1렌즈부; 상기 제1렌즈부를 통과한 입사광이 반사되어 분리 및 제거되는 제1미러부; 상기 제1렌즈부를 통과한, 시료 내 표적 단일 나노입자 유래 및 상기 표적 단일 나노입자와 상호작용하는 표지물질 유래의 시료광을 수집하는 제2렌즈부; 상기 시료광으로부터 표적 단일 나노입자 유래의 산란광 및 상기 표지물질 유래의 광을 분리하는 광 분리부; 및 검출부; 를 포함하는, 실시간 다중모드 단일 분자 단일 나노입자 동시 검출 시스템을 제공한다.
상기 광 분할기를 통해 광원부로부터 조사된 입사광이 투과 또는 반사된다. 상기 대물 렌즈부는 입사광 및 입사광에 의해 여기되는 시료광을 동시에 수집한다. 이때 시료광이라 함은 표적 단일 나노입자 유래 산란광과 상기 표적 단일 나노입자와 상호작용하는 표지물질 유래의 광의 복합광을 의미할 수 있다.
대물 렌즈부로부터 통과된 입사광과 시료광의 전위(lateral displacement)와 초점거리 차를 극대화시키는 것이 제1렌즈부의 역할이다. 제1렌즈부를 통과한 입사광은 제1미러부에서 반사되어 분리 및 제거된다. 이후, 제2렌즈부는 제1렌즈부를 통과한 시료광만을 수집한다.
상기 표적 단일 나노입자 유래의 산란광은 레일리 산란(Rayleigh scattering)광인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 상기 단일 나노입자의 물리적 크기 및 편극도(polarizability)에 따라 세기가 결정되는 레일리 산란이 일어날 수 있다.
상기 표지물질 유래의 광은 레일리 산란광보다 장파장의 광으로서 형광, 발광 및 라만 신호로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 상기 표지물질은 표적 단일 나노입자와 상호작용을 하는 물질로서, 하나 또는 둘 이상 사용될 수 있으며, 동일 물질 또는 서로 다른 물질일 수 있다.
구체적으로 예를 들면, 표지물질로부터의 형광을 포함하는 시료광, 표지물질로부터의 발광을 포함하는 시료광, 표지물질로부터의 라만 신호를 포함하는 시료광, 표지물질 1로부터의 형광 및 표지물질 2로부터의 발광을 포함하는 시료광, 표지물질 1로부터의 발광 및 표지물질 2로부터의 라만 신호를 포함하는 시료광, 표지물질 1로부터의 형광 및 표지물질 2로부터의 라만 신호를 포함하는 시료광 또는 표지물질 1로부터의 형광, 표지물질 2로부터의 발광 및 표지물질 3으로부터의 라만 신호를 포함하는 시료광일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 형광은 표지물질에 결합된 형광 물질로부터 발하는 것일 수 있고, 상기 형광 물질은 시아닌(Cyanine)계열 형광분자, 로다민(Rodamine) 계열 형광분자, 옥사진(oxazine) 계열 형광 분자, 알렉사(Alexa) 계열 형광분자, FITC(fluorescein isothiocyanate) 형광분자, FAM(5-carboxy fluorescein) 형광분자 및 텍사스 레드(Texas Red) 형광분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로 상기 형광 물질은 싸이3(Cy3), 싸이5(Cy5), 플루오레세인 아이소티오시안산염(FITC), 테트라메 틸로다민 아이소티오시안산염(RITC), 알렉사(Alexa), 4,4,-다이플루오로-4-보로-3a,4a-다이아자-s-인다센(BODIPY), 텍사스 레드(Texas Red), 비오틴 로다민, 쿠마린, Cy, 에보블루(EvoBlue), 옥사진, 카보피로닌, 나프탈렌, 비페닐, 안트라센, 페난트렌, 피렌, 카바졸 등을 기본 골격으로 가지는 형광 색소나 그 형광 색소의 유도체를 예시할 수 있다.
상기 광원은 내부 전반사 조건에 따라 조사되는 것으로서 대물렌즈의 중심인 광축을 벗어나 조사되어 시료 표면에 도달하며, 상기 시료 표면에 존재하는 분자와 나노입자들을 여기 시킨 뒤 대물렌즈의 반대쪽 축을 통과하여 시료광과 함께 대물렌즈를 통과한다.
상기 대물 렌즈로부터 수집된 입사광 및 시료광이 튜브렌즈를 통과하고, 통과된 광이 제1렌즈부를 거치면서, 오버랩되어 있던 광들의 분리가 증폭될 수 있다. 제1렌즈부를 통과한 광은 분리를 위한 최적화가 이루어지고, 제1미러부에서 입사광이 분리 및 제거될 수 있다. 제1렌즈부는 상기 광 분리의 최적화를 위하여 하나 또는 둘 이상의 조리개(iris)를 포함할 수 있다. 특히, 제1렌즈부에 구비되어 설치될 수 있는 조리개는 단일 나노입자 유래 산란광 신호 감도를 조절함으로써 광 분리의 최적화를 유도할 수 있다.
상기 제1미러부에서 분리 및 제거되는 입사광의 초점면은 제1미러부에 위치하는 제1초점면이고, 상기 시료광의 초점면은 제1미러부 후단에 위치하는 제2초점면으로서, 입사광 및 시료광의 초점면이 상이함에 따라, 입사광이 제거되고 시료광만이 남아 이를 수집하는 제2렌즈부를 통과할 수 있다. 이때, 추가적으로 상기 제2초점면에 하나 또는 둘 이상의 조리개가 설치되어 시료광이 아닌 잡음 신호를 효과적으로 제거 할 수 있다.
상기 제2렌즈부는 상기 단일 나노입자 유래의 산란광 및 표지물질 유래의 광신호를 분리하기 전에 시료광을 평행광으로 형성되도록 함으로써 광의 수집형태를 제어하는 것이 가능하다. 즉, 상기 시료광은 제2초점면에서 집광된 후에 넓은 각도로 분산 되는데, 이러한 광을 제2렌즈부에서 평행광으로 변환시킴으로써 광 분리부를 통해 파장에 따라 분리된 시료광이 각각 제3렌즈부와 제4렌즈부에 의해 다시 집광되어 검출부에서 시각화 (Visualization) 될 수 있다.
본 발명에서의 상술한 제1렌즈부, 제2렌즈부, 제3렌즈부 및 제4렌즈부는 빛을 평행광으로 변환하거나 또는 평행광을 집광할 수 있는 렌즈를 포함하고, 평면볼록렌즈(Planoconvex lens) 또는 볼렌즈(Ball lens)를 포함할 수 있다. 또한 각 렌즈부는 복수의 렌즈로 구성될 수 있고, 이 경우 넓은 각도로 분산되는 경로의 광을 평행광으로 전환하는 효과를 높일 수 있다.
또한, 본 발명에 따라 상기 광 분리부는 제1다이크로익 미러, 제3렌즈부 및 제4렌즈부를 포함하는 것일 수 있다. 상기 제2렌즈부를 통하여 평행광이 형성된 후, 평행광은 제1다이크로익 미러를 통하여 장파장의 광은 투과되고, 단파장의 광은 반사될 수 있다. 즉, 시료광에 포함된 단일 나노입자 유래의 산란광 및 표지물질 유래의 광의 분리가 여기서 일어난다.
상기 광 분리부는 하나 이상의 미러부 및 제2다이크로익 미러를 더 포함할 수 있고, 제2다이크로익 미러는 제1다이크로익 미러로부터 투과된 광 및 상기 미러부로부터 반사된 광을 검출부로 보내는 역할을 할 수 있다.
구체적으로, 상기 제1다이크로익 미러로부터 반사된 단파장의 광은 하나의 미러부(제2미러부)를 통과하고 순차적으로 제4렌즈부에 의해 집광되어 EM CCD의 이미지면에 최종적으로 포커싱될 수 있다. 이때 상기 광 분리부는 BP(bandpass) 필터를 더 포함할 수 있으며, 제1다이크로익 미러에서 반사되어 제2미러부의 경로를 통과한 광이 상기 BP 필터를 통과하면서, 더 균일한 파장을 수집함으로써, 산란 광신호의 선택성이 향상될 수 있다. 또한 상기 광 분리부는 ND(Neutral density) 필터를 더 포함할 수 있고, 상기 ND 필터는 산란광 세기를 감소시켜 표적 나노입자의 산란광과 표지물질 유래 광의 상대적 빛의 세기 조절을 용이하게 하는 역할을 수행할 수 있다.
상기 제3렌즈부는 제1다이크로익 미러를 투과하여 BP 필터를 통과한 표지물질 유래 광을 집광하고, 수집된 광은 예를 들어, EM CCD의 이미지면에 최종적으로 포커싱될 수 있다. 이 경우, 제2다이크로익 미러를 통하여 추가적인 EM CCD를 구비할 필요없이, 보다 효율적으로 상기 광을 집광하여 검출부로 송광할 수 있다.
상기 검출부는 수집된 광신호를 이미징화하는 영상처리부를 포함하는 것일 수 있고, 상기 영상처리부에서 획득된 이미지는 단일 나노입자 유래의 레일리 산란광 및 표지물질 유래의 광인 것을 특징으로 하여 다중모드로 단일 분자 단일 나노입자의 동시검출을 확인하고 분석하는 것이 가능하다.
상기 광 분리부는 본 발명에 따른 구성 외에 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 기술에 따른 구성을 포함할 수 있고, 상기 구성들에 특별히 제한되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 실시간 다중모드 단일 분자 단일 나노입자의 동시검출 시스템을 나타낸 것으로, 구체적으로 다음과 같은 원리로 작동될 수 있다. 532 또는 660 nm의 광원이 현미경에 삽입되어 있는 광 분할기를 통해 시료로 전달되고, 미세유체 채널의 센서 표면에서 내부전반사 기반의 15×15 ㎛2의 광시야 영역을 생성하여, 단일 나노입자 및 이와 상호작용하는 표지물질에 결합된 형광염료를 동시에 여기시킨다. 상기 단일 나노입자 유래의 산란광의 경우, 입사광과 동일한 파장을 가져, 광학적 필터로는 분리하기 불가능하며 또한 입사광과 비교할 때 수십만 배 이상 작고, 매우 미세한 산란 신호를 가진다. 따라서 상기 입사광과 단일 나노입자 유래의 산란광을 분리하기 위하여 본 발명에 따른 검출 시스템은 제1렌즈부를 통하여 광 신호의 전위 및 초점거리 차이를 극대화시킨 후, 상기 입사광을 본 발명에 따른 제1렌즈부 후단에 위치하는 제1초점면에 인접하여 구비된 제1미러부를 통하여 반사시킴으로써 분리 및 제거할 수 있다.
이후, 시료광은 제1다이크로익 미러를 통하여 형광 채널(위)과 레일리 산란 채널(아래)로 분리되어 방출되고, EM CCD 이미지면에 평행하게 배치된다. 이때, EM CCD는 하나 또는 둘 이상을 사용할 수 있으나, 본 발명에 따른 제2다이크로익 미러를 구비함으로써 하나를 사용하는 것이 가능하고, 효율적인 측면에서 바람직할 수 있다.
도 2는 다중모드 단일 분자 단일 나노입자 동시 이미지 패키징을 통하여 단일 나노입자를 식별하는 본 발명에 따른 일 용도를 나타낸 것으로서, 도 2(A)는 표지물질의 일 예인 항체를 통한 단일 바이러스들의 간접적인 검출방법과 바이러스의 직접적인 검출방법 각각을 결합한 본 발명의 방식을 설명한다. 도 2(B)는 기존의 바이러스 검출방법에 따른 위양성 또는 위음성의 오류에 관한 이미지를 나타낸 것으로, 상단 이미지는 바이러스와 표지 항체가 동시에 존재하는 경우, 하단의 좌측은 바이러스가 존재하지 않고, 형광으로 표지된 항체만 있는 경우, 하단의 우측은 포획 항체 없이 오로지 바이러스만이 산란광을 방출하는 경우를 보여준다. 이 때, 적색 원으로 표시된 형광과 파란색 원으로 표시된 산란광이 모두 일치하지는 않는다는 사실을 상단 이미지를 통해 확인할 수 있다. 실제로 노란색 원으로 표시된 부분이 진양성(true positive)을 나타내는 것이므로 단일 나노입자의 직접적인 검출방법 및 간접적인 검출방법에서의 위양성 및 위음성의 오류가 있음을 육안으로 확인할 수 있다.
본 발명은 상기 직접적인 검출 및 간접적인 검출 방법을 결합한 실시간 다중모드 시스템을 도입함으로써 상기의 검출 오류를 방지하고 높은 정확도로 단일 나노입자를 식별할 수 있다.
상기 검출부는 광다이오드 배열(photodiode arrays: PDA), 전하주입장치(charge-injection device: CID), 전하결합장치(charge-couple device: CCD) 및 디지철 단렌즈 반사식 사진기(digital single lens reflex)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명은 상기 실시간 다중모드 단일 분자 단일 나노입자 동시 검출 시스템과 더불어 실시간으로 단일 나노입자를 검출하는 방법을 제공한다. 구체적으로 실시간 단일 나노입자를 검출하는 방법에 있어서, (S1) 표적 단일 나노입자가 포함된 시료와 표지물질을 접촉시켜 시료 내 표적 단일 나노입자 및 표지물질이 상호작용하여 복합체를 형성하는 단계; (S2) 상기 복합체에 특정 파장의 광원을 조사하는 단계; (S3) 상기 광원이 조사된 복합체의 광으로부터 입사광을 분리하는 단계; (S4) 상기 복합체 내 단일 나노입자에서 산란된 광을 분리하여 산란 신호를 검출하는 단계; 및 (S5) 상기 복합체 내 표지물질로부터 유래된 광을 분리하여 광 신호를 검출하는 단계;를 포함한다.
상기 단일 나노입자와 상호작용하는 표지물질은 항체(antibody), 폴리뉴클레오타이드(Polynucleotide), 수용체(receptor), 생물학적 압타머(biological aptamer), 효소(enzyme), 리간드(ligand), 천연물 및 합성분자로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있다. 이때, 합성분자는 단일 나노입자와 상호작용하는 합성된 화합물을 의미하는 것이다.
또한, 상기 검출 방법은 (S6) 검출된 산란 신호 및 광 신호를 각각 이미징화하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 산란 신호는 단일 나노입자로부터 유래된 레일리 산란 신호일 수 있고, 상기 광 신호는 레일리 산란광보다 장파장의 광으로서 형광, 발광 및 라만 신호로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있다. 상기 이미징화하는 단계는 상술한 검출부를 통하여 수행될 수 있고, 바람직하게는 둘 이상의 이미지를 통하여 단일 나노입자로부터의 산란 신호 및 표지물질로부터의 광 신호를 모두 관찰하는 것이 적합하다. 따라서 이를 통하여 단일 나노입자 뿐만 아니라 표지물질을 동시다발적으로 검출하는 것이 가능하다.
본 발명에 따른 검출 방법은 (S7) 상기 산란 신호 및 광 신호를 동시에 나타내는 스팟의 유무로 표적 단일 나노입자의 존재를 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다. 표적 단일 나노입자는 표지물질과 상호작용을 하고, 바람직하게는 특이적 결합을 하는 것일 수 있다. 상기 단일 나노입자와 상호작용하는 표지물질은 단일 나노입자가 아닌 다른 분자와의 상호작용으로 인한 광 신호를 발생시킬 수 있어 위양성의 결과를 나타낼 수 있고, 단일 나노입자가 표지물질과 상호작용하지 않음에 따라 위음성의 결과를 나타낼 수 있는 위험도가 존재한다.
본 발명에 따른 검출 방법은 상기 산란 신호 및 광신호를 동시에 나타내는 스팟이 존재할 경우, 그 스팟은 표적 단일 나노입자와 표지물질의 상호작용이 있었던 것으로 해석할 수 있어 표적 단일 나노입자의 존재를 정확하게 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 표적 단일 나노입자가 표지물질과의 상호작용이 원활하게 일어났음을 확인할 수 있는 지표로도 활용될 수 있다.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시를 위한 구체적인 내용을 설명한다. 첨부된 도면은 하기의 실험예를 통하여 본 발명에 따른 실시간 다중모드 단일 분자 단일 나노입자 동시 검출 시스템 및 검출 방법에 대한 결과를 나타낸 것이다. 다만, 하기의 실험예의 결과를 나타낸 도면은 본 발명을 상세히 설명하기 위한 하나의 참조일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 여러 형태로 구현될 수 있다. 그리고 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지기능에 대하여 이 분야의 기술자에게 자명한 사항으로서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략한다.
실험예 1. 단일 나노입자로서 인플루엔자 바이러스에 결합하는 단백질 형태의 항체를 표지물질로 활용한 실험.
약 100 nm의 크기를 가지는 인플루엔자 A 바이러스 (subtype H1N1)를 검출하기 위하여 미세유체 채널 표면에 포획 항체 (capture antibody)를 우선적으로 고정시켰다. 이후, 인플루엔자 바이러스 및 형광표지된 검출 항체(detection antibody)를 포함한 용액을 순차적으로 흘려보내 주었다. 상기 미세유체 채널 표면에 입사광원을 광대역 집광시켜, 여기된 바이러스들의 레일리 산란 신호와 표지된 검출 항체들의 형광 신호가 검출기의 양 이미지 채널에서 관찰되었다.
도 3은 상기 실험예 1에 따른 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 (hemagglutinin, HA)에 결합하는 항체를 Alexa 532로 표지하여 진양성 신호를 추적한 실험에 대한 결과를 나타낸 것이다. 도 3 (A)의 좌측은 형광을 측정한 것이며, 우측은 같은 이미지의 레일리 산란광을 측정한 것이다. 스팟 1 (황색)은 진양성, 스팟 2 (적색)은 위양성, 스팟 3 (청색)은 위음성을 의미한다. 도 3(B), 3(C), 3(D)는 각 스팟의 형광(Fluo)과 산란광 (Scat)을 실시간으로 측정한 결과이다. 도 3(E)는 세 종류의 독립적인 스팟을 각각 800 개 가량 측정하여 최대형광값 (IMax Fluo)와 최대산란광값 (IMax Scat)을 비교한 결과이다. 도 3(F)는 최대형광값의 정수배 변이를 나타내며 바이러스 입자 하나에 2개 또는 3개의 항체가 결합하고 있음을 알 수 있다. 이러한 분석을 통하여 본 발명에 따른 검출 시스템으로 단일 나노입자의 정량적 검출이 가능함을 확인할 수 있다.
Claims (14)
- 특정 파장을 조사하는 광원부;
상기 광원부로부터 조사된 광원이 투과 또는 반사되는 광 분할기;
상기 광 분할기로부터의 입사광 및 입사광에 의해 여기되는 시료광을 수집하는 대물 렌즈부;
상기 대물 렌즈부로부터 수집된 입사광과 시료광의 전위 및 초점거리 차이를 극대화시키는 제1렌즈부;
상기 제1렌즈부를 통과한 입사광이 반사되어 분리 및 제거되는 제1초점면을 포함하는 제1미러부;
상기 제1미러부 후단에 위치하며, 상기 입사광이 분리된 후 남은 시료광을 집광하는 제2초점면;
상기 제1렌즈부를 통과한, 시료 내 표적 단일 나노입자 유래 및 상기 표적 단일 나노입자와 상호작용하는 표지물질 유래의 광을 통합적으로 수집하는 제2렌즈부;
상기 시료광으로부터 표적 단일입자 유래의 산란광 및 상기 표지물질 유래의 광을 분리하는 광 분리부; 및
검출부; 를 포함하는,
실시간 다중모드 단일 분자 단일 나노입자 동시 검출 시스템. - 제 1항에 있어서,
상기 표적 단일 나노입자 유래의 산란광은 레일리 산란(Rayleigh scattering)광인 것을 특징으로 하는 실시간 다중모드 단일 분자 단일 나노입자 동시 검출 시스템. - 제 1항에 있어서,
상기 표지물질 유래의 광은 레일리 산란광보다 장파장의 광으로서, 형광, 발광 및 라만 신호로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 실시간 다중모드 단일 분자 단일 나노입자 동시 검출 시스템. - 제 1항에 있어서,
상기 광원은 내부 전반사 조건으로서, 상기 대물렌즈의 광축을 벗어나 조사되는 것인, 실시간 다중모드 단일 분자 단일 나노입자 동시 검출 시스템. - 삭제
- 제 1항에 있어서,
상기 광 분리부는 제1다이크로익 미러, 제3렌즈부 및 제4렌즈부를 포함하는, 실시간 다중모드 단일 분자 단일 나노입자 동시 검출 시스템. - 제 6항에 있어서,
상기 광 분리부는 하나 이상의 미러부 및 제2다이크로익 미러를 더 포함하고, 제2다이크로익 미러는 제1다이크로익 미러로부터 투과된 광 및 상기 미러부로부터 반사된 광을 집광하여 검출부로 보내는 것을 특징으로 하는, 실시간 다중모드 단일 분자 단일 나노입자 동시 검출 시스템. - 제 1항에 있어서,
상기 검출부는 수집된 광신호를 이미징화하는 영상처리부를 포함하는 것인, 실시간 다중모드 단일 분자 단일 나노입자 동시 검출 시스템. - 제 8항에 있어서,
상기 영상처리부에서 획득된 이미지는 단일 나노입자 유래의 레일리 산란광 및 표지물질 유래의 광인 것을 특징으로 하는, 실시간 다중모드 단일 분자 단일 나노입자 동시 검출 시스템. - 실시간으로 단일 나노입자를 검출하는 방법에 있어서,
(S1) 표적 단일 나노입자가 포함된 시료와 표지물질을 접촉시켜 시료 내 표적 단일 나노입자 및 표지물질이 상호작용하여 복합체를 형성하는 단계;
(S2) 상기 복합체에 특정 파장의 광원을 조사하는 단계;
(S3) 상기 광원이 조사된 복합체의 시료광으로부터 입사광을 분리하는 단계;
(S4) 상기 복합체 내 단일 나노입자에서 산란된 광을 분리하여 산란 신호를 검출하는 단계;
(S5) 상기 복합체 내 표지물질로부터 유래된 광을 분리하여 광 신호를 검출하는 단계;
(S6) 상기 검출된 산란 신호 및 광 신호를 각각 이미징화하는 단계; 및
(S7) 상기 산란 신호 및 광 신호를 동시에 나타내는 스팟의 유무로 표적 단일나노입자의 존재를 확인하는 단계;를 포함하는, 실시간 다중모드 단일 분자 단일 나노입자 동시 검출 방법. - 삭제
- 삭제
- 제 10항에 있어서,
상기 표지물질은 단일 나노입자와 상호작용을 하는 것으로서, 항체(antibody), 폴리뉴클레오타이드(Polynucleotide), 수용체(receptor), 생물학적 압타머(biological aptamer), 효소(enzyme), 리간드(ligand) 및 합성분자로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인, 실시간 다중모드 단일 분자 단일 나노입자 동시 검출 방법. - 제 1항 내지 제 4항 및 제 6항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단일 나노입자는 단일 바이러스인, 실시간 다중모드 단일 분자 단일 나노입자 동시 검출 시스템.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190168421A KR102256255B1 (ko) | 2019-12-17 | 2019-12-17 | 실시간 단일 분자 단일 나노입자 동시검출을 위한 이미징 시스템 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020190168421A KR102256255B1 (ko) | 2019-12-17 | 2019-12-17 | 실시간 단일 분자 단일 나노입자 동시검출을 위한 이미징 시스템 |
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| KR102256255B1 true KR102256255B1 (ko) | 2021-05-26 |
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ID=76137332
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| KR1020190168421A KR102256255B1 (ko) | 2019-12-17 | 2019-12-17 | 실시간 단일 분자 단일 나노입자 동시검출을 위한 이미징 시스템 |
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20060111142A (ko) * | 2005-04-22 | 2006-10-26 | 한국표준과학연구원 | 공초점 어레이 검출기를 이용한 마이크로스코프 |
| JP2013036872A (ja) * | 2011-08-09 | 2013-02-21 | Ricoh Co Ltd | ラマン分光装置およびラマン分光測定法 |
| KR20140063159A (ko) * | 2012-11-16 | 2014-05-27 | 삼성전기주식회사 | 경화도 측정장치 |
| KR20170052256A (ko) * | 2015-11-04 | 2017-05-12 | 한림대학교 산학협력단 | 라만 산란을 이용한 물질의 농도 측정 장치 및 방법 |
-
2019
- 2019-12-17 KR KR1020190168421A patent/KR102256255B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (4)
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