JP2013511713A - 向上した蛍光検出及び方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、発光をモニターする状況下での光学的検出及び感度を改善するシステム及び方法に関する。発光検出の感度の増大を達成する試料担体が提供される。試料担体は試料担持部分と光反射部分とを含んでおり、光反射部分は、試料担持部分に配置された試料から集光及び検出システムの方向に放出された発光だけでなく、集光及び検出システムから離れる方向に放出されて光反射部分によって集光及び検出システムの方向に反射された発光も集光及び検出システムで集光することができるように配置される。励起光源が必要とされる場合、光反射部分は、さらに、励起光線が試料を通して光反射部分に当たり、反対方向に反射して戻ることができるようにし、したがって、反射励起光は、さらに、試料を通過する。さらに、かかる試料担体を使用する方法が提供される。
【選択図】 図２

Description

本発明は光学的検出及び感度を改善する方法及びシステムに関する。具体的には、本発明は、発光をモニターする状況下での光学的検出及び感度を改善する方法及びシステムに関する。

光学的検出は、多くの分野及び様々な用途で多用されている。多くの場合、観察又は分析の対象物から発せられる光信号は非常に低く、検出限界付近にある。そこで、光学及び電気光学システムの検出感度を増大させるため、換言すれば、低強度の光信号を検出できるように光学又は電気光学システムの能力を向上させることに多大な努力がなされてきた。

蛍光顕微鏡法はその一例である。蛍光顕微鏡法は組織及び細胞を分析するための最も強力な技術の１つである。光が分析試料を透過する明視野顕微鏡法とは異なり、蛍光顕微鏡法では、信号は光を発する特定のものでしか得られず、バックグラウンドは暗いままである。そのため、蛍光顕微鏡法は試料中の物質の存在及び分布並びにその量を検出するための非常に感度の高い方法となる。したがって、蛍光顕微鏡法は光学顕微鏡法で用いられる最も重要な試験法の１つである。

このように、蛍光顕微鏡法では、分析試料は光を放つが、これは蛍光として知られている現象である。蛍光は分析試料に特有であることもあるし、分析試料とプローブとの相互作用の所産であることもある。ある種のプローブは特定の条件下で蛍光を発する化学物質である。例えば、試料中に存在又はその一部をなす化学物質（例えば、水素又はカルシウムイオンのようなイオン）のレベルに応じて異なる化学発光を呈するプローブが知られている。かかるプローブは試料中の特定のイオンの濃度及び／又は分布の決定に有用である。他のプローブには、結合部分及び蛍光タグがある。結合部分は、例えば、試料中に存在する結合対の第２の構成要素と結合できる結合対の第１の構成要素とすることができる。結合対の構成要素は、例えば、受容体に結合するリガンドとその逆、抗原に結合する抗体とその逆、補体に結合する核酸、酵素に結合する基質、生成物、阻害剤又は同族体とその逆などがある。蛍光タグは、典型的には、結合対の第１の構成要素に共有結合した蛍光色素であり、分析試料中に存在する結合対の第２の構成要素との結合をモニターするのに役立つ。多くの蛍光色素は、特有の吸収スペクトルと吸収ピーク及び発光スペクトルと発光ピークで特徴づけられることが知られている。蛍光色素の例としては、緑色、黄色、シアン及び赤色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質、フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ（登録商標）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ（登録商標）、Ａｑｕａ、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５．５などの低分子化合物が挙げられる。その他何百もの蛍光色素が公知である。

蛍光の検出に様々な改良がなされている。高感度の電荷結合デバイス（ＣＣＤ）を用いた画像顕微鏡法が多用されており、特に限定されないが、高感度化、同時検出することのできるプローブ数の増大、定量分析の精度向上及び自動化を始めとする多くの態様で検出の改良がなされている。さらに、被写界深度の精度を改善する共焦点光学系と組合せたレーザー走査機構を用いた共焦点顕微鏡法も多用されている。これらの検出法によって蛍光顕微鏡法の用途が広がっている。

蛍光検出は、（ｉ）生体物質担持チップ、及び（ｉｉ）様々な起源からの核酸、タンパク質、ペプチド又は炭水化物などの生体分子の電気泳動分離及び検出の分野でも広く使用されている。いずれの場合も、好ましい検出法の１つとして蛍光検出がある。

蛍光検出は様々な技術分野で特に重要となりつつある。望ましい検出レベル、換言すれば、望ましい感度レベルは、試料が小さくにつれて高まる。一例として、遺伝子発現の評価プロセスにおいてチップ上のＤＮＡアレイを検出する場合、回答すべき問題はイエス／ノー問題ほど単純ではない。主な問題は、１又は複数の遺伝子の発現レベルを決定するのにすべての配列をどの程度ハイブリダイズさせるかということである。測定精度が高いほど、多くの情報がもたらされ、分析は正確になる。検出システムはこの意味で主要な制限要因の１つである。

そこで、新規な蛍光検出のための方法で、既存の光学系で蛍光を検出することのできる感度を増大させる方法に対するニーズが存在しており、かかる方法を提供することができれば非常に有益である。

米国特許出願公開第２００８／０１００９１１号明細書

本発明は、発光をモニターする状況下での光学的検出及び感度を改善するシステム及び方法に関する。

第１の態様では、本発明は、発光の検出感度を増大させる試料担体を提供する。試料担体は試料担持部分と光反射部分とを含んでおり、光反射部分は、試料担持部分に配置された試料から集光及び検出システムの方向に放出された発光だけでなく、集光及び検出システムから離れる方向に放出されて光反射部分によって集光及び検出システムの方向に反射された発光も集光及び検出システムで集光することができるように配置される。励起光源が必要とされる場合、光反射部分は、励起光線が試料を通して光反射部分に当たり、反対方向に反射して戻り、反射励起光も試料を通過するように配置される。

第２の態様では、本発明は、試料から放出された発光を検出する際の集光及び検出システムの感度を増大させる方法を提供する。本方法は、試料担持部分と光反射部分とを含む試料担体上に試料を配置することを含み、集光及び検出システムは、（１）試料担持部分に配置された試料から、集光及び検出システムの方向に放出された発光と、（２）試料から、集光及び検出システムから離れる方向に放出され、光反射部分によって集光及び検出システムの方向に反射された発光とを共に集光して、発光の検出感度を増大させる。励起光源が必要とされる場合、光反射部分は、さらに、励起光線が試料を通して光反射部分に当たり、反対方向に反射して戻り、反射励起光も試料を通過するように配置される。

本発明の一実施形態に係る試料担体を用いた蛍光検出の概略の光路を示す図である。 同じ原理を示す図１の一部の拡大図である。

定義
コーナレフレクタは互いに垂直な３枚の交差平面からなる再帰反射器であり、光源の方に電磁波を反射して戻す。３枚の交差面は大抵は正方形である。これはコーナーキューブとしても知られている。光学系において、コーナレフレクタは、典型的には、入射光ビームを反対方向に戻す３枚の鏡又は反射プリズムからなる。

本発明の詳細な説明
蛍光走査・分光法を始めとする蛍光分析における課題は測定感度をできるだけ高めることである。これを達成するには、効率的な集光が鍵となる。試料の効率的な照明も非自発蛍光試料では重要である。本発明の実施形態は、単純ではあるが洗練された設計によってこれらの目標を達成する試料担体及び方法を提供する。

本発明は、光学的検出及び感度の改良に使用できる方法及びシステムに関するものである。具体的には、本発明は、発光をモニターする状況下での光学検出及び感度の改良に使用できる。

本明細書で用いる「発光」という用語は、白熱によるものでなく、白熱体よりも低い温度で生じる光の放出をいい、例えば、蛍光、自発蛍光、化学蛍光、エレクトロルミネセンス及び化学ルミネセンスを包含する。

本発明によるシステム及び方法の原理及び動作については、図面及び以下の説明を参照することによって理解を深めることができよう。図面を参照すると、図１は、本発明の一実施形態に係る試料担体を用いた蛍光検出の概略の光路を示す。図２は、同じ原理を示す拡大図を示す。これらの図は、試料が非自発蛍光性である例を示す。試料が自発蛍光性である場合には、外部光源は必要ない。

図１を参照すると、光源は例示的な分析用ゲル及びそのバンドを照明する（明瞭化のため、図には１本の光源光線しか示していない。）。なお、ゲルはガラス板上に配置した状態で示してある。ガラス板と再帰反射器との間に空間が示してあるが、必須ではない。励起光線は光源から発せられ、ゲル及びバンドを通過する。励起光線は試料担持部分（つまりガラス板）を通って進み、光反射部分（すなわち、再帰反射器）に到達し、再帰反射器に当たって反射して入射励起光線とは反対方向に戻る。このように、蛍光分子は上下からの光線で励起される。したがって、励起光は２回利用される。

ゲルバンド中の蛍光分子は励起され、すべての方向に等方的に光を発する。ゲルバンドから上方に向いた矢印は分子から放射される光線を示し、これらはレンズの開口数にある。光線はレンズで集光及び屈折され、発光フィルタで濾光され、ＣＣＤにバンドの画像を形成する。試料ゲルバンドから下方に放出される光線もある。この光線は再帰反射器に当たって反射して戻り、ゲルを通ってレンズで屈折されてＣＣＤ上に画像を形成する。このように、下方に進む放出光も利用して画像の強度を高める。

一実施形態では、本発明は発光の検出感度を増大させるための試料担体を提供し、試料担体は試料担持部分と光反射部分とを含む。好ましくは、試料担持部分は片側で試料を担持し、光反射部分は試料担持部分の反対側に位置する。適宜、光反射部分は試料担持部分の片側に接合される。

一実施形態では、光反射部分は再帰反射器を含む。好ましい実施形態では、光反射部分はマイクロコーナレフレクタなどのコーナレフレクタを含む。かかるマイクロコーナレフレクタの一例として、Ｆｒｅｓｎｅｌ Ｏｐｔｉｃｓ ＧｍｂＨ（ドイツ）製のものがある。

一実施形態では、試料担持部分は顕微鏡スライドである。

別の実施形態では、試料担持部分はガラス板である。

本発明の別の態様では、試料から放出された発光を検出する際の集光及び検出システムの感度を増大させる方法が提供される。この方法は上述の試料担体上に試料を配置することを含んでおり、その結果、集光及び検出システムは、（１）集光及び検出システムの方向に、試料担体の試料担持部分に配置された試料から放出された発光と、（２）試料から、集光及び検出システムから離れる方向に放出され、光反射部分によって集光及び検出システムの方向に反射される発光とを共に集光する。

一実施形態では、試料を通過する励起光線は試料担体の光反射部分に当たり、反対方向に反射して戻り、反射励起光も試料を通過する。

一実施形態では、分析用の試料は生体試料である。例えば、生体試料は、細胞、ファージ、細菌、核酸、タンパク質、ペプチド及び炭水化物からなる群から選択される。一例として、試料は、Ｃｙ５色素などで標識され、電気泳動分析用ゲル上で分離されたタンパク質又は核酸試料である。

別の実施形態では、試料は生体試料であり、試料担持部分は、生体試料が結合したチップである。好ましくは、生体物質はアレイフォーマットのチップに結合している。

別の実施形態では、試料から放出される発光は試料の自発蛍光に由来する。別の実施形態では、試料から放出される発光は、試料と相互作用する蛍光プローブに由来する。一例では、蛍光プローブは、蛍光タグと結合した結合対の第１の構成要素を含む。適宜、結合対の第１の構成要素は、核酸、リガンド、受容体、抗原、抗体、酵素、基質、基質同族体及び阻害剤からなる群から選択される。適宜、蛍光タグは、蛍光色素、量子ドット、ナノ結晶及び蛍光タンパク質からなる群から選択される。

本発明の実施に当たり、任意の集光及び検出システムを使用することができる。例えば、特に限定されないが、キセノンランプ又は水銀ランプなどのアークランプを有する蛍光スキャナ又は顕微鏡、共焦点顕微鏡、例えば、レーザー光線のようなコヒーレント光を発する走査可能な光源を含む集光及び検出システムが挙げられる。或いは、光源は発光ダイオード（ＬＥＤ）でも白熱光源でもよい。

以下の実施例は例示にすぎず、特許請求の範囲で規定される発明を限定するものではない。

Ｅｔｔａｎ ＤＩＧＥ Ｉｍａｇｅｒ（ユニット１２）−０５１０１１での反射器試験
Ｅｔｔａｎ ＤＩＧＥ Ｓｃａｎｎｅｒで、Ｆｒｅｎｅｌ Ｏｐｔｉｃｓ ＧｍｂＨ製の３種類の異なるコーナキューブレトロレフレクタを試験した。キューブサイズは、ＲＦ０９０では１辺当たり０．１５２ｍｍ、ＯＴ８５３では０．８６４ｍｍ、ＯＴ８６７では１辺当たり０．２５４ｍｍであった。レトロレフレクタは、別々の試料を含むゲルから１．５ｍｍの距離に配置した。

走査設定：１００μｍ、Ｃｙ５チャネル、露光レベル：０．０２ｓ。

この試験結果は、レトロレフレクタの使用によって信号／雑音比が最大１．８８倍増大したことを示している。コーナーキューブはできるだけ小さくすべきである。１辺が０．８６４ｍｍの最も大きいキューブでは画像が歪んだ。ゲルを含む試料までの反射器の距離を最適化すると、信号を改善することができる。

本明細書で言及したすべての特許、特許刊行物、及び他の刊行された参考文献は、あたかも各々が参照により個々に具体的に本明細書に組み込まれているようにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明の好ましい例示的な実施形態が説明されているが、当業者は、本発明が、限定のためでなく例証のためにのみ示されている説明した実施形態以外のものによって実施することができることを理解されよう。本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。

Claims (29)

1. 発光の検出感度を増大させるための試料担体であって、
   試料担持部分と光反射部分と
   を含んでおり、光反射部分が、試料担持部分に配置された試料から集光及び検出システムの方向に放出された発光だけでなく、試料から、集光及び検出システムから離れる方向に放出されて光反射部分によって集光及び検出システムの方向に反射された発光も集光及び検出システムで集光することができるように配置されている、試料担体。
2. 光反射部分が、励起光線が試料を通して光反射部分に当たり、反対方向に反射して戻り、反射励起光も試料を通過するように配置されている、請求項１記載の試料担体。
3. 試料担持部分が片側で試料を担持し、光反射部分が試料担持部分の反対側にある、請求項１記載の試料担体。
4. 光反射部分が試料担持部分の片側に接合される、請求項１記載の試料担体。
5. 光反射部分が再帰反射器を含む、請求項１記載の試料担体。
6. 光反射部分がコーナレフレクタを含む、請求項１記載の試料担体。
7. 試料担持部分が顕微鏡スライドである、請求項１記載の試料担体。
8. 試料担持部分がガラス板である、請求項１記載の試料担体。
9. 試料が電気泳動ゲルで分離された生体試料である、請求項１記載の試料担体。
10. 試料が生体試料であり、試料担持部分は、生体試料が結合したチップである、請求項１記載の試料担体。
11. 試料から放出された発光を検出する際の集光及び検出システムの感度を増大させる方法であって、
    試料担持部分と光反射部分とを含む試料担体上に試料を配置する
    ことを含んでおり、集光及び検出システムが、（１）試料担持部分に配置された試料から、集光及び検出システムの方向に放出された発光と、（２）試料から、集光及び検出システムから離れる方向に放出され、光反射部分によって集光及び検出システムの方向に反射された発光とを共に集光し、もって発光の検出感度を増大させる、方法。
12. 光反射部分が、励起光線が試料を通して光反射部分に当たり、反対方向に反射して戻り、反射励起光も試料を通過するように配置される、請求項１１記載の方法。
13. 試料担持部分が片側で試料を担持し、光反射部分が試料担持部分の反対側にある、請求項１１記載の方法。
14. 光反射部分が試料担持部分の片側に接合される、請求項１１記載の方法。
15. 光反射部分が再帰反射器を含む、請求項１１記載の方法。
16. 光反射部分がコーナレフレクタを含む、請求項１１記載の方法。
17. 試料が生体試料であり、試料担持部分は、生体試料が結合したチップである、請求項１１記載の方法。
18. 集光及び検出システムが蛍光スキャナである、請求項１１記載の方法。
19. 試料担持部分が顕微鏡スライドである、請求項１１記載の方法。
20. 試料担持部分がガラス板である、請求項１１記載の方法。
21. 試料が電気泳動ゲルで分離された生体試料である、請求項１１記載の方法。
22. 試料から放出される発光が試料の自発蛍光に由来する、請求項１１記載の方法。
23. 試料から放出される発光が、試料と相互作用する蛍光プローブに由来する、請求項１１記載の方法。
24. 蛍光プローブが、蛍光タグと結合した結合対の第１の構成要素を含む、請求項２３記載の方法。
25. 結合対の第１の構成要素が、核酸、リガンド、受容体、抗原、抗体、酵素、基質、基質同族体及び阻害剤からなる群から選択される、請求項２４記載の方法。
26. 蛍光タグが、蛍光色素、量子ドット、ナノ結晶及び蛍光タンパク質からなる群から選択される、請求項２４記載の方法。
27. 励起光線が走査可能な光源からのものである、請求項１２記載の方法。
28. 走査可能な光源がコヒーレント光を発する、請求項２７記載の方法。
29. 励起光線が、アークランプ、発光ダイオード又は白熱光源からのものである、請求項１２記載の方法。