CN114966042A - 一种高灵敏度多通道分子免疫检测装置及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高灵敏度多通道分子免疫检测装置及其检测方法。检测装置包括标记分子、检测基板、倒置样品台、激发光源、倒置荧光显微成像光路模块和成像器件；本发明在检测基板上修饰若干种探针分子，并对应使用具有不同荧光特性的荧光标记物标记得到不同标记分子，标记分子经过反应固定于所述检测基板后经激发光源激发荧光反应，经荧光显微成像后利用荧光特性与待测生物分子的对应关系，实现对待测生物分子的检测，并可单次实现对多通道检测，有效提高检测效率；另外，具有长荧光寿命的荧光标记物在短寿命荧光完全衰减后仍能稳定激发荧光，可有效地避免生物样品本身的自发荧光、散射光以及背景荧光的干扰，在免疫检测中提高信噪比以及灵敏度。

Description

一种高灵敏度多通道分子免疫检测装置及其检测方法

技术领域

本发明涉及生物分子检测技术领域，特别是涉及一种高灵敏度多通道分子免疫检测装置及其检测方法。

背景技术

免疫检测在疾病的监测和治疗过程中有着广泛的应用，随着科学技术进步和新发疾病的多样化，对免疫检测灵敏度和检测效率的要求也随之增加。现今主流的免疫检测技术包括酶联免疫分析、化学发光免疫分析和电化学发光免疫分析等，因反应体系简单，反应条件温和，重复好，被广泛地应用于无机有机化合物、生物及医药分析领域。但由于检测方法和设备的局限性，检测信号受到背景噪声的影响较大，并且单次只能实现一种分子的检测，检测灵敏度和检测效率都受到了极大地限制。

发明内容

基于此，本发明的目的在于，提供一种高灵敏多通道分子免疫检测装置，其具有高灵敏度以及高检测效率的优点。

一种高灵敏度多通道分子免疫检测装置，其包括标记分子、检测基板、倒置样品台、激发光源、倒置荧光显微成像光路模块和成像器件；

所述标记分子具有若干种，其由具有不同荧光特性的荧光标记物一一对应标记不同种待测生物分子得到，或者由具有不同荧光特性的荧光标记物一一对应标记不同种检测分子得到，所述检测分子可与所述待测生物分子特异性结合，所述荧光标记物具有长荧光寿命；

所述检测基板上修饰有若干种探针分子，不同种探针分子可一一对应与不同种待测生物分子特异性结合，并使标记分子结合固定于所述检测基板的底部，且所述探针分子与所述待测生物分子特异性结合的位点和所述检测分子与所述待测生物分子特异性结合的位点不同；

所述倒置样品台用以固定所述检测基板；

所述倒置荧光显微成像光路模块与所述倒置样品台、所述激发光源、以及所述成像器件光路连接；所述倒置荧光显微成像光路模块用以将所述激发光源发出的光线反射至所述检测基板，并使结合固定于所述检测基板上的标记分子的荧光标记物激发荧光，激发的荧光经过所述倒置荧光显微成像光路模块到达所述成像器件，并由所述成像器件形成图像。

本发明实施例所述高灵敏多通道分子免疫检测装置，其通过在检测基板上设置若干种探针分子，并使用具有不同荧光特性的荧光标记物标记待测生物分子或者标记可与待测生物分子特异性结合的检测分子，进而利用探针分子与待测生物分子的特异性结合，经过杂交反应直接将荧光标记的待测生物分子或间接通过待测生物分子将荧光标记的检测分子固定于检测基板的底部，随后进一步经激发光源激发荧光反应，经荧光显微成像后利用荧光特性与待测生物分子的对应关系，可实现对生物待测分子的检测，并可单次实现对多种待测生物分子的检测，有效提高检测效率；另外，相对于普通荧光团，具有长荧光寿命的荧光标记物在短寿命荧光完全衰减后仍能稳定激发荧光，同时可有效地避免生物样品本身的自发荧光、散射光以及背景荧光的干扰，在免疫检测中提高信噪比以及灵敏度。

进一步地，所述荧光标记物为上转换光致发光纳米材料或时间分辨荧光微球。镧系元素即稀土离子具有特异性强、斯托克斯位移大和荧光衰变时间长等特点，基于稀土离子的发光特性发展出的上转换光致发光纳米材料、时间分辨荧光微球等荧光材料均具有稳定以及较长的荧光寿命，其中上转换光致发光纳米材料是一类掺杂稀土离子的无机纳米材料，其可在低能量的近红外激发后发射出高能量的紫外可见光，进而有效避免高能量激发光对生物样品的损伤；时间分辨荧光微球是一种特殊的功能微球，其采用较长荧光半衰期的稀土离子作标记物，每个微球中可以包裹成千上万个荧光分子，有效地提高了荧光的标记效率和分析灵敏度，同时荧光微球表面还可修饰有合适密度的羧基或其它功能基团，用于与蛋白或抗体的共价偶联，提高了标记物的稳定性。

进一步地，激发光源的波长根据选取的荧光标记物的不同相应设置，对应荧光标记物为上转换光致发光纳米材料，所述激发光源为波长为808nm或980nm的LED光源；对应荧光标记物为时间分辨荧光微球，所述激发光源为波长为365nm的LED灯源。

进一步地，所述倒置显微成像光路模块包括二向色镜、物镜以及滤光装置，所述二向色镜将光路分成两路，其中一路光路中，所述激发光源、所述二向色镜、所述物镜与所述倒置样品台依次光路连接，另一路光路中，所述倒置样品台、所述物镜、所述二向色镜、所述滤光装置以及所述成像器件依次光路连接；所述滤光装置用于单一波长光束的筛选。

进一步地，所述倒置显微成像光路模块还包括小孔光阑以及准直透镜，所述激发光源、所述小孔光阑、所述准直透镜与所述二向色镜依次光路连接。激发光源激发的光经过小孔光阑的小孔到准直透镜，准直透镜进一步将激发光变成一束平行的准直光柱并聚焦至二向色镜，经二向色镜反射后通过物镜聚焦至倒置样品台上的检测基板。

进一步地，所述滤光装置包括若干可切换设置的滤光片，且每一所述滤光片可筛选滤出特定工作波长的光束。通过切换滤出波长不同的滤光片，可轮流滤出若干个特定工作波长以对应不同荧光特性的荧光标记物所激发的荧光，可实现对多种待测生物分子的检测，提高检测效率，同时单次仅通过一种波长的荧光，可有效将除荧光外的杂散光进行过滤，提高检测灵敏度。

进一步地，所述倒置显微成像光路模块还包括双胶合透镜，所述成像器件包括面阵CCD相机以及图像显示设备；所述二向色镜、所述滤光装置、所述双胶合透镜与所述面阵CCD相机依次光路连接，所述图像显示设备与所述面阵CCD相机电性连接。固定于检测基板上的标记分子的荧光标记物经聚焦的激光激发荧光，激发的荧光经过物镜采集后再经过二向色镜的透射到达滤光装置，根据不同荧光特性的荧光标记物发出的不同荧光，切换对应的滤光片，过滤出特定波长的荧光，进一步经过选取合适焦距的双胶合透镜的扩束到达面阵CCD相机进行成像，得到的图像最后经图像显示设备进行显示，以供对比检测分析。

进一步地，所述检测基板为96孔板，兼容传统免疫检测方法中使用的检测基板。

另外，本发明实施例还提供一种高灵敏度多通道分子免疫检测方法，其应用以上所述的高灵敏度多通道分子免疫检测装置进行检测，其包括以下具体操作步骤：

S1、对应不同种待测生物分子，选用具有不同荧光特性的荧光标记物，建立荧光特性与待测生物分子的种类对应关系库；

S2、在检测基板上修饰若干种与待测生物分子一一对应特应性结合的探针分子；

S3、使用具有不同荧光特性的荧光标记物一一对应与待测生物分子进行标记反应，得到若干种标记分子；将若干种标记分子加入至检测基板，检测基板上的探针分子对应与待测生物分子进行杂交反应，以使标记分子固定于检测基板；

或者，

使用具有不同荧光特性的荧光标记物一一对应与检测分子进行标记反应，得到若干种标记分子；将待测生物分子与若干种标记分子加入至检测基板，检测基板上的探针分子对应与待测生物分子、标记分子进行杂交反应，以使标记分子结合固定于检测基板；

S4、将步骤S3得到的杂交反应后的检测基板固定于所述倒置样品台，通过选用特定波长的激发光源进一步经所述倒置荧光显微光路模块以及所述成像器件对结合固定的标记分子上的荧光标记物进行检测和成像；

S5、根据测得的荧光标记物的荧光特性，结合步骤S1建立得到的荧光特性和待测生物分子的种类对应关系库，识别待测生物分子的种类，并根据测得的荧光标记物的数量计算得到待测分子的浓度。

本发明实施例所述高灵敏多通道分子免疫检测方法，其通过优选具有长荧光寿命的荧光标记物对待测生物分子或可与待测生物分子特异性结合的检测分子进行标记，同时建立荧光特性和待测生物分子种类的对应关系，在单次检测中对多种生物分子的混合样品进行种类分析和定量检测，有效地降低了背景噪声的干扰和提高了检测效率，检测方法操作简便，在生物分子分析和临床疾病诊断等领域中具有很好的应用前景。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1为本发明实施例1所述高灵敏度多通道分子免疫检测装置结构示意图；

图2为本发明实施例2所述高灵敏度多通道分子免疫检测方法的步骤示意图；

图3为本发明实施例2中对结合在检测基板底部的时间分辨荧光微球荧光成像结果图；

图4为本发明实施例3中对结合在检测基板底部的上转换光致发光纳米颗粒荧光成像结果图一；

图5为本发明实施例3中对结合在检测基板底部的上转换光致发光纳米颗粒荧光成像结果图二；

图6为BGP标准品浓度和CRP标准品浓度与上转换光致发光纳米颗粒计数结果的关系图。

具体实施方式

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

实施例1

请参照图1，图1为本发明实施例1所述高灵敏度多通道分子免疫检测装置结构示意图，如图所示，本发明实施例1提供一种高灵敏度多通道分子免疫检测装置，其包括标记分子、检测基板1、倒置样品台2、激发光源3、倒置荧光显微成像光路模块和成像器件；

所述标记分子具有若干种，其由具有不同荧光特性的荧光标记物一一对应标记不同种待测生物分子得到，或者由具有不同荧光特性的荧光标记物一一对应标记不同种检测分子得到，所述检测分子可与所述待测生物分子特异性结合，所述荧光标记物具有长荧光寿命；

检测基板1上修饰有若干种探针分子，不同种探针分子可一一对应与不同种待测生物分子特异性结合，并使标记分子结合固定于检测基板1的底部，且所述探针分子与所述待测生物分子特异性结合的位点和所述检测分子与所述待测生物分子特异性结合的位点不同；

倒置样品台2用以固定检测基板1；

所述倒置荧光显微成像光路模块与倒置样品台2、激发光源3以及所述成像器件光路连接；所述倒置荧光显微成像光路模块用以将激发光源3发出的光线反射至检测基板1，并使结合固定于检测基板1上的标记分子的荧光标记物激发荧光，激发的荧光经过所述倒置荧光显微成像光路模块到达所述成像器件，并由所述成像器件形成图像。

本发明实施例1所述高灵敏多通道分子免疫检测装置，其通过在检测基板上设置若干种探针分子，并使用具有不同荧光特性的荧光标记物标记待测生物分子或者标记可与待测生物分子特异性结合的检测分子，进而利用探针分子与待测生物分子的特异性结合，经过杂交反应直接将荧光标记的待测生物分子或间接通过待测生物分子将荧光标记的检测分子固定于检测基板的底部，随后进一步经激发光源激发荧光反应，经荧光显微成像后利用荧光特性与待测生物分子的对应关系，可实现对生物待测分子的检测，并可单次实现对多种待测生物分子的检测，有效提高检测效率；另外，相对于普通荧光团，具有长荧光寿命的荧光标记物在短寿命荧光完全衰减后仍能稳定激发荧光，同时可有效地避免生物样品本身的自发荧光、散射光以及背景荧光的干扰，在免疫检测中提高信噪比以及灵敏度。

作为一种具体实施方式，检测基板1为96孔板，其选用进口光学透明纯聚苯乙烯制造，并采用特殊工艺，使其具有高结合力，便于探针分子的修饰，且兼容传统免疫检测方法中使用的检测基板1；

所述荧光标记物为上转换光致发光纳米材料或时间分辨荧光微球。镧系元素即稀土离子具有特异性强、斯托克斯位移大和荧光衰变时间长等特点，基于稀土离子的发光特性发展出的上转换光致发光纳米材料、时间分辨荧光微球等荧光材料均具有稳定以及较长的荧光寿命，其中上转换光致发光纳米材料是一类掺杂稀土离子的无机纳米材料，其可在低能量的近红外激发后发射出高能量的紫外可见光，进而有效避免高能量激发光对生物样品的损伤；时间分辨荧光微球是一种特殊的功能微球，其采用较长荧光半衰期的稀土离子作标记物，每个微球中可以包裹成千上万个荧光分子，有效地提高了荧光的标记效率和分析灵敏度，且微球内包埋的稀土粒子已经经过螯合，无需进行解离增强，可简化操作步骤，同时荧光微球表面还可修饰有合适密度的羧基或其它功能基团，如氨基基团或亲和素等，用于与蛋白或抗体的共价偶联，提高了标记物的稳定性。

激发光源3的波长根据选取的荧光标记物的不同相应设置，对应荧光标记物为上转换光致发光纳米材料，激发光源3为波长为808nm或980nm的LED光源；对应荧光标记物为时间分辨荧光微球，激发光源3为波长为365nm的LED灯源。

进一步优选地，所述倒置显微成像光路模块包括小孔光阑4、准直透镜5、二向色镜6、物镜7、滤光装置8以及双胶合透镜9，所述成像器件包括面阵CCD相机10以及图像显示设备11，图像显示设备11与面阵CCD相机电性连接；所述成像器件包括二向色镜6将光路分成两路，包括第一光路以及第二光路；滤光装置8用于单一波长光束的筛选，优选地，滤光装置8包括若干可切换设置的滤光片，且每一所述滤光片可筛选滤出特定工作波长的光束，通过切换滤出波长不同的滤光片，可轮流滤出若干个特定工作波长以对应不同荧光特性的荧光标记物所激发的荧光，可实现对多种待测生物分子的检测，提高检测效率，同时单次仅通过一种波长的荧光，可有效将除荧光外的杂散光进行过滤，提高检测灵敏度。

具体地，在所述第一光路中，激发光源3、小孔光阑4、准直透镜5、二向色镜6、物镜7与倒置样品台2依次光路连接，激发光源3激发的光经过小孔光阑4的小孔到准直透镜5，准直透镜5进一步将激发光变成一束平行的准直光柱并聚焦至二向色镜6，经二向色镜6反射后通过物镜7聚焦至倒置样品台2上的检测基板1。

在所述第二光路中，倒置样品台2、物镜7、二向色镜6、滤光装置8、双胶合透镜9以及面阵CCD相机10依次光路连接；固定于检测基板1上的标记分子的荧光标记物经聚焦的激光激发荧光，激发的荧光经过物镜7采集后再经过二向色镜6的透射到达滤光装置8，根据不同荧光特性的荧光标记物发出的不同荧光，切换对应的滤光片，过滤出特定波长的荧光，进一步经过选取合适焦距的双胶合透镜9的扩束到达面阵CCD相机10进行成像，得到的图像最后经图像显示设备11进行显示，以供对比检测分析。

实施例2

本发明实施例2提供一种高灵敏度多通道分子免疫检测方法，其应用以上所述的高灵敏度多通道分子免疫检测装置进行检测，请参照图2，图2为本发明实施例2所述高灵敏度多通道分子免疫检测方法的步骤示意图，其包括以下具体操作步骤：

S1、对应不同种待测生物分子，选用具有不同荧光特性的荧光标记物，建立荧光特性与待测生物分子的种类对应关系库；

S2、以96孔板作为检测基板1，并在基板上修饰若干种与待测生物分子一一对应特异性结合的探针分子，在本实施例中，作举例说明地，待测生物分子为羊抗小鼠IgG以及羊抗兔IgG，具体地为同时在检测基板1上修饰探针分子小鼠IgG和兔IgG；

S3、选用具有长荧光寿命的荧光标记物直接一一对应与待测生物分子进行标记反应，得到若干种标记分子，其中本实施例选用两种粒径为100nm、激发波长为365nm的具有不同荧光发射波长的时间分辨荧光微球作为荧光标记物，该时间分辨荧光微球的表面还修饰有合适密度的羧基基团，具体地，选用包埋铕离子、荧光发射波长为615nm并呈红色荧光的时间分辨荧光微球标记羊抗小鼠IgG，选用包埋铽离子、荧光发射波长为550nm并呈绿色荧光的时间分辨荧光微球标记羊抗兔IgG；

将两种标记分子加入至检测基板1，检测基板1上修饰的探针分子小鼠IgG和兔IgG的对应与待测生物分子羊抗小鼠IgG和羊抗兔IgG进行杂交反应，以使两种标记有荧光标记物的标记分子固定于检测基板1的底部；

S4、将步骤S3得到的杂交反应后的检测基板1固定于倒置样品台2，选用波长为365nm的LED作为激发光源3，激发光经过小孔光阑4的小孔后到达准直透镜5，准直透镜5将激发光准直聚焦到二向色镜6，经二向色镜6反射后通过物镜7聚焦在固定于倒置样品台2的检测基板1；结合在检测基板1底部的两种可激发不同荧光的时间分辨荧光微球同时被激发，分别产生红色荧光以及绿色荧光；激发的荧光透过检测基板1底部并经过物镜7采集后再通过二向色镜6透射到达滤光装置8；依据两种不同的荧光，对应切换红色滤光片和绿色滤光片，轮流滤出两种特定工作波长的光束，一次只通过一种荧光并将除荧光外的杂散光过滤；最后荧光经过双胶合透镜9在面阵CCD相机10上成像，并在图像显示设备11，即计算机上成像显示结果图；

S5、请参照图3，图3为本发明实施例2中对结合在检测基板1底部的时间分辨荧光微球荧光成像结果图，需要进行说明的是，图3中选取的均是完整计数视野的1/6区域，只作示意而不作为统计标准；根据测得的荧光标记物的荧光特性，结合步骤S1建立得到的荧光特性和待测生物分子的种类对应关系库，确定所测荧光标记物所对应的标记分子，从而确定待测生物分子的种类，即图3中a图为检测系统切换为红色滤光片时的孔板底部的时间分辨荧光微球荧光成像图，即羊抗小鼠IgG的检测结果图；图3中b图为检测系统切换为绿色滤光片时的孔板底部的时间分辨荧光微球荧光成像图，即羊抗兔IgG的检测结果图；进一步地，还可根据整个完整技术视野中荧光标记物的数量计算得到待测分子的浓度。

实施例3

本发明实施例3提供一种高灵敏度多通道分子免疫检测方法，其与实施例2的区别在于：在本实施例中为基于不同具有不同荧光特性的上转换光致发光纳米材料颗粒作为标记物，具体地，其包括以下具体操作步骤：

S1、对应不同种待测生物分子，选用具有不同荧光特性的荧光标记物，建立荧光特性与待测生物分子的种类对应关系库；

S2、以96孔板作为检测基板1，并在在基板上修饰若干种与待测生物分子一一对应特异性结合的探针分子，在本实施例中，作举例说明地，待测生物分子为骨钙素(BGP)以及C反应蛋白(CRP)，具体地为同时在检测基板1上修饰探针分子骨钙素(BGP)包被抗体和C反应蛋白(CRP)包被抗体；

S3、在本实施例中为选用双抗体夹心法进行检测，具体为选用具有长荧光寿命的荧光标记物对检测分子进行标记，该检测分子可与待测生物分子特异性结合，且其与待测生物分子特异性结合的位点与探针分子与待测生物分子特异性结合的位点不同，即探针分子间接通过待测生物分子将荧光标记的检测分子，即标记分子固定于检测基板底部；

作举例说明地，在本实施例中，选用粒径为100nm、激发波长为980nm的两种羧基修饰功能化上转换光致发光纳米材料颗粒作为荧光标志物，具体地选用荧光发射波长为650nm并呈红色荧光的上转换光致发光纳米颗粒标记骨钙素(BGP)检测抗体，选用荧光发射波长为470nm并呈蓝色荧光的上转换光致发光纳米颗粒标记C反应蛋白(CRP)检测抗体，分别得到两种标记分子；其中，骨钙素(BGP)包被抗体以及骨钙素(BGP)检测抗体可分别与骨钙素(即抗原)的不同位点特异性结合，C反应蛋白(CRP)包被抗体以及C反应蛋白(CRP)检测抗体可分别与C反应蛋白(即抗原)的不同位点特异性结合；

具体操作如下：

两种标记分子混合得到标记分子混合溶液；将BGP标准品和CRP标准品分别用PBS缓冲液稀释到以下浓度：5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL，0.625ng/mL，0.3125ng/mL，0.15625ng/mL，相同浓度的BGP和CRP混合作为待测生物分子混合溶液(即抗原混合溶液)；

按照浓度梯度依次将待测生物分子混合溶液以及标记分子混合溶液加入至检测基板1；

检测基板1上修饰的BGP包被抗体对应与BGP、BGP检测抗体进行杂交反应，以使标记有荧光标记物的检测分子固定于检测基板1的底部，形成双抗体夹心免疫复合物：BGP包被抗体-BGP-红色荧光上转换光致发光纳米颗粒标记的BGP检测抗体；

检测基板1上修饰的CRP包被抗体对应与CRP、CRP检测抗体进行杂交反应，以使标记有荧光标记物的检测分子固定于检测基板1的底部，形成双抗体夹心免疫复合物：CRP包被抗体-CRP-蓝色荧光上转换光致发光纳米颗粒标记的CRP检测抗体；

S4、将步骤S3得到的杂交反应后的检测基板1固定于倒置样品台2，选用波长为980nm的LED作为激发光源3，激发光经过小孔光阑4的小孔后到达准直透镜5，准直透镜5将激发光准直聚焦到二向色镜6，经二向色镜6反射后通过物镜7聚焦在固定于倒置样品台2的检测基板1；结合在检测基板1底部的两种可激发不同荧光的上转换光致发光纳米颗粒同时被激发，分别产生红色荧光以及蓝色荧光；激发的荧光经过物镜7采集后再通过二向色镜6透射到达滤光装置8；依据两种不同的荧光，对应切换红色滤光片和蓝色滤光片，轮流滤出两种特定工作波长的光束，一次只通过一种荧光并将除荧光外的杂散光过滤；最后荧光经过双胶合透镜9在面阵CCD相机10上成像，并在图像显示设备11，即计算机上成像显示结果图；

S5、请参照图4-5，图4为本发明实施例3中对结合在检测基板1底部的上转换光致发光纳米颗粒荧光成像结果图一，图5为本发明实施例3中对结合在检测基板1底部的上转换光致发光纳米颗粒荧光成像结果图二，需要进行说明的是，图4-5中选取的均是完整计数视野的1/6区域，只作示意而不作为统计标准；根据测得的荧光标记物的荧光特性，结合步骤S1建立得到的荧光特性和待测生物分子的种类对应关系库，确定所测荧光标记物所对应的标记分子，从而确定待测生物分子的种类，图4中A-F为检测系统切换为红色滤光片时的孔板底部的一系列上转换光致发光纳米颗粒荧光成像图，即骨钙素BGP一系列浓度梯度的检测结果图；图5中a-f为检测系统切换为蓝色滤光片时的孔板底部的一系列上转换光致发光纳米颗粒荧光成像图，即C反应蛋白CRP的一系列浓度梯度的检测结果图。

另外，分别对图中测得的相对应的荧光标记物数量，可确定对应待测分子的浓度。请参照图6，图6为BGP标准品浓度和CRP标准品浓度与上转换光致发光纳米颗粒计数结果的关系图。根据图6中的数据进行计算得到BGP的检测下限为0.315ng/mL，CRP的检测下限为0.201ng/mL。得到对应的标准曲线线性方程分别为：

BGP：y＝99.54x+27.60:

CRP：y＝598.49x+4.55:

其中相关系数R²分别为0.981和0.996

x表示上转换纳米颗粒计数结果；

y表示待测分子浓度。

由以上实施例可以看出，本发明利用所述高灵敏多通道分子免疫检测装置及其检测方法，利用具有长荧光寿命的荧光标记物，同时建立荧光特性和待测生物分子种类的对应关系，在单次检测中对多种生物分子的混合样品进行种类分析和定量检测，有效地降低了背景噪声的干扰和提高了检测效率。在生物分子分析和临床疾病诊断等领域中具有很好的应用前景。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种高灵敏度多通道分子免疫检测装置，其特征在于：包括标记分子、检测基板、倒置样品台、激发光源、倒置荧光显微成像光路模块和成像器件；

所述标记分子具有若干种，其由具有不同荧光特性的荧光标记物一一对应标记不同种待测生物分子得到，或者由具有不同荧光特性的荧光标记物一一对应标记不同种检测分子得到，所述检测分子可与所述待测生物分子特异性结合；所述荧光标记物具有长荧光寿命；

所述检测基板上修饰有若干种探针分子，不同种探针分子可一一对应与不同种待测生物分子特异性结合，并使标记分子结合固定于所述检测基板的底部，且所述探针分子与所述待测生物分子特异性结合的位点和所述检测分子与所述待测生物分子特异性结合的位点不同；

所述倒置样品台用以固定所述检测基板；

所述倒置荧光显微成像光路模块与所述倒置样品台、所述激发光源、以及所述成像器件光路连接；所述倒置荧光显微成像光路模块用以将所述激发光源发出的光线反射至所述检测基板，并使结合固定于所述检测基板上的标记分子的荧光标记物激发荧光，激发的荧光经过所述倒置荧光显微成像光路模块到达所述成像器件，并由所述成像器件形成图像。

2.根据权利要求1所述的高灵敏度多通道分子免疫检测装置，其特征在于：所述荧光标记物为上转换光致发光纳米材料或时间分辨荧光微球。

3.根据权利要求2所述的高灵敏度多通道分子免疫检测装置，其特征在于：所述激发光源为波长为808nm、980nm或365nm的LED灯源。

4.根据权利要求2所述的高灵敏度多通道分子免疫检测装置，其特征在于：所述倒置显微成像光路模块包括二向色镜、物镜以及滤光装置，所述二向色镜将光路分成两路，其中一路光路中，所述激发光源、所述二向色镜、所述物镜与所述倒置样品台依次光路连接，另一路光路中，所述倒置样品台、所述物镜、所述二向色镜、所述滤光装置以及所述成像器件依次光路连接；所述滤光装置用于单一波长光束的筛选。

5.根据权利要求4所述的高灵敏度多通道分子免疫检测装置，其特征在于：所述倒置显微成像光路模块还包括小孔光阑以及准直透镜，所述激发光源、所述小孔光阑、所述准直透镜与所述二向色镜依次光路连接。

6.根据权利要求4所述的高灵敏度多通道分子免疫检测装置，其特征在于：所述滤光装置包括若干可切换设置的滤光片，且每一所述滤光片可筛选滤出特定工作波长的光束。

7.根据权利要求6所述的高灵敏度多通道分子免疫检测装置，其特征在于：所述倒置显微成像光路模块还包括双胶合透镜，所述成像器件包括面阵CCD相机以及图像显示设备；所述二向色镜、所述滤光装置、所述双胶合透镜与所述面阵CCD相机依次光路连接，所述图像显示设备与所述面阵CCD相机电性连接。

8.根据权利要求1所述的高灵敏度多通道分子免疫检测装置，其特征在于：所述检测基板为96孔板。

9.一种高灵敏多通道分子免疫检测方法，其特征在于，应用权利要求1-8任一所述的高灵敏度多通道分子免疫检测装置进行检测，其包括以下具体操作步骤：

S1、对应不同种待测生物分子，选用具有不同荧光特性的荧光标记物，建立荧光特性与待测生物分子的种类对应关系库；

S2、在检测基板上修饰若干种与待测生物分子一一对应特应性结合的探针分子；

S3、使用具有不同荧光特性的荧光标记物一一对应与待测生物分子进行标记反应，得到若干种标记分子；将若干种标记分子加入至检测基板，检测基板上的探针分子对应与待测生物分子进行杂交反应，以使标记分子固定于检测基板；

或者，

使用具有不同荧光特性的荧光标记物一一对应与检测分子进行标记反应，得到若干种标记分子；将待测生物分子与若干种标记分子加入至检测基板，检测基板上的探针分子对应与待测生物分子、标记分子进行杂交反应，以使标记分子结合固定于检测基板；

S4、将步骤S3得到的杂交反应后的检测基板固定于所述倒置样品台，通过选用特定波长的激发光源进一步经所述倒置荧光显微光路模块以及所述成像器件对结合固定的标记分子上的荧光标记物进行检测和成像；

S5、根据测得的荧光标记物的荧光特性，结合步骤S1建立得到的荧光特性和待测生物分子的种类对应关系库，识别待测生物分子的种类，并根据测得的荧光标记物的数量计算得到待测分子的浓度。

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