JP2008524601A - 蛍光体によって放出される蛍光を増大させるためのシステムと照明サブシステム、および蛍光を増大させる方法 - Google Patents

Abstract

蛍光体によって放出される蛍光を増大させるためのシステム、照明サブシステム、方法が提供される。粒子の蛍光を測定するように構成された１つのシステムは非垂直方向に配向した直線偏光、円偏光、または楕円偏光を有する光で粒子を照明するように構成された照明サブシステムを含む。光を偏光させることにより、蛍光体によって放出される蛍光が、主に垂直方向に配向させられた直線偏光光または非偏光光で照明されるときに蛍光体によって放出される蛍光よりも高輝度になる。本システムはまた、蛍光体によって放出される蛍光に応答して出力信号を発生するように構成された検出サブシステムも含む。

Description

本発明は概して、蛍光体によって放出される蛍光を増大させるためのシステムと照明サブシステム、および蛍光を増大させる方法に関する。ある種の実施態様は、蛍光体が付着されるかまたは蛍光体が組み込まれる粒子を照明するために使用される光の偏光を変更し、それによって蛍光体によって放出される蛍光を増大させるステップに関する。

以下の説明および実例はこの項の中のそれらの内容が理由で先行技術であるとは認められない。

生物学的試料などのいくつかの多様な試料に関して測定値を入手するために光学系が使用されてきており、ますます使用されるであろう。生物学的アッセイの分野でますます重要になりつつある１つの特定の光学ベースのシステムはフローサイトメータであり、これは科学者が相対的に短い量の時間で相対的に多数の検体に関して試料を検査することができる。すべての光学系と同様に、フローサイトメータの測定の精度は大部分、フローサイトメータを使用して入手され得る信号対ノイズ比（ＳＮＲ）によって決まる。特に、ＳＮＲが増大するにつれて測定精度が上がる。

したがってフローサイトメータの光学設計や構造はすべての光学系と同様に、ＳＮＲの必要条件を考慮に入れて発展してきた。例えば、ＳＮＲを上げることが可能な１つの方式は測定される粒子を照明するために使用される光源の輝度を上げることである。特に、測定のために利用可能な光の量が増大するにつれ、測定のＳＮＲは概して上がるであろう。この方式では、レーザなどの高い強度の光源がフローサイトメータに使用されることが多い。フローサイトメータのＳＮＲを上げるための別の方式はフローサイトメータ内に含まれる焦点集束用光学素子、（試料から散乱または放出される光を集めるための）集光用光学素子、検出器の選択と構成を含むであろう。フローサイトメータのＳＮＲの改善はフローサイトメータが最初に導入されたとき以来なされてきたが、可能な最大のＳＮＲに関する探求は継続中の課題である。

現在、散乱と蛍光測定を目的としてフローサイトメータ内の流れる細胞を照明するために直線偏光光が使用されている。例えば、本明細書に十分に記述するように参照で組み込まれるｄｅ Ｇｒｏｏｔｈらの米国特許第５０１７４９７号はビーム軸に直交する平面内で直線偏光を垂直角で使用することを述べている。しかしながら、ｄｅ Ｇｒｏｏｔｈらは「直線偏光」に関して偏光比の定義を与えていない。さらに、蛍光測定を目的として照明光の偏光の状態（楕円形など）を変更することは、以前は実施されなかった。

フローサイトメータで測定される試料、例えば蛍光染色されたビーズや蛍光染色された試薬などを最適化することも、同様に、フローサイトメータ測定のＳＮＲを上げるための手段として探索されてきた。しかしながら、フローサイトメータ測定で使用するために入手可能な材料はある程度限定されていることが多い。例えば、これらの材料は検査される試料と適合性がなければならない。言い換えると、ビーズや蛍光染料の材料が測定される試料を変性させないことが好ましく、その逆も真である。さらに、これらの材料はフローサイトメータの設計と適合性があることが好ましい。例えば、蛍光染料はフローサイトメータの少なくとも１つの光源の（複数の）波長で励起されることが好ましい。さらに、ビーズの材料はそれらがフローサイトメータによって曝露されるであろう光の（複数の）波長によって変性させられないことが好ましい。少なくともこれらの理由のために、試料に使用される材料を変更するのとは逆にフローサイトメータの光学設計と構成を変更することによってフローサイトメータ測定のＳＮＲを上げるように試みることがより魅力的であり、複雑さも少ない。

したがって、フローサイトメータまたは他の蛍光ベースの撮像システムと／または測定システムの１つまたは複数のパラメータを変更することにより、蛍光体によって放出される蛍光を増大させるためのシステム、照明サブシステム、方法を開発することが有利であろう。

様々なシステム、照明サブシステム、方法の実施態様の以下の説明は決して添付の特許請求項の主題事項を限定するように解釈されるべきではない。

ある実施態様は粒子の蛍光を測定するように構成されたシステムに関する。このシステムは、非垂直方向に配向した直線偏光、円偏光、または楕円偏光を有する光で粒子を照明するように構成された照明サブシステムを含む。蛍光体がこれらの粒子に付着されるかまたは組み込まれる。光を上記のように偏光させることにより、蛍光体によって放出される蛍光が、垂直方向に支配的に配向させられた（例えばレーザまたは非レーザ光源のどちらかからの）直線偏光光または（いずれかの光源からの）非偏光光で照明されるときに蛍光体によって放出される蛍光よりも高輝度になる。このシステムはまた、蛍光体によって放出される蛍光に応答して出力信号を発生するように構成された検出サブシステムも含む。

一実施態様では、この照明サブシステムは１つまたは複数のレーザを含む。別の実施態様では、この照明サブシステムは発光ダイオード（ＬＥＤ）、アークランプ、光ファイバ照明器、電球から成る群から選択される１つまたは複数の非レーザ光源を含む。

一実施態様では、偏光はいずれかの配向を備えて１００：１未満の偏光比（すなわち偏光の半短軸に対する偏光の半長軸の比）を有する。別の実施態様では、偏光は非垂直配向を備えて１００：１よりも大きい偏光比を有する。対照的に、垂直方向に支配的に配向させられた直線偏光は、１００：１よりも大きい偏光比を有し、主に垂直方向に配向させられる。本明細書では直線偏光は、垂直方向に対する半長軸の配向とは無関係に１００：１よりも大きい偏光比を有する偏光状態として定義される。

楕円偏光であって垂直に対していずれかの方向に配向させられる非線形偏光は１００：１未満の偏光比を有し、そうでなければ楕円偏光はいくつかの配向を備えた直線偏光と考えられるであろう。理論的に厳密に言えば、すべての偏光は楕円と称されることが可能である。この方式で偏光が定義されれば、円偏光は半長軸と半短軸の両方が同じ大きさを有する楕円偏光の特定のケースであろう。直線偏光もやはり半長軸と半短軸の大きさが１００：１よりも大きい比を有する楕円偏光の特定のケースであろう。

一実施態様では、蛍光体はＲ−フィコエリスリン（Ｒ−ＰＥ：R-phycoerytherin）を含む。別の実施態様では、蛍光体は有機または非有機の染料を含む。いくつかの実施態様で、粒子は蛍光を発するように構成される。１つのそのような実施態様では、光の偏光により、粒子によって放出される蛍光が、垂直方向に支配的に配向させられた直線偏光光または非偏光光で照明されたときに粒子によって放出される蛍光よりも高輝度になる。

一実施態様では、本システムはフローサイトメータとして構成される。異なる実施態様では、本システムは蛍光撮像システムとして構成される。上述されたシステムの実施態様の各々はさらに、本明細書で述べられるように構成されることも可能である。

別の実施態様は測定システムに照明を供給するように構成された照明サブシステムに関する。この照明サブシステムは光を発生するように構成された光源を含む。この照明サブシステムはまた、測定システムによって測定が実行されている間に光が粒子を照明する前に光の偏光を変更するように構成された偏光要素も含む。変更された偏光は非垂直方向に配向させられた直線偏光、円偏光、または楕円偏光である。蛍光体が粒子に付着されるかまたは組み込まれる。変更された偏光により、蛍光体によって放出される蛍光が、垂直方向に支配的に配向させられた直線偏光光または非偏光光で照明されたときに蛍光体によって放出される蛍光よりも高輝度になる。

一実施態様では、光源は１つまたは複数のレーザを含む。別の実施態様では、光源はＬＥＤ、アークランプ、光ファイバ照明器、電球から成る群から選択される１つまたは複数の非レーザ光源を含む。いくつかの実施態様で、偏光要素は半波長遅延器、１／４波長遅延器、遅延器スタック、またはこれらのいくつかの組合せを含む。

一実施態様では、変更された偏光はいずれかの配向を備えて１００：１未満の偏光比を有する。異なる実施態様では、変更された偏光は非垂直配向を備えて１００：１よりも大きい偏光比を有する。別の実施態様では、蛍光体はＲ−ＰＥを含む。異なる実施態様では、蛍光体は有機または非有機の染料を含む。

一実施態様では、測定システムはフローサイトメータとして構成される。異なる実施態様では、測定システムは蛍光撮像システムとして構成される。上述された照明サブシステムの実施態様の各々はさらに、本明細書で述べられるように構成されることも可能である。

追加の実施態様は、粒子に付着されるかまたは組み込まれた蛍光体によって放出される蛍光を増大させるための方法に関する。この方法は測定中に光が粒子を照明する前に光の偏光を変更するステップを含む。変更された偏光は非垂直方向に配向させられた直線偏光、円偏光、または楕円偏光である。一実施態様では、変更された偏光はいずれかの配向を備えて１００：１未満の偏光比を有する。異なる実施態様では、変更された偏光は非垂直配向を備えて１００：１よりも大きい偏光比を有する。上述された方法の実施態様の各々は、本明細書で述べられるいずれかの他の（複数の）ステップを含むこともある。

本発明のさらなる利点は、以下の好ましい実施形態の詳細な説明によって、および添付の図面を参照することで当業者にとって明らかになるであろう。

本発明は様々な改造や変更の余地があるが、特定の実施形態が図中に例として示され、本明細書で詳細に述べられる。これらの図面は縮尺通りではないこともある。しかしながら、これらの図面とそれに対する詳細な説明が開示される特定の形態に本発明を限定することを意図しておらず、逆に、その意図は、添付の特許請求項によって規定されるような本発明の精神と範囲内に入るすべての改造例、同等例、代替例を網羅することであることは理解されるべきである。

以下の説明は全体として、蛍光体を照明するために使用される光ビームの偏光状態および／または配向（例えば楕円偏光の度合い）を変更することによってＲフィコエリスリン（Ｒ−ＰＥ）などの蛍光体から増大した蛍光を得るためのシステム、照明サブシステム、方法に関する。

本明細書では粒子に関して実施形態が述べられるが、ミクロスフィア、ポリスチレン・ビーズ、微粒子、金ナノ粒子、量子ドット、ナノドット、ナノ粒子、ナノシェル、ビーズ、マイクロビーズ、ラテックス粒子、ラテックス・ビーズ、蛍光ビーズ、蛍光粒子、着色粒子、着色ビーズ、組織、細胞、微生物、有機物、またはいずれかの非有機物に関して本システム、照明サブシステム、および方法が使用されることもやはり可能であることは理解されるべきである。これらの粒子は分子反応のための媒体として役立つ。適切なミクロスフィアや、ビーズ、粒子の例はＦｕｌｔｏｎの米国特許第５７３６３３０号明細書、Ｃｈａｎｄｌｅｒらの米国特許第５９８１１８０号明細書、Ｆｕｌｔｏｎの米国特許第６０５７１０７号明細書、Ｃｈａｎｄｌｅｒらの米国特許第６２６８２２２号明細書、Ｃｈａｎｄｌｅｒらの米国特許第６４４９５６２号明細書、Ｃｈａｎｄｌｅｒらの米国特許第６５１４２９５号明細書、Ｃｈａｎｄｌｅｒらの米国特許第６５２４７９３号明細書、Ｃｈａｎｄｌｅｒの米国特許第６５２８１６５号明細書に具体的に示され、これらは本明細書に十分に記述するように参照で組み込まれる。本明細書に述べられるシステム、照明サブシステム、方法はこれらの特許に述べられたミクロスフィアや、ビーズ、粒子のいずれと共に使用されることも可能である。さらに、フローサイトメトリで使用するためのミクロスフィアはＬｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓなどの製造業者から入手されることが可能である。「粒子」、「ビーズ」、「ミクロスフィア」という用語は本明細書では同義的に使用される。

本明細書ではレーザに関していくつかの実施形態が述べられるが、本システム、照明サブシステム、方法の実施形態が１つまたは複数のレーザおよび／または非レーザ光源と共に使用されることも同様に可能であることは理解されるべきである。これらの非レーザ光源は発光ダイオード（ＬＥＤ）、アークランプ、光ファイバ照明器、電球、当該技術で知られているいずれかの他の適切な非レーザ光源を含む。コヒーレント光、部分的コヒーレント光、または非コヒーレント光の光源によって発生した光が選択された偏光状態および／または配向を有するように、本明細書に述べられるように構成される適切な光学フィルタおよび／または偏光要素によって調整されるかまたは変更されることが可能であることは理解されるべきである。

ここで図面を参照すると、これらの図面が縮尺通りに描かれていない。特に、図のいくつかの要素の量はこれらの要素の特徴を強調するために大幅に誇張されている。これらの図面が同じ縮尺で描かれていないことも分かるであろう。複数の図面に示された類似して構成される複数の要素は同じ参照番号を使用して示されている。

フローサイトメータは通常、流れる細胞に含まれる試料を照明するために直線偏光レーザ・ビームを利用する。フローサイトメータで利用される殆どのレーザによって作り出される光は１００：１の最少偏光比で直線偏光にされる。実際のレーザによって作られる直線偏光は１００：１から８００：１を超える偏光比で大幅に変わる。偏光比は楕円偏光の軸成分の大きさの比を表現する。光波は２つの直交波動成分として数学的にモデル化されることが可能である。これら２つの直交波動の相対位相に応じて、光波が波長を進むときに結果として生じる瞬間的偏光状態ベクトルは楕円の「軌跡をたどる」であろう。偏光比はこの楕円偏光の（半長軸成分に直交する）半短軸成分の大きさに対する半長軸成分の大きさの比である。したがって、「直線偏光」という用語は絶対的な用語ではなく相対的であり、最少で１００：１を超える偏光比を備えた直線偏光ビームを称するが、これは現実の実践では大幅に変わる。半長軸の配向が偏光の配向を決める。

レーザ・ビームにある一定量の位相遅延を加える処理が、このレーザ・ビームで照明されるときにある蛍光体によって放出される蛍光の量を大幅に増大させることを実験データが実証した。蛍光体によって放出される蛍光を増大させることができる位相遅延はレーザ・ビームの偏光状態を改変偏光状態へと変更する。この改変偏光状態は垂直に対して角度配向を備えた直線偏光、円偏光、または楕円偏光を含む。楕円偏光の配向は垂直方向から遠く離れた有意の成分を有する。

「垂直」または「垂直方向」という用語は異なる測定システムで異なって定義されることもある。例えば、フローサイトメータでは、垂直方向に支配的に配向させられた偏光とは、粒子が照明されるポイントでフローサイトメータを通る粒子の流れに実質的に平行である半長軸を有する偏光として本明細書で定義される。この方式では、レーザはあらゆる位置と配向で配置されることが可能であり、ビームが粒子に当たるとビームの偏光が選択された配向を有するように、ミラーなどの使用を通じてビームが経路指定され、反射され、方向付けされる。この状況では、粒子に当たる光の偏光状態が選択された配向を有する限り、偏光の配向は照明経路に沿って変わってもよい。

蛍光撮像システム（または「プレートリーダー」）では、粒子は基材上で実質的に静止位置を有する。したがって、そのようなシステムでは、粒子の流れに関して垂直方向が定義されない。本明細書にさらに述べられるようないくつかの撮像測定システムに対しては、光は粒子が配置されている平面へ実質的に直角の入射角度に向けられる。そのようなシステムでは、粒子が照明されるポイントで光の偏光ベクトルは配向に関係なく実質的にこの平面に平行であろう。この方式では、偏光の配向は測定システムの異なる軸または平面に対して決めることができる。この構成では、入射光の偏光の配向がある種の蛍光染料による蛍光発光の「支配的な」偏光成分（または配向）を生じさせるであろう。Ｌｕｍｉｎｅｘ較正ビーズに使用される較正用染料などの染料は小さくて直線的である。そのような染料は入射光の偏光をその蛍光発光の中に有意で測定可能な程度で再現する。この蛍光発光が偏光ビーム・スプリッタを使用して分割された場合、入射光の偏光と整列した直線偏光蛍光がビーム・スプリッタを通過するかまたはこれによって反射され、これはビーム・スプリッタの配向によって決まるであろう。ビーム分割表面が蛍光の直線偏光に平行になるようにこの偏光ビーム・スプリッタが配向させられた場合、これは直角入射の入射光を備えたプレートリーダー構成のための直線偏光入射光を特徴付ける幾何学構造であろう。いずれにしても、光源によって放出される光の偏光は（いずれかの方向に配向させられた）直線であり、偏光の配向を変更すること、または偏光の状態を本明細書に述べられる実施形態に従って（いずれかの方向に配向させられた）円または楕円へと変更することのどちらかによって偏光されることが可能である。

蛍光撮像測定システムは、場合によっては、試料粒子を保持するプレートの平面に対して斜めまたは非直角である入射角度で光が粒子へ向けられるように構成されてもよい。この構成では、偏光の半長軸が入射面に対して実質的に平行であるとき、入射光の偏光の配向は垂直であると定義される。入射面は、入射光線、反射光線、光学面を超えて部分的または全体的に媒質を通過するかまたは中に入って伝えられる（または表面の媒質が非透過型であれば伝えられるであろう）いずれかの光線を含む平面である。このときこの偏光は主に「ｐ」偏光であろう。

したがって一実施形態によると、粒子に付着されるかまたは中に組み込まれた蛍光体によって放出される蛍光を増大させるための方法は、測定中に光が粒子を照明する前に光の偏光を変更することを含む。変更された偏光は非垂直方向に配向させられた直線偏光、円偏光、または楕円偏光である。一実施形態では、変更された偏光はいずれかの配向を備えて１００：１未満の偏光比を有する。別の実施形態では、変更された偏光は非垂直配向を備えて１００：１よりも大きい偏光比を有する。対照的に、垂直方向に支配的に配向させられた直線偏光は１００：１よりも大きい偏光比を有し、垂直方向に配向させられる。非垂直方向に配向させられた直線偏光（すなわち非垂直方向に配向させられた半長軸を有する直線偏光）は１００：１よりも大きい偏光比を有するが、水平偏光に対する垂直の比は１００：１未満である。直線偏光の配向に関係なく偏光比は１００：１よりも大きい。すなわち、直線偏光の支配的な配向を前提として、半長軸に直交する偏光成分に対する半長軸偏光成分の比は１００：１よりも大きい。

楕円偏光であっていずれかの方向に配向させられる非線形偏光は１００：１未満の偏光比を有し、そうでなければ楕円偏光はいくつかの配向を備えた直線偏光と考えられる。理論的に厳密に言えば、すべての偏光は楕円と称されることが可能である。この方式で偏光が定義されれば、円偏光は半長軸と半短軸の両方が同じ大きさを有する楕円偏光の特定のケースであろう。直線偏光もやはり半長軸と半短軸の大きさが１００：１よりも大きい比を有する楕円偏光の特定のケースであろう。

いくつかの実施形態では、蛍光体はＲ−ＰＥを含む。別の実施形態では、蛍光体は有機または非有機の染料を含む。この有機または非有機の染料は当該技術で知られている適切ないずれかの染料を含み、これらのいくつかの例は上記の参照で組み込まれる特許に含まれている。蛍光体は当該技術で知られている方式で粒子に付着されるかまたは中に組み込まれ、これらのいくつかの例は上記の参照で組み込まれる特許に含まれる。蛍光体は粒子の分類または識別（例えば、粒子が属する集団部分の識別）のために使用される。場合によっては、粒子の表面上で起こった反応の識別、判定、または定量化のためにも蛍光体を使用することができる。

上述された方法の実施形態の各々は、本明細書で述べられるいずれかの他のステップ（複数可）を含んでもよい。さらに、上述された方法の実施形態の各々は、本明細書で述べられる照明サブシステムまたはシステムのいずれかによって実施される。さらに、上述された方法の実施形態の各々は本明細書で述べられる他の実施形態の利点のすべてを有する。

上述された技術は、主に直線偏光のビームを発生するレーザを使用して粒子を照明するように構成される既にあるフローサイトメータに応用できる。既にあるフローサイトメータに使用される１つの光学構成が図１に示されている。図１に示されるように、この光学構成は光源１０を含む。これはレーザまたは当該技術で知られている任意の他の適切な光源である。この光源は垂直方向に支配的に配向させられた直線偏光を発生するように構成される。特に、光源１０によって発生した光１２は偏光１４を有し、これは直線であって主に垂直方向（すなわちキュベット１６を通る粒子（図示せず）の流れに実質的に平行の方向）に配向させられている。

光がキュベットを通って流れる粒子を照明するように光１２はキュベット１６へと向けられる。光１２はまた、光源１０とキュベット１６との間に配置される焦点集束用レンズなどの１つまたは複数の光学部品（図示せず）によってキュベット１６に焦点集束されるようにしてもよい。粒子、粒子に付着された物質、または粒子に組み込まれた物質によって放出および／または散乱される光は集光用光学素子１８によって集められる。集光用光学素子１８は光を検出器２０に集めるように構成されている。検出器２０は集光用光学素子１８によって集められた放出および／または散乱光に応答して出力信号を発生する。キュベット１６、集光用光学素子１８、検出器２０は当該技術で知られている適切ないずれかの部品を含む。

図２に示されたフローサイトメータの光学構成の実施形態では、Ｒ−ＰＥなどの蛍光体によって放出される蛍光を増大させ、可能であれば最大にするために照明の偏光状態が位相遅延によって、例えば楕円または円偏光状態へと変更されるように図１に示された光学構成が改造されている。図１に関して上述されたように構成されてもよい図２に示された複数の素子は簡潔にする目的でさらに述べられない。

図２に示された光学構成の実施形態は測定システムのために照明を供給するように構成された照明サブシステムを含む。特に、図１に示された光学構成のように、図２に示された光学構成は光源１０を含む。光源１０は上述されたような光１２を発生するように構成されている。一実施形態では光源１０はレーザである。このレーザは当該技術で知られている適切ないずれかのレーザでよい。さらに、この光学構成は複数のレーザ（図示せず）を含んでもよい。別の実施形態では、光源１０はＬＥＤ、アークランプ、光ファイバ照明器、電球から成る群から選択される非レーザ光源である。この光源は当該技術で知られている適切ないずれかの光源を含むことが可能である。さらに、図２に示された光学構成は複数の非レーザ光源（図示せず）を含んでもよい。さらに、この光学構成は１つまたは複数のレーザと１つまたは複数の非レーザ光源を含んでもよい。この光源はさらに、本明細書に述べられるように構成されてもよい。

図１に示された光学構成とは異なり、図２に示された光学構成は光源１０とキュベット１６との間に配置された偏光要素２２を含む。偏光要素２２は測定システムによって実行される測定中に光が粒子（図２に示されていない）を照明する前に光１２の偏光を変更するように構成されている。言い換えると、偏光要素２２は光の偏光状態および／または配向を変更するために光１２の光学経路に配置される。例えば図２に示されるように、偏光要素２２を出る光２４は変更された偏光２６を有し、これは偏光１４が配向させられる方向とは異なる方向に配向させられた楕円偏光として示される。しかしながら、変更された偏光２６は非垂直方向に配向させられた直線偏光、円偏光、または楕円偏光（垂直に対していずれかの方向に配向させられている）であってもよい。変更された偏光はいずれかの配向を備え、１００：１未満の偏光比を有する。場合によっては、変更された偏光は非垂直配向を備え、１００：１よりも大きい偏光比を有してもよい。殆どのレーザは（それらが直線偏光を発生するように構成されるときに）様々な直線偏光比を有する光を発生するので、偏光要素２２によって光１２に加えられる特定の量の位相遅延をレーザ毎に換えることができ、システムの位置合わせ中に選択することが可能である。

したがって本明細書で述べられる実施形態では、光ビーム（例えば直線偏光ビーム）の偏光を変更するために波長板、偏光用遅延器、または他の偏光要素、または本明細書に述べられる偏光要素の組合せといった偏光要素が光源（例えばレーザ）と照明標的（例えばフローサイトメータの場合、測定される粒子）との間に置かれる。いくつかの実施形態で、偏光要素は、半波長遅延器、１／４波長遅延器、位相遅延機能のいずれかの組合せを有するように構成された偏光要素（例えば遅延器スタックなど）、光源１０によって発生する光の偏光を変更するために使用され得る当該技術で知られているいずれかの光学部品、またはこれらのいくつかの組合せを含む。焦点集束用光学素子が照明サブシステム内に含まれる場合、この遅延器は、焦点集束用光学素子（図示せず）の前または後で照明経路内に置かれる。さらに、本明細書ではシステムと照明サブシステムの実施形態が１つの偏光要素を含むように述べられるが、一連の偏光要素が光源によって発生した光ビームの偏光を変更するように本システムと照明サブシステムが複数の偏光要素（図示せず）を含んでもよいことは理解されるべきである。

蛍光体（図示せず）はキュベット１６を通って流れる粒子に付着されるかまたは中に組み込まれる。この蛍光体はＲ−ＰＥを含んでもよい。場合によっては、この蛍光体は有機または非有機の染料を含む。この有機または非有機の染料は当該技術で知られている適切ないずれかの染料を含む。この蛍光体はさらに、本明細書に述べられるように構成されてもよい。垂直方向に支配的に配向させられた（例えばレーザまたは非レーザ光源のどちらかからの）直線偏光光または（あらゆる光源からの）非偏光光で照明されるときに蛍光体によって放出される蛍光よりも、変更された偏光は、蛍光体によって放出される蛍光を高輝度にする。言い換えると、偏光要素２２は光１２の偏光比および／または配向（または偏光の相対位相）を選択された偏光状態および／または配向へと変更し、これが標的蛍光体の測定蛍光発光を増大させる。

追加の実施形態では、粒子自体が蛍光を発するように構成される。１つのそのような実施形態では、偏光要素２２を出て粒子を照明する光の偏光により、粒子によって放出される蛍光が、垂直方向に支配的に配向させられた直線偏光光または非偏光光で照明されるときに粒子によって放出される蛍光よりも高輝度になる。上述されたように、光１２の偏光の相対位相を変更することによって、結果として非垂直配向を備えた直線偏光、円偏光、または垂直に対していずれかの角度に配向させられた楕円偏光といった変更された偏光状態および／または配向になる。

一実施形態では、図２に示された光学構成は、フローサイトメータとして構成される測定システムを照明するために使用される。図２に示された光学構成はフローサイトメータで現在使用されている他の光学構成を上回るいくつかの利点を有する。例えば、偏光波長板などの偏光要素が光学構成の照明経路の中に挿入されるのみで、蛍光体によって放出される蛍光を増大させることができる。この方式で、現在使用されているフローサイトメータの光学構成を、十分に簡略な方式で信号対ノイズ比、したがってフローサイトメータの精度の大幅な上昇を達成するように変更することが可能である。さらに、いくつかの実施形態では、図２に示された光学構成は測定システムを照明するように構成される、すなわちさらに本明細書で述べられる撮像システムなどの蛍光撮像システムとして構成されることが可能である。そのような実施形態は図２に示された光学構成の利点もやはり有する。さらに、蛍光体によって放出される蛍光の測定を実行し、かつ本明細書で述べられる実施形態によって供給されるさらに高い信号対ノイズ比から利益を得るであろういずれかの測定システムに、図２に示された光学構成を使用することが可能である。図２に示された光学構成はさらに、本明細書で述べられるように構成されてもよい。

結果として最適な蛍光体の吸収／発光につながる照明の偏光に加えられる位相遅延の正確な量は、例えばフローサイトメータの特性（例えば光源の波長やその他の特性）と蛍光体の特性に応じて変わる。結果は下記（例えば表１参照）に提示されており、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販入手可能なＬｕｍｉｎｅｘ ＬＸ１００フローサイトメータで５３２ｎｍの照明を使用してＲ−ＰＥによる測定蛍光発光の増大を実証している。

本明細書に述べられるシステム、照明サブシステム、方法が、増大した蛍光が達成される（すなわち蛍光信号応答の増大が増大した吸収メカニズムによって引き起こされることが可能であり、および／または部分的には一層効率的な発光および／または発光検出によって引き起こされることが可能である）特定のメカニズムに限定されないことは理解されるべきである。しかしながら、いくつかの可能なメカニズムが下記に述べられる。

ＬＸ１００フローサイトメータに使用される蛍光発光レポーター染料はＲ−ＰＥである。Ｒ−ＰＥ分子は比較的大きく、２４０，０００ダルトンの分子量を有する。これらの分子が他の分子を介して（例えば反応産物を介して）付着されるので、各々のＲ−ＰＥ分子は粒子の表面から間隔を置いた「中心」を有すると考えることができる。Ｒ−ＰＥ分子の少なくとも１つの外縁部は粒子から遠く離れてその中心を越えて相当の距離であろう。

そのような粒子が生理食塩水などの液体の移動カラム内に含まれると、この粒子は各々が加圧下にある数百から数千の液体分子によって液体の移動の方向に運ばれるかまたは「押される」。この圧力は液体の移動に関与する。さらに、この圧力の恒常的な印加は粒子に付着されたＲ−ＰＥの大部分（または少なくともいくらか）が流体の流れの方向に向かいがちである方向に配向させられる（すなわちこれらの分子は上方向に「曲げられる」）。この配向は、ミクロスフィアの全表面にわたって置かれたＲ−ＰＥ分子すべてについて合計すると結果として正味の配向ベクトルにつながる。この配向ベクトルは偏光状態および／または配向が照明にとって最適となることに影響を与える。

標準的なＬｕｍｉｎｅｘの構成および制御用の粒子はスクアライン(squaraine)類の染料の一員である較正用染料に結合されるかまたはこれを含む。この較正用染料は照明ビームの偏光状態によってＲ−ＰＥと同じ方式で影響を受けることはない。この非反応性は、この較正用染料が形状因子で比較的小さく「平坦」（または直線的）であって粒子の内部全域にわたって無作為に配分される合成染料であるという事実に起因する可能性が最も高い。したがって、粒子全体にわたる較正用染料の正味の配向は存在しない。それゆえに、この較正用染料分子の吸収の双極子モーメントが１つにまとめられると正味の結果はほぼゼロであろう。さらに、この較正用染料は小さく直線的な分子であるので、この較正用染料は直線偏光に対して他の偏光状態を有する光に対するよりも効率的に応答することが可能である。

他のメカニズムも同様に、垂直方向に支配的に配向させられた直線偏光または非偏光以外の光で照明されるときに、Ｒ−ＰＥによって放出される蛍光の観察される増大に寄与する。例えば、すべてのタンパク質と同様にＲ−ＰＥは螺旋またはキラル構造を有する。この螺旋またはキラル構造は部分的には、照明の楕円偏光の程度の相当する変化に起因するＲ−ＰＥの反応性（すなわち測定蛍光発光の輝度）の変化に関与する。Ｒ−ＰＥなどのタンパク質は複数のアミノ酸で構成され、これらはしばしば、入射光への影響および結果として散乱する光の偏光状態への影響という意味で「旋光性」であるという点で光学的に活性な物質である。蛍光体による最も効率的な光吸収に結果としてつながるであろう照明の偏光状態と配向を判定するために吸収性発色団の組合せ、これらの正味の双極子モーメント、これらのキラル構造が評価される。

本明細書に述べられる蛍光増大のための他の可能性のあるメカニズムはＲ−ＰＥ内で起こるフェルスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ：Foerster Resonance Energy Transfer）である。Ｒ−ＰＥは複数の吸収性発色団を有し、結果として広範な吸収スペクトルになる。しかしながら、Ｒ−ＰＥは単一の発光性発色団を示唆する比較的狭い発光スペクトルを有する。発光性発色団はＦＲＥＴを介して吸収性発色団からエネルギーを得る。この過程は蛍光発光発色団がフォトンを放出するまで起こる。隣り合う発色団の間のＦＲＥＴは発色団の振動双極子モーメントが互いに比較的接近していてエネルギー転移が双極子モーメントの電界によって起こるときに生じる（すなわちＦＲＥＴの経過中にフォトンは放出されない）。Ｒ−ＰＥでは、吸収性発色団はフォトンを放出しないが吸収したエネルギーを隣りの発色団へと移す。照明の偏光状態および／または配向の変化は最初の吸収性発色団に影響を及ぼす可能性が高いばかりでなく、隣り合う発色団の間の双極子モーメントを整列させることによるＦＲＥＴ過程の効率もやはり上げることができる。

さらに、円偏光される（または楕円偏光される）光は正味の角運動量を有しているが、それに対して直線偏光は正味の角運動量を有さない。円偏光は吸収性物質中の電子が電界によって発生する力に応答して部分的円（または楕円）運動を有する事象を生じさせるであろう。この運動は励起された電子に正味の角運動量を与えるが、それに対して直線偏光は励起された電子に角運動量を与えない。電子に与えられる角運動量は光伝播の方向に相対する円（または楕円）偏光の左右像（右または左）および吸収性発色団の双極子モーメントによって決まる。この正味の角運動量転移は、楕円の照明偏光が変更されるときのＲ−ＰＥの吸収の増大を説明し得る追加的なメカニズムである。

蛍光体によって放出される蛍光の増大を引き起こさせるために照明の偏光を変更することはフローサイトメトリや他のタイプの蛍光をベースとした器具類（例えば本明細書でさらに述べられる蛍光撮像システムなど）で広い応用を持つことができる。特に、この技法はＲ−ＰＥの測定される平均蛍光強度（ＭＦＩ）の応答を大幅に増大させることが可能である。

様々なレーザを使用して得られた実験データが本明細書でさらに詳しく述べられる。本明細書に含まれる実験データのすべてが本発明を限定した実施形態を記述または決めるものではないことは理解されるべきである。蛍光応答はＭＦＩの単位で測定される。Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって提供された１０個のＰｌｅｘビーズ・セットが実験に利用された。このビーズ・セットは較正用染料で染められたビーズとＲ−ＰＥを付着されたビーズの両方、さらに染料を伴わないブランク・ビーズを含む。各々のビーズは、そのビーズについて予期されるＭＦＩとは無関係の独自の実験区番号（例えば９−Ｒ−ＰＥ）で区別される。レーザによって発生する光の偏光の変更を伴うことなくフローサイトメータを使用して、１０個のＰｌｅｘが各々のレーザについて１０回測定された。このデータ・セットが較正用染料とＲ−ＰＥの両方に関するベースライン・データを形成した。

次いで、５３２ｎｍでπ／２の相対的遅延を与える波長板（１／４波長板）がレーザとレーザ集束用レンズの間に置かれた。以前の実験に基づいて、波長板の速軸の角度は垂直に対して約４０度に設定された。この構成は直線偏光の照明を楕円偏光の照明へと変更する。どのような追加の光学的位置合わせもせずに、１０個のＰｌｅｘがフローサイトメータによって再測定され、データが収集された。この構成ではＲ−ＰＥのＭＦＩ応答が増大し、較正用染料のＭＦＩ応答が減少した。次いで機器が再較正され、１０個のＰｌｅｘが１０回再測定された。このデータは、較正用染料応答に対してＲ−ＰＥ応答で増大するＭＦＩの量を与える。表１に示されたデータがこの応答を具体的に示す。

表１で、非偏光光学系は照明の偏光の変更を伴わずに上述のように測定されたデータを示す。１／４波長板＠４０度データの最初のセットは照明の偏光を変更するために上述の波長板を使用して測定されたデータである。１／４波長板＠４０度データの第２のセットは機器の再較正の後に照明の偏光を変更するために上述の波長板を使用して測定されたデータである。

図３〜６に示されたプロットは、上述の波長板が照明経路に置かれずに上述のビーズ・セットのうちの６個のＲ−ＰＥビーズに関して測定された平均ＭＦＩ、および波長板が照明経路に置かれてシステムが再較正された後に６個のＲ−ＰＥビーズに関して測定された平均ＭＦＩを例示している。図３〜６に示されたプロットは異なる機器の異なるレーザを使用して作られた。６個のＲ−ＰＥビーズはこれらに付着された異なる量のＲ−ＰＥを有する。

図３に示されたデータはＪＤＳ Ｕｎｉｐｈａｓｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから市販入手可能なＭｏｄｅｌ Ｎｏ．４６０２−０１０−０４８５レーザを使用して得られた。プロット２８は波長板が照明経路に置かれずに各々のビーズについて測定された平均ＭＦＩを例示している。プロット３０は波長板が照明経路に配置された各々のビーズについて測定された平均ＭＦＩを例示している。図３に示されるように、波長板が照明経路に置かれないで各々のビーズについて測定された平均ＭＦＩは波長板が照明経路に配置されて各々のビーズについて測定された平均ＭＦＩよりも低い。したがって、ビーズの各々について測定された平均ＭＦＩは測定中にビーズを照明する光の偏光を変更するために波長板が使用されるときにさらに高くなる。さらに、図３のプロット３２に示されるようにビーズの各々について測定された平均ＭＦＩの％での増加はビーズ毎にある程度変わるが、ビーズの各々について測定された平均ＭＦＩの％での増加は大きい（例えば２４．０％以上）。したがって、図３に示されたプロットは明らかに、ビーズがＲ−ＰＥによる蛍光発光において偏光誘起型の応答を示すことを示している。

図４に示されたデータはＪＤＳ Ｕｎｉｐｈａｓｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販入手可能なＭｏｄｅｌ Ｎｏ．４６０２−０１０−０４８５レーザを使用して得られた。プロット３４は波長板が照明経路に置かれずに各々のビーズについて測定された平均ＭＦＩを例示している。プロット３６は波長板が照明経路に配置された各々のビーズについて測定された平均ＭＦＩを例示している。図４に示されるように、波長板が照明経路に置かれないで各々のビーズについて測定された平均ＭＦＩは、波長板が照明経路に配置されて各々のビーズについて測定された平均ＭＦＩよりも低い。したがって、ビーズの各々について測定された平均ＭＦＩは測定中にビーズを照明する光の偏光を変更するために波長板が使用されるときにさらに高くなる。さらに、図４のプロット３８に示されるようにビーズの各々について測定された平均ＭＦＩの％での増加はビーズ毎にある程度変わるが、ビーズの各々について測定された平均ＭＦＩの％での増加は大きい（例えば２０．０％以上）。したがって、図４に示されたプロットは明らかに、ビーズがＲ−ＰＥによる蛍光発光において偏光誘起型の応答を示すことを示している。

図５に示されたデータはＪＤＳ Ｕｎｉｐｈａｓｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販入手可能なＭｏｄｅｌ Ｎｏ．４６０２−０１０−０４８５レーザを使用して得られた。プロット４０は波長板が照明経路に置かれずに各々のビーズについて測定された平均ＭＦＩを例示している。プロット４２は波長板が照明経路に配置された各々のビーズについて測定された平均ＭＦＩを例示している。図５に示されるように、波長板が照明経路に置かれないで各々のビーズについて測定された平均ＭＦＩは、波長板が照明経路に配置されて各々のビーズについて測定された平均ＭＦＩよりも低い。したがって、ビーズの各々について測定された平均ＭＦＩは測定中にビーズを照明する光の偏光を変更するために波長板が使用されるときにさらに高くなる。さらに、図５のプロット４４に示されるようにビーズの各々について測定された平均ＭＦＩの％での増加はビーズ毎にある程度変わるが、ビーズの各々について測定された平均ＭＦＩの％での増加は大きい（例えば２２．０％以上）。したがって、図５に示されたプロットは明らかに、ビーズがＲ−ＰＥによる蛍光発光において偏光誘起型の応答を示すことを示している。

図６に示されたデータはＣｏｈｅｒｅｎｔ Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから市販入手可能なＣＯＭＰＡＳＳ２１５Ｍ−１５レーザを使用して得られた。プロット４６は波長板が照明経路に置かれずに各々のビーズについて測定された平均ＭＦＩを例示している。プロット４８は波長板が照明経路に配置された各々のビーズについて測定された平均ＭＦＩを例示している。図６に示されるように、波長板が照明経路に置かれないで各々のビーズについて測定された平均ＭＦＩは波長板が照明経路に配置されて各々のビーズについて測定された平均ＭＦＩよりも低い。したがって、ビーズの各々について測定された平均ＭＦＩは測定中にビーズを照明する光の偏光を変更するために波長板が使用されるときにさらに高くなる。さらに、図６のプロット５０に示されるようにビーズの各々について測定された平均ＭＦＩの％での増加はビーズ毎にある程度変わるが、ビーズの各々について測定された平均ＭＦＩの％での増加は大きい（例えば１７．０％以上）。したがって、図６に示されたプロットは明らかに、ビーズがＲ−ＰＥによる蛍光発光において偏光誘起型の応答を示すことを示している。

本明細書に述べられる方法は（例えば照明経路への１つまたは複数の偏光要素の挿入による）大きな改造を伴わずに現在あるＬＸ１００フローサイトメータで実施されることが可能であり、いずれのフローサイトメータでも容易に実施されることが可能である。本明細書に述べられる照明サブシステムと方法は蛍光体によって放出される蛍光の量を増大させることが可能であり、したがってフローサイトメータの感度と精度を高めることが可能である。この技法はまた、残りの光学部品に影響を与えることなく現在のフローサイトメータ機器の中に容易に組み込まれることが可能である。

図７は粒子の蛍光を測定するように構成されたシステムの一実施形態を例示している。図７に例示された測定システムは本明細書に述べられた実施形態に従って構成された照明サブシステムを含む。図７に示されたシステムの実施形態はフローサイトメータとして構成される。図７で、測定システムは粒子５４が通って流れるキュベット５２の断面を通る平面に沿って示されている。一例では、このキュベットは標準的なフローサイトメータに使用されるような標準的な石英ガラスのキュベットである。しかしながら、いずれか他のタイプの視認用または供給用チャンバを、分析用の試料を供給するために使用することもやはり可能である。

このシステムは非垂直方向に配向させられた直線偏光、円偏光、または楕円偏光で粒子５４を照明するように構成された照明サブシステムを含む。蛍光体（図示せず）が粒子５４に付着されるかまたはその中に組み込まれる。光の偏光により、蛍光体によって放出される蛍光が、垂直方向に支配的に配向させられた直線偏光光または非偏光光で照明されるときに蛍光体によって放出される蛍光よりも高輝度になる。

この照明サブシステムは光源５６を含む。一実施形態では光源５６はレーザである。このレーザは当該技術で知られているどのような適切なレーザであってもよい。さらに、この照明サブシステムは複数のレーザ（図示せず）を含んでもよい。光源は青色光または緑色光などの１つまたは複数の波長を有する光を放出するように構成されてもよい。他の実施形態では、照明サブシステムはＬＥＤ、アークランプ、光ファイバ照明器、電球から成る群から選択される１つまたは複数の非レーザ光源（図示せず）を含む。非レーザ光源（群）は当該技術で知られているどのような適切な非レーザ光源（群）でもよい。この方式で、照明サブシステムは複数の光源を含んでもよい。一実施形態では、これらの光源は異なる波長または異なる帯域を有する光（例えば青色光と緑色光）で粒子を照明するように構成される。いくつかの実施形態では、これらの光源は異なる方向で粒子を照明するように構成されることもある。さらに、この照明サブシステムは１つまたは複数のレーザおよび／または１つまたは複数の非レーザ光源を含むこともある。光源５６は当該技術で知られているどのような他の適切な光源を含むこともある。

この照明サブシステムはまた、光源５６によって作られる光の光学経路に配置された偏光要素５８を含む。偏光要素５８は半波長遅延器、１／４波長遅延器、遅延器スタック、本明細書に述べられるいずれかの他の適切な偏光要素、またはこれらのいずれかの組合せを含む。偏光要素５８は測定システムによって実行される測定中に光が粒子５４を照明する前に光の偏光を変更するように構成される。例えば、光源は垂直方向に支配的に配向させられた直線偏光または非偏光を発生するように構成される。変更された偏光は非垂直方向に配向させられた直線偏光、円偏光、または楕円偏光である。一実施形態では、変更された偏光はいずれかの配向を備えて１００：１未満の偏光比を有する。他の実施形態では、変更された偏光は非垂直配向を備えて１００：１よりも大きい偏光比を有する。さらに、図７に示されたシステムは光源５６とキュベット５２の間の光学経路に配置された１つの偏光要素を含むが、このシステムが光源５６とキュベット５２の間の光学経路に配置された複数の偏光要素（図示せず）を含んでもよい。これらの偏光要素は直列になって、選択された偏光状態および／または配向の光で粒子５４が照明されるように光源５６によって作られる光の偏光を変更する。

偏光要素５８を出る光は粒子がキュベットを通って流れるときにこれらを照明する。この照明により、粒子または粒子に付着されるかまたは組み込まれた蛍光体が１つまたは複数の波長または波長帯域を有する蛍光を放出する。さらに、偏光要素を出る光の変更された偏光により、蛍光体によって放出される蛍光が、垂直方向に支配的に配向させられた直線偏光光または非偏光光で照明されるときに蛍光体によって放出される蛍光よりも高輝度になる。一実施形態では蛍光体はＲ−ＰＥを含む。異なる実施形態では蛍光体は有機または非有機の染料を含む。この有機または非有機の染料は当該技術で知られている適切ないずれの染料を含んでもよい。

いくつかの実施形態では、粒子５４自体が蛍光を発するように構成される。１つのそのような実施形態では、偏光要素５８を出る光の偏光により、粒子によって放出される蛍光が、垂直方向に支配的に配向させられた直線偏光光または非偏光光で照明されるときに粒子によって放出される蛍光よりも高輝度になる。

いくつかの実施形態では、システムは光源からの光を粒子または流路上に焦点集束させるように構成された１つまたは複数のレンズ（図示せず）を含む。この１つまたは複数のレンズは光源５６と偏光要素５８の間、または偏光要素５８とキュベット５２の間に配置される。

粒子から前方に散乱する光はフォールディング・ミラー６２または他の適切な光配向用部品によって検出システム６０へと向けられる。場合によっては、検出システム６０が前方散乱光の経路に直接置かれてもよい。この方式ではフォールディング・ミラーまたは他の光配向用部品はシステム内に含まれなくてもよい。一実施形態では、前方散乱光は図７に示されるように光源５６による照明の方向から約１８０°の角度で粒子によって散乱させられる光である。前方散乱光の角度は、光源からの入射光が検出システムの感光性表面上に衝突することは不可能な、照明の角度から正確に１８０°でないのもある。例えば、前方散乱光は照明の角度から１８０°を下回る、または上回る角度で粒子によって散乱させられる光（例えば約１７０°、約１７５°、約１８５°、または約１９０°で散乱させられる光）である。

照明の方向から約９０°の角度で粒子によって散乱させられる光もやはり集められる。粒子によって散乱させられる光は、同様に、または場合によってはどのような角度または配向でも集められる。一実施形態では、この散乱光は１つまたは複数のビーム・スプリッタまたは２色性ミラーによって複数の光ビームへと分割される。例えば、照明の方向に対して約９０°の角度で散乱させられる光がビーム・スプリッタ６４によって２つの異なる光ビームへと分割される。４つの異なる光ビームを作るためにこれら２つの異なる光ビームがビーム・スプリッタ６６と６８によって再び分割される。光ビームの各々は１つまたは複数の検出器を含む異なる検出システムへと向けられる。例えば、４つの光ビームのうちの１つが検出システム７０へと向けられる。検出システム７０は粒子によって散乱させられる光を検出するように構成される。

検出システム６０および／または検出システム７０によって検出される散乱光は通常、光源によって照明される粒子の体積に比例する。したがって、検出システム６０の出力信号および／または検出システム７０の出力信号は照明ゾーンまたは検出窓内にある粒子の直径を判定するために使用される。さらに、一緒に繋がっている、または殆ど同時に照明ゾーンを通過する複数の粒子を識別するために、検出システム６０の出力信号および／または検出システム７０の出力信号が使用される。それゆえに、そのような粒子は他の試料粒子や較正用粒子から区別されることが可能である。

本システムはまた、蛍光体によって放出される蛍光に応答して出力信号を発生するように構成された検出サブシステムも含む。例えば、他の３つの光ビームが検出システム７２、７４、７６へと向けられる。検出システム７２、７４、７６は蛍光体または粒子自体によって放出される蛍光を検出するように構成される。各々の検出システムは異なる波長または異なる波長帯域の蛍光を検出するように構成されてもよい。例えば、検出システムのうちの１つが緑色の蛍光を検出するように構成される。別の検出システムが黄色から橙色の蛍光を検出するように構成され、その他の検出システムが赤色の蛍光を検出するように構成される。

いくつかの実施形態では、スペクトル・フィルタ７８、８０、８２がそれぞれ検出システム７２、７４、７６に連結される。これらのスペクトル・フィルタは検出システムが検出するように構成される波長以外の波長の蛍光を遮断するように構成される。また、１つまたは複数のレンズ（図示せず）が検出システムの各々に光学的に連結されてもよい。これらのレンズは、散乱光または発光蛍光を検出器の感光面上に集束させるように構成される。

検出器の出力電流は検出器に入射する蛍光に比例し、結果として電流パルスになる。この電流パルスは電圧パルスへと変換され、ローパス・フィルタで処理され、次いでＡ／Ｄコンバータ（図示せず）によってデジタル化される。蛍光の量を表わす数を供給するためにデジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）などのプロセッサ８４がパルスの面積を積分する。図７に示されたように、プロセッサ８４は伝達媒体８６を介して検出器７０に連結される。また、プロセッサ８４は、伝達媒体８６と１つまたは複数のＡ／Ｄコンバータなどの他の構成要素（図示せず）を介して検出器７０に間接的に連結されてもよい。同様の方式でプロセッサが本システムの他の検出器に連結されてもよい。プロセッサ８４はさらに、本明細書に述べられるように構成されることも可能である。

いくつかの実施形態では、蛍光体または粒子によって放出される蛍光から作られた出力信号は粒子の身元、および粒子の表面で起こった、または起こっている反応についての情報を判定するために使用される。例えば、２つの検出システムの出力信号が粒子の身元を判定するために使用され、その他の検出システムの出力信号が粒子の表面で起こった、または起こっている反応についての情報を判定するために使用される。それゆえに、検出器とスペクトル・フィルタの選択は粒子に組み込まれるかまたは付着される染料または蛍光体のタイプ、および／または測定される反応（すなわち反応の中に含まれる反応物質に組み込まれるかまたは付着される（複数の）染料）に応じて変わる。

試料粒子の身元を判定するために使用される検出システム（例えば検出システム７２、７４）はＡＰＤ、ＰＭＴ、または他のタイプの光検出器であってもよい。粒子の表面で起こった、または起こっている反応を識別するために使用される検出システム（例えば検出システム７６）はＡＰＤ、ＰＭＴ、またはその他のタイプの光検出器である。この測定システムはさらに、本明細書に述べられるように構成されることも可能である。

図７のシステムは、異なる染料特徴を有する粒子間の区別をするために２つの異なる検出窓を有する２つの検出システムを含むように示されているが、本システムが２つを超えるそのような検出窓（すなわち３つの検出窓、４つの検出窓など）を含んでもよいことは理解されるべきである。そのような実施形態では、システムは追加のビーム・スプリッタと、他の検出窓を有する追加の検出システムを含む。また、スペクトル・フィルタおよび／またはレンズが追加の検出システムの各々に連結されてもよい。

他の実施形態では、システムは粒子の表面で反応させられる異なる物質間の区別をするように構成された２つ以上の検出システムを含む。これら異なる反応物質は粒子の染料特徴とは異なる染料特徴を有する。

本明細書に述べられるように構成される測定システムの追加の実例（例えばシステムの照明経路への１つまたは複数の偏光要素の挿入による）がＣｈａｎｄｌｅｒらの米国特許第５９８１１８０号明細書、Ｃｈａｎｄｌｅｒの米国特許第６０４６８０７号明細書、Ｃｈａｎｄｌｅｒの米国特許第６１３９８００号明細書、Ｃｈａｎｄｌｅｒの米国特許第６３６６３５４号明細書、Ｃｈａｎｄｌｅｒの米国特許第６４１１９０４号明細書、Ｃｈａｎｄｌｅｒらの米国特許第６４４９５６２号明細書、Ｃｈａｎｄｌｅｒらの米国特許第６５２４７９３号明細書に例示されており、これらは十分に記述するように本明細書に参照で組み込まれる。本明細書に述べられる測定システムはさらにこれらの特許に述べられたように構成されることもやはり可能である。図７に示されたシステムはさらに、他のシステムと実施形態に関して本明細書に述べられるように構成されることも可能である。さらに、図７に示されたシステムは本明細書に述べられる他の実施形態の利点のすべてを有する。

粒子の蛍光を測定するように構成されたシステムの他の実施形態が図８に示されている。図８に示されたシステムは試料の多検体測定などの用途に使用可能である。本システムの実施形態は蛍光撮像システムとして構成される。このシステムは非垂直方向に配向させられた直線偏光、円偏光、または楕円偏光を有する光で粒子を照明するように構成された照明サブシステムを含む。蛍光体が粒子に付着されるかまたは組み込まれる。光の偏光により、蛍光体によって放出される蛍光が、垂直方向に支配的に配向させられた直線偏光光または非偏光光で照明されるときに蛍光体によって放出される蛍光よりも高輝度になる。

一実施形態では、照明サブシステムは光源８８を含む。光源８８は適切ないずれかのＬＥＤ、レーザ、アークランプ、光ファイバ照明器、電球、白熱電球、または当該技術で知られているいずれかの他の適切な光源などの１つまたは複数の光源を含む。さらに、この照明サブシステムは複数の光源（図示せず）を含んでもよく、これらの各々は少なくとも１つの波長または少なくとも１つの波長帯域の光を発生するように構成される。図８に示されたシステムに使用するための光源の適切な組合せの一例は、限定はされないが２つ以上のＬＥＤを含む。

複数の光源によって発生する光がビーム・スプリッタ（図示せず）または当該技術で知られているいずれかの他の適切な光学素子によって共通の照明経路に組み合わされ、複数の光源からの光が同時に粒子に向けられてもよい。場合によっては、撮像サブシステムは、反射ミラーなどの光学素子（図示せず）やいずれの光源が粒子を照明するために使用されるかに応じてこの光学素子を照明経路に出し入れして移動させるように構成されたデバイス（図示せず）を含む。この方式では、これらの光源は異なる波長または異なる波長帯域の光で順々に粒子を照明するために使用される。（複数の）光源はまた、基材の下からではなく上から（図示せず）基材を照明することも可能である。

粒子または粒子に結合するかまたは組み込まれた物質に蛍光を放出させる（複数の）波長または（複数の）波長帯域で光を供給するために（複数の）光源が選択される。例えば、（複数の）波長または（複数の）波長帯域は、粒子の中に組み込まれる、および／または粒子の表面に連結される蛍光体、蛍光染料、または他の蛍光物質を励起するように選択される。この方式では、（複数の）波長または（複数の）波長帯域は粒子が蛍光を発してこれが粒子の分類に使用されるように選択される。さらに、（複数の）波長または（複数の）波長帯域は、粒子の表面上の試薬を介して粒子に連結された蛍光体、蛍光染料、または他の蛍光物質を励起するように選択されてもよい。それ自体、（複数の）波長または（複数の）波長帯域は粒子が蛍光を発してこれが粒子の表面で起こった（複数の）反応を検出および／または定量化するために使用されるように選択されてもよい。

この照明サブシステムはまた、光源８８によって発生する光の光学経路に配置された偏光要素９０も含む。偏光要素９０は、半波長遅延器、１／４波長遅延器、遅延器スタック、これらのいくつかの組合せ、または本明細書に述べられるいずれかの他の偏光要素または偏光要素の組合せを含む。偏光要素９０はシステムによって実行される測定中に光が粒子９２を照明する前に光の偏光を変更するように構成される。変更された偏光は非垂直方向に配向させられた直線偏光、円偏光、または楕円偏光である。一実施形態では、変更された偏光はいずれかの配向を備えて１００：１未満の偏光比を有する。別の実施形態では、変更された偏光は非垂直配向を備えて１００：１よりも大きい偏光比を有する。

変更された偏光により、蛍光体によって放出される蛍光は、垂直方向に支配的に配向させられた直線偏光光または非偏光光で照明されるときに、蛍光体によって放出される蛍光よりも高輝度になる。一実施形態では、蛍光体はＲ−ＰＥを含む。異なる実施形態では、蛍光体は有機または非有機の染料を含む。この有機または非有機の染料は当該技術で知られている適切ないずれかの染料を含む。いくつかの実施形態では粒子自体が蛍光を発するように構成される。１つのそのような実施形態では、光の偏光により、粒子によって放出される蛍光が、垂直方向に支配的に配向させられた直線偏光光または非偏光光で照明されるときに粒子によって放出される蛍光よりも高輝度になる。

図８に示されるように、照明サブシステムは偏光要素９０からの光を粒子９２が固定される基材９６へと向けるように構成される光学素子９４を含む。一例では、光学素子９４はコリメータレンズである。しかしながら、光学素子９４は偏光要素９０からの光を基材９６上に結像させるために使用できるいずれの他の適切な光学素子を含んでもよい。さらに、この光学素子は単一の光学素子として図８に示されているが、光学素子９４が複数の屈折用素子を含むことは理解されるべきである。さらに、光学素子９４は屈折用の光学素子として図８に示されているが、偏光要素９０からの光を基材９６上に結像させるために１つまたは複数の反射用および／または回折用光学素子を使用できる（１つまたは複数の屈折用光学素子との組合せであろう）ことも理解されるべきである。さらに、光学素子９４は偏光要素９０からの光を実質的に直角の入射角度で基材９６上に結像させるように図８に示されているが、本システムが斜めの入射角度で光を基材９６に向けるように構成されてもよいことは理解されるべきである。

さらに、偏光要素９０は光源８８と光学部品９４の間の光学経路に配置されて示されているが、場合によっては偏光要素９０は光学部品９４と基材９６の間の光学経路に配置されることもある。さらに、図８に示されたシステムは光源８８と基材９６の間の光学経路に配置された１つの偏光要素を含むが、本システムが光源８８と基材９６の間の光学経路に配置された複数の偏光要素を含むこともある。これらの偏光要素は直列になって、選択された偏光状態および／または配向の光で粒子９２が照明されるように光源８８によって作られる光の偏光を変更することが可能である。

粒子９２は上述されたいずれの粒子をも含む。基材９６は当該技術で知られているいずれの適切な基材を含む。基材９６上に固定される粒子は撮像チャンバ（図示せず）または基材９６とその上に固定された粒子９２の位置を照明サブシステムに対して保持するためのいずれかの他のデバイス内に配置されてもよい。基材９６の位置を保持するためのデバイスはまた、撮像の前に（例えば照明を基材上に焦点集束させるために）基材の位置を変更するように構成されることもある。

基材上への粒子の固定は磁力、真空フィルタ板、または当該技術で知られているいずれかの他の適切な方法を使用して実行される。撮像のためにミクロスフィアを位置決めするための方法とシステムの例が２００４年１１月１１日に提出されたＰｅｍｐｓｅｌｌの米国特許出願公開第６０／６２７３０４号明細書に例示されており、これは本明細書に十分に記述するように参照で組み込まれる。粒子固定法自体は本明細書に述べられる方法とシステムに特に重要ではない。しかしながら、数秒の長さである検出器の積分期間中に粒子が目に見えるほど移動しないように粒子が固定されることが好ましい。

図８に示されたシステムはまた、蛍光体によって放出される蛍光に応答して出力信号を発生するように構成される検出サブシステムも含む。例えば、図８に示されるように、検出サブシステムは光学素子９８と２色性ビーム・スプリッタ１００を含んでいる。光学素子９８は基材９６やその上に固定された粒子９２からの光を集めて平行にし、この光をビーム・スプリッタ１００へと向けるように構成される。光学素子９８はさらに、光学素子９４に対して上述されたように構成される。ビーム・スプリッタ１００は当該技術で知られている適切ないずれかのビーム・スプリッタを含んでもよい。ビーム・スプリッタ１００は光の波長に基づいて光学素子９８からの光を異なる検出器へと向けるように構成される。例えば、第１の波長または波長帯域を有する光がビーム・スプリッタ１００によって透過され、第１とは異なる第２の波長または波長帯域を有する光がビーム・スプリッタ１００によって反射される。

検出サブシステムは光学素子１０２と検出器１０４をも含む。ビーム・スプリッタ１００によって透過された光は光学素子１０２へと向けられる。光学素子１０２はビーム・スプリッタ１００によって透過された光を検出器１０４上に焦点集束させるように構成される。検出サブシステムは光学素子１０６および検出器１０８をさらに含んでいる。ビーム・スプリッタ１００によって反射された光が光学素子１０６へと向けられる。光学素子１０６はビーム・スプリッタ１００によって反射された光を検出器１０８上に焦点集束させるように構成される。光学素子１０２、１０６は光学素子９４に関して上述されたように構成されてもよい。

検出器１０４、１０８は、例えば電荷結合素子（ＣＣＤ）検出器または当該技術で知られているＣＭＯＳ検出器、感光素子の二次元アレイ、時間遅延積分（ＴＤＩ）検出器などのいずれかの他の適切な撮像用検出器を含む。いくつかの実施形態では、実質的に全部の基材または基材上に固定されたすべての粒子の画像を同時に得るために二次元ＣＣＤ撮像アレイなどの検出器が使用される。システム内に含まれる検出器の数を関心のある波長または波長帯域の数に等しくし、それにより、各々の検出器を、これらの波長または波長帯域のうちの１つで画像を作るために使用するようにしてもよい。

検出器によって作られた画像の各々は、ビーム・スプリッタから検出器への光学経路に配置される光学的帯域通過素子（図示せず）または当該技術で知られているいずれかの他の適切な光学素子を使用してスペクトル濾波される。各々の捕捉された画像について異なる濾波「帯域」が使用されてもよい。画像が取得される各々の波長または波長帯域に関する検出波長の中心と幅は、たとえ粒子の分類に使用されても、レポーター信号に使用されても関心ある蛍光発光に合わせられる。

この方式では、図８に示されたシステムの検出サブシステムは多様な波長または波長帯域で複数の画像を同時に作るように構成される。図８に示されたシステムは２つの検出器を含むが、本システムが２つを超える検出器（例えば３つの検出器、４つの検出器など）を含み得ることは理解されるべきである。上述されたように、各々の検出器を、多様な波長または波長帯域の光を多様な検出器へと同時に向けるための１つまたは複数の光学素子を含むことによって多様な波長または波長帯域で複数の画像を同時に作るように構成させることが可能である。さらに、図８に示されたシステムは複数の検出器を含むが、本システムが単一の検出器を含むこともあることは理解されるべきである。複数の波長または波長帯域で複数の画像を順々に作るように単一の検出器が使用されてもよい。例えば、多様な波長または波長帯域の光が順々に基材へと向けられてもよく、多様な波長または波長帯域の各々による基材の照明の間に多様な画像が作られることも可能である。別の例では、多様な波長または波長帯域で順々に画像を作るために、単一の検出器に向けられる光の波長または波長帯域を選択するための多様なフィルタを（例えば多様なフィルタを撮像経路に出し入れして移動させることによって）変更させるようにしている。

したがって、図８に示された検出サブシステムは、関心あるいくつかの波長で粒子９２の蛍光発光を表わす複数または一連の画像を作るように構成される。さらに、本システムは、粒子の蛍光発光を表わす複数または一連のデジタル画像をプロセッサ（すなわち処理機関）へと供給するように構成されてもよい。１つのそのような例では、本システムはプロセッサ１１０を含む。プロセッサ１１０は検出器１０４、１０８から画像データを入手する（例えば受信する）ように構成される。例えば、プロセッサ１１０は、当該技術で知られている適切ないずれかの方式で（例えば各々が検出器のうちの１つをプロセッサに連結する伝達媒体（図示せず）を介して、各々が検出器のうちの１つとプロセッサの間に連結されたアナログ／デジタル・コンバータなどの１つまたは複数の電子部品（図示せず）を介して、など）検出器１０４、１０８へ連結される。

プロセッサ１１０は、粒子の分類および粒子の表面で起こった反応についての情報などの粒子９２の１つまたは複数の特徴を判定するために画像を処理および分析するように構成されることが好ましい。この１つまたは複数の特徴は、各々の波長または波長帯域で各々の粒子についての蛍光の量に関する記入事項を備えたデータ・アレイのような適切ないずれかの書式でプロセッサによって出力されることが可能である。

プロセッサ１１０は通常のパーソナル・コンピュータ、メインフレーム・コンピュータ・システム、ワークステーションなどに共通して含まれるようなプロセッサなどである。「コンピュータ・システム」という用語はメモリ媒体からの命令を実行する１つまたは複数のプロセッサを有するいずれのデバイスも包含するように広義に定義される。プロセッサはいずれかの他の適切な機能ハードウェアを使用して実装される。例えば、このプロセッサはファームウェアの固定プログラムを備えたＤＳＰ、書き換え可能ゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、または超高速集積回路（ＶＨＳＩＣ）ハードウェア記述言語（ＶＨＤＬ）などの高水準のプログラミング言語で「書かれた」順序論理を使用する他のプログラム可能な論理デバイス（ＰＬＤ）を含む。別の例では、プロセッサ１１０で実行可能なプログラム命令（図示せず）は、所望であれば適切なＡｃｔｉｖｅＸ制御、Ｊａｖａ（登録商標）Ｂｅａｎｓ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｃｌａｓｓｅｓ（ＭＦＣ）、または他の技術もしくは方法論としてＣ＋＋の部分を備えたＣ＃などの高水準言語で符号化される。これらのプログラム命令は、プロシージャ・ベース技術、コンポーネント・ベース技術、および／またはオブジェクト指向型技術を含めた様々な方式のいずれかで実現できる。

図８に示されたシステムはさらに、他のシステムと実施形態に関して本明細書に述べられたように構成されることも可能である。さらに、図８に示されたシステムは本明細書に述べられた他の実施形態の利点のすべてを有する。

上述のように、図７〜８に示されたシステムはシステムの照明経路に配置された１つまたは複数の偏光要素を含む。さらに、上述のように、図７〜８に示されたシステムは複数の光源を含むこともある。いくつかのそのような実施形態では光源のうちのいくつかは粒子に連結された多様な物質から蛍光を励起するために使用されてる（例えば第１の光源が分類染料のために励起源として使用され、第２の光源がレポーター染料のため励起源として使用される、等々）。この方式では、光源の各々によって作られる光の偏光は独立して変更され、それにより、光源の各々によって励起される物質の蛍光を増大させることが可能である。例えば、本明細書に述べられた偏光要素のような偏光要素は各々の光源の照明経路に配置され、これらの光源によって作られる光ビームが共通の照明経路の中に組み合わされる場合、偏光要素は光ビームを組み合わせる（複数の）光学素子の上流で照明経路に配置される。この方式では、粒子を照明する各々の光ビームの偏光はシステムによって実行される各々（または少なくとも複数）の蛍光測定値の大きさを増大させるように、できれば最大にするように独立して変更および制御される。

この説明を考慮すると本発明の様々な態様のさらなる改造や変形実施形態が当業者に明らかであろう。例えば、蛍光体によって放出される蛍光を増大させるためのシステム、照明サブシステム、方法が提供される。したがって、この説明は単なる具体的例示として解釈されるべきであり、本発明を実行するための一般的な方式を当業者に教示する目的のためのものである。本明細書に示されて説明された本発明の形態が現在好ましい実施形態として解釈されるべきであることは理解されるはずである。すべて本発明の説明の恩典を有した後に当業者に明らかになるであろうが、複数の素子と材料が本明細書に例示されて述べられたものと置き換えられることが可能であり、複数の部分や処理が逆にされることも見込まれ、本発明のある種の特徴が独立して利用されることも見込まれる。添付の特許請求項に述べられた本発明の精神と範囲から逸脱することなく、本明細書に述べられた素子に変更がなされることが可能である。

フローサイトメータのための光学構成の一例の透視光景を例示する概略図である。 フローサイトメータのための光学構成の実施形態の透視光景を例示する概略図である。 光の偏光の変更を伴わない場合と光の偏光の変更を伴う場合の両方で粒子を光で照明することによって得られたデータを例示するグラフである。 光の偏光の変更を伴わない場合と光の偏光の変更を伴う場合の両方で粒子を光で照明することによって得られたデータを例示するグラフである。 光の偏光の変更を伴わない場合と光の偏光の変更を伴う場合の両方で粒子を光で照明することによって得られたデータを例示するグラフである。 光の偏光の変更を伴わない場合と光の偏光の変更を伴う場合の両方で粒子を光で照明することによって得られたデータを例示するグラフである。 粒子の蛍光を測定するように構成されたシステムの様々な実施形態の断面光景を例示する概略図である。 粒子の蛍光を測定するように構成されたシステムの様々な実施形態の断面光景を例示する概略図である。

Claims (23)

1. 非垂直方向に配向した直線偏光、円偏光、または楕円偏光を有する光で、蛍光体が付着されるかまたは組み込まれている粒子を照明するように構成された照明サブシステムであって、垂直方向に支配的に配向させられた直線偏光光または非偏光光で照明されるときに前記蛍光体から放出される蛍光よりも、前記光の偏光によって、前記蛍光体から放出される蛍光が高輝度になる、前記照明サブシステムと、
   前記蛍光体によって放出される前記蛍光に応答して出力信号を発生するように構成された検出サブシステムと
   を含む、粒子の蛍光を測定するように構成されたシステム。
2. 前記照明サブシステムが１つまたは複数のレーザを含む請求項１に記載のシステム。
3. 前記照明サブシステムが発光ダイオード、アークランプ、光ファイバ照明器、および電球から成る群から選択される１つまたは複数の非レーザ光源を含む請求項１に記載のシステム。
4. 偏光がいずれかの配向を備えて１００：１未満の偏光比を有する請求項１に記載のシステム。
5. 偏光が非垂直配向を備えて１００：１よりも大きい偏光比を有する請求項１に記載のシステム。
6. 前記蛍光体がＲ−フィコエリスリンを含む請求項１に記載のシステム。
7. 前記蛍光体が有機または非有機の染料を含む請求項１に記載のシステム。
8. 前記粒子が蛍光を発するように構成され、前記光の偏光により、前記粒子によって放出される前記蛍光が、垂直方向に配向させられた前記直線偏光または前記非偏光光で照明されるときに前記粒子によって放出される前記蛍光よりも高輝度になる請求項１に記載のシステム。
9. さらにフローサイトメータとして構成される請求項１に記載のシステム。
10. さらに蛍光撮像システムとして構成される請求項１に記載のシステム。
11. 測定システムのための照明を供給するように構成された照明サブシステムであって、
    光を発生するように構成された光源と、
    前記測定システムによって実行される測定中に、蛍光体が付着されるかまたは組み込まれた粒子を、前記光が照明する前に、その光の偏光を変更するように構成された偏光要素と
    を含み、変更された偏光が非垂直方向に配向させられた直線偏光、円偏光、または楕円偏光であり、その変更された偏光により、前記蛍光体によって放出される蛍光が、垂直方向に支配的に配向させられた直線偏光光または非偏光光で照明されるときに前記蛍光体によって放出される蛍光よりも高輝度になる照明サブシステム。
12. 前記光源が１つまたは複数のレーザを含む請求項１１に記載の照明サブシステム。
13. 前記光源が発光ダイオード、アークランプ、光ファイバ照明器、電球から成る群から選択される１つまたは複数の非レーザ光源を含む請求項１１に記載の照明サブシステム。
14. 前記偏光要素が半波長遅延器、１／４波長遅延器、遅延器スタック、またはこれらのいくつかの組合せを含む請求項１１に記載の照明サブシステム。
15. 変更された偏光がいずれかの配向を備えて１００：１未満の偏光比を有する請求項１１に記載の照明サブシステム。
16. 変更された偏光が非垂直配向を備えて１００：１よりも大きい偏光比を有する請求項１１に記載の照明サブシステム。
17. 前記蛍光体がＲ−フィコエリスリンを含む請求項１１に記載の照明サブシステム。
18. 前記蛍光体が有機または非有機の染料を含む請求項１１に記載の照明サブシステム。
19. 前記測定システムがさらにフローサイトメータとして構成される請求項１１に記載の照明サブシステム。
20. 前記測定システムがさらに蛍光撮像システムとして構成される請求項１１に記載の照明サブシステム。
21. 粒子に付着されるかまたは組み込まれた蛍光体によって放出される蛍光を増大させるための方法であって、測定中に前記光が前記粒子を照明する前に光の偏光を変更するステップを含み、変更された偏光が非垂直方向に配向させられた直線偏光、円偏光、または楕円偏光である方法。
22. 変更された偏光がいずれかの配向を備えて１００：１未満の偏光比を有する請求項２１に記載の方法。
23. 変更された偏光が非垂直配向を備えて１００：１よりも大きい偏光比を有する請求項２１に記載の方法。

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