CN115639178A - 基于多色上转换荧光编码微球的成像系统及多重检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于多色上转换荧光编码微球的成像系统及多重检测方法，包括：激光激发子系统、样品台、信息采集子系统以及处理子系统；激光激发子系统包括可见光激发器和近红外光激发器；可见光激发器用于激发样品台上待测生物样本中标记物的荧光信号；近红外光激发器用于激发待测生物样本中编码微球的上转换荧光信号；信息采集子系统，设置在样品台的下方，用于采集标记物的荧光信号以及编码微球的上转换荧光信号并生成对应的定量图像和定性图像；处理子系统，与信息采集子系统连接，基于定量图像和定性图像对待测生物样本进行定量和定性检测。本发明能够实现生物样本的快速多重检测。

Description

基于多色上转换荧光编码微球的成像系统及多重检测方法

技术领域

本发明涉及荧光成像及多重检测技术领域，特别是涉及一种基于多色上转换荧光编码微球的成像系统及多重检测方法。

背景技术

对生物因子的多重分析检测可以在更短的时间内获取更多信息，随着对多重分析需求的不断增加，需要更加简单、灵敏和经济高效的多重检测方法。目前的主流技术是液体芯片技术，其使用传统流式细胞仪等检测仪器并具有较高的检测精度，具有在单位体积内能够提供更多分析识别位点的优势，在生物多重检测领域具有更广阔的应用前景。

具体来说，液体芯片是在微球内部装入精确比例的不同发射波长的荧光材料，使每组编码微球具有唯一的光谱编码，用以对分析物进行测定。荧光编码的数量随着不同发光颜色和强度的变化呈现指数倍增长。而且可以在编码微球表面偶联抗体或者DNA探针，在编码波长区外另一波长激发下发光的荧光报告分子标记目标抗原或DNA来进行检测，从而实现其高度集成的在线多重检测。

多重检测在保证准确性的前提下追求编码数量最大化与检测方法最简化。现有的技术存在以下问题：(1)目前荧光编码材料主要是有机荧光染料和量子点。在构建多色荧光编码的过程中，荧光染料和不同量子点材料的发射峰均有重叠现象，限制了其荧光编码的数量。(2)现在基于流式分析的液体芯片技术对设备要求高，流式细胞仪体积大，结构复杂且价格昂贵，不够便携(3)使用流式分析的液体芯片技术需对每个微球进行逐一扫描，对单个样本的分析需要较长时间，检测速度和检测效率有待提高。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于多色上转换荧光编码微球的成像系统及多重检测方法，以实现生物样本的快速多重检测。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

一种基于多色上转换荧光编码微球的成像系统，包括：激光激发子系统、样品台、信息采集子系统以及处理子系统；

所述激光激发子系统包括可见光激发器和近红外光激发器，所述可见光激光器为定量检测的激发光源，所述近红外激光器为定性检测的激发光源；

所述可见光激发器，设置在所述样品台的上方，用于激发所述样品台上待测生物样本中标记物的荧光信号；所述近红外光激发器，设置在所述样品台的侧面，用于激发所述待测生物样本中编码微球的上转换荧光信号；

所述信息采集子系统，设置在所述样品台的下方，用于采集所述标记物的荧光信号以及所述编码微球的上转换荧光信号并生成对应的定量图像和定性图像；

处理子系统，与所述信息采集子系统连接，基于所述定量图像和所述定性图像对所述待测生物样本进行定量和定性检测。

可选地，所述激光激发子系统还包括：

激光滤光片，设置在所述可见光激发器的出射光路上，用于选择性的透过可见光激光器发出的可见光；

透镜，设置在所述近红外光激发器的出射光路上，用于对所述近红外光激发器发出的近红外光进行透射；

二向色镜，设置在所述透镜的透射光路上，用于对透射的红外光进行反射；

物镜，设置在所述二向色镜的反射光路上，用于将反射后的红外光聚焦到所述待测生物样本上。

可选地，所述信息采集子系统包括：

透镜组，设置在所述二向色镜的透射光路上，用于对所述标记物的荧光信号以及所述编码微球的上转换荧光信号进行透射；

发射滤光片转盘，设置在所述透镜组的透射光路上，用于选择性的透过所述标记物的荧光信号以及所述编码微球的上转换荧光信号；

高反射镜，设置在所述发射滤光片转盘的透射光路上，用于对透射的荧光信号进行反射；

相机模组，设置在所述高反射镜的反射光路上，用于对透射的荧光信号进行成像，得到对应的定量图像和定性图像。

可选地，所述发射滤光片转盘含有多个发射光滤光片；所述激发滤光片和所述发射光滤光片采用短通滤光片、带通滤光片或长通滤光片。

可选地，还包括：白光光源，设置在所述样品台的上方，用于提供照明光源。

可选地，所述可见光激光器采用波长为400nm-700nm的激光器；所述近红外激光器采用中心波长为700nm-1550nm的激光器；所述白光光源采用汞灯、LED灯或卤素灯。

可选地，所述相机模组采用CMOS检测器；二向色镜采用短通二向色镜。

本发明还提供了一种基于多色上转换荧光编码微球的多重检测方法，所述方法应用于上述成像系统，所述方法包括：

制备待测生物样本；

通过所述成像系统获取所述待测生物样本中的标记物的荧光信号以及编码微球的上转换荧光信号，并生成对应的定量图像和定性图像；

对所述定量图像和所述定性图像进行处理，得到所述待测生物样本的生物分子的数量和类别。

可选地，所述制备待测生物样本，具体包括：

在多种上转换荧光编码微球表面偶联不同的抗体或者DNA探针，然后加入待测生物样本进行孵育，利用抗体抗原特异性结合或DNA碱基互补原理杂交，加入荧光标记的检测抗体或DNA再进行反应。

可选地，所述待测生物样本包括全血或血浆。

根据本发明提供的具体实施例，本发明公开了以下技术效果：

1)本发明通过时序切换近红外光激发器、可见光激发器和白光光源，实现同一样本同一位置的同一视角的显微成像，最终同时实现对多色编码微球的解码及检测信号的高灵敏度成像，从而实现同时对多种生物分子的快速检测。

2)本发明设计近红外光与可见光从样品台两侧激发，激光激发子系统中所有光学元件不用切换，检测结果更准确、重复性更高，避免元件经常切换造成的系统磨损和数据误差。

3)本发明采用相机模组的彩色拍照式数据采集，效率更高、速度更快、结果更准确，可避免点扫描式的耗时、位置抖动、数据不准确等缺点。

4)本发明利用近红外光激发下上转换荧光信噪比高、噪音低的特点，获得高灵敏和颜色分辨的成像，从而实现对编码微球的多重解码。同时通过可见光激光对生物样品标记信号进行荧光成像，从而实现对目标生物大分子，包括且不限于蛋白及核酸等的测定及分析。将荧光成像与上转换成像相结合，从而获得相同微球的定性及荧光信号定量图。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的基于多色上转换荧光编码微球的成像系统的结构示意图；

图2为本发明利用基于多色上转换荧光编码微球的成像系统进行多重检测的步骤示意图；

图3为编码微球进行多重检测后的分别于明场、488nm和980nm波长的激光激发下成像的示意图；

图4为图3中编码微球于980nm波长激光激发下的颜色分布图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的目的是提供一种基于多色上转换荧光编码微球的成像系统及多重检测方法，以实现生物样本的快速多重检测。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

如图1所示，本发明提供的基于多色上转换荧光编码微球的成像系统，包括：激光激发子系统、样品台4、信息采集子系统以及处理子系统。

其中，激光激发子系统包括近红外激光器8(即编码微球激光器)、可见光激光器1(即报告基团信号激光器)、激发滤光片3、二向色镜6、透镜7以及物镜5。可见光激光器1为定量检测的激发光源，用于激发样品台4上待测生物样本中标记物的荧光信号；近红外激光器8为定性检测的激发光源，用于激发待测生物样本中编码微球的上转换荧光信号。

其中，信息采集子系统包括：透镜组9、发射滤光片转盘10、高反镜11以及相机模组12。信息采集子系统用于采集标记物的荧光信号以及编码微球的上转换荧光信号并生成对应的定量图像和定性图像。

上述成像系统还包括：白光光源2，设置在样品台4的上方，用于提供照明光源。

整个成像系统为上下结构，可见光激光器1与白光光源2位于最上方，可见光激光经激发滤光片3后入射到待测生物样本上。样品台4位于可见光激光器1与白光光源2下方，样本台4上具有可以固定载玻片的卡槽，样品台4可以多方向移动。物镜5位于样本台4下方，且物镜5与样本台4之间距离可调，可使待测生物样本处于合适焦距上。近红外激光器8放置在样品台4下方的侧面，且其出射光通过二向色镜6及物镜5入射到待测生物样本上。透镜组9与发射滤光片转盘10位于样品台4的正下方，用来聚焦、收集荧光信号。需要注意的是发射滤光片转盘10中的多个发射光滤光片均垂直于平行光路的光轴。所收集的荧光信号经高反镜11射入相机模组12中。

作为一个可选地实施例，激发滤光片3和发射光滤光片采用短通滤光片、带通滤光片或长通滤光片。激发滤光片3能够选择性的透过可见光激光器1光源，避免激发光拖尾导致的高背景干扰。发射光滤光片能够选择性的透过目标发射光，同时滤掉激发光，提高检测灵敏度。发射滤光片转盘可以任意更换滤光片，在成像过程中也可实现激光器与滤光片的同步切换。

作为一个可选地实施例，可见光激光器1采用波长为400nm-700nm的激光器；近红外激光器8采用中心波长为700nm-1550nm的激光器。

作为一个可选地实施例，白光光源2采用汞灯、LED灯或卤素灯。

作为一个可选地实施例，相机模组12采用CMOS检测器。

作为一个可选地实施例，二向色镜6采用短通二向色镜，即短于截止波长的光透过，而长于截止波长的光被反射。

本发明提供的成像系统具有以下优点：

近红外光与可见光激光从样品台两侧激发，激光激发子系统中的所有光学元件不用切换，检测结果更准确、重复性更高，避免元件经常切换造成的系统磨损和数据误差。采用彩色拍照式数据采集，效率更高、速度更快、结果更准确，可避免点扫描式的耗时、位置抖动、数据不准确等缺点。利用近红外光激发下上转换荧光信噪比高、噪音低的特点，获得高灵敏和颜色分辨的成像，从而实现对编码微球的多重解码。同时通过可见光激光对微球上的生物样品标记信号进行荧光成像，从而实现对目标生物大分子，包括且不限于蛋白及核酸等的测定及分析。将荧光成像与上转换成像相结合，从而获得相同微球的定性及荧光信号定量图。

本发明提供的成像系统通过不同的光学部件，增加可见光和近红外光激发器以及彩色成像相机模组，并匹配相应的滤光片系统，构建了一套能够进行上转换成像、荧光成像及明场成像的显微系统。本发明与以往的显微成像系统相比，具有高灵敏度和高信噪比，是一套具有上转换成像、荧光成像及明场成像的一体化显微系统。

对于上述成像系统，本发明同时提供了一种基于多色上转换荧光编码微球的多重检测方法。检测方法通过不同上转换荧光编码微球捕获多种待测目标物(待测目标物包括多种抗原、细胞因子、蛋白质或DNA等生物分子)进行定量分析，并根据目标物在成像中所呈现的荧光信号种类来识别各种目标物。具体包括：

(1)制备待测生物样本。在多种上转换荧光编码微球表面偶联不同的抗体或者DNA探针，然后加入待测生物样本进行孵育，利用抗体抗原特异性结合或DNA碱基互补原理杂交，加入荧光标记的检测抗体或DNA再进行反应一段时间，最后将反应结束后的待测生物样本转移至载玻片上，使其表面上负载有样本的微球呈均匀单分散状态。

(2)通过成像系统获取待测生物样本中的标记物的荧光信号以及编码微球的上转换荧光信号，并生成对应的定量图像和定性图像。采用成像系统，使编码微球分别在近红外和可见光激发下发出各自的荧光信号，并被双波显微成像系统捕获。近红外激发下的荧光照片用于定性分析，可见光激发下的荧光照片用于定量分析。将定性图像和定量图像分开，分别构成基于荧光编码微球检测目标物的定性图像集和定量图像集。

(3)对定量图像和定性图像进行处理，得到待测生物样本的生物分子的数量和类别。通过近红外激光激发下荧光信号呈现的颜色种类和可见光下的荧光强度值来对待测生物样本中的不同待测物进行定性和定量检测，最后用软件进行统计分析。

步骤(1)中，通过在编码微球内部改变上转换稀土元素的掺杂种类和掺杂浓度可以同时调节多个发射峰的位置及强度变化，实现高通量的微球荧光编码。编码微球标记方面可以在多种上转换荧光编码微球表面偶联不同的抗体或者DNA探针。待测生物样本包括全血或血浆。

具体实施例：

可见光激光器1采用中心波长为488nm的激光器。白光光源2采用LED灯。近红外激光器8采用中心波长为980nm的激光器。相机模组12采用CMOS检测器。激发滤光片3采用475nm带通滤光片。物镜5采用倍数为10倍的可见光高透物镜。二向色镜6采用截止波长为750nm的短通二向色镜。透镜7为焦距为200mm的近红外凸透镜。透镜组9为直径50mm、焦距150的可见镀膜增透凸透镜。发射滤光片转盘10含有500nm长通滤光片(可见光激发使用)和750nm短通滤光片(近红外光激发使用)。反射镜11为银镜。

如图2所示，利用上述成像系统进行样品检测的具体实施方式包括如下步骤：

1、待测生物样本制备。

2、将待测生物样本的载玻片置于样品台的卡槽里，打开仪器，使用白光光源校准样品台的位置，调节焦距，使激光束正好打在样本中的编码微球上。

3、确定样品台的位置正确后，使用近红外激光束照射样品，获得微球解码信息。

4、切换至可见光激光器，切换发射光滤光片，测定检测物的荧光信号，也就得到了荧光强度。

5、对步骤3和4得到的数据通过软件进行处理。可以得到每个微球的编码信息以及荧光信息。通过编码微球的编码信号，可以判断出编码微球的类别，而编码微球表面携带的探针分子类型是已知的，进而可以通过信号强度得出待测生物分子的类别及数量。

6、切换下一个样本，重复步骤2-4。

7、由分析软件给出定性判断和定量测定的结果。

以下是基于多色上转换荧光编码微球的多重检测方法进一步详细说明，将使用检测四种不同的生物因子a、b、c、d作为具体案例对检测流程的具体步骤进一步说明如下：

1、选用四种不同的磁性稀土材料编码微球，四种微球分别于近红外激光激发下呈现不同颜色。例如编码微球1为18％Yb磁性编码微球，发射黄光，编码微球2为49％Yb磁性编码微球，发射蓝光等。

2、微球清洗：将磁性稀土材料编码微球1、编码微球2、编码微球3和编码微球4于MES缓冲液中振荡洗涤。

3、微球活化：将磁性稀土材料编码微球1、编码微球2、编码微球3和编码微球4置于EDC和NHS溶液混合溶液，振荡活化30min。

4、活化后清洗：将磁性稀土材料编码微球1，编码微球2，编码微球3和编码微球4于MES缓冲液中振荡洗涤。

5、抗体偶联：分别将不同的针对目标检测物的捕获抗体1、捕获抗体2、捕获抗体3和捕获抗体4加入编码微球1、编码微球2、编码微球3和编码微球4离心管中，振荡孵育2h。

6、微球封闭：抗体偶联结束后，磁吸去上清液。将含1％BSA的10mM PBS封闭液加入编码微球1、编码微球2、编码微球3和编码微球4离心管中，振荡封闭30min。

7、封闭后清洗：将磁性稀土材料编码微球1、编码微球2、编码微球3和编码微球4于PBS缓冲液中振荡洗涤。

8、保存：将含1％BSA的10mM PBS封闭液加入编码微球1、编码微球2、编码微球3和编码微球4离心管中，获得不同抗体标记的磁性稀土材料编码微球，于4℃保存备用。

9、生物因子a、b、c、d检测步骤10、准备：将血浆或血清样本进行处理配置样本稀释液。将标记好的编码微球1、编码微球2、编码微球3和编码微球4进行混合，获得编码微球混合液。

11、样本孵育：将样本稀释液和加入至编码微球混合液，于37℃孵育30min。

12、清洗：反应结束后，使用清洗缓冲液对编码微球进行振荡洗涤，置1min，磁吸去上清液。共重复清洗三次。

13、荧光抗体孵育：将分别针对于四种不同的生物因子a、b、c、d的荧光标记抗体共同加入编码微球混合液中，于37℃孵育30min。

14、清洗：反应结束后，使用清洗缓冲液对编码微球进行振荡洗涤，置1min，磁吸去上清液。共重复清洗三次。

15、微球转移：将处理好的微球混合液转移至玻璃载玻片上，并进行干燥处理。

16、拍照与分析：将载玻片转移至双光显微成像系统上，完成拍照步骤，包括：(1)在明场下寻找成像区域并调节焦距；(2)关闭白光光源，打开近红外激光，在近红外波段下成像；(3)关闭近红外光源，打开可见光激光并成像。

17、导出数据，通过分析软件完成数据分析，包括：(1)在明场下圈出微球所在位置，去除背景；(2)使用近红外激光成像图解码微球，获得微球种类；(3)通过可见光激光成像图以及在明场下圈出的微球位置获得检测信号荧光值。多色编码微球进行多重检测后的分别于明场，488nm和980nm波长的激光激发下成像如图3所示，编码微球于980nm波长激光激发下的颜色分布图如图4所示。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (10)

1.一种基于多色上转换荧光编码微球的成像系统，其特征在于，包括：激光激发子系统、样品台、信息采集子系统以及处理子系统；

所述激光激发子系统包括可见光激发器和近红外光激发器，所述可见光激光器为定量检测的激发光源，所述近红外激光器为定性检测的激发光源；

所述可见光激发器，设置在所述样品台的上方，用于激发所述样品台上待测生物样本中标记物的荧光信号；所述近红外光激发器，设置在所述样品台的侧面，用于激发所述待测生物样本中编码微球的上转换荧光信号；

所述信息采集子系统，设置在所述样品台的下方，用于采集所述标记物的荧光信号以及所述编码微球的上转换荧光信号并生成对应的定量图像和定性图像；

处理子系统，与所述信息采集子系统连接，基于所述定量图像和所述定性图像对所述待测生物样本进行定量和定性检测。

2.根据权利要求1所述的基于多色上转换荧光编码微球的成像系统，其特征在于，所述激光激发子系统还包括：

激光滤光片，设置在所述可见光激发器的出射光路上，用于选择性的透过可见光激光器发出的可见光；

透镜，设置在所述近红外光激发器的出射光路上，用于对所述近红外光激发器发出的近红外光进行透射；

二向色镜，设置在所述透镜的透射光路上，用于对透射的红外光进行反射；

物镜，设置在所述二向色镜的反射光路上，用于将反射后的红外光聚焦到所述待测生物样本上。

3.根据权利要求2所述的基于多色上转换荧光编码微球的成像系统，其特征在于，所述信息采集子系统包括：

透镜组，设置在所述二向色镜的透射光路上，用于对所述标记物的荧光信号以及所述编码微球的上转换荧光信号进行透射；

发射滤光片转盘，设置在所述透镜组的透射光路上，用于选择性的透过所述标记物的荧光信号以及所述编码微球的上转换荧光信号；

高反射镜，设置在所述发射滤光片转盘的透射光路上，用于对透射的荧光信号进行反射；

相机模组，设置在所述高反射镜的反射光路上，用于对透射的荧光信号进行成像，得到对应的定量图像和定性图像。

4.根据权利要求3所述的基于多色上转换荧光编码微球的成像系统，其特征在于，所述发射滤光片转盘含有多个发射光滤光片；所述激发滤光片和所述发射光滤光片采用短通滤光片、带通滤光片或长通滤光片。

5.根据权利要求4所述的基于多色上转换荧光编码微球的成像系统，其特征在于，还包括：

白光光源，设置在所述样品台的上方，用于提供照明光源。

6.根据权利要求5所述的基于多色上转换荧光编码微球的成像系统，其特征在于，所述可见光激光器采用波长为400nm-700nm的激光器；所述近红外激光器采用中心波长为700nm-1550nm的激光器；所述白光光源采用汞灯、LED灯或卤素灯。

7.根据权利要求3所述的基于多色上转换荧光编码微球的成像系统，其特征在于，所述相机模组采用CMOS检测器；所述二向色镜采用短通二向色镜。

8.一种基于多色上转换荧光编码微球的多重检测方法，其特征在于，所述方法应用于权利要求1-7任一项所述的成像系统，所述方法包括：

制备待测生物样本；

通过所述成像系统获取所述待测生物样本中的标记物的荧光信号以及编码微球的上转换荧光信号，并生成对应的定量图像和定性图像；

对所述定量图像和所述定性图像进行处理，得到所述待测生物样本的生物分子的数量和类别。

9.根据权利要求8所述的基于多色上转换荧光编码微球的多重检测方法，其特征在于，所述制备待测生物样本，具体包括：

在多种上转换荧光编码微球表面偶联不同的抗体或者DNA探针，然后加入待测生物样本进行孵育，利用抗体抗原特异性结合或DNA碱基互补原理杂交，加入荧光标记的检测抗体或DNA再进行反应。

10.根据权利要求8所述的基于多色上转换荧光编码微球的多重检测方法，其特征在于，所述待测生物样本包括全血或血浆。

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