JPH04505663A - 面積調節ルミネセンス（ａｍｌ） - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 面積調節ルミネセンス（ＡＭＬ） 本発明の分野は、ルミネセンスの高検知力測定に関する。

背景 世間では、増加するいろいろな背景において、広い種類の被分析物を測定する能 力に益々依存するようになっている。いろいろな化学反応又はいろいろな計器装 備を伴う定性及び定量技術が、医学、プロセス制御、汚染物の検出、システムの 監視、等に用いられている。意図する物質即ち「被分析物」の濃度、妨害物質の 存在、単離の容易さ、サンプルの前処理は、測定に伴うほんの少しの事柄である 。サンプルの調製は、被分析物の検知についてのほんの序の口にすぎない。

多くの場合において、被分析物に関して最小限の前処理を行うことが望ましい。

微生物に関しては、現在の計器の感度が低いので、検知可能にするように微生物 の数を増やすため、サンプル内に存在する微生物を成長させることが屡々必要と なっている。その他の、例えば、血液を使用するような状況においては、蛍光物 質、酵素阻害物質等が存在するため、血液の種々の成分が、多くの検知システム に対しての障害となる。前処理を最小限にすること、測定時間を短縮すること、 及びバックグラウンド障害（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ　１ｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ）を減少させることが重要であるため、検知システムの感度を大きく上昇させる ことを可能ならしめ、サンプル内の非常に小数の被分析物を検知することができ ることに大きな重要性がある。

蛍光測定法は、感度の向上、及び低濃度又は小数の被分析物を正確に測定する能 力に関して移しい調査の対象であった。しかしながら、蛍光測定法は、蛍光分子 がサンプル内に存在すること、レーリー散乱、ラマン散乱等のためかなりのバッ クグラウンド値になることがあるか、又は光源の照射レベルにおける変化も含む 種々のソースがあるため、信号又はバックグラウンドにおけるノイズがでること があるという多くの不都合がある。

これらのノイズレベルの原因の多くによる障害を減らす能力においてはかなりの 向上があったものの、なお改良の余地が残っ重要な米国特許には、米国特許第４ ．３２０．９７０号、第４．４０７．９６４号、第４．４２１．８６０号、第４ ．４６１．５７３号、第４．５０１．９７０号、第４、５３１．８３４号、第４ ．５３７．８６１号、第４．６４７．５４４号及び第４．７５０．８３７号があ る。低濃度の被分析物の測定に蛍光測定法を使用することに関する重要な論文に は、Ｄｏｖｉｃｈｉ、　ｅｔ、　ａｌ、　、　５ｃｉｅｎｃｅ　１９二８４５− ８４７、１９８３；　Ｍａｔｈｉｅｓ　ａｎｄ　５ｔｒｙｅｒ、　”Ｓｉｎｇｌ ｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ　Ｐｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：　＾ 　Ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ　５ｔｕｄｙ　Ｌｌｓｉｎｇ　Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈ ｒｉｎ、”Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎ 　ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　ｐｐ、１２９−１４ ０，１９８６；　Ｎｇｕｙｅｎ　ａｎｄ　Ｋｅｌｌｅｒ、　”旧ｔｒａｓｅｎｓ ｉｔｉｖｅ　Ｌａ５ｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｄｅｔ ｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃａｌｌｙ　Ｐｏｃｕｓｅｄ　Ｆ ｌｏｗｓ、　Ｊ、Ｏｐｔ、Ｓｏｃ、Ａｎ、Ｂ、、４：Ｎｏ、２．　Ｆｅｂｒｕａ ｒｙ　１９８７．ｐｐ、１３８−１４３；　Ｎｇｕｙｅｎ、ｅｔ、ａｌ、、Ａｎ ａｌ、Ｃｈｅｒｎ、、１９８７．５９：２１５８−２１６１；及びＢｕｓｔａｍ ａｎｔｅ　ａｎｄ　Ｍａｅｓｔｒｅ、　Ｐｒｏｃ、　ＮａｔＬ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　、　８５：８４８２−８４８６、１９８８がある。

開示の概要 低レベルのルミネセンスを検知する計測器及び方法が提供される。このシステム は、通常一定の深さのサンプル内の二つの異なる位置への一定の入射輻射力を使 用することによるものであり、このシステムにおいては、二つの位置の検知をし ている間に光放射の同じ濃度を見出す可能性が少ない。反復して測定し、平均す ることが可能である。照射位置の大きさ及び場所を変えるため、種々の技術が用 いられる。二つの位置からの情報を処理することにより、小数の被分析物を検知 し、定量するこきができる。

図面の簡単な説明 第１図は、本発明の装置の概略図である。

第２図は、光学システムの模式図である。

具体的実施態様の説明 蛍光分析システム及び燐光分析システムは、位置に固定した光子束を照射するこ とにより低レベルの被分析物を検知するために提供され、この場合、二辺上の別 の位置における発色団の濃度が、同じになる可能性を最小限にするように位置の 容積が選択される。したがって、本発明の方法は、主として、約０．１０Ｍ（ナ ノモル）未満、通常は約１ｐＭ　（ピコモル）未満、好ましくは約１１Ｍ（フェ ムトモル）未満の濃度のものについて測定する場合に向けられてふり、本発明の システムは、被分析物を、約１ａＭ（アトモル）未満の濃度で又はそれより低い 濃度においても検出することができる。

本発明の方法は、領域調整ルミネセンス（ＡＭＬ）と称する。ルミネセンスは、 燐光及び蛍光の両方を含むことを意図するものであり、この場合、通常は後者が 用いられる。本発明の方法は、超低濃度では、被分析物が分析試料に不均質に分 布し、これらの試料は、ベール−ランベルトの法則（Ｂｅｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ 　ｌｏｗ）に従わないことに基づくものである。斯かる試料の特性は、分析試料 の内に被分析物が殆どない又は殆ど枯渇している領域が存在することである。

均質に分布したバックグラウンドと不均質に分布した被分析物との差異を、Ａｌ ４Ｌを使用した被分析物に関する検知の限界を下げるのに利用することができる 。ＡＭＬ技術は、本質的に根本的な目的としての検知能に向けられている。この 被分析物の検知への指向が、ＡＭＬを先行技術の分光分析法と区別するものであ る。しかしながら、ＡＭＬは、測定容積及び揺動理論の知識と組合せて、被分析 物の容積濃度を決定するのに用いることができる。

本発明の方法は、測定容積において被分析物の分子数に関する大きな度合いの不 均質がある場合に、特に役立つものである。

応用止しては、例えば、分析試料内で被分析物を粒子、細胞、細胞断片、細胞小 器官等の凝集体のような小数の位置に凝集させることができる場合がある。更に 、本発明の方法は、蛍光部分が細胞等の大きな目標に結合し、未結合の蛍光部分 は溶液に残る場合にも用途を提供するものである。加えて、本発明の方法は、核 酸ストランドの検知、例えば、複数の蛍光部分を標的配列を用いるハイブリッド 形成により結合させることができる場合にも用途を提供するものである。最も独 特で有力な用途には、超低濃度で被分析物を検知することが含まれる。

本発明を理解するためには、本発明の測定の性質と、従来の吸光及び蛍光分光学 の性質との間の比較が重要であると考えられる。従来の光ルミネセンス測定では 、ルミネセンス信号は、検体によって吸収された輻射力（単位時間あたりのエネ ルギー）と比例している。何れの検体によって吸収された輻射力（光子７秒）も 、（１）検体に入射する輻射力、及び（２）光線と相互作用する吸収体（ａｂｓ ｏｒｂｅｒ）の総数によって変化する。入射する輻射力は、輻射照度（単位面積 あたりの輻射力（ｐｏｗｅｒ）　）と試料の照射面積との積に等しい。所定の照 射面積に関して、入射光と相互作用する吸収体の数は、媒体の厚さ及び吸収種（ ａｂｓｏｒｂｉｎｇｓｐｅｃｉｅｓ）によって左右される。光ルミネセンス測定 は、吸収された輻射力及びルミネセンス信号は、入射する輻射力、試料の厚さ及 び被分析物の濃度と直線的な関係にある環境下（例えば、比較的低濃度、又は短 い光路長）で行うのが通常である。

所定の検体の何れの容積要素における被分析物の分子数も、統計的な揺動を受け 、斯かる揺動の大きさは、被分析物の分子数の平方根のオーダーである。したが って、被分析物が十分な高濃度で存在している場合には、統計的な揺らぎは、媒 体が被分析物を統計的に意味のある単位体積あたりの濃度で含むかのように、媒 体を取り扱うことができるのに十分に低い率の被分析物濃度を表わす。斯かる検 体は、均質な連続体として取り扱って良い近似を得ることができる。この均質性 、並びに濃度及び光路長への従属性は、従来の吸光及び蛍光分光学の基礎となる ベール−ランベルトの吸収法則にとって必要な条件である。

技術水準の分光蛍光光度計を使用する従来の蛍光測定法及び分光蛍光法は、ミリ リットルあたり１０９〜１０８個の粒子数に相当する、１０−１２〜１０−１３ Ｍと低い被分析物の溶液内における濃度に対して検知の限界を示す。

超低濃度の被分析物を含む検体は、均質な連続体として取り扱うことはできない 。被分析物が超低濃度で存在する場合には、被分析物に由来するルミネセンス信 号は、濃度及び試料の厚さとは最早単純な関係にはない。一方、分析試料の非− 被分析成分、特に溶媒は、遥かに高い濃度で存在する。その結果、溶媒及び被分 析物よりもかなり高い濃度で存在するあらゆる共存物（ｃｏｎｃｏｍｉｎａｎｔ ）は、それらが試料中に連続的で均質に分布しているように取り扱ってよい。

ＡＭＬ技術は、照射試料面積を調節することを利用した任意の分光測定法からな る。調節は、種々の実験的態様で行うことができるが、光路長及び光子束を一定 に保つのが実験上好都合である。何れの態様においても、面積の調節に伴うルミ ネセンス出力の小さな差を測定することが秘訣である。

ルミネセンス差分信号（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｓ ｉｇｎａｌ）は、バックグラウンド信号から抽出される。散乱した光子、例えば レーリー散乱光及びラマン散乱光は、時間又は波長ドメイン技術により区別する ことができる。バックグラウンドルミネセンス光子及び散乱光子は、原理的に均 質に分布した材料から出てくるので、本発明の方法論により区別することができ る。したがって、本発明の技術において被分析物により発生した少しの差分信号 を、特に測定を反復方式で行った場合には、直接観察することができる。

照射面積を規則的に繰返して調節し、それにより、立体位置にふける変化を伴い つつ、又は伴わずに輻射照度を変化させると、非常に少しの信号でも識別するこ とができる。本発明における信号を直接観察することができるようにするために は、その信号は、バックグラウンド信号の揺らぎよりもかなり大きくなくてはな らない。反復システムを採用することにより、被分析物とバックグラウンドから の信号は、平均してバックグラウンドだけの信号の平均よりもほんの少しだけ高 いだけでよい。

必要な増加の程度は、観察するために行うサイクル数による。

斯かる技術、例えば、ゲート集積軸ａｔｅｄ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）技術、 光子計数、自己相関、及び同時検知（ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ　ｄｅｔｅｃｔｉ ｏｎ）を、大きなバックグラウンドの分担からの少しの規則的な変化を抽出する ために、単独で又は組合せて使用することができる。

米国特許′ｉｌ！Ｊ４．４０７．９６４号参照。

如何なる論理的な分析にもしばられることを意図するものではないが、ＡＭＬの 全ての態様の基礎になる測定の理論は、簡単な形式化により理解することができ る。秒あたりＮ個の光子が、通常一定した波長で、断面積が八で奥行（光路長） がｄの検知容積Ｖに入射（照射）する（理想化された）実験的な状況を考える。

ここで、Ｎ１光子の東の数、に光子のエネルギーを乗じると、入射する光線の輻 射力になることに留意する。光子のエネルギーが確定すると、光子の東及び輻射 力は、記述の原理的な枠組みを変更することなく交換可能に使用することができ る。

ｎを、Ｖに含まれる所定の分子種の数で、入射光と相互作用することができるも のとする。ルミネセンスの有効断面を、相互作用する分子あたりσとする（ここ で、σは、吸収に関する分子断面と、ルミネセンス光子の再放射に関する分子断 面との積を表わす）。次いで、有効総合相互作用断面が、ｎ個の相互作用分子の 断面の合計、即ち、積：ｎｘσにより与えられる。そして、ルミネセンス光子の 期待される数７秒であるしか、以下のように与えらえる。

ここで、分数項は単に有効相互作用断面ｎσと幾何学的断面積へとの比である。

（上述のＬとＮとの間の比例関係は、入射する光子東二Ｎが「不飽和（ｎｏｎ− ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ）　Ｊであり、相互作用する分子種の母集団が一定、即ち 、枯渇していないということを必ずしも意味しないことに留意する。）ＡＭＬ技 術は、面積を調節することを伴うため、光子束：Ｎは一定に保持されているが、 変化するＡのしに及ぼす影響を検査する。

面積は、固定点の周りの照射領域の大きさを変化させること、又は大きさを固定 した照射領域の位置を変化させること、或いはその両方により調節することがで きる。しかし、サンプルの奥行ｄは、固定させておく。眠次いでＬへの影響を検 査する。

一般に、ｎ−ρＶであり、ここでρは相互作用する分子種の密度（単位体積あた りの数）である。ρが固定されている（定数）場合には、均質に分布した分子種 の場合のように、以下のとおこの結果は、照射面積Ａは、割算してしに関する式 から消える、即ち、ρが固定されている場合には如何なる分子種についても、Ｌ は面積とともに（又は、光路長ｄが一定ならば、体積とともに）変化しないとい うことである。このことは、ルミネセンス信号は、分析検体に均質に分布した如 何なる分子種に関しても、照射面積の変化にともない変化しないことを意味する 。

より一般的には、ρが固定されていない場合には、即ち、相互作用する分子種が 均質に分布していないと仮定した場合には、ｎは必ずしも体積と比例して変化し ない。この場合、ＶがＶｏになると、ｎ＝ｐＶ＝ｐＡｄは、ｎ”＝ｐ”Ｖ’＝ｐ ”Ａ’ｄへと変化する。

すると、（ｉ）から以下が導かれる。

差分信号：ΔＬは、等式（１１）から等式（ｉｉｉ）を引くことにより得られ、 以下が導かれる。

ΔＬ＝Ｌ’　−Ｌ＝　Ｃ９”　−ρ）　ｔｙｄ−Ｎ　（ｉｖ）ρ′＝ρでさえあ れば、即ち、Ｖｏにおける相互作用する分子種の密度（単位体積あたりの数）が 、Ｖにおける分子種密度と同じであれば、即ち、分子種が、均質に分布している 場合には、ΔＬ＝０であることが分る。そうでない場合、不均質に分布した分子 種については、即ち、ρ”がρと等しくない場合には、ΔＬはＯに等しくない。

即ち、ρ＝ρ（Ｖ）であれば、ΔＬは０に等しくはなく、面積：体積／ｄを調節 すると、０でない差分信号が発生する。

Ａは、平方センナメートルで表わし、量：Ｎ／Ａは、−秒についての平方センナ メートルあたりの光子で表わす輻射照度を示すことに留意する。したがって、一 定の輻射力にあける面積の調節は、輻射照度の変化に相当する。ＡＭＬのこの特 定の実施態様は、特にルミネセンスが蛍光の場合には、示差輻射照度蛍光測定法 （Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ｉｒｒａｄｉａｎｃｅ　Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ （ＤＩＰ＞）と呼ぶことができる。ＤＩＦは、照射光学装置が、測定の間に変化 するサンプルの輻射照度を生じさせるように設計されている点で新規である。

先の説明は、実証的で実験的に好都合であるが、限定をするものと考慮すべきで ない成る特徴を含んでいる。例えば、光子束：Ｎ１又はサンプルの厚さｄ等の実 験パラメーターを、一定に保持する代りに、回転マスクシステム又はクサビ形の サンプルの場合のように、適正な規格化（ｎｏｒｍａ　１１ｚａｔ　１ｏｎ）で 変化させることのできる実施態様を考えることができる。

以上に注釈したように、先の分析は、成る「特別な」場合を説明するのには修正 を行う必要がある。このような場合の一つには、照射光子束が、相互作用する分 子種のルミネセンスを吸収及び放射する能力を「飽和」させるのに十分な場合が ある。

基底状態の母集団が、入射光子が増加してもそれ以上にはルミネセンスが増加し ない点に達する状態になった時に飽和状態ができる。この状態で、飽和した分子 種からのルミネセンス：　Ｌｓａｔは、入射輻射照度には従属せず、飽和した分 子の数：ｎ５ａｔに単純に比例する。即ち、Ｎσ／Ａは事実上、ルミネセンスに よる分子の不活性化の速度定数（秒−１）である定数二ｋになる。これらの状況 下では、以下が成立する。

Ｌｓａｔ＝ｋｎｓａｔ％　Ｌ’５ａｔ＝ｋｎ’ｓａｔ、及びΔＬ＝　ｋ　（ｎ’ 　５ａｔ−ｎｓａｔ）（Ｖ） 斯くして、飽和状態下では、信号の差に影響する唯一の事象は、相互作用する分 子の数の変化である。

等式（ｉ）乃至（１ｖ）をもたらした分析に潜む他の仮定は、如何なる所定の実 験条件の設定下においても、ルミネセンスを生じさせる分子の数は一定している ということである。実際上、ルミネセンスを発する分子の母集団は、光分解を通 じて枯渇すると考えられる。典型的な発蛍光団の光分解量子収率は、約１Ｏ−５ であることが示されている（マチス及びストライヤー、生体医科学における蛍光 の用途、１９８６年、１２９〜１４０頁（Ｍａｔｈｉｓ　ａｎｄＳｔｒｙｅｒ、 Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ！１ｓ　ｏｆ　ＦｌｕｏｒｅＳｃｅｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ 　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、１９８６、ｐｐ、１２９−１４０） ）　。即ち、斯かる発蛍光団（ｆｌｕｏｒ）は、分解するまでに平均的１０５の 光子を放射し続ける。その結果、ルミネセンスを生じさせる分子の数は、指数的 に減少する。

この母集団の減少は、実際の測定に関する入射する輻射力又は期間（或いはその 両方）を制限する。実際、発蛍光団の光分解は、総ルミネセンス出力及びＡＭＬ 測定の信頼度を根本的に抑制する。

本発明の方法論によれば、通常は単色である光源は、サンプルに向う光路が調節 される。光源のエネルギーは、検知期間の間に測定する発色団（発蛍光団又は燐 光体）の著しい光分解をもたらすこともありもたらさないこともある。光源は、 照射線を当てる断面積を変化させることにより、望ましくは、それとともに光が サンプルに当る位置を変えることにより調節する。

二辺上の態様で、サンプルの照射が測定の間に繰返される。サイクルの数が多い ほど、検知できる信号が小さくなる。サイクルの総数は、１回と少なくてもよい が、通常は少なくとも１００、普通１０００〜１０６の範囲である。斯くして、 照射領域を、交互に拡張又は縮小しすることができ、ある位置から別の位置へと 移動させるのが望ましい。照射する領域を変化させる場合に、光子の東は、一定 の侭であるか又は規格化されるため、理想的に発生する信号は、二つ照射位置の 間の単位体積当りの発光部分の数における差に関してのみ変化する。

光の放射を誘発するため、入射光線は、サンプル内に存在する発光部分を励起す るように選択される。サンプルから放射された光は、集められて検知システムに 送られ、検知システムは、各測定位置からの信号を交互に受ける。

照射の期間は、一般に約１０マイクロ秒〜２０ミリ秒、通常は５０マイクロ秒〜 １０ミリ秒の範囲であり、ここで周期数は、一般に約１０〜１２００サイクル／ 分である。サンプルの一回の（ｓｉｎｇｌｅ）測定の総合時間は、一般に約０． ０１〜２分である。同じ中心を包含する二つの照射領域の断面積比は、被分析物 の濃度によって変化し、一般に約Ｉ＋ｉｏ、ｏｏｏの範囲である。照射される体 積は、一般に１マイクロリツトル〜１ミリリツトルの範囲である。

励起光に関して種々の光源を使用するこさができる。単色光光源の例には、レー ザー、フィルタードブロードスペクトルランプ（ｆｉｌｔｅｒｅｄ　ｂｒｏａｄ 　ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ｌａｍｐｓ）、又はランプモノクロメータシステムがある 。便利なレーザー光源が、４８８ｎｍ又は５１４ｎｍで作動する２０ｍＷの連続 波ライン出力（ＣＷ　１ｉｎｅ　ｏｕｔｐｕｔ）、或いは更に長い波長で輻射す るレーザーとして例示される。

輻射照度を調節するため、光源、サンプル又はレンズシステムを移動させること により、回転ディスクでマスギングすることにより、或いは、ソースビームを交 互に断続的にサンプルの成る位置（又は、複数の位置）に当てること（ｐｏｓｉ ｔｉｏｎｉｎｇ）により、光ビームの焦点をサンプルにおいて変えることができ る。

光ビームの位置、及びサンプルの照射位置を変えるため、種々の技術を用いるこ とができる。

放射光を測定するため、識別高効率収集検知システム（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔ ｉｎｇ、ｈｉｇｈ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｄｅｔｅｃ ｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ）が使用される。このシステムには、レーリー及びラマ ン光子に対して最も良く識別を行う一方、放射された輻射線の大きな立体角を収 集し、高量子収率光電検出器を使用するあらゆるシステムが含まれる。被分析物 から信号を抽出する手段は、被分析物からの信号とバックグラウンド信号レベル との単純比較、又はゲート集積、同時検知、自己相関、比較光子計数又はこれら の技術の組合せ等の時間相関を使用する手段でよい。

放射された光子は、所定の時間をかけて数え、各測定に関する各々の位置におけ る単位時間当りの光子束を得ることができる。

本発明の方法は、発光信号を与えることのできる被分析物について、通常は標識 し声共約物（ｃｏｎ　ｊｕｇａｔｅ）とともに、使用することができる。蛍光に 関しては、発蛍光団が、少なくとも約１０４、好ましくは少なくとも約１０５、 より好ましくは１０６の高いモル吸光係数（ｃ＋ｎ−Ｍ）−１を有することが望 ましい。単一の凝集体又は粒子として存在する蛍光分子の数は、少なくきもｌ、 通常は少なくとも５、より一般的には少なくとも１０で、１００以上のこともあ るが、通常は５００を越えず、より一般には２００を越えず、約１〜１００、よ り一般的には５〜７５であることが望ましい。広い種類の蛍光発色団を利用する ことができ、その中には、フルオレシン；ローダミン；フィコエリトリン等のフ ィコビリ蛋白質（ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎｓ）　；ウンベリフ、ｏン ；ユウロピウム、ガドリニウム等の遷移金属キレート等がある。

被分析物が、自然には蛍光性ではない場合には、様々な方法で蛍光性にすること ができる。被分析物に結合することのできる種々の配位子又は受容体が結合した 蛍光粒子を用いることができる（米国特許第３．８５３．９８７号及び第４．３ １１８．７０７号）。例えば、このプロトコールは、被分析物を斯かる粒子に結 合させ、しかる後、蛍光粒子が被分析物のアフィニテイ力ラム、マルチウェルプ レート（ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ）の壁等の容器の壁に結合した被分析 物等に結合するのを阻害する。細胞が、意図するものである場合には、表面膜蛋 白質又は細胞表面の糖に対して特異的な蛍光標識抗体を使用することができる。

ある場合には、発光部分を細胞に導入する条件を使用することができ、この場合 には、発光部分は、発光部分を細胞内に維持する反応、又は非発光反応体を発光 生成物に変える反応を受ける。所望であれば、細胞はルミネセンス共役受容体か ら遠心分離、洗浄、及び再分散により容易に分離することができる。しかしなが ら、ルミ不センス標識受容体は、媒体に均質に分散するので、ルミネセンス標識 受容体共役物を含６サンプル媒体を用いれば十分であり、これは、未錯化（ｕｎ ｃｏｎ＋ｐ　１ｅｘｅｄ）受容体共役物のルミネセンス信号に対する如何なる影 響もバックグラウンドの部分として差引くことができるからである。本発明にし たがい、ハブテン；抗原；受容体：ウィルス、バクテリア細胞、原生生物、菌類 、を椎動物又は無を椎動物からの細胞等の凝集体；その他を含む広範な種類の被 分析物を測定することができる。種々の配位子及。

び受容体の一覧が、米国特許第４．２３３．４０２号に見出せる。受容体として 特に有益なのが、モノクローナル又はポリクローナル抗体であり、モノクローナ ル抗体が好ましい。

被分析物の性質により、種々のプロトコールを採用することができる。例えば、 特定の細胞種が血液中に存在するか否かを決定しようと欲する場合には、蛍光共 役抗体を血液に加えることができる。所望であり、標的細胞の濃度が許容するの であれば、サンプルを希釈して赤血球吸収を緩和することができ、その他、最初 に赤血球を取り除いて血英又は血清を使用することができる。

発蛍光団の不均質性が得られる場合には、体積の大きさを決定するのに種々の技 術を使用することができる。被分析物の期待される濃度範囲と、検知する発光部 分の吸光度がわかる止、測定する体積が計算できる。適当なレンズを用いること により、サンプルとレンズの間の距離を修正して、焦点及び照射する体積を変え ることができる。薄いフィルム又は毛細管のサンプルを使用することができる。

薄いフィルムを使用することにより、又は表面への結合を与えることにより、内 部全反射を用いるシステムを使用するこ々ができる。このシステムでは、励起光 が、サンプル容器の反対側の面を鋭角で照して全反射し、それにより表面の極く 近傍の発蛍光団のみが励起され、蛍光を発する。

大抵の場合、光はサンプルの側方又は上方から導入される。

サンプルの体積は、通常約１０〜５００マイクロリツトル、より一般的には約１ ５〜５０マイクロ？Ｊツトルである。サンプルは、ドロップ（ｄｒｏｐ）、薄い フィルム、浅い皿に収容された容積形態（ｖｏｌｕｍｅ）等でよい。サンプルの 奥行は、一般に約１マイクロメートル〜１センチメートルである。サンプルは、 固定サンプルでも流動（ｆｌｏｗｉｎｇ）サンプルでもよいが、固定サンプルが 好ましい。

一般的な計器設計には、通常、単色光光源が含まれ、この光源は、輻射照度を調 節する手段に光を送り、光はこの調節手段からサンプル材料へと送られる。励起 ソースからの反射光は、通常ビームダンプに送られる。発蛍光体からの放射光は 高効率収集装置に集められ、適当なフィルタを通過して検知システムへき進み、 このシステムは、バックグラウンドの土のルミネセンス信号の存在を検知するた め、順次、信号をデータ処理装置に供給する。

模式的な装置が、第１図に描かれている。レーザー１が、励起ソースとして使用 されている。レーザー出力は、ビームデフィニション光学素子（ｂｅａｍ　ｄｅ ｆｉｎｉｔｉｏｎ　ｏｐｔｉｃ）　２通って光路を通過し、この光学素子は、サ ンプル保持要素３にレーザーの焦点を合わせる。薄い切片のサンプルが、サンプ ル保持要素に据えられる。ルミネセンス輻射線は、楕円体状の鏡４によって集め られ、フィルター５を通過して電源７で作動する検知器６へと進む。検知器出力 は、）言号処理／制御電子装置９により記録される前に、増幅器／弁別器回路８ によって処理される。Ｆ及びＦ゛は、楕円体状の鏡の二つの焦点である。

個々の実施態様について論述する。励起ソースは、通常単色のものであり、適当 な波長の範囲と、効率的にルミネセンスを励起させるのに十分強いパワーを有し ている。典型的なソースは、４８８釦又は５１４ｎｍで作動するアルゴンイオン レーザ−である。

ビームデフィニション光学素子の模式図が、第２図に描かれている。平行になっ たソースビームを、レンズＬ１によりピンホールＰ１の面に焦点合わせする。こ れらの構成部品は、空間フィルタ止して作用して迷光を減らし、ビームの質を改 善する。レンズＬ２は、ビームを平行にする。レンズし３は、ビームがサンプル に到達する際のビームの性質を決定する。レンズは、圧電又はステッパモーター 駆動ステージ等のＸＹＺステージに据える。

可動レンズが、ソースビームにより照射されるサンプルの領域を、照射領域の大 きさと照射領域の中心の二つの面において、変えることを可能にする。

その他、容易に焦点距離を変化させて照射する領域を変えることのできる液体レ ンズを使用してもよい。この技術は、循環（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ）ディスク のいろいろなレンズを使用して、位置及び／又は断面積を順次変化させることが できる。

集光素子は、楕円体状の鏡であるのが好都合であり、この鏡は、励起光線の導入 及び励起のための適当な開口を有する楕円体であるのが良い。楕円体状集光素子 は、サンプルの照射領域が、楕円の焦点のうちの一つにあるように設けるのがよ い。励起ビームは、小さな孔を通って楕円体状の境内に入る。出口は、楕円のも う一方の焦点に中心がある。この光学素子を比較的大きくシ（少なくとも楕円の 半分）、照射するサンプルの領域と、出口とを楕円体状の面の焦点に配置するこ とにより、ルミネセンスの大部分を収集することができる。

サンプル保持要素は、顕微鏡のスライド又は浅い皿等のサンプルを保持する平坦 な面でよい。サンプルは、サンプルが約１ｃｍ２　（又はそれ未満）の面積を占 めるようにし、しかもサンプルの深さが固定されるようにスライドに載せる。ス ライドガラスの表面は、特にサンプルを二度通過することが好都合であることが わかっている場合には、金等の反射性金属で被覆することができる。これを行わ ない場合には、サンプル保持要素の後にビームダンプを設置する。サンプル保持 要素は、先に説明したように、必要であれば、ＸＹＺ並進（ｔｒａｎｓｌａｔ　 １ｏｎ）システムに設けてサンプルの異なる領域の照射を行うことができる。ビ ームがサンプルを通って反射して戻ってくる実施態様においては、楕円体状の鏡 は、反射したビーム用の出口が備っている。

出口／フィルタアセンブリは、楕円体の焦点のうちの一つに中心がある丸い孔と 、一連のフィルタからなる。出口は、フィルタアセンブリ及び検知器６を収容す るハウジングへの唯一の入口である。このことは、サンプルの照射領域で生じた 輻射線のみが検知器に達することを確実にするものである。フィルタアセンブリ は、レーリー及びラマン散乱に対して弁別を行うようになっている一連のカット オフフィルタ及び帯域通過フィルタである。例示のフィルタは、オリエル（Ｏｒ ｉｅｌ）５３９５０型帯域通過フィルタ及びオリエル５７８８１型ロングパスフ イル９　（ｌｏｎｇ　ｐａｓｓ　ｆｉｌｔｅｒ）である。

検知器は、通常、真向式（ｅｎｄ−ｏｎ）光電子増倍管（ＰＵＴ）又は光ダイオ ードである。ＰＭＴは、高い収集効率がルミネセンスを楕円の第二の焦点に正確 に焦点を合わせることに左右されないように、通常大きな光電陰極を有している 。ＰＩＴには、好適な高電圧電源７により動力を供給するこ止ができ、ＰＭＴは 、光子計数モードで作動する。ＰＵＴの暗流の影響を減らすため、冷却したハウ ジングを用いることもできる。

増幅器／弁別器８は、ＰＭＴの出力を受け、この出力を処理する。これらの回路 は、ありふれたものであり、Ｓ、１．／マクファーソン＜ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ） 　７７０１型光子計数システム又はハママッ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）　Ｃ１２３ ０型増幅器／弁別器付き光子計数器により例示されるものである。

信号処理／制御電子システム９は、幾つかの重要な構成部品を有している。シス テム全体は、ソフトウェアを介して、計測器の機能を制御しデータを収集するマ イクロプロセッサにより制御される。増幅器／弁別器回路の出力は、コンピュー タに操作されるゲートカウンターに受取られる。カウンターに集められたデータ は、後に処理するため記憶される。マイクロプロセッサは、更に、可動光学素子 （Ｌ３）、並びに、適当であれば、サンプル保持要素、又は励起光路の他の構成 部品も制御する。この装置を用いて、ソフトウェアを介し、一箇所が採用されて いるか、複数箇所が採用されているかく斯かる箇所は広げたり、狭めたりされる ）等、どの方法が望ましいかにより、測定方法を選択することができる。

本発明の装置は、内部制御系を備え、光源及び保護システムが、はぼ一定の信号 を与えることを更に確かなものとするが、最初のビームは、分割されＰＵＴに伝 送される。このようにして、チョッパーを用いることにより、サンプルからの信 号と制御系からの信号を交互にして装置について一定の値を維持することができ る。装置における揺らぎに基づく修正を与えるのに種々の技術が用いられている 。例えば、米国特許第４．７５０．８３７号を、先に示した他の特許とともに参 照。

本発明は、極めて低い濃度レベルにおいて発光部分の存在を正確に測定するため の新規な技術を提供するものである。媒体の不均質性を利用することにより、い ろいろなレベルの発光部分を有する可能性を有するサンプル（ｓａｍｐｌｅ　ｖ ｏｌｕｍｅｓ）を照射することができる。二つの結果を引算することにより、測 定に用いた装置並びに散乱光又は媒体における発光部分における変化も差引きし てしまう。このようにして、第一の位置から第二の位置へと照射を循環させるこ とにより、共通の中心の周りに拡張したり収縮したりして、多数の結果を得るこ とができ、この結果は、信号のほんの少しの変化を、比較的多量のバックグラウ ンドノイズの存在下に検知することができるように、平均してもよい。この技術 は、ナノモルよりも相当低い濃度で存在する被分析物を検知しようとするあらゆ るシステムにおける用途を提供するものである。

本明細書において引用された全ての刊行物及び特許出願は、あたかも個々の刊行 物又は特許出願が、具体的に個別的に参照することにより組込まれるように、参 照することにより本明細書に組込まれている。

前記において、本発明は、理解を明瞭にするための説明及び例としである程度詳 細に説明したが、本発明の教示に照して、添付の請求の範囲の精神から逸脱する ことなく変更及び修飾を施すことが可能であることが、当業者には明らかであろ う。

ＦＩＧ、　１ ＦＩＧ、　２ａ ＦＩＧ、２ｂ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） ３．１１．１９ 平成　年　月　日 ３、特許出願人 名　称　アクロジエン　インコーホレイテッド６、添付書類の目録 （１）翻訳書第２頁第１０行ないし第３頁第２１行を以下の通り低レベルのルミ ネセンスを検知する計測器及び方法が提供される。このシステムは、通常一定の 深さのサンプル内の二つの異なる位置への一定の入射輻射力を使用することによ るものであり、このシステムにおいては、二つの位置の検知をしている間に光放 射の同じ濃度を見出す可能性が少ない。反復して測定し、平均することが可能で ある。照射位置の大きさ及び場所を変えるため、種々の技術が用いられる。二つ の位置からの情報を処理することにより、小数の被分析物を検知し、定量するこ 第１図は、本発明の装置の概略図である。

第２ａ図及び第２ｂ図は、それぞれ光システム及び光学システムの模式図である 。

具体的実施態様の説明 蛍光分析システム及び燐光分析システムは、位置に固定した光子東を照射するこ とにより低レベルの被分析物を検知するために提催され、この場合、二辺上の別 の位置における発色団の１度が、同じになる可能性を最小限にするように位置の 容積が選択される。したがって、本発明の方法は、主として、約０．１ｎＭ（ナ ノモル）未満、通常は約１ｐＭ（ピコモル）未満、好ましくは約１ｆＭ（フェム トモル）未満の濃度のものについて測定する場合に向けられており、本発明のシ ステムは、被分析物を、約１ａＭ　（アトモル）未満の濃度で又はそれより低い 濃度においても検出することができる。」 （２）翻訳書第１５頁第１０行ないし第１６頁第１２行を以下の通り訂正する。

「　一般的な計器設計には、通常、単色光光源が含まれ、この光源は、輻射照度 を調節する手段に光を送り、光はこの調節手段からサンプル材料へと送られる。

励起ソースからの反射光は、通常ビームダンプに送られる。発蛍光体からの放射 光は高効率収集装置に集められ、適当なフィルタを通過して検知システムへと進 み、このシステムは、バックグラウンドの上のルミネセンス信号の存在を検知す るため、順次、信号をデータ処理装置に供給する。

模式的な装置が、第１図に描かれている。レーザー１が、励起ソースとして使用 されている。レーザー出力は、ビームデフィニション光学素子（ｂｅａｍ　ｄｅ ｆｉｎｉｔｉｏｎ　ｏｐｔｉｃ）　２通って光路を通過し、この光学素子は、サ ンプル保持要素３にレーザーの焦点を合わせる。薄い切片のサンプルが、サンプ ル保持要素に据えられる。ルミネセンス輻射線は、楕円体状の鏡４によって集め られ、フィルター５を通過して電源７で作動する検知器６へと進む。検知器出力 は、信号処理／制御電子装置９により記録される前に、増幅器／弁別器回路８に よって処理される。Ｆ及びＦ゛は、楕円体状の鏡の二つの焦点である。

個々の実施態様について論述する。励起ソースは、通常単色のものであり、適当 な波長の範囲と、効率的にルミネセンスを励起させるのに十分強いパワーを有し ている。典型的なソースは、４８８ｎｍ又は５１４ｎｍで作動するアルゴンイオ ンレーザ−である。

第２ａ図は、本発明に関する光路を描くものである。

レーザー１０が、光源として使用され、光は、光路１２に沿って鏡１４へと伝送 される。鏡１４は、矢印１６で示す水平軸に沿って回転する。光は、鏡１４によ って、矢印２０により示す垂直軸の回りに回転することのできる鏡１８へと反射 される。

光線路２２は、鏡２０から反射された後、合焦レンズ２２を通過する。この合焦 レンズは、第２ｂ図に更に詳細に描かれ、サンプル２６への光路２４に沿って存 在している。

ビームデフィニション光学素子の模式図が、第２ｂ図に描かれている。平行にな ったソースビームを、レンズＬ１によりピンホールＰ１の面に焦点合わせする。

これらの構成部品は、空間フィルタとして作用して迷光を減らし、ビームの質を 改善する。

レンズＬ２は、ビームを平行にする。レンズＬ３は、ビームがサンプルに到達す る際のビームの性質を決定する。レンズは、圧電又はステッパモー」 （３）翻訳書第２３頁第１６行ないし第２６行を以下の通り訂正する。

［１６，前記装置が、前記交互の照射を繰返して前記領域各々からの放射光を平 均するだめの手段を更に備えていることを特徴とする請求項１４記載の装置。

１７、前記放射光検知手段が、楕円体状の鏡を備え、前記サンプルセルが、前記 楕円体状の鏡の一つの焦点にあることを特徴とする請求項１４記載の装置。

１８、前記比較をするための手段が、増幅器／弁別器回路、及び前記増幅器／弁 別器回路からの信号を受けて交互に照射を行うための手段を制御する処理／制御 電子要素を備えている。

１９、前記装置が、前記具なる体積に関する前記交互の照射からの信号における 揺らぎを測定するための手段と、前記揺らぎの差により前記サンプルにおける光 放射源の濃度を決定するための手段とを備えていることを特徴とする請求項１４ 記載の装置。」 （４）翻訳書の第２図を別紙の通り訂正する。

ＦＩＧ、　２ 国際調査報告

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．ルミネセンス標識を用いたサンプルにおける被分析物の存在を測定する方法 において、検定媒体の体積の異なる少なくとも二つの異なる領域を照射し、被分 析物の量に関する発光部分の数が、前記領域に不均質に分布していおり、前記方 法が、前記サンプルにおける被分析物の量に関する量で存在する発光部分を含む 前記検定媒体の前記少なくとも二つの異なる体積を順次照射することであって、 所定の波長分布に関して、前記体積の各々において一定の輻射力又は一定の光子 束であり、前記体積の差異以外は同じ条件下で前記照射を行うことと、前記体積 から放射された光を検知し、前記体積各々からの光放射の差を測定することを含 み、 前記差が前記サンプルにおける被分析物の存在に関連している ことを特徴とする方法。
2. ２．前記異なる体積の前記照射及び前記検知を反復して前記体積各々に関して複 数の値を得、更に、前記体積の各々からの光放射の差を測定して前記差を平均す る追加の工程、又は前記体積各々からの光放射を平均して前記平均値の差を決定 する追加の工程を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
3. ３．前記発光部分が、蛍光粒子、或いは細胞又は細胞の蛋白質であることを特徴 とする請求項１記載の方法。
4. ４．前記体積が、重複領域を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
5. ５．前記体積が、共通の中心を共有していることを特徴とする請求項１記載の方 法。
6. ６．少なくとも四つの体積を照射し、体積の対が重複領域を有することを特徴と する請求項１記載の方法。
7. ７．前記体積が非重複領域を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
8. ８．前記体積が、一定の厚さのものであることを特徴とする請求項１記載の方法 。
9. ９．ルミネセンス標識を用いたサンプルにおける被分析物の存在を測定する方法 において、検定媒体の体積の異なる少なくとも二つの異なる領域を照射し、被分 析物の量に関する発光部分の数が、前記領域に不均質に分布していおり、前記方 法が、検定媒体において、前記サンプルを、前記被分析物の複数の部位に結合す ることのできる蛍光標識した共役体と結合させることと、 前記サンプルにおける被分析物の量に関する量で存在する発光部分を含む前記検 定媒体の前記少なくとも二つの異なる体積を順次照射することであって、所定の 波長分布に関して、前記体積の各々において一定の輻射力又は一定の光子束であ り、前記体積の差異以外は同じ条件下で、前記体積の一部が重複している前記照 射を行うことと、 前記体積から放射された光を検知し、前記体積各々からの光放射の差を測定する ことを含み、 前記差が前記サンプルにおける被分析物の存在に関連している ことを特徴とする方法。
10. １０．前記異なる体積の前記照射及び前記検知を反復して前記体積各々に関して 複数の値を得、更に、前記体積の各々からの光放射の差を測定して前記差を平均 する追加の工程、又は前記体積各々からの光放射を平均して前記平均値の差を決 定する追加の工程を含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
11. １１．前記サンプルにおける被分析物の濃度測定に、前記体積の各々に関するル ミネセンス信号を、前記体積の大きさとともに用いることを特徴とする請求項１ ０記載の方法。
12. １２．ルミネセンス標識を用いたサンプルにおける被分析物の存在を測定する方 法において、検定媒体の体積の異なる少なくとも二つの異なる領域を照射し、被 分析物の量に関する発光部分の数が、前記領域に不均質に分布していおり、前記 方法が、前記サンプルに存在する被分析物の量に関連する発光部分としての凝集 体の生成を引き起こす又は抑制するため、検定媒体において、被分析物の存在下 又は不存在下に凝集することのできる蛍光粒子を、前記サンプルと結合させるこ とと、前記サンプルにおける被分析物の量に関する量で存在する発光部分を含む 前記検定媒体の前記少なくとも二つの異なる体積を順次照射することであって、 所定の波長分布に関して、前記体積の各々において一定の輻射力又は一定の光子 束であり、前記体積の差異以外は同じ条件下で前記照射を行うことと、前記体積 から放射された光を検知し、前記体積各々からの光放射の差を測定することを含 み、 前記差が前記サンプルにおける被分析物の存在に関連している ことを特徴とする方法。
13. １３．前記異なる体積の前記照射及び前記検知を反復して前記体積各々に関して 複数の値を得、更に、前記体積の各々からの光放射の差を測定して前記差を平均 する追加の工程、又は前記体積各々からの光放射を平均して前記平均値の差を決 定する追加の工程を含むことを特徴とする請求項１２記載の方法。
14. １４．一定の輻射力又は光子束の励起光を、サンプル用に選択した一つの又は複 数の波長で前記サンプルに投射する励起光学システムと、 前記サンプル用のサンプルセルと、 異なる体積を有する前記サンプルの異なる領域を交互に照射する手段と、 放射された光を検知する放射光検知手段と、異なる体積の前記領域からの放射光 における差を比較するための手段とを、備えていることを特徴とする装置。
15. １５．前記励起光学システムが、前記励起光を前記サンプルに焦点合わせをする ためのレンズを備え、前記交互に照射を行う手段が、前記サンプルセルと前記レ ンズとの間の距離を変えるための手段を備えていることを特徴とする請求項１４ 記載の装置。
16. １６．前記交互に照射を行う手段が、回転マスクのシステムを備えていることを 特徴とする請求項１４記載の装置。
17. １７．前記装置が、前記交互の照射を繰返して前記領域各々からの放射光を平均 するための手段を更に備えていることを特徴とする請求項１４記載の装置。
18. １８．前記放射光検知手段が、楕円体状の鏡を備え、前記サンプルセルが、前記 楕円体状の鏡の一つの焦点にあることを特徴とする請求項１４記載の装置。
19. １９．前記比較をするための手段が、増幅器／弁別器回路、及び前記増幅器／弁 別器回路からの信号を受けて交互に照射を行うための手段を制御する処理／制御 電子要素を備えている。
20. ２０．前記装置が、前記異なる体積に関する前記交互の照射からの信号における 揺らぎを測定するための手段と、前記揺らぎの差により前記サンプルにおける光 放射源の濃度を決定するための手段とを備えていることを特徴とする請求項１４ 記載の装置。