KR20030079577A

KR20030079577A - 레이저 유발 표면형광 검출 장치

Info

Publication number: KR20030079577A
Application number: KR1020020018728A
Authority: KR
Inventors: 남기봉
Original assignee: 바이오메드포토닉스 주식회사
Priority date: 2002-04-04
Filing date: 2002-04-04
Publication date: 2003-10-10
Also published as: WO2003085387A1; AU2003219577A1; KR100483706B1

Abstract

본 발명은 레이저 유발 표면형광 검출 장치에 관한 것으로, 생체시료가 배열되는 시료기판으로 투명 또는 반투명 재질의 기판을 사용하고, 시료에서 반사되는 형광과 입사광의 산란광을 집속하는 반사경을 구비하며, 상기 시료를 투과하는 광을 포집하는 집광수단과, 상기 반사경에 의해 반사된 광 및/또는 집광수단에서 출력되는 광에서 노이즈(noise)를 제거하는 기능을 갖는 공간필터와, 공간필터를 통과한 광을 평행광으로 전환하는 평행광학계와, 평행광학계를 통과한 광 중에서 순수한 형광성분을 추출하는 형광필터 및 형광필터에서 출력되는 광을 전기신호로 변환하는 광검출기를 포함하여 시료를 투과하는 빛을 시료측으로 궤환시키는 광 궤환수단을 더 구비함으로써 시료를 투과하는 여기광을 재활용함으로써 발광 포집 효율을 향상시키도록 한 것이다.

Description

레이저 유발 표면형광 검출 장치{A Apparatus for the Detection of Laser-induced Epifluoresecne}

본 발명은 일반적으로 레이저-유도된 형광(fluorescence)의 검출 방법 및 장치에 관한 것으로, 보다 자세하게는 생체시료가 부착된 투명 또는 반투명 재질의 기판 표면에 부착된 형광체에 레이저나 적절한 파장의 빛을 조사할 때 나오는 형광을 타원반사경 또는 구면반사경 또는 원통형 반사경을 이용하여 포집함과 아울러 생체시료를 투과하는 빛을 포집하여 형광을 검출하는 방법 및 장치에 관한 것이다.

현재 DNA 칩 또는 멤브레인을 이용한 단백질 칩에 대해 형광을 검출하는 방법으로는 레이저 유발 형광 검출법(laser-induced fluorescence detection)이 대표적으로 이용되고 있다. 레이저 유발 형광 검출법은 형광물질이 흡수하는 파장의 들뜸 광원으로 레이저를 사용하여 형광물질을 여기 상태(excited state)로 만들고 다시 바닥 상태(ground state)로 이동되면서 나오는 형광의 세기를 측정하는 것이며 각 형광의 세기로부터 농도를 알 수 있다. 이러한 방법으로 DNA 또는 단백질 시료에 형광물질을 붙여 정량 분석을 할 수 있다.

레이저 유발 형광 검출법을 이용하여 형광을 검출하는 장치중에서 가장 많이 사용되는 것은 공초점 레이저 주사 장치(confocal laser scanning system)이다. 이 장치는 레이저를 광원으로 이용하고 표본으로부터 발산된 형광 신호를 별도의 특수 검출기인 광증배관(photomultiplier tube)로 받아들인 후 디지털 영상으로 변환시키는 것이다.

즉, 도 1에 도시한 바와 같이, 공초점 레이저 주사 장치에서는 레이저 광원(11)을 사용하여 표본에 표지한 형광물질에 적합한 파장대의 빛만을 조사(excitation)하여 형광의 발광(emission)을 유도한다. 수10 마이크로 미터 크기의 면적에서 발광한 형광은 최종적으로는 광검출기(17) 앞에 위치한 공간필터(pinhole)(16)를 통하면서 형광점에서 발광한 형광만이 검출 될 수 있도록 구성되어 있다. 미설명 부호 (12)는 입사광용 공간필터, (14)는 대물렌즈, (15)는 시료이다.

이러한 공초점 레이저 스캐닝 장치는 표본 제작시에 적당한 두께의 커버 글라스를 사용하고, 적합한 대물렌즈를 선택하며, 마운팅 매질(mounting medium)의 올바른 선택 등을 요구하는 한편 초점이 일치하지 않는 부분(out of focus)의 상을 제거할 수 있는 장점이 있으나, 다음과 같은 문제점이 있다.

첫째, 집광 효율이 미약한 문제점이 있다.

종래 기술에 의한 장치는 집광 효율면에서 집광각이 60°일 때, 8％선을 넘기 어렵다. 형광은 시료 주변의 모든 방향으로 진행하지만 집광렌즈가 포획할 수있는 부분은 렌즈와 발광점이 이루는 입체각에 비례하기 때문에 전체 입체각 4π에 대한 렌즈 입체각의 비가 8％선을 넘기 어려운 것이다.

따라서 시료에서 발광된 형광의 90％ 이상은 유용한 정보의 생산에 이용되지 못하고 손실되고 있다. 이와 같이 유실된 형광을 효율적으로 집적할 수 있다면 형광 포착 장비로 이용되는 고가의 광증배관을 사용하지 않고 저가의 실리콘 광 검출기 등을 사용할 수 있는 것이다.

둘째, 형광 발광 효율이 미약하다는 문제가 있다.

형광 발광량은 근본적으로 대상 시료에 포함된 형광 요소들의 양에 의해 결정되는데, 일차적으로 입사 광량을 증대시키면 형광 광량이 증가하게 된다. 그런데 입사광의 강도가 어느 특정치를 넘어서면 형광의 증가는 관찰되지 않고 오히려 높은 에너지 밀도에 의하여 형광 발광 기전이 파괴되는 현상이 관찰된다. 따라서 종래의 장치는 형광을 발광시키기 위하여 특정 파장을 가진 일정 세기 이하의 입사광을 시편에 입사시켜야만 한다.

그러나 이러한 입사광 중에서 형광의 발광기전에 참여한 일부의 빛을 제외한 나머지의 광 즉, 시편을 투과한 광은 그대로 빔-덤프(Beam Dump), 빔-트랩(Beam Trap) 등에 의해 포획하여 소진시킨다. 이 빔-덤프 또는 빔-트랩을 이용한 투과광의 소진은 형광 검출에 사용되지 않은 광이 최종면에서 반사된 뒤 임의의 경로를 통하여 광 검출계에 도달함에 따라 신호대 잡음비가 저하되는 것을 방지하기 위한 방안이다. 이러한 방법으로 투과광의 악영향은 방지할 수 있으나, 이를 재활용할 수 있다면 단위 시간당 입사한 광자의 수를 증가시켜 형광을 효율적으로 발광시킬수 있다.

이와 같은 문제점을 감안하여 안출한 본 발명은 타원, 구면 또는 원통형 반사경을 사용하여 집광 효율을 향상시킨 레이저 유발 표면형광 검출 장치를 제공함에 목적이 있으며, 또한 본 발명의 추가 목적은 시료를 투과하는 여기광을 재활용하여 형광 발광 효율을 획기적으로 개선하도록 한 레이저 유발 표면형광 검출 장치를 제공함에 있다.

한 가지 관점으로서, 본 발명은 레이저 광을 출사하기 위한 광원; 상기 광원으로부터 출사된 광을 여기시키는 입사필터; 상기 입사필터를 통과한 광이 주사되는 시료의 위치를 제어하는 시료 제어수단; 상기 시료에서 발광되는 형광과 입사광의 산란광을 반사하는 타원반사경; 상기 시료를 투과하는 광을 포집하기 위한 집광수단; 상기 타원반사경으로부터 반사되는 광 및 상기 집광수단으로부터 출력되는 광에서 노이즈(노이즈)를 제거하는 기능을 하는 공간필터; 상기 공간필터를 통과한 광을 평행광으로 전환하는 평행광학계; 상기 평행광학계를 통과한 광에서 입사 여기광 성분을 여과하여 순수한 형광성분만을 통과시키는 형광필터; 상기 형광필터의 출력 광을 전기 신호로 변환하기 위한 광 검출기를 포함하는 레이저 유발 표면형광 검출 장치를 제공한다.

다른 관점으로서, 본 발명은 레이저 광을 출사하기 위한 광원; 상기 광원으로부터 출사된 광을 여기시키는 입사필터; 상기 입사필터를 통과한 광이 주사되는시료의 위치를 제어하는 시료 제어수단; 상기 시료에서 발광되는 형광과 입사광의 산란광을 반사하는 구면반사경; 상기 시료를 투과하는 광을 포집하기 위한 집광수단; 상기 구면반사경으로부터 반사되어 시료를 투과하는 광과 상기 집광수단으로부터 출력되는 광 중에서 노이즈 성분을 제거하기 위한 공간필터; 상기 공간필터를 통과한 광을 평행광으로 전환하는 평행광학계; 상기 평행광학계를 통과한 광에서 여기광을 여과하여 순수한 형광성분만을 통과시키는 형광필터; 상기 형광필터의 출력 광을 전기 신호로 변환하기 위한 광 검출기를 포함하는 레이저 유발 표면형광 검출 장치를 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 1차원의 레이저 광을 출사하기 위한 광원, 상기 광원으로부터 출사된 광을 여기시키는 입사필터, 상기 입사필터를 통과한 1차원의 광이 주사되는 시료의 위치를 제어하는 시료 제어수단, 상기 시료에서 발광되는 형광과 입사광의 산란광을 반사하는 원통형 반사경, 상기 시료를 투과하는 1차원의 광을 포집하기 위한 집광수단, 상기 원통형 반사경으로부터 반사되는 광 및 상기 집광수단으로부터 출력되는 1차원의 광에서 노이즈를 제거하기 위한 공간필터, 상기 공간필터를 통과한 광을 평행광으로 전환하는 평행광학계, 상기 평행광학계를 통과한 광에서 여기광을 여과하여 순수한 형광성분만을 통과시키는 형광필터, 상기 시료의 각 점에서 나온 형광을 점위치별로 분리하여 검출할 수 있도록 상기 형광필터를 통과한 1차원적 광을 1차원 배열 광검출기로 1차원적으로 집속하는 결상렌즈, 상기 결상렌즈로부터 출력된 1차원적 광을 전기 신호로 변환하기 위한 1차원 배열 광검출기를 포함하는 레이저 유발 표면형광 검출 장치를 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 레이저 광을 출사하기 위한 광원; 상기 광원으로부터 출사된 광의 파장대역을 조절하는 입사필터; 상기 입사필터를 통과한 광이 주사되어지는 시료의 위치를 제어하는 시료 제어수단; 상기 시료에서 발광되는 형광과 입사광의 산란광을 반사하는 반사경; 상기 시료의 후방에 설치되어 상기 시료를 투과하는 여기광을 시료로 궤환시키는 광 궤환수단; 상기 반사경으로부터 반사되는 광에서 노이즈 제거를 위한 핀홀을 갖는 공간필터; 상기 공간필터를 통과한 광을 평행광으로 전환하는 평행광학계; 상기 평행광학계를 통과한 광에서 산란광을 여과하여 순수한 형광성분만을 통과시키는 형광필터; 상기 형광필터의 출력 광을 전기 신호로 변환하기 위한 광 검출기를 포함하는 레이저 유발 표면형광 검출 장치를 제공한다.

도 1은 종래 기술에 따른 레이저 유발 형광 검출 장치의 구성도.

도 2는 본 발명에 따라 타원반사경이 적용된 레이저 유발 표면형광 검출 장치의 구성도.

도 3은 본 발명에 따라 구면경이 적용된 레이저 유발 표면형광 검출 장치의 구성도.

도 4는 본 발명에 따라 원통형 반사경이 적용된 레이저 유발 표면형광 검출 장치의 구성도.

도 5는 도 4에 의한 레이저 유발 표면형광 검출 장치에 의해 스캔을 실시하는 상태도.

도 6은 본 발명에 따라 광궤환 수단이 적용된 레이저 유발 표면형광 검출 장치의 구성도.

< 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명 >

21,31,41: 광원22,32,42: 입사필터

23: 타원반사경33: 구면반사경

43: 원통형 반사경24,34,44: 시료기판

25,35(A, B),45: 집광수단26,36,46: 공간필터

27,37,47: 평행광학계28,38,48: 형광필터

29,39,49: 광검출기30,40,50: 컴퓨터 단말기

51: 결상렌즈60: 광 궤환수단

본 발명의 레이저 유발 표면형광 검출 장치에서 표면형광(epifluorescence)은 DNA 칩 또는 멤브레인을 이용한 단백질 칩과 같은 바이오칩(biochip)에 고정되는 분석물로부터 발광되는 형광을 가리킨다.

DNA 칩이란 기계 자동화와 전자 제어 등을 이용하여 적게는 수백 개부터 많게는 수십만 개의 DNA를 아주 작은 공간에 집어넣을 수 있게 만든 것이다. 다시 말해 DNA 칩은 유리, 실리콘, 등의 투명 또는 반투명 재질로 된 작은 기판 위에 DNA를 결합시켜 유전자 발현 양상, 유전자 결합, 단백질 분포, 반응 양상 등을 분석해 낼 수 있는 생물학적 마이크로칩을 말한다. DNA 칩은 붙이는 유전물질의 크기에 따라 cDNA 칩과 올리고 뉴클레오타이드 칩으로 나누어질 수 있다. cDNA 칩에는 최소한 500 bp 이상의 유전자(full-length open leading frame)가 붙여져 있고, 올리고뉴클레오타이드 칩에는 약 15 내지 25개의 염기들로 이루어진 올리고뉴클레오타이드가 붙여져 있다.

표적 DNA를 이용한 DNA 칩의 제작 기술은 크게 기판 위에 올리고뉴클레오타이드를 직접 합성하는 방식과 합성 또는 증폭된 표적 DNA를 기판 위에 심는 방식으로 나뉜다. 전자는 반도체 칩을 제작하는 방식에서 유래된 포토리소그래픽(photolithographic) 방법을 이용한 것으로 고밀도 집적이 가능하지만 표적 DNA의 길이가 20개 뉴클레오타이드 내외로 제한된다. 질병의 진단 혹은 일염기 다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)의 연구 등에 적합하다. 후자인 DNA 칩은 차등 유전자 발현(differential gene expression)의 연구에 많이 응용되며 폴리 L-라이신, 아민 혹은 알데하이드로 코팅된 슬라이드 위에 표적 DNA를 심는다.

본 발명의 다른 양태로서, 멤브레인을 이용한 단백질 칩으로부터 발산되는 표면형광을 검출한다. 이러한 단백질 칩은 제법 또는 응용에 있어서 당업자에게 잘 알려져 있음은 물론 많은 과학전문지 및 특허 문헌에 다양하게 기술되어 있다. 예를 들면, 단백질 칩은 소형의 투명 또는 반투명 기판 위에 여러 질환에 관계되는 단백질에 대한 항체를 집적하고, 환자의 체액으로부터 준비한 분석물을 생화학적 마커로 하여 그 질환의 존재여부 및 진행상태를 조기에 진단한다. 상기 소형의 기판은 통상의 유리판 위에 아비딘(avidin) 등을 이용하여 원하는 단백질을 고착할수 있다. 다른 방도로서, 폴리스티렌(polystylene)을 기판 재질로 사용할 수 있으며 이러한 폴리스틸렌 기판은 단백질 부착이 용이하고 부착효율도 좋다. 이외에도 기판에 부착하는 단백질의 성질에 따라 폴리염화비닐(polyvinylchloride) 및 폴리프로필렌 (polypropylene)도 사용할 수 있다.

상술한 투명 또는 반투명 기판에 단백질을 집적하는 공정은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들면 폴리스티렌 기판을 사용하는 경우 가로 1.5cm, 세로 1.5cm 크기의 폴리스틸렌 기판에 가로 1mm, 세로 2mm, 깊이 1.5 mm의 홈(groove) 8개를 1mm 간격으로 나란히 형성한다. 분석하고자 하는 단백질을 각각의 홈에 대략 직경 400nm, 간격 500nm로 하여 집적할 경우, 1cm 길이에 10가지 종류의 단백질을 집적하는 것이 가능하다. 즉, 1개의 기판에 80여 종류의 단백질을 집적할 수가 있다.

본 발명의 레이저 유발 표면형광 검출 방법 및 장치에서 분석물 시료를 표지하는 형광물질은 흡수파장과 방출파장이 20 nm 이상의 차이가 나는 것을 사용할 수 있는데, 대표적인 형광물질로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 형광 입자, 퀀텀 도트(quantum dot), 란타니드 킬레이트(lanthanide chelate)(예, 사마륨(Sm), 유로퓸(Eu) 및 테르븀(Tb)) 및 플루오레슨스(fluorescence)(예, FITC, 로다민 그린, 티아디카르보시아닌, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Alexa 488, Alexa 546, Alexa 594 및 Alexa 647)가 포함된다. DNA를 검출하는데 사용되는 바람직한 형광물질은 Cy3와 Cy5이다. 일반적으로 형광의 세기는 여기광의 세기가 지나치게 강하지 않으면 여기 광(excitation light)의 세기에 직접 비례한다.

본 발명의 레이저 유발 표면형광 검출 방법 및 장치에 사용되는 레이저는 대표적으로 He-Ne 레이저 및 다이오드 레이저가 포함된다. He-Ne 레이저의 예로는 National Research Laboratory of Metrology(NRLM), Agency of Industrial Science and Technology(AIST), Ministry of International Trade and Industry(MITI)에서 개발한 소형의 휴대용 정밀 요도드-안정화 He-Ne 레이저(Model NEO-92SI) 및 모델 05 LYR 173(캘리포니아 어어빈 소재 Melles Griot 제품)을 들 수 있다. 다이오드 레이저는 He-Ne 레이저보다 컴팩트하고 보다 정밀하며 적외선 또는 적색광 다이오드 레이저가 있다.

본 발명의 장치는 시료에서 발광되는 형광과 입사광의 산란광을 반사하는 반사경 및 시료를 투과하는 광을 포집하기 위한 집광수단을 포함한다. 반사경이 타원반사경인 경우에는 입사필터를 통과한 광이 주사되는 타원반사경의 제1초점에 시료를 위치시키고, 타원반사경에 반사되는 광 및 집광수단에서 출력되는 광은 타원반사경의 제2초점에 집속시킨다. 반사경이 구면반사경인 경우에는 입사필터를 통과한 광이 주사되는 구면반사경의 중심에 상기 시료를 위치시킨다. 또한, 광원을 1차원의 레이저광을 사용하는 경우에는 반사경이 원통형 반사경을 구비하여 상기 입사필터를 통과한 광이 주사되는 원통형 반사경의 제1초점에 상기 시료를 위치시킨다.

본 발명의 장치는 다른 관점으로서 시료의 후방에 설치되어 시료를 투과하는 여기광을 시료로 궤환시키는 광 궤환수단을 포함한다. 이러한 광 궤환 수단은 구면반사경이 바람직하다.

이하, 상기한 바와 같은 본 발명에 의한 레이저 유발 표면형광 검출 장치의실시 예를 첨부도면을 참조하여 보다 상세하게 설명한다.

도 2는 본 발명의 제1 실시 예에 따른 타원반사경 레이저 유발 표면형광 검출 장치의 구성도로서, 점상의 레이저 광을 출사하기 위한 광원(21)과, 광원(21)으로부터 출사되는 광을 필터링하는 입사필터(22)와, 입사필터(22)를 통과한 광이 주사되는 시료의 위치를 제어하는 시료 제어수단(24)과, 시료(DNA 칩 또는 단백질 칩)의 면에서 발광된 형광과 입사광의 산란광을 반사시키는 타원반사경(23)과, 시료 제어수단(24)을 통과한 광을 포집하는 집광수단(25)인 대물렌즈와, 타원반사경(23)의 제2초점에 위치되어 타원반사경(23)에서 반사되는 광 및 집광수단(25)으로부터 출력되는 광에서 노이즈를 제거하는 핀홀을 갖는 공간필터(26)와, 공간필터(26)를 통과한 광을 평행광으로 변환하는 평행광학계(27)와, 평행광학계(27)를 통해 출력되는 광신호에서 여기광 성분은 필터링하고 순수한 형광성분을 통과시키는 형광필터(28)와, 형광필터(28)를 통과한 광을 전기 신호로 변환하기 위한 광검출기(29)와, 광검출기(29)로 입력되는 신호를 분석처리하여 디스플레이하는 컴퓨터 단말기(30)로 구성되어 있다.

시료가 일정한 패턴으로 배열된 시료기판을 갖는 시료제어 수단(24)은 시료기판을 투명 또는 반투명 재질의 기판을 사용하고, 반사경으로 타원반사경(23)을 사용하며, 시료 제어수단(24)에 의해 시료를 타원반사경(23)의 제1초점에 위치시키도록 구성한다.

본 발명에 적용된 광원(21)인 레이저는 형광물질 표지 Alexa의 흡수 최대치에 근접하는 파장 638 nm에서 방출하는 2 mW He-Ne 레이저이다.

이와 같이 구성되는 본 발명의 제1 실시예에 의한 레이저 유발 표면형광 검출 장치의 동작은 레이저 광원(21)의 빛이 입사필터(22)를 통과하고 타원반사경(23)의 중간 지점에 위치한 구멍을 통과한다. 이때 광원(21)의 빛이 입사필터(22)를 지나 타원반사경(23)의 구멍을 적절히 통과할 수 있도록 광원(21), 입사필터(22) 및 타원반사경(23)은 일렬로 나란히 배치되는 것이 바람직하다.

타원반사경(23)을 통과한 빛은 시료 제어수단(24)의 시료(DNA 칩 또는 단백질 칩)의 면에 적절한 크기로 집속되며, 이때, 시료는 빛이 최적으로 집속될 수 있도록 시료 제어수단(24)에 의하여 상,하 혹은 전,후(지면에 수직한 방향)로 이동하여 위치를 변경할 수 있다. 이 집속점은 타원반사경(23)의 제1초점에 위치하고 있다.

시료의 표면에서 입사광에 의해 발광된 형광은 시료 제어수단(24)의 전면부(입사광이 들어온 방향)와 후면부로 진행한다. 전면부로 진행한 빛(A)은 타원반사경(23)에 반사되어 시료 제어수단(24)의 후면부로 진행되고, 후면부로 진행하는 빛(B)은 집광수단(25)에 의해 공간필터(26)의 핀홀로 집속된다. 이때, 타원반사경(23)에 의해 반사되어 후면부로 진행되는 빛(A)도 공간필터(26)의 핀홀로 집속된다.

이와 같이 공간필터(26)를 통과하는 빛은 시료의 표면에 위치한 먼지 등에 의한 노이즈(노이즈)를 제거하는 작용을 실시하게 되며, 공간필터(26)를 통과한 빛은 평행광학계(collimator)(27)에 의하여 평행광으로 변형되고, 평행광학계(27)을 통과하면서 형성된 평행광은 형광필터(28)를 지나면서 여기광은 걸러지고 순수한형광성분만이 광검출기(29)로 입사되어 이의 세기(fluorescence intensity)를 표시하는 신호(signals)로 컴퓨터(30)로 전송되어 분석 처리된다.

시료기판에 배열된 시료의 일 지점에 대하여 이상과 같은 과정을 수행하고 난 후에는 시료 제어수단(24)을 상,하 또는 전,후방향으로 이동시켜 동일한 과정을 반복수행함으로써 시료의 형광성분을 측정한다.

도 3은 본 발명의 제2 실시예에 따른 구면경 레이저 유발 표면형광 검출 장치의 구성도로서, 투명 또는 반투명재질의 시료기판을 포함하는 시료 제어수단(34)을 구비하고, 반사경을 구면반사경(33)을 사용하며, 구면반사경(33)의 중심에 시료가 위치되도록 시료 제어수단(34)을 설치한 것이다.

장치의 구성은 점상의 레이저 광을 출사하기 위한 광원(31)과, 광원(31)으로부터 출사되는 광을 필터링하는 입사필터(32)와, 입사필터(32)를 통과한 광이 주사되는 시료의 위치를 제어하는 시료 제어수단(34)과, 시료(DNA 칩 또는 단백질 칩)의 면에서 발광된 형광과 입사광의 산란광을 반사시키는 구면반사경(33)과, 시료 제어수단(34)을 통과한 광을 포집하는 집광수단(35)인 대물렌즈들(35A,35B)과, 집광수단(35)으로부터 출력되는 광에서 노이즈를 제거하는 핀홀을 갖는 공간필터(36)와, 공간필터(36)를 통과한 광을 평행광으로 변환하는 평행광학계(37)와, 평행광학계(37)를 통해 출력되는 광신호의 여기광은 필터링하고 순수한 형광성분을 통과시키는 형광필터(38)와, 형광필터(38)를 통과한 광을 전기 신호로 변환하기 위한 광검출기(39)와, 광검출기(39)로 입력되는 신호를 분석 처리하는 컴퓨터 단말기(40)로 구성되어 있다.

이와 같이 구성된 본 발명의 제2 실시예에 의한 레이저 유발 표면형광 검출 장치의 동작은 레이저 광원(31)의 빛은 입사필터(32)를 통과하고 입사필터(32)와 시료 사이에 배치되어 있는 구면반사경(33)의 중간 지점에 위치한 구멍을 통과한다. 구면반사경(33)을 통과한 빛은 시료(DNA 칩 또는 단백질 칩)에 적절한 크기로 집속되어 형광의 발광이 유도되는데, 이때 시료의 표면에서 입사광에 의해 발광된 형광은 시료의 전면부(입사광이 들어온 방향)와 후면부로 진행된다. 전면부로 진행하는 빛(D)은 시료에서 그 반지름만큼의 거리에 위치한 구면반사경(33)에 수직으로 입사한 후에 정확하게 다시 본래의 위치인 시료의 위치로 반사된다. 이와 같이 시료쪽으로 재입사한 형광은 시료에 일부 밖에 흡수되지 않기 때문에 대부분은 시료를 투과하여 진행된다.

따라서 시료의 후면부로 진행하는 빛(E)과 구면반사경(34)에 의하여 반사되어 진행하는 빛(D)은 집광수단(35)을 거치게 된다. 본 발명의 제2 실시예에서는 집광수단(35)을 대물렌즈(35A)와 대물렌즈(35B)를 사용하고 있는 바, 이에 한정되는 것이 아니라 다양한 종류의 볼록 또는 오목형태의 렌즈의 조합이 실시가능하다.

집광수단(35)을 통과한 빛은 공간필터(36)의 핀홀을 통해 노이즈 제거 과정(36)를 거치면서 시료의 표면에 위치한 먼지 등에 의한 노이즈를 제거하는 작용을 실시하며, 공간필터(36)를 통과한 빛은 평행광학계(37)에 의하여 평행광으로 변형되고, 이러한 평행광은 형광필터(38)를 지나면서 입사 여기광은 걸러지고 순수한 형광성분만이 광검출기(39)로 입사되어 이의 세기를 표시하는 신호로 컴퓨터 단말기(40)로 전송되어 분석 처리된다.

본 발명의 제2 실시 예에서도 동일하게 시료의 일 지점에 대하여 이상과 같은 과정을 수행하고 난 후에는 시료 제어수단(34)에 의해 시료를 상,하 또는 전,후로 이동시켜 동일한 과정을 반복수행함으로써 시료의 형광성분을 측정하게 된다.

도 4는 본 발명의 제3 실시예에 따른 원통형 반사경 레이저 유발 표면형광 검출 장치의 구성도로서, 반사경은 원통형(Cylindrical) 반사경(43)을 사용하고, 시료가 원통형 반사경(43)의 중심에 위치하도록 시료 제어수단(44)을 설치한 것이다.

장치의 구성은 1차원적으로 확장되는 1차원의 레이저광을 출사하기 위한 광원(41)과, 광원(41)으로부터 출사된 광을 필터링하는 입사필터(42)와, 입사필터(42)를 통과한 1차원 광이 주사되는 시료의 위치를 제어하는 시료 제어수단(44)과, 시료의 형광과 입사광의 산란광을 반사시키는 원통형 반사경(43)과, 시료를 통과한 광을 포집하는 집광수단(45)인 대물렌즈와, 원통형 반사경(43)에서 반사되는 광 및 시료를 통과한 광에서 노이즈를 제거하는 공간필터(46)와, 공간필터(46)를 통과한 광을 평행광으로 변형하는 평행광학계(47)와, 평행광학계(47)를 통해 출력되는 광신호의 여기광은 필터링하고 순수한 형광성분을 통과시키는 형광필터(48)와, 시료(44)의 각 점에서 나온 형광을 점위치별로 분리하여 검출할 수 있도록 형광필터(48)를 통과한 1차원적 광을 1차원 배열 광검출기(49)로 1차원적으로 집속하는 결상렌즈(51)와, 결상렌즈로부터 출력된 1차원적 광을 전기 신호로 변환하기 위한 1차원 배열 광검출기(49)와, 1차원 배열 광검출기(49)로 입력되는 신호를 분석처리하는 컴퓨터 단말기(50)로 구성되어 있다.

이와 같이 구성되어 있는 본 발명의 제3 실시예에 의한 레이저 유발 표면형광 검출 장치의 동작은 시료를 원통형 반사경(43)의 중심에 위치시킨 상태에서 레이저 광원(41)으로부터 입사되는 1차원으로 확장된 빛이 입사필터(42)를 통과하여 시료로 주사되어 발광되는 형광과 입사광의 산란광이 원통형 반사경(43)에서 반사되어 공간필터(46)로 집속되며, 시료를 투과하는 광은 집광수단(45)에 의해 집광된 상태로 공간필터(46)로 집속된다.

이와 같이 집속된 상태로 공간필터(46)를 통과한 광은 평행광학계(47)를 통과하면서 평행광으로 변형된 후에 형광필터(48) 및 결상렌즈(51)를 차례로 통과하여 1차원 배열 광검출기(49)로 입사되어 컴퓨터 단말기(50)로 전송되어 분석 처리된다.

시료의 일 배열에 대하여 이상의 과정을 수행한 후에 시료를 상, 하 또는 좌,우로 이동시켜 동일한 과정을 반복하여 시료의 형광성분을 측정한다.

상기 집광수단(45) 및 평행광학계(47)는 각각 독립적으로 실린더형 렌즈이거나 도 4에 도시된 바와 같은 반쪽 실린더형 렌즈이다.

도 5는 도 4에 의한 레이저 유발 표면형광 검출 장치에 의해 생체시료기판을 스캐닝 하는 상태를 설명하기 위한 도면이다.

1차원으로 확장된 빛은 2차원으로 시료가 배열되어 있는 시료기판(44A)에 주사되므로 1회의 스캔(S)에 의해 다수의 시료(44B)로부터 발광되는 형광을 검출할수 있게 되며, 결과적으로 2차원적인 스캔 과정을 1차원 스캔으로 줄일 수 있어 측정 시간을 단축함과 아울러 발광 효율을 향상시킬 수 있다.

도 6은 본 발명의 제4 실시예에 따른 광 궤환수단이 적용된 레이저 유발 표면형광 검출 장치의 구성도로서, 집광 효율을 높이기 위해 반사경을 적용함과 아울러 시료의 형광 발광 효율을 증대시키기 위하여 여기광을 재활용하도록 구성한 것이다. 이를 위하여 본 발명의 제4 실시예에서는 시료의 후방에 광 궤환수단을 구비하여 시료를 투과한 여기광을 다시 시료로 궤환시켜 다시 여기광의 기능을 수행하도록 한 것이다.

본 발명의 제4 실시예에서는 반사경을 구면반사경(33)을 사용하였으나, 필요에 의해 타원반사경을 사용할 수도 있다.

본 발명 제4 실시예의 구성은 점상의 레이저광을 출사하기 위한 광원(31)과, 광원(31)으로부터 출사된 광을 필터링하는 입사필터(32)와, 입사필터(32)를 통과한 광이 주사되는 시료의 위치를 제어하는 시료 제어수단(34)과, 시료의 형광과 입사광의 산란광을 반사시키는 구면반사경(33)과, 시료의 후방에 설치되어 시료를 투과한 광(I)과 근축산란광(H)을 시료측으로 궤환시키기 위한 광 궤환수단(60)인 제2의 구면반사경과, 광 궤환수단(60)의 후방에 설치되어 시료 제어수단(34)을 통과한 광을 포집하는 집광수단(35)인 대물렌즈와, 집광수단(35)으로부터 출력되는 광에서 노이즈를 제거하는 핀홀을 갖는 공간필터(36)와, 공간필터(36)를 통과한 광을 평행광으로 변형하기 위한 평행광학계(37)와, 평행광학계(37)를 통해 출력되는 광신호의 여기광은 필터링하고 순수한 형광성분을 통과시키는 형광필터(38)와,형광필터(38)를 통과한 광을 전기 신호로 변환하기 위한 광검출기(39)와, 광검출기(39)로 입력되는 신호를 분석처리하여 디스플레이하는 컴퓨터 단말기(40)로 구성되어 있다.

본 발명의 제4 실시예에서는 시료 제어수단(34)의 후방에 시료의 영상점에 중심점이 일치하도록 광 궤환수단(60)인 제2 구면반사경을 설치하여 시료를 투과하는 광(I)과 근축산란광(H)을 궤환시켜 다시 여기광의 기능을 수행케 한다. 시료를 통과한 광은 광 궤환수단(60)의 후방에 설치된 집광수단(35)에 의해 포집되어 이를 통해 공간필터(46)로 집속된다.

이와 같이 구성된 본 발명의 제4 실시예의 동작은 시료 제어수단(34)에 의해 시료를 구면반사경(33)의 중심점에 위치시키고, 외부의 광원(31)으로부터 특정 파장의 빛을 집속시켜 형광의 발광을 유도하면, 시료의 표면에서 입사광에 의해 발광된 형광은 시료의 전면부와 후면부로 진행된다.

따라서 전면부로 진행하는 빛(D)은 시료에서 구면반사경(33)의 반지름의 거리에 위치한 구면반사경(33)에 수직으로 입사하여 반사됨으로써 정확하게 제 위치인 시료로 재입사되는데 이때 재입사되는 형광은 시료의 흡수에너지와 다르기 때문에 시료에 일부 밖에 흡수되지 않고 대부분이 시료를 투과하여 진행된다.

한편, 시료를 투과하여 후면부로 진행한 광(I) 및 근축산란광(H)은 광의 폭보다 약간 큰 너비를 갖는 광 궤환수단(60)인 제2 구면반사경에 의해 반사되어 시료로 재입사되면서 다시 빛(F)의 상태로 구면반사경(33)으로 궤환되어 결과적으로 시료에는 입사광과 광 궤환수단(60)에 의하여 궤환된 광이 조사하게 되어 생체시료의 발광효율을 향상시키는 것이다.

이후에 시료를 투과하는 광은 광궤환수단(60)의 후방에 위치한 집광수단(35)을 통해 공간필터(36)에 집속되고, 평행광학계(37)를 통과하면서 적절한 광속 처리과정을 거치게 되며, 최종적으로 형광필터(38)를 통과한 후에 광 검출기(39)로 입사되어 컴퓨터 단말기(40)로 전송되어 분석 처리된다.

이처럼 본 발명의 제4 실시예는 시료를 투과한 광을 궤환시켜 단위시간당 입사되는 광자의 수를 증가시키게 되므로 입사광량을 증가시킬 필요가 없게 되고, 입사 광량을 지나치게 증가시킴에 따라 형광 발광기전이 파괴되는 문제점을 해결할 수 있게 된다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 DNA 또는 단백질 칩과 같은 생체시료가 일정한 패턴으로 형성된 기판을 투명 또는 반투명 재질의 기판을 사용하도록 하고, 이러한 기판을 홀딩하여 위치를 제어할 수 있는 시료 제어수단을 구비하며, 시표로 주사되는 입사광을 집속시키기 위한 수단으로 타원, 구면 또는 원통형 반사경을 사용함으로써 집광 효율을 종래의 기술보다 최소 5배 이상으로 향상시키는 효과가 있다.

또한, 시료로부터 투과되는 광을 포집하기 위하여 시료의 후방에 광 궤환수단을 설치함으로써 형광을 발생시키는 입사광의 유효에너지를 2배 이상으로 활용할 수 있어 형광 발광 효율을 극대화시키는 효과가 있다.

Claims

레이저 광을 출사하기 위한 광원;

상기 광원으로부터 출사된 광을 여기시키는 입사필터;

상기 입사필터를 통과한 광이 주사되는 시료의 위치를 제어하는 시료 제어수단;

상기 시료에서 발광되는 형광과 입사광의 산란광을 반사하는 타원반사경;

상기 시료를 투과하는 광을 포집하기 위한 집광수단;

상기 타원반사경으로부터 반사되는 광 및 상기 집광수단으로부터 출력되는 광에서 노이즈를 제거하기 위한 핀홀을 갖는 공간필터;

상기 공간필터를 통과한 광을 평행광으로 전환하는 평행광학계;

상기 평행광학계를 통과한 광에서 여기광을 여과하여 순수한 형광성분만을 통과시키는 형광필터;

상기 형광필터의 출력 광을 전기 신호로 변환하기 위한 광 검출기를 포함하는 레이저 유발 표면형광 검출 장치.
제 1 항에 있어서,

상기 입사필터를 통과한 광이 주사되는 상기 타원반사경의 제1초점에 상기 시료를 위치시키고, 상기 타원반사경에 반사되는 광 및 상기 집광수단에서 출력되는 광은 상기 타원반사경의 제2초점에 집속시키는 것을 특징으로 하는 레이저 유발표면형광 검출 장치.
제 1 항에 있어서,

상기 집광수단은 볼록렌즈 또는 오목렌즈 중 선택되는 적어도 하나 이상의 렌즈 또는 렌즈군인 것을 특징으로 하는 레이저 유발 표면형광 검출 장치.
레이저 광을 출사하기 위한 광원;

상기 광원으로부터 출사된 광을 여기시키는 입사필터;

상기 입사필터를 통과한 광이 주사되는 시료의 위치를 제어하는 시료 제어수단;

상기 시료에서 발광되는 형광과 입사광의 산란광을 반사하는 구면반사경;

상기 시료를 투과하는 광을 포집하기 위한 집광수단;

상기 구면반사경으로부터 반사되어 시료를 투과하는 광과 상기 집광수단으로부터 출력되는 광에서 노이즈를 제거하기 위한 핀홀을 갖는 공간필터;

상기 공간필터를 통과한 광을 평행광으로 전환하는 평행광학계;

상기 평행광학계를 통과한 광에서 여기광을 여과하여 순수한 형광성분만을 통과시키는 형광필터;

상기 형광필터의 출력 광을 전기 신호로 변환하기 위한 광 검출기를 포함하는 레이저 유발 표면형광 검출 장치.
제 4 항에 있어서,

상기 입사필터를 통과한 광이 주사되는 상기 구면반사경의 중심에 상기 시료를 위치시키는 것을 특징으로 하는 레이저 유발 표면형광 검출 장치.
제 4 항에 있어서,

상기 집광수단은 볼록렌즈 또는 오목렌즈 중 선택되는 적어도 하나 이상의 렌즈 또는 렌즈군인 것을 특징으로 하는 레이저 유발 표면형광 검출 장치.
1차원의 레이저 광을 출사하기 위한 광원;

상기 광원으로부터 출사된 광을 여기시키는 입사필터;

상기 입사필터를 통과한 1차원의 광이 주사되는 시료의 위치를 제어하는 시료 제어수단;

상기 시료에서 발광되는 형광과 입사광의 산란광을 반사하는 원통형 반사경;

상기 시료를 투과하는 1차원의 광을 포집하기 위한 집광수단;

상기 원통형 반사경으로부터 반사되는 광 및 상기 집광수단으로부터 출력되는 1차원의 광에서 노이즈를 제거하기 위한 공간필터;

상기 공간필터를 통과한 광을 평행광으로 전환하는 평행광학계;

상기 평행광학계를 통과한 광에서 여기광을 여과하여 순수한 형광성분만을 통과시키는 형광필터;

상기 시료의 각 점에서 나온 형광을 점위치별로 분리하여 검출할 수 있도록상기 형광필터를 통과한 1차원적 광을 1차원 배열 광검출기로 1차원적으로 집속하는 결상렌즈;

상기 결상렌즈로부터 출력된 1차원적 광을 전기 신호로 변환하기 위한 1차원 배열 광검출기를 포함하는 레이저 유발 표면형광 검출 장치.
제 7 항에 있어서,

상기 입사필터를 통과한 1차원의 레이저광이 주사되는 상기 원통형 반사경의 제1초점에 상기 시료를 위치시키는 것을 특징으로 하는 레이저 유발 표면형광 검출 장치.
제 7 항에 있어서, 집광수단, 평행광학계 및 결상렌즈가 각각 독립적으로 볼록렌즈인 레이저 유발 표면형광 검출 장치.
레이저 광을 출사하기 위한 광원;

상기 광원으로부터 출사된 광을 여기시키는 입사필터;

상기 입사필터를 통과한 광이 주사되어지는 시료의 위치를 제어하는 시료 제어수단;

상기 시료에서 발광되는 형광과 입사광의 산란광을 반사하는 반사경;

상기 시료의 후방에 설치되어 상기 시료를 투과하는 여기광을 시료로 궤환시키는 광 궤환수단;

상기 광 궤환수단의 후방에 설치되어 시료로부터 투과하는 광을 포집하는 집광수단;

상기 집광수단으로부터 출력되는 광에서 노이즈를 제거하기 위한 핀홀을 갖는 공간필터;

상기 공간필터를 통과한 광을 평행광으로 전환하는 평행광학계;

상기 평행광학계를 통과한 광에서 여기광을 여과하여 순수한 형광성분만을 통과시키는 형광필터;

상기 형광필터의 출력 광을 전기 신호로 변환하기 위한 광 검출기를 포함하는 레이저 유발 표면형광 검출 장치.
제 10 항에 있어서,

상기 반사경은 타원반사경 또는 구면반사경이고, 상기 광 궤환수단은 구면반사경인 것을 특징으로 하는 레이저 유발 표면형광 검출 장치.