JP3535174B2 - 生物特異性アッセイ法 - Google Patents
生物特異性アッセイ法Info
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、１の単一サンプルからの多重被検体の同時
測定のための生物特異性マルチパラメーターアッセイ法
に関する。
測定のための生物特異性マルチパラメーターアッセイ法
に関する。
本発明は、単一蛍光分子又はそれらの複合体のための
計数方法に更に関する。
計数方法に更に関する。
発明の背景
イムノアッセイは、確立された生物特異性アッセイ法
であり、慣用的な診断及び調査研究に広く用いられてい
る。生物特異性アッセイの他のグループは、まだ開発中
であるが、DNA及びRNAハイブリダイゼーションアッセイ
である。２つの生物特異性プローブ、第１のプローブ及
び第２のプローブ（即ち抗体、DNA又はRNAプローブ）
が、通常、生物特異性アッセイに用いられる。それら
は、被検体分子の特異性決定基に結合し、更に３分子の
複合体（サンドイッチ構造）も形成する。通常、これら
の２つの試薬の１つがラベルされている。現在、最も一
般的に用いられるラベルはラジオアイソトープ、酵素、
ルミネセンス及び蛍光ラベルである。本明細書で後に、
生物特異性反応に用いられるラベルは、蛍光、リン光、
ケミルミネセンス又はバイオルミネセンスを生成又は触
媒するラベルをいうホトルミネセンスラベルとして言及
されよう。
であり、慣用的な診断及び調査研究に広く用いられてい
る。生物特異性アッセイの他のグループは、まだ開発中
であるが、DNA及びRNAハイブリダイゼーションアッセイ
である。２つの生物特異性プローブ、第１のプローブ及
び第２のプローブ（即ち抗体、DNA又はRNAプローブ）
が、通常、生物特異性アッセイに用いられる。それら
は、被検体分子の特異性決定基に結合し、更に３分子の
複合体（サンドイッチ構造）も形成する。通常、これら
の２つの試薬の１つがラベルされている。現在、最も一
般的に用いられるラベルはラジオアイソトープ、酵素、
ルミネセンス及び蛍光ラベルである。本明細書で後に、
生物特異性反応に用いられるラベルは、蛍光、リン光、
ケミルミネセンス又はバイオルミネセンスを生成又は触
媒するラベルをいうホトルミネセンスラベルとして言及
されよう。
慣用的診断におけるマルチパラメーター分析のための
絶え間なく増加する必要性がある。不幸なことに、現在
の技術は、異なるラベルからの分光測定シグナルが十分
に分離され得ないので、同時に測定されるべき２又は３
以上のラベルの使用を許容しない。ホトルミネセンスラ
ベルの放出スペクトルは重大にオーバーラップし、結果
として、それらは要求される濃度範囲にわたり異なる被
検体の不適切な分離を供する。
絶え間なく増加する必要性がある。不幸なことに、現在
の技術は、異なるラベルからの分光測定シグナルが十分
に分離され得ないので、同時に測定されるべき２又は３
以上のラベルの使用を許容しない。ホトルミネセンスラ
ベルの放出スペクトルは重大にオーバーラップし、結果
として、それらは要求される濃度範囲にわたり異なる被
検体の不適切な分離を供する。
本発明の目的は、マルチパラメーター生物特異性アッ
セイのためのより優れた方法を提供することである。本
発明に従う方法は、免疫学及びDNAハイブリダイゼーシ
ョンの分野内で一般に知られる方法に基づく。通常、そ
れらは次の通り行われる。その方法は、被検体分子ｋを
認識する２つの生物特異性プローブを用いる。本明細書
において、これらのプローブは第１のプローブAb（k,
1）及び第２のプローブAb（k,2）として言及される。第
２のプローブが例えばホトルミネセンスラベルＦでラベ
ルされる場合、それは記号AbF（k,2）で表される。その
反応溶液中には、被検体分子Mkの数と比較して過剰の第
１及び第２のプローブがある。ポリペプチド又は高分子
のいずれかである被検体分子が分離したエピトープ、即
ちプローブに特異的に結合する分子構造を有するなら、
それらは複合体Ab（k,1）＋Mk＋AbF（k,2）を形成す
る。原則的に、形成される複合体の量は被検体の量に直
接比例し、過剰の第１及び第２のプローブが溶液中に残
る。複合体は、例えば第１のプローブが固体担体に結合
して遊離プローブがサンプルから洗い落とされる一般に
知られている技術を用いて遊離プローブから分離され
る。最後に、複合体中の結合したラベルＦのシグナル
は、選択されたラベルに依存する慣用的方法で測定され
る。得られたシグナルの強度は溶液中のラベルの量に直
接比例し、システムの応答は直線的である。
セイのためのより優れた方法を提供することである。本
発明に従う方法は、免疫学及びDNAハイブリダイゼーシ
ョンの分野内で一般に知られる方法に基づく。通常、そ
れらは次の通り行われる。その方法は、被検体分子ｋを
認識する２つの生物特異性プローブを用いる。本明細書
において、これらのプローブは第１のプローブAb（k,
1）及び第２のプローブAb（k,2）として言及される。第
２のプローブが例えばホトルミネセンスラベルＦでラベ
ルされる場合、それは記号AbF（k,2）で表される。その
反応溶液中には、被検体分子Mkの数と比較して過剰の第
１及び第２のプローブがある。ポリペプチド又は高分子
のいずれかである被検体分子が分離したエピトープ、即
ちプローブに特異的に結合する分子構造を有するなら、
それらは複合体Ab（k,1）＋Mk＋AbF（k,2）を形成す
る。原則的に、形成される複合体の量は被検体の量に直
接比例し、過剰の第１及び第２のプローブが溶液中に残
る。複合体は、例えば第１のプローブが固体担体に結合
して遊離プローブがサンプルから洗い落とされる一般に
知られている技術を用いて遊離プローブから分離され
る。最後に、複合体中の結合したラベルＦのシグナル
は、選択されたラベルに依存する慣用的方法で測定され
る。得られたシグナルの強度は溶液中のラベルの量に直
接比例し、システムの応答は直線的である。
測定されるべき被検体が、プローブに特異的に結合す
る２以上のエピトープのない小さな分子であるなら、被
検体及び第１のプローブにより形成される複合体に特異
的に反応する第２のプローブを用いることができる（C.
H.Self ＆ al.,Clin Chem 40（1994）2035〜2041）。
る２以上のエピトープのない小さな分子であるなら、被
検体及び第１のプローブにより形成される複合体に特異
的に反応する第２のプローブを用いることができる（C.
H.Self ＆ al.,Clin Chem 40（1994）2035〜2041）。
マルチパラメーター生物特異性アッセイ法の原理は、
早くから導入されている。多重のラベルをラベル生物特
有試薬に用いること、及びそれらの異なる放出スペクト
ルに基づきシグナルを分離することが一般的な実施であ
る。しかしながら、ほとんどの場合、周知のマルチパラ
メーター法は、生物特異性試薬が分離した、任意に識別
可能な領域に固定化され得る固体支持体の使用に基づく
か、又は固体支持体としての人工の微小粒子の使用に基
づく。その方法のいくつかを以下に報告する： 1. 種々の生物特異プローブが偏平な固体支持体上の小
領域により形成されたマトリックスに付着される方法
が、PCT WO 84/01031に記載される。この方法におい
て、反応及び洗浄の後、各々の領域内のホトルミネセン
スラベルからのシグナルが、例えばレーザー走査顕微鏡
を用いて分離して測定される。
早くから導入されている。多重のラベルをラベル生物特
有試薬に用いること、及びそれらの異なる放出スペクト
ルに基づきシグナルを分離することが一般的な実施であ
る。しかしながら、ほとんどの場合、周知のマルチパラ
メーター法は、生物特異性試薬が分離した、任意に識別
可能な領域に固定化され得る固体支持体の使用に基づく
か、又は固体支持体としての人工の微小粒子の使用に基
づく。その方法のいくつかを以下に報告する： 1. 種々の生物特異プローブが偏平な固体支持体上の小
領域により形成されたマトリックスに付着される方法
が、PCT WO 84/01031に記載される。この方法におい
て、反応及び洗浄の後、各々の領域内のホトルミネセン
スラベルからのシグナルが、例えばレーザー走査顕微鏡
を用いて分離して測定される。
2. 被検体カテゴリーの同定が固体支持体として用いら
れる微小粒子の色に基づき、分析されるべき粒子の光吸
収を任意に測定することにより達成される方法（J.G.St
reefkerk ＆ al.,Protides Biol.Fluids 24（1976）811
〜814及び米国特許5,162,863）。
れる微小粒子の色に基づき、分析されるべき粒子の光吸
収を任意に測定することにより達成される方法（J.G.St
reefkerk ＆ al.,Protides Biol.Fluids 24（1976）811
〜814及び米国特許5,162,863）。
3. 被検体カテゴリーの同定が粒子内側の染料の吸光
度、分析されるべき粒子の反射示数又はサイズを任意に
測定することにより行われる方法。
度、分析されるべき粒子の反射示数又はサイズを任意に
測定することにより行われる方法。
4. 被検体カテゴリーの同定が異なる粒子サイズの使用
に基づき、その同定が分析されるべき粒子の径を任意に
測定することにより行われる方法（T.M.McHugh ＆ al.,
Journal of Immunological Methods 95（1986）57〜6
1）。
に基づき、その同定が分析されるべき粒子の径を任意に
測定することにより行われる方法（T.M.McHugh ＆ al.,
Journal of Immunological Methods 95（1986）57〜6
1）。
5. 微小粒子が該粒子内に混合され、又は浸含された蛍
光染料の手段により同定され、生物特異性シグナルがFI
TCのような他の蛍光染料の蛍光強度から測定される方法
（EP 126540,GOIN 33/58）。
光染料の手段により同定され、生物特異性シグナルがFI
TCのような他の蛍光染料の蛍光強度から測定される方法
（EP 126540,GOIN 33/58）。
6. 短い減衰時間の蛍光を放出する染料（減衰時間数ナ
ノ秒）が微小粒子の同定のために用いられ、長い減衰時
間の蛍光を放出する染料（減衰時間10マイクロ秒〜２ミ
リ秒）が被検体濃度を測定するために用いられ、時間分
解分光光度計が短い及び長い寿命の蛍光の識別のために
用いられる方法（米国特許5,028,545）。
ノ秒）が微小粒子の同定のために用いられ、長い減衰時
間の蛍光を放出する染料（減衰時間10マイクロ秒〜２ミ
リ秒）が被検体濃度を測定するために用いられ、時間分
解分光光度計が短い及び長い寿命の蛍光の識別のために
用いられる方法（米国特許5,028,545）。
7. 短い減衰時間の蛍光を放出する染料（減衰時間数ナ
ノ秒）が微小粒子の同定のために用いられ、ケミルミネ
センス又はバイオルミネセンスを発生する分子（減衰時
間数秒）が被検体濃度を測定するのに用いられ、蛍光及
びルミネセンスシグナルが、励起され、異なる時間にお
いて光を放出することにより蛍光から効果的に分離され
得る方法（FI−特許89837）。
ノ秒）が微小粒子の同定のために用いられ、ケミルミネ
センス又はバイオルミネセンスを発生する分子（減衰時
間数秒）が被検体濃度を測定するのに用いられ、蛍光及
びルミネセンスシグナルが、励起され、異なる時間にお
いて光を放出することにより蛍光から効果的に分離され
得る方法（FI−特許89837）。
8. 短い減衰時間の蛍光を放出する染料（減衰時間数ナ
ノ秒）が微小粒子の同定のために用いられ、リン光を放
出する染料（減衰時間10マイクロ秒〜２ミリ秒）が被検
体濃度を測定するのに用いられ、そして時間分解フルオ
ロメーターが短い減衰時間の蛍光及び長い減衰時間のリ
ン光の間の識別のために用いられる方法（FI−特許9069
5）。
ノ秒）が微小粒子の同定のために用いられ、リン光を放
出する染料（減衰時間10マイクロ秒〜２ミリ秒）が被検
体濃度を測定するのに用いられ、そして時間分解フルオ
ロメーターが短い減衰時間の蛍光及び長い減衰時間のリ
ン光の間の識別のために用いられる方法（FI−特許9069
5）。
9. ランタノイドイオンTb,Dy,Eu及びSmの蛍光キレート
のような長い減衰時間の蛍光を放出する染料が微小粒子
の同定のため、及び生物特異的シグナルの測定のために
用いられる方法（FI−特許931198）。
のような長い減衰時間の蛍光を放出する染料が微小粒子
の同定のため、及び生物特異的シグナルの測定のために
用いられる方法（FI−特許931198）。
先に言及される多くのマルチパラメーターアッセイに
おける共通の問題は、被検体のカテゴリーを示すホトル
ミネセンスラベルのシグナル、及び生物特異性プローブ
の濃度を測定するホトルミネセンスラベルのシグナルが
互いを妨害することである。これは、被検体濃度の測定
の動的範囲を大きく制限する問題である。被検体の同定
のために用いられる指示体からのシグナルが生物特異性
アッセイの測定のために用いられるホトルミネセンスラ
ベルからのシグナルと干渉しないことが本発明の方法の
センシティビティーのために、並びに先に言及される及
び以前から周知のマルチパラメーターアッセイのために
本質的であるこの妨害は、低い被検体濃度を測定する場
合、及び広い動的範囲が、生物特有シグナルの測定のた
めに必要とされる場合に特に重大となり得る。先に言及
される方法6,7、及び８においては、実質的に異なる減
衰時間を有する生物特異性反応及び同定ラベルの測定の
ためにこのようなホトルミネセンスラベルを選択するこ
とにより妨害が除かれる。方法1,2,3及び４において
は、被検体はホトルミネセンスラベルを用いるよりむし
ろ代わりの方法を用いて同定される。方法５及び９にお
いては、被検体の同定方法は本質的に測定の動的範囲を
制限する。
おける共通の問題は、被検体のカテゴリーを示すホトル
ミネセンスラベルのシグナル、及び生物特異性プローブ
の濃度を測定するホトルミネセンスラベルのシグナルが
互いを妨害することである。これは、被検体濃度の測定
の動的範囲を大きく制限する問題である。被検体の同定
のために用いられる指示体からのシグナルが生物特異性
アッセイの測定のために用いられるホトルミネセンスラ
ベルからのシグナルと干渉しないことが本発明の方法の
センシティビティーのために、並びに先に言及される及
び以前から周知のマルチパラメーターアッセイのために
本質的であるこの妨害は、低い被検体濃度を測定する場
合、及び広い動的範囲が、生物特有シグナルの測定のた
めに必要とされる場合に特に重大となり得る。先に言及
される方法6,7、及び８においては、実質的に異なる減
衰時間を有する生物特異性反応及び同定ラベルの測定の
ためにこのようなホトルミネセンスラベルを選択するこ
とにより妨害が除かれる。方法1,2,3及び４において
は、被検体はホトルミネセンスラベルを用いるよりむし
ろ代わりの方法を用いて同定される。方法５及び９にお
いては、被検体の同定方法は本質的に測定の動的範囲を
制限する。
先に言及される方法6,7,8及び９に関連する他の問題
は、蛍光及びリン光ラベルの長い減衰時間（T1/2＝１ミ
リ秒）が原因である長い測定時間である。これは、１秒
までの測定時間が各々の微小粒子に必要とされるような
低いレベルに励起光の強度を制限するラベルの励起状態
の飽和のためである。同様に、ケミルミネセンス、バイ
オルミネセンス及びエレクトロルミネセンスに基づくラ
ベルからのシグナルの測定も少くとも１秒かかる。
は、蛍光及びリン光ラベルの長い減衰時間（T1/2＝１ミ
リ秒）が原因である長い測定時間である。これは、１秒
までの測定時間が各々の微小粒子に必要とされるような
低いレベルに励起光の強度を制限するラベルの励起状態
の飽和のためである。同様に、ケミルミネセンス、バイ
オルミネセンス及びエレクトロルミネセンスに基づくラ
ベルからのシグナルの測定も少くとも１秒かかる。
発明の概要
１つの態様において、本発明は、同じ反応溶液中の多
重の被検体Mk（ｋ＝1,2,…,k）の同時測定のための生物
特異性マルチパラメーターアッセイ方法であって、該方
法が、各々のサンプル分子Mkを、蛍光ラベルでラベルさ
れた少くとも２つの生物特異性プローブAb（ｊ）（ｊ＝
1,2）と反応させて複合体Ab（k,1）＋Mk＋Ab（k,2）を
供するステップと、 希釈剤を加えることにより前記反応を停止させるステ
ップと、 各々励起及び放射波長に調整されたレーザービーム及
び光子ディテクターを前記希釈溶液に焦点を合わせるス
テップと、 焦点を通して動いている単一分子からの単一光子の形
態における蛍光シグナル及びそれらの時間領域を記録す
るステップと、 を含むことを特徴とする方法に関する。その方法は、 前記第１の生物特異性プローブがDkとして言及される
べき蛍光ラベルD1,D2,D3,…Dkの組合せでラベルされ、
前記第２のプローブが蛍光ラベルＦでラベルされ、そし
て、前記複合体AbDK（k,1）＋Mk＋AbF（k,2）からのシ
グナルが、時間領域における自動相関及び異なるラベル
から得られたシグナルでの相互相関を適用することによ
りバックグラウンドシグナルから、及び他の分子のシグ
ナルから分離され、そしてその相関したシグナルが、被
検体分子Mkの数及びそれらのサンプル中の濃度を決定す
るためにDkに従って分類され、 ラベルDk及びＦの励起及び検出が光焦光学システムで
行われ、又は ラベルDk及びＦの励起が２光子励起により行われるこ
とを特徴とする。
重の被検体Mk（ｋ＝1,2,…,k）の同時測定のための生物
特異性マルチパラメーターアッセイ方法であって、該方
法が、各々のサンプル分子Mkを、蛍光ラベルでラベルさ
れた少くとも２つの生物特異性プローブAb（ｊ）（ｊ＝
1,2）と反応させて複合体Ab（k,1）＋Mk＋Ab（k,2）を
供するステップと、 希釈剤を加えることにより前記反応を停止させるステ
ップと、 各々励起及び放射波長に調整されたレーザービーム及
び光子ディテクターを前記希釈溶液に焦点を合わせるス
テップと、 焦点を通して動いている単一分子からの単一光子の形
態における蛍光シグナル及びそれらの時間領域を記録す
るステップと、 を含むことを特徴とする方法に関する。その方法は、 前記第１の生物特異性プローブがDkとして言及される
べき蛍光ラベルD1,D2,D3,…Dkの組合せでラベルされ、
前記第２のプローブが蛍光ラベルＦでラベルされ、そし
て、前記複合体AbDK（k,1）＋Mk＋AbF（k,2）からのシ
グナルが、時間領域における自動相関及び異なるラベル
から得られたシグナルでの相互相関を適用することによ
りバックグラウンドシグナルから、及び他の分子のシグ
ナルから分離され、そしてその相関したシグナルが、被
検体分子Mkの数及びそれらのサンプル中の濃度を決定す
るためにDkに従って分類され、 ラベルDk及びＦの励起及び検出が光焦光学システムで
行われ、又は ラベルDk及びＦの励起が２光子励起により行われるこ
とを特徴とする。
他の態様において、本発明は、単一蛍光分子又はそれ
らの複合体のための計数方法であって、 ラベルされた蛍光分子を含む回折制限容量にレーザー
ビーム及び光子ディテクターを焦点を合わす、ステップ
と、 該焦点の周りの焦点容量を通して動く単一分子からの
単一光子シグナル及びそれらの時間領域を記録するステ
ップと、 を含むことを特徴とする方法に関する。その方法は、
前記分子又はそれらの複合体の蛍光の励起が、２光子励
起により行われ、蛍光からのシグナルが時間領域におけ
る自動相関の手段によりバックグラウンドシグナルから
分離されることを特徴とする。
らの複合体のための計数方法であって、 ラベルされた蛍光分子を含む回折制限容量にレーザー
ビーム及び光子ディテクターを焦点を合わす、ステップ
と、 該焦点の周りの焦点容量を通して動く単一分子からの
単一光子シグナル及びそれらの時間領域を記録するステ
ップと、 を含むことを特徴とする方法に関する。その方法は、
前記分子又はそれらの複合体の蛍光の励起が、２光子励
起により行われ、蛍光からのシグナルが時間領域におけ
る自動相関の手段によりバックグラウンドシグナルから
分離されることを特徴とする。
図面の簡単な記載
図１は、本発明の方法に必要とされる測定システムの
機能図である。
機能図である。
図２は、ディテクターから得られたシグナルの例を表
す。
す。
発明の詳細な記載
これにより、本発明は、生物特異性反応物により結合
された分子の数が測定される分子計数の使用に基づく生
物特異性プローブをラベルするための蛍光ラベルを用い
る生物特異性マルチパラメーターアッセイに関する。分
子計数は、その方法が溶液中の生物特異性分子の個々の
蛍光複合体からの蛍光シグナルを記録することができる
センシティブな単一光子計数システムを用いることを意
味する。
された分子の数が測定される分子計数の使用に基づく生
物特異性プローブをラベルするための蛍光ラベルを用い
る生物特異性マルチパラメーターアッセイに関する。分
子計数は、その方法が溶液中の生物特異性分子の個々の
蛍光複合体からの蛍光シグナルを記録することができる
センシティブな単一光子計数システムを用いることを意
味する。
光の回折により制限された極めて小さな測定容量内で
共焦蛍光計で単一分子を計数することは文献において周
知である（A.Castro ＆ al.,Anal Chem 65（1993）849
〜852;S.Nie ＆ al.,Science 266（1994）1018〜1021,E
P038169,WO 90/14589）。
共焦蛍光計で単一分子を計数することは文献において周
知である（A.Castro ＆ al.,Anal Chem 65（1993）849
〜852;S.Nie ＆ al.,Science 266（1994）1018〜1021,E
P038169,WO 90/14589）。
本発明は、単一分子検出の方法を用いるマルチパラメ
ーター生物特異性アッセイのための新しい方法に関す
る。特に、本発明は、同じ反応溶液中でいくつかの異な
る生物分子を同時に測定するための新しい方法に関す
る。本方法は、生物特異性第１プローブをラベルするた
めの蛍光ラベル及び第２のプローブに結合した他のラベ
ルの組合せを用いる。生物特異性反応において第１のプ
ローブ、被検体分子及び第２のプローブを含む誘導体が
形成される。これらの単一分子複合体は選択的に計数さ
れ；他の蛍光分子からのシグナルは前記蛍光ラベルから
得られたシグナルの自動−及び相互−相関を含む共焦蛍
光法又は２光子励起蛍光法を用いて識別される。
ーター生物特異性アッセイのための新しい方法に関す
る。特に、本発明は、同じ反応溶液中でいくつかの異な
る生物分子を同時に測定するための新しい方法に関す
る。本方法は、生物特異性第１プローブをラベルするた
めの蛍光ラベル及び第２のプローブに結合した他のラベ
ルの組合せを用いる。生物特異性反応において第１のプ
ローブ、被検体分子及び第２のプローブを含む誘導体が
形成される。これらの単一分子複合体は選択的に計数さ
れ；他の蛍光分子からのシグナルは前記蛍光ラベルから
得られたシグナルの自動−及び相互−相関を含む共焦蛍
光法又は２光子励起蛍光法を用いて識別される。
本発明により用いられる方法において、その複合体は
Ab（k,1）＋Mk＋AbF（k,2）として言及される。分子計
数で複合体と遊離蛍光ラベルAbF（k,2）との間を識別す
るために、本方法は、蛍光ラベルＦに加えて他の蛍光ラ
ベルＤを用いる。ラベルＤは第１のプローブAb（k,1）
に結合する。これにより計数されるべき分子複合体の構
造はAbDk（k,1）＋Mk＋AbF（k,2）である。本発明の方
法において、分子計数の選択性は共焦蛍光分析に、又は
２光子励起蛍光分析に基づき、そして蛍光ラベルＦ及び
Ｄからのシグナルの時間ドメインにおける自動相関及び
相互相関に基づく。これは後でより詳細に説明されよ
う。本発明の方法において、マルチパラメトリシティ
ー、即ち同じ反応溶液からの多くの被検体の同時の測定
は、蛍光ラベルD1,D2,D3,…Dkの組合せが、被検体の同
定の目的のためにDkとして言及される第１のラベルとし
て用いられる方法に基づく。ラベルD1,D2,D3,…Dkの放
射は互いにスペクトルで分離され得る異なる波長におい
て現れる。先に言及される相関計算で、ラベルDkの組合
せからの指数ｋは付加的なパラメーターとして機能し、
被検体Mkの名前（後のカテゴリー）を表現する。
Ab（k,1）＋Mk＋AbF（k,2）として言及される。分子計
数で複合体と遊離蛍光ラベルAbF（k,2）との間を識別す
るために、本方法は、蛍光ラベルＦに加えて他の蛍光ラ
ベルＤを用いる。ラベルＤは第１のプローブAb（k,1）
に結合する。これにより計数されるべき分子複合体の構
造はAbDk（k,1）＋Mk＋AbF（k,2）である。本発明の方
法において、分子計数の選択性は共焦蛍光分析に、又は
２光子励起蛍光分析に基づき、そして蛍光ラベルＦ及び
Ｄからのシグナルの時間ドメインにおける自動相関及び
相互相関に基づく。これは後でより詳細に説明されよ
う。本発明の方法において、マルチパラメトリシティ
ー、即ち同じ反応溶液からの多くの被検体の同時の測定
は、蛍光ラベルD1,D2,D3,…Dkの組合せが、被検体の同
定の目的のためにDkとして言及される第１のラベルとし
て用いられる方法に基づく。ラベルD1,D2,D3,…Dkの放
射は互いにスペクトルで分離され得る異なる波長におい
て現れる。先に言及される相関計算で、ラベルDkの組合
せからの指数ｋは付加的なパラメーターとして機能し、
被検体Mkの名前（後のカテゴリー）を表現する。
本発明の方法は次のステップ：
被検体Mk並びにプローブAbDk（k,1）及びAbF（k,2）
が適切な反応溶液に添加され（ｋ＝1,2,3,…,k） その反応が希釈剤を加えることにより停止され その希釈されたサンプルが薄いフローセルを通して供
され その後者がラベルＦ及びDkの放射波長に調整されるレ
ーザービーム及び光子ディテクターが光学系で動いてい
るサンプルに焦点を合わせられ 単一分子からの単一光子蛍光シグナルがシグナルの到
達時間と共に記録され 複合体AbDk（k,1）＋Mk＋AbF（k,2）からのシグナル
が、時間領域における自動相関及び相互相関をシグナル
光子カウントに適用することにより、ノイズシグナル及
び他の分子からのシグナルから分離され 先のシグナルが指数ｋに従って分類され、これにより
被検体の数Mk及びそれらの濃度に相当する数値の結果が
得られる ことを含む。
が適切な反応溶液に添加され（ｋ＝1,2,3,…,k） その反応が希釈剤を加えることにより停止され その希釈されたサンプルが薄いフローセルを通して供
され その後者がラベルＦ及びDkの放射波長に調整されるレ
ーザービーム及び光子ディテクターが光学系で動いてい
るサンプルに焦点を合わせられ 単一分子からの単一光子蛍光シグナルがシグナルの到
達時間と共に記録され 複合体AbDk（k,1）＋Mk＋AbF（k,2）からのシグナル
が、時間領域における自動相関及び相互相関をシグナル
光子カウントに適用することにより、ノイズシグナル及
び他の分子からのシグナルから分離され 先のシグナルが指数ｋに従って分類され、これにより
被検体の数Mk及びそれらの濃度に相当する数値の結果が
得られる ことを含む。
周知の方法と比較した本発明の利点
生物特異性反応の強みは、被検体濃度が生物特異性反
応により作り得される分子複合体の数として本方法にお
いて測定されることである。シグナルは、各々の個々の
分子の複合体から分離して得られる。分子計数において
シグナルは特徴的に０又は１であるので、極めて狭いダ
イナミックレンジは蛍光シグナルＦ及びDkを測定するた
めに十分である。これにより、慣用的な蛍光ラベルは、
カテゴリーを同定すること及び異なる蛍光ラベルのオー
バーラップするスペクトルにより引きおこされる干渉か
らのいずれの害もなく生物特異性シグナルを測定するこ
とのために用いられ得る。これは、その両方が短い減衰
時間を有し、通常の分光法がシグナル間を識別するのに
用いられるが、同定シグナルが生物特異性シグナルと干
渉しないことを意味する。
応により作り得される分子複合体の数として本方法にお
いて測定されることである。シグナルは、各々の個々の
分子の複合体から分離して得られる。分子計数において
シグナルは特徴的に０又は１であるので、極めて狭いダ
イナミックレンジは蛍光シグナルＦ及びDkを測定するた
めに十分である。これにより、慣用的な蛍光ラベルは、
カテゴリーを同定すること及び異なる蛍光ラベルのオー
バーラップするスペクトルにより引きおこされる干渉か
らのいずれの害もなく生物特異性シグナルを測定するこ
とのために用いられ得る。これは、その両方が短い減衰
時間を有し、通常の分光法がシグナル間を識別するのに
用いられるが、同定シグナルが生物特異性シグナルと干
渉しないことを意味する。
本発明の方法において、慣用の有機蛍光染料は、生物
特異性試薬のための蛍光ラベルＦとして用いられ得る。
これらの染料の利点は、励起光のそれらの高い吸収及び
蛍光の高い量子効率である。
特異性試薬のための蛍光ラベルＦとして用いられ得る。
これらの染料の利点は、励起光のそれらの高い吸収及び
蛍光の高い量子効率である。
数ナノ秒の放出減衰時間を有する蛍光ラベルが本発明
の方法に用いられるので、励起光の強度は長い減衰時間
の蛍光ラベルの励起強度より106倍まで高くなり得る。
極めてより強いシグナルが短い減衰時間を有するラベル
から得られ得、相応じて相当により迅速に測定され得
る。これは、１分子を検出するために必要とされる時間
が極めて短い、例えば100マイクロ秒であり、多くの分
子が１つのアッセイで利用できる時間内に測定され得、
これによりより高い正確性及び精度を生ずる利点を有す
る。
の方法に用いられるので、励起光の強度は長い減衰時間
の蛍光ラベルの励起強度より106倍まで高くなり得る。
極めてより強いシグナルが短い減衰時間を有するラベル
から得られ得、相応じて相当により迅速に測定され得
る。これは、１分子を検出するために必要とされる時間
が極めて短い、例えば100マイクロ秒であり、多くの分
子が１つのアッセイで利用できる時間内に測定され得、
これによりより高い正確性及び精度を生ずる利点を有す
る。
共焦原理での本発明の実現
図１は、本発明の方法のために必要とされる測定シス
テムの機能図である。それは共焦原理で現実化される。
図は、その組合せが記号Dkだマークされる２つの蛍光ラ
ベルd1及びd2が被検体の同定のために用いられることが
仮定される例を示す。蛍光の励起のために用いられるレ
ーザー（１）は、レンズ（2a）及び対物レンズ（2b）を
通してサンプル（３）を含むキュベット（４）に集中さ
れる。サンプルからの蛍光シグナルは、ピンホール
（６）並びに２色鏡（７）及び（８）を通して各々ラベ
ルF,d1及びd2の放射波長に調整された（９），（10）及
び（11）のディテクターに達する。ディテクター
（９），（10）及び（11）はシグナルプロセッサー（1
2）に接続される。シグナルプロセッサーは相関計算を
処理し、その結果はハードウェアを制御するコンピュー
ター（13）内で処理される。ラベルＦ及びDkは、それら
の励起波長が異なるか、又はより優れた結果が２つのレ
ーザーを用いることにより達成されるなら、異なるレー
ザーでも励起され得る。この場合において、両方のレー
ザーは動くサンプルの同じ又は隣接した点に集中され
る。
テムの機能図である。それは共焦原理で現実化される。
図は、その組合せが記号Dkだマークされる２つの蛍光ラ
ベルd1及びd2が被検体の同定のために用いられることが
仮定される例を示す。蛍光の励起のために用いられるレ
ーザー（１）は、レンズ（2a）及び対物レンズ（2b）を
通してサンプル（３）を含むキュベット（４）に集中さ
れる。サンプルからの蛍光シグナルは、ピンホール
（６）並びに２色鏡（７）及び（８）を通して各々ラベ
ルF,d1及びd2の放射波長に調整された（９），（10）及
び（11）のディテクターに達する。ディテクター
（９），（10）及び（11）はシグナルプロセッサー（1
2）に接続される。シグナルプロセッサーは相関計算を
処理し、その結果はハードウェアを制御するコンピュー
ター（13）内で処理される。ラベルＦ及びDkは、それら
の励起波長が異なるか、又はより優れた結果が２つのレ
ーザーを用いることにより達成されるなら、異なるレー
ザーでも励起され得る。この場合において、両方のレー
ザーは動くサンプルの同じ又は隣接した点に集中され
る。
共焦セット・アップの原理は図１を引用して以下に記
載される。最初に、対物レンズ（2b）の焦点面（３）へ
の点様光源（１）のイメージングが記載される。回折の
ため、点様光源は、焦点面において光学系に特徴的であ
る強度分布を形成する。強度分布は、３次元で決定され
る点像強度分布関数と呼ばれる。標準化された点像強度
分布関数は、点様光源から放出された光子が焦点距離
（３）上にいかに分散するかの確率S1;即ち光子がサン
プル容量の異なる部分に吸収される確率を規定する。
載される。最初に、対物レンズ（2b）の焦点面（３）へ
の点様光源（１）のイメージングが記載される。回折の
ため、点様光源は、焦点面において光学系に特徴的であ
る強度分布を形成する。強度分布は、３次元で決定され
る点像強度分布関数と呼ばれる。標準化された点像強度
分布関数は、点様光源から放出された光子が焦点距離
（３）上にいかに分散するかの確率S1;即ち光子がサン
プル容量の異なる部分に吸収される確率を規定する。
対応する点像強度分布関数S2は、ディテクターの前の
ピンホールに達する焦点から放出される光子の空間的分
布でも決定され得る。その焦点の近隣におけるこの標準
化関数の値は、異なる点から放出され、ピンホール
（６）に当たる光子の確率を規定する。
ピンホールに達する焦点から放出される光子の空間的分
布でも決定され得る。その焦点の近隣におけるこの標準
化関数の値は、異なる点から放出され、ピンホール
（６）に当たる光子の確率を規定する。
本発明の方法及び装置に適用される共焦光学系におい
て、光源（１）及びピンホール（６）は同じ焦点（３）
に焦点を合わせられる。点様光源（１）から放射された
光子がサンプル中で蛍光放出が引きおこし、放出された
光子がピンホール（６）に当たる確率は照射及び検出強
度分布の標準化した積S1×S2により記載される。これに
より得えられた確率分布は３次元であり、特に軸方向に
おける慣用的光学構成物により製造されたものより明ら
かに制限される。共焦システムにおいて測定されるべき
流体容量は慣用的光学系におけるものよりかなり小さ
い。大きい開口数（N.A.＝1.4）を有する対物レンズ及
び共焦系を用いる場合、アクティブな流体体積は慣用的
光学系において要求されるものの10分の１未満に削減さ
れる。観察下の流体体積は横方向より軸方向に明らかに
大きく、開口数（N.A.）の平方根に比例する。
て、光源（１）及びピンホール（６）は同じ焦点（３）
に焦点を合わせられる。点様光源（１）から放射された
光子がサンプル中で蛍光放出が引きおこし、放出された
光子がピンホール（６）に当たる確率は照射及び検出強
度分布の標準化した積S1×S2により記載される。これに
より得えられた確率分布は３次元であり、特に軸方向に
おける慣用的光学構成物により製造されたものより明ら
かに制限される。共焦システムにおいて測定されるべき
流体容量は慣用的光学系におけるものよりかなり小さ
い。大きい開口数（N.A.＝1.4）を有する対物レンズ及
び共焦系を用いる場合、アクティブな流体体積は慣用的
光学系において要求されるものの10分の１未満に削減さ
れる。観察下の流体体積は横方向より軸方向に明らかに
大きく、開口数（N.A.）の平方根に比例する。
アクティブな流体容量は、システムの開口数がサンプ
ルの共焦観測のために互いに反対に位置した２つの対物
レンズで増加されていることを示す文献（Eur.特許出願
91121368.4）に既に証明されている共焦原理により更に
削減され得る。この系において、照射及び検出は、対物
レンズ及び観測下である流体容量の両方が１つの対物レ
ンズを有する慣用の共焦顕微鏡と比較して少くとも半分
まで更に削減されて、同時かつ干渉的におこる。更に、
検出のセンシティビティーは、より高い開口数のため改
良される。
ルの共焦観測のために互いに反対に位置した２つの対物
レンズで増加されていることを示す文献（Eur.特許出願
91121368.4）に既に証明されている共焦原理により更に
削減され得る。この系において、照射及び検出は、対物
レンズ及び観測下である流体容量の両方が１つの対物レ
ンズを有する慣用の共焦顕微鏡と比較して少くとも半分
まで更に削減されて、同時かつ干渉的におこる。更に、
検出のセンシティビティーは、より高い開口数のため改
良される。
共焦システムにおいて高い開口数を有する対物レンズ
を用いることが可能でないなら、例えば、互いに90度の
角度で取り付けられた２つの共焦対物レンズを用いるこ
とにより軸方向での観測下でその容量を減少させること
が可能である（E.Steltzer ＆ al.,Opt.Commun.111（19
94）536〜547）。この方法は、先に記載される方法のよ
うにシステムの開口数を増加させないが、バックグラウ
ンドシグナル及び特に後方散乱を削減することが実用的
である。
を用いることが可能でないなら、例えば、互いに90度の
角度で取り付けられた２つの共焦対物レンズを用いるこ
とにより軸方向での観測下でその容量を減少させること
が可能である（E.Steltzer ＆ al.,Opt.Commun.111（19
94）536〜547）。この方法は、先に記載される方法のよ
うにシステムの開口数を増加させないが、バックグラウ
ンドシグナル及び特に後方散乱を削減することが実用的
である。
共焦測定システムであるにかかわらず、散乱及び自己
蛍光により引きおこされるバックグラウンドシグナルは
分子計数のセンシティビティーを減少させる。しかし、
蛍光ラベルのシグナルを測定する場合、バックグラウン
ドシグナルは、優れたスペクトル識別に加えて、ディテ
クターからの確率的ポアソン分布した光子からのシグナ
ルの自己相関を用いることにより減少され得る（PCT WO
94/16313;S.A.Soper ＆ al.,Anal Chem 63（1991）432
〜437;M.Eiger ＆ al.,Proc Nat Acad Sci USA 91（199
4）5740〜5747）。
蛍光により引きおこされるバックグラウンドシグナルは
分子計数のセンシティビティーを減少させる。しかし、
蛍光ラベルのシグナルを測定する場合、バックグラウン
ドシグナルは、優れたスペクトル識別に加えて、ディテ
クターからの確率的ポアソン分布した光子からのシグナ
ルの自己相関を用いることにより減少され得る（PCT WO
94/16313;S.A.Soper ＆ al.,Anal Chem 63（1991）432
〜437;M.Eiger ＆ al.,Proc Nat Acad Sci USA 91（199
4）5740〜5747）。
文献において証明された自己相関に加えて、シグナル
分子から得られたシグナルの識別は、本発明に従う方法
におけるシグナルＦ及びDkの相互相関により改良され
る。本発明において、相互相関は、遊離したラベルされ
た化合物から複合体AbDk（k,1）＋Mk＋AbF（k,2）を区
別するのに適用される。相互相関を行うために、複合体
の各々のラベルのための自己相関条件も測定時間窓内で
行うのに必要とされる。例えば、１つのＦ及び１つのＤ
ラベルでの複合体において、相互相関条件に達する確率
はＦ及びＤのための自己相関関数の条件を満たす確率の
積である。パルスの列の相互及び自己相関は、シグナル
プロセッサーで、又は図１に示される装置（12）の結合
論理で計算される。
分子から得られたシグナルの識別は、本発明に従う方法
におけるシグナルＦ及びDkの相互相関により改良され
る。本発明において、相互相関は、遊離したラベルされ
た化合物から複合体AbDk（k,1）＋Mk＋AbF（k,2）を区
別するのに適用される。相互相関を行うために、複合体
の各々のラベルのための自己相関条件も測定時間窓内で
行うのに必要とされる。例えば、１つのＦ及び１つのＤ
ラベルでの複合体において、相互相関条件に達する確率
はＦ及びＤのための自己相関関数の条件を満たす確率の
積である。パルスの列の相互及び自己相関は、シグナル
プロセッサーで、又は図１に示される装置（12）の結合
論理で計算される。
図１のディテクター（９），（10）及び（11）からの
シグナルは、例えば10ナノ秒間の遅延でのバイナリーデ
ジタルシグナルに変換される特徴的な単一光子シグナル
である。図２は、時間スケール（Ａ），（Ｂ）及び
（Ｃ）におけるディテクター（９），（10）及び（11）
（図１）から得られたパルスの例を供する。分子は、共
焦光学構成物の点像強度分布関数により規定される容量
内のレーザービームの励起下で時間tmにとどまる。実際
に、時間tmはキュベット（４、図１）内側の流れの速度
に依存し、典型的に100マイクロ秒である。ラベルＦの
励起のために用いられるレーザービームの強度は焦点
（３）において高いので、それは励起状態をほとんど飽
和し得る。蛍光ラベルＦの減衰時間は、時間間隔tm＝10
0マイクロ秒内で約１〜10ナノ秒のみであるので、それ
らは強力なレーザービームの影響下で104回、励起して
緩和する。ディテクターにより観測される光子の数は、
ラベルＦの量子効率、光学構成物（2a,2b,4）のための
相関効率及び損失並びに光子ディテクター（９）の量子
効率による。実際、10-3の検出効率は、光電子増倍管を
用いる場合に得られ、10-2が、80％量子効率のアバラン
シェ光子カウンター（EG ＆ G Optoelectronics,Canad
a,type SPCM−141−AQ）を用いて得られる。レーザービ
ームの露出時間tm内において、ディテクター（９）は、
アクティブな容量を通して流れる１つの分子から発する
蛍光放出から最少で10の光子を検出することができる。
光子は、tmの時間間隔内で確率的光子バーストとして現
れる。これらのバーストに加えて、多くの他の確率的シ
グナルも検出され得る（セクション２、図２）。それら
は、バックグラウンド蛍光、サンプル中の他の分子、散
乱及び熱ノイズから生ずる。確率的シグナルの大半は、
正確な自己相関パラメーターを選択することにより自己
相関で除去され得る。同様に、一緒になったいくつかの
複合体により、又は凝集した分子により引きおこされた
シグナルは、自己相関パラメーターの適切な選択により
除去され得る。
シグナルは、例えば10ナノ秒間の遅延でのバイナリーデ
ジタルシグナルに変換される特徴的な単一光子シグナル
である。図２は、時間スケール（Ａ），（Ｂ）及び
（Ｃ）におけるディテクター（９），（10）及び（11）
（図１）から得られたパルスの例を供する。分子は、共
焦光学構成物の点像強度分布関数により規定される容量
内のレーザービームの励起下で時間tmにとどまる。実際
に、時間tmはキュベット（４、図１）内側の流れの速度
に依存し、典型的に100マイクロ秒である。ラベルＦの
励起のために用いられるレーザービームの強度は焦点
（３）において高いので、それは励起状態をほとんど飽
和し得る。蛍光ラベルＦの減衰時間は、時間間隔tm＝10
0マイクロ秒内で約１〜10ナノ秒のみであるので、それ
らは強力なレーザービームの影響下で104回、励起して
緩和する。ディテクターにより観測される光子の数は、
ラベルＦの量子効率、光学構成物（2a,2b,4）のための
相関効率及び損失並びに光子ディテクター（９）の量子
効率による。実際、10-3の検出効率は、光電子増倍管を
用いる場合に得られ、10-2が、80％量子効率のアバラン
シェ光子カウンター（EG ＆ G Optoelectronics,Canad
a,type SPCM−141−AQ）を用いて得られる。レーザービ
ームの露出時間tm内において、ディテクター（９）は、
アクティブな容量を通して流れる１つの分子から発する
蛍光放出から最少で10の光子を検出することができる。
光子は、tmの時間間隔内で確率的光子バーストとして現
れる。これらのバーストに加えて、多くの他の確率的シ
グナルも検出され得る（セクション２、図２）。それら
は、バックグラウンド蛍光、サンプル中の他の分子、散
乱及び熱ノイズから生ずる。確率的シグナルの大半は、
正確な自己相関パラメーターを選択することにより自己
相関で除去され得る。同様に、一緒になったいくつかの
複合体により、又は凝集した分子により引きおこされた
シグナルは、自己相関パラメーターの適切な選択により
除去され得る。
アバランシェダイオード光子カウンターは、10-3の確
率で同時に発する後のパルスを発生し得る。アバランシ
ェ光子カウンター、及び光電子増倍管は、確率的カウン
トとして現れる熱ノイズを被る。後のパルス及びノイズ
は、以下のかわりの方法で除去され得る。アバランシェ
光子カウンターからのシグナルを３カウント以上のしき
い値で自己相関することは、後のパルスにより引きおこ
されるバックグラウンドを除去するが、これは検出効率
の代償で行われる。２つの分離した光子カウンターのた
めに、相互相関を用いて50％/50％ビームスプリッター
で、放出ビームを２つの部分に分けることにより、後の
パルス及び熱ノイズを識別することが可能である。増加
した光学的損失は増加したレーザー出力で補われ得る。
率で同時に発する後のパルスを発生し得る。アバランシ
ェ光子カウンター、及び光電子増倍管は、確率的カウン
トとして現れる熱ノイズを被る。後のパルス及びノイズ
は、以下のかわりの方法で除去され得る。アバランシェ
光子カウンターからのシグナルを３カウント以上のしき
い値で自己相関することは、後のパルスにより引きおこ
されるバックグラウンドを除去するが、これは検出効率
の代償で行われる。２つの分離した光子カウンターのた
めに、相互相関を用いて50％/50％ビームスプリッター
で、放出ビームを２つの部分に分けることにより、後の
パルス及び熱ノイズを識別することが可能である。増加
した光学的損失は増加したレーザー出力で補われ得る。
単一光子バーストのための相関分析を行う図１の装置
（12）は、予めセットされた各々のディテクターからの
単一光子カウントの数が予めセットされた時間内に到達
するなら出力シグナルを与える電子論理回路であり得
る。その回路は、より複雑な相関関数も行うことがで
き、その回路はデジタルシグナルプロセッサー内に、又
は慣用のコンピューター上にロードされた特別のコンピ
ューターソフトウェアにより置き換えられ得る。
（12）は、予めセットされた各々のディテクターからの
単一光子カウントの数が予めセットされた時間内に到達
するなら出力シグナルを与える電子論理回路であり得
る。その回路は、より複雑な相関関数も行うことがで
き、その回路はデジタルシグナルプロセッサー内に、又
は慣用のコンピューター上にロードされた特別のコンピ
ューターソフトウェアにより置き換えられ得る。
終始、流速により、分子がレーザービームの励起下に
100マイクロ秒とどまることが仮定された。分子はレー
ザービームにランダムに達するので、そして２粒子以上
の組合せは許容されないので、微小粒子の計数頻度は多
くとも1000分子／秒である。例えば各々の種類の10000
分子がカウントされるなら、そして10の異なる種類があ
るなら、１つのサンプルを測定するために100秒かかる
だろう。
100マイクロ秒とどまることが仮定された。分子はレー
ザービームにランダムに達するので、そして２粒子以上
の組合せは許容されないので、微小粒子の計数頻度は多
くとも1000分子／秒である。例えば各々の種類の10000
分子がカウントされるなら、そして10の異なる種類があ
るなら、１つのサンプルを測定するために100秒かかる
だろう。
発色団Dkの蛍光シグナルは、Ｆのそれと同様のバース
ト（図２のＢ及びＣ）として現れ、それらは発色団Dkの
放射波長に調整された光子ディテクター（図１の10及び
11）で、先に記載されるように検出される。自己相関に
加え、シグナルＦ並びにシグナルD1及びD2の相互相関が
シグナル分析に適用される。これは、ディテクター
（５），（６）及び（７）（図１）からの各々シグナル
A,B及びＣ（図２）が相関されることを意味する。この
方法において、流れる分子複合体AbDk（k,1）＋Mk＋AbF
（k,2）の重要な部分が検出され得；同時に、他のソー
スからのバックグラウンドシグナルのレベルが最小化さ
れ得る。そのシステムのセンシティビティーは、相関法
で選択されたシグナルの比率とランダムなバッグクラウ
ンドから、及び非特異的複合体の形成から生ずるものと
の間の関係により規定される。より厳しい相関条件は分
子からの受け入れられるパルスの比率を減少させるが、
誤ったカウントの比率が更により迅速に削減され、これ
によりシグナル対ノイズ比が改良されることが明らかで
ある。この場合、要求される統計的精度を達成するため
に、より大きなサンプル容量がそれゆえ必要とされる。
同様に、相互相関は各々の適用とは別に最適化されなけ
ればならない。
ト（図２のＢ及びＣ）として現れ、それらは発色団Dkの
放射波長に調整された光子ディテクター（図１の10及び
11）で、先に記載されるように検出される。自己相関に
加え、シグナルＦ並びにシグナルD1及びD2の相互相関が
シグナル分析に適用される。これは、ディテクター
（５），（６）及び（７）（図１）からの各々シグナル
A,B及びＣ（図２）が相関されることを意味する。この
方法において、流れる分子複合体AbDk（k,1）＋Mk＋AbF
（k,2）の重要な部分が検出され得；同時に、他のソー
スからのバックグラウンドシグナルのレベルが最小化さ
れ得る。そのシステムのセンシティビティーは、相関法
で選択されたシグナルの比率とランダムなバッグクラウ
ンドから、及び非特異的複合体の形成から生ずるものと
の間の関係により規定される。より厳しい相関条件は分
子からの受け入れられるパルスの比率を減少させるが、
誤ったカウントの比率が更により迅速に削減され、これ
によりシグナル対ノイズ比が改良されることが明らかで
ある。この場合、要求される統計的精度を達成するため
に、より大きなサンプル容量がそれゆえ必要とされる。
同様に、相互相関は各々の適用とは別に最適化されなけ
ればならない。
実施例
条件的測定状況において自己相関及び相互相関を適用
する典型的計算を以下に示す。アクティブな容量内で、
１つのＦ及び１つのＤがあり、それらの量子効率が100
％であり、時間窓が100マイクロ秒であり、そしてディ
テクターの熱バックグラウンドが104パルス／秒である
ことが仮定された。単一の光子のためのシステムの光学
的及び電子的検出効率は10-3であり、ラベルの励起状態
の寿命は5nsであり、そしてそれにより引きおこされる
ラベルの励起状態の励起比率は２×107/秒であり、そし
て、自己相関の許容の限界は期待値１の60％（しかしな
がら、最も近いより大きな整数ａに）であることが仮定
された。
する典型的計算を以下に示す。アクティブな容量内で、
１つのＦ及び１つのＤがあり、それらの量子効率が100
％であり、時間窓が100マイクロ秒であり、そしてディ
テクターの熱バックグラウンドが104パルス／秒である
ことが仮定された。単一の光子のためのシステムの光学
的及び電子的検出効率は10-3であり、ラベルの励起状態
の寿命は5nsであり、そしてそれにより引きおこされる
ラベルの励起状態の励起比率は２×107/秒であり、そし
て、自己相関の許容の限界は期待値１の60％（しかしな
がら、最も近いより大きな整数ａに）であることが仮定
された。
ポアソン分布の点確率Pk（等式１）が先に記載される
測定条件（１（シグナル）＝2,1（バックグラウンド）
＝1,a＝２）に適用されるなら、単一分子の検出のポア
ソン確率Pa（シグナル）は0.865であり、バックグラウ
ンドの検出の確率Pa（バックグラウンド）は0.632とな
ろう。相関条件ａ＝２の値及び等式２を適用した後、単
一光子カウントの検出の確率は0.59となり、バックグラ
ウンドカウントの検出の確率は0.26となろう。両発色団
のシグナルが相互相関される場合、分子複合体の検出の
確率〔PA（シグナル）〕２は0.35となり、バックグラウ
ンドカウントの検出の確率〔PA（バックグラウンド）〕
２は0.07となろう。これにより、自己相関及び相互相関
の組合せは1.4〜5.0シグナル対ノイズ比を改良すると結
論づけられ得る。２〜３の自己相関条件の値を増加させ
ることはシグナル対ノイズを比を16.7の値に改善する。
測定条件（１（シグナル）＝2,1（バックグラウンド）
＝1,a＝２）に適用されるなら、単一分子の検出のポア
ソン確率Pa（シグナル）は0.865であり、バックグラウ
ンドの検出の確率Pa（バックグラウンド）は0.632とな
ろう。相関条件ａ＝２の値及び等式２を適用した後、単
一光子カウントの検出の確率は0.59となり、バックグラ
ウンドカウントの検出の確率は0.26となろう。両発色団
のシグナルが相互相関される場合、分子複合体の検出の
確率〔PA（シグナル）〕２は0.35となり、バックグラウ
ンドカウントの検出の確率〔PA（バックグラウンド）〕
２は0.07となろう。これにより、自己相関及び相互相関
の組合せは1.4〜5.0シグナル対ノイズ比を改良すると結
論づけられ得る。２〜３の自己相関条件の値を増加させ
ることはシグナル対ノイズを比を16.7の値に改善する。
プローブが１以上のラベル分子でラベルされるか、又
はいくつかの他の理由のために、（後にバーストとして
言及される）１以上のパルスが時間窓内にラベルから得
られるなら、自己相関を用いてシグナル対ノイズ比にお
ける向上を達成することが可能である。この場合、その
向上には先の例におけるものよりかなり高い。異なる測
定条件下における、異なる量の蛍光ラベルＦ及びＤでの
シグナル対バックグラウンド比が表１に示される。表１
における記号Ｎ（Ｆ）及びＮ（ｄ）は複合体当りのラベ
ル分子Ｆ及びＤの数を各々示し;S/Nは自己相関のシグナ
ル対バックグラウンド比を示し；そしてＰ（det）は自
己相関後のシグナルの検出確率である。
はいくつかの他の理由のために、（後にバーストとして
言及される）１以上のパルスが時間窓内にラベルから得
られるなら、自己相関を用いてシグナル対ノイズ比にお
ける向上を達成することが可能である。この場合、その
向上には先の例におけるものよりかなり高い。異なる測
定条件下における、異なる量の蛍光ラベルＦ及びＤでの
シグナル対バックグラウンド比が表１に示される。表１
における記号Ｎ（Ｆ）及びＮ（ｄ）は複合体当りのラベ
ル分子Ｆ及びＤの数を各々示し;S/Nは自己相関のシグナ
ル対バックグラウンド比を示し；そしてＰ（det）は自
己相関後のシグナルの検出確率である。
この場合分子計数のダイナミックレンジに等しいシグ
ナル対バックグラウンド比は、１以上の蛍光ラベルが複
合体中に用いられる場合に実質的に増加されることが表
１の結果から結論づけられ得る。この場合、非特異的反
応及びシグナルがダイナミックレンジの主な制限因子で
ある。
ナル対バックグラウンド比は、１以上の蛍光ラベルが複
合体中に用いられる場合に実質的に増加されることが表
１の結果から結論づけられ得る。この場合、非特異的反
応及びシグナルがダイナミックレンジの主な制限因子で
ある。
２光子励起
先に供される文献において、蛍光ラベルは、蛍光ラベ
ルの発色団がレーザービームの波長において光を吸収す
ることを意味する単一光子励起されている。本発明に従
う方法において、２光子励起が単一光子励起及び共焦光
学構成物と置きかわり、自己蛍光により、及び特に散乱
により引きおこされるバックグラウンドを削減する。２
光子励起は、強い光源を集中することにより、単位容量
当り及び単位時間当りの光子の密度が、２つの光子と同
じ発色団内に吸収されるのに十分に高くなる場合に用い
られる。この場合、吸収されたエネルギーは、２光子の
エネルギーの総計である。1930年代の既に、蛍光材料の
２光子励起が理論的に知られており、1960年代から、分
光法及び顕微鏡法の分野に適用されている（M.J.Sepani
ak ＆ al.,Anal.Chem.49（1977）1554〜1556,米国特許
5,034,613）。確率の概念に従って、発色団による単一
光子の吸収は独立した出来事であり、いくつかの光子の
吸収は一連の単一の独立した出来事である。単一光子の
吸収の確率は、励起されるべきエネルギー状態から飽和
されない限り線形関数として記載され得る。２光子の吸
収は第２の種類の非線形方法である。２光子励起におい
て、発色団は、約１フェムトセカンド内である両光子が
同時に吸収される場合にのみ励起される。２光子の吸収
の確率は単一光子の吸収の確率分布の積に等しい。これ
により、２光子により引きおこされる蛍光放出の強度は
照射の光子密度の２次処理である。
ルの発色団がレーザービームの波長において光を吸収す
ることを意味する単一光子励起されている。本発明に従
う方法において、２光子励起が単一光子励起及び共焦光
学構成物と置きかわり、自己蛍光により、及び特に散乱
により引きおこされるバックグラウンドを削減する。２
光子励起は、強い光源を集中することにより、単位容量
当り及び単位時間当りの光子の密度が、２つの光子と同
じ発色団内に吸収されるのに十分に高くなる場合に用い
られる。この場合、吸収されたエネルギーは、２光子の
エネルギーの総計である。1930年代の既に、蛍光材料の
２光子励起が理論的に知られており、1960年代から、分
光法及び顕微鏡法の分野に適用されている（M.J.Sepani
ak ＆ al.,Anal.Chem.49（1977）1554〜1556,米国特許
5,034,613）。確率の概念に従って、発色団による単一
光子の吸収は独立した出来事であり、いくつかの光子の
吸収は一連の単一の独立した出来事である。単一光子の
吸収の確率は、励起されるべきエネルギー状態から飽和
されない限り線形関数として記載され得る。２光子の吸
収は第２の種類の非線形方法である。２光子励起におい
て、発色団は、約１フェムトセカンド内である両光子が
同時に吸収される場合にのみ励起される。２光子の吸収
の確率は単一光子の吸収の確率分布の積に等しい。これ
により、２光子により引きおこされる蛍光放出の強度は
照射の光子密度の２次処理である。
本発明の光学系の特徴は、点様光源へのシステムの応
答に関して先に記載されている。点様光源は、回折のた
め、光学系の特徴である焦点面内に強度分布を形成する
（点像強度分布関数）。標準化した場合、この点像強度
分布関数は光源からの光子が焦点領域に達する確率分布
である。２光子励起において、励起の確率分布は、２光
子の強度分布の標準化した積に等しい。これにより得ら
れた確率分布は３次元であり、特に軸方向において、単
一光子励起のためのものより明らかに制限される。これ
により、２光子励起において、焦点の明らかに制限され
た３次元の近隣において形成される蛍光のみが励起され
る。
答に関して先に記載されている。点様光源は、回折のた
め、光学系の特徴である焦点面内に強度分布を形成する
（点像強度分布関数）。標準化した場合、この点像強度
分布関数は光源からの光子が焦点領域に達する確率分布
である。２光子励起において、励起の確率分布は、２光
子の強度分布の標準化した積に等しい。これにより得ら
れた確率分布は３次元であり、特に軸方向において、単
一光子励起のためのものより明らかに制限される。これ
により、２光子励起において、焦点の明らかに制限され
た３次元の近隣において形成される蛍光のみが励起され
る。
発色団が２光子励起され、励起が焦点の３次元的近隣
に制限される場合、焦点の近隣において散乱することに
より、及び光学構成物から生じるシグナルは、通常の励
起と比較して著しく削減される。更に、２光子励起はサ
ンプルの周囲及び光学構成物において焦点の外側のバッ
クグラウンド蛍光を削減する。励起光ビームは可能な限
り小さい点に集中しなければならないので、２光子励起
は、本発明に従う方法における状況でもある少いサンプ
ル容量及び構造の観測に最も適する。
に制限される場合、焦点の近隣において散乱することに
より、及び光学構成物から生じるシグナルは、通常の励
起と比較して著しく削減される。更に、２光子励起はサ
ンプルの周囲及び光学構成物において焦点の外側のバッ
クグラウンド蛍光を削減する。励起光ビームは可能な限
り小さい点に集中しなければならないので、２光子励起
は、本発明に従う方法における状況でもある少いサンプ
ル容量及び構造の観測に最も適する。
２光子励起の先に言及される利点は、可視光又は近赤
外（NIR）光が、例えば紫外又は青色領域における励起
のために用いられ得るという事実に基づく。同様に、可
視領域における励起は、NIR光より達成され得る。光源
の波長は発色団の放射波長よりかなり長いので、光源の
波長における散乱及び可能な自己蛍光は、それらがディ
テクターに達することを防ぐための低通過フィルター
（少くとも10オーダー倍の減衰）を用いて効果的に減衰
され得る。
外（NIR）光が、例えば紫外又は青色領域における励起
のために用いられ得るという事実に基づく。同様に、可
視領域における励起は、NIR光より達成され得る。光源
の波長は発色団の放射波長よりかなり長いので、光源の
波長における散乱及び可能な自己蛍光は、それらがディ
テクターに達することを防ぐための低通過フィルター
（少くとも10オーダー倍の減衰）を用いて効果的に減衰
され得る。
我々の実験において、我々は、極めて高いシグナル対
バックグラウンド比及び優れた感度が２光子励起及び短
寿命の蛍光ラベルで達成され得ることを観察した。２光
子励起のための適切な蛍光ラベルは、例えばクマリン、
ロダミン誘導体及びフィコビリプロテインである。
バックグラウンド比及び優れた感度が２光子励起及び短
寿命の蛍光ラベルで達成され得ることを観察した。２光
子励起のための適切な蛍光ラベルは、例えばクマリン、
ロダミン誘導体及びフィコビリプロテインである。
２光子励起は連続波レーザー照射で観測され得るか、
２光子励起はパルスレーザーで最も行われ得ることが観
測されている。短いパルスの間、２光子励起のための十
分に高いエネルギー密度を達成するが、平均エネルギー
を低く維持することが可能である。短い遷移時間は極め
て高い繰返し周波数を有するパルスレーザーを要求す
る。今日、この適用に適したレーザーは10nJのパルスエ
ネルギーを有し、76MHzのパルス周波数を有し、調節可
能な700〜900nmの波長を有するチタン−サファイアフェ
ムトセカンドレーザーである。この適用に適したより安
価なパルスレーザーが、近い将来利用できるようになる
だろう。この種の開発の例は、モードロック30MHzパル
スダイオードレーザー（Laser Ionics Inc.,Orlando,Fl
orida,USA）、λ＝825nm、パルスエネルギー0.03nJ、パ
ルス幅１〜2psである。他の例は、新しく、また市販さ
れていないが、80MHzパルスレート、30fsパルス幅、0.5
nJパルスエネルギー及び調節可能820〜900nm波長を有す
るダイオードポンプCrLi−Sapphireレーザーである。
２光子励起はパルスレーザーで最も行われ得ることが観
測されている。短いパルスの間、２光子励起のための十
分に高いエネルギー密度を達成するが、平均エネルギー
を低く維持することが可能である。短い遷移時間は極め
て高い繰返し周波数を有するパルスレーザーを要求す
る。今日、この適用に適したレーザーは10nJのパルスエ
ネルギーを有し、76MHzのパルス周波数を有し、調節可
能な700〜900nmの波長を有するチタン−サファイアフェ
ムトセカンドレーザーである。この適用に適したより安
価なパルスレーザーが、近い将来利用できるようになる
だろう。この種の開発の例は、モードロック30MHzパル
スダイオードレーザー（Laser Ionics Inc.,Orlando,Fl
orida,USA）、λ＝825nm、パルスエネルギー0.03nJ、パ
ルス幅１〜2psである。他の例は、新しく、また市販さ
れていないが、80MHzパルスレート、30fsパルス幅、0.5
nJパルスエネルギー及び調節可能820〜900nm波長を有す
るダイオードポンプCrLi−Sapphireレーザーである。
自己相関と共に２光子励起の方法を用いることにおい
て、シグナルＦ及びシグナルDkの相互相関は、ディテク
ターを通して流れる分子複合体AbDK（k,1）＋MK＋Ab
F（k,2）からの蛍光シグナルの分析にも適用され得る。
これは、かわりに先に記載されるのと同様に、共焦光学
構成物に基づく。自己及び相互相関に加えて、レーザー
パルス及び光子ディテクターからのパルスの同期条件
も、光子ディテクターからの熱ノイズを除去するのに用
いられる。この場合、熱ノイズは重大でない。先に言及
される相関及び同期法が、分子計数に適用される場合、
分子複合体の最も低い検出可能な濃度は、ラベルされた
生物特異性試薬の非特異的反応にのみ依存する。２光子
励起の使用は、特にサンプル中の蛋白質及び他の高分子
により引きおこされる散乱及びバックグラウンドノイズ
がかなり低いため、共焦法と比較して有利である。レー
ザーの波長において蛍光は発生せず、またレーザービー
ムにより引きおこされる散乱もディテクターに達し得な
い。それは、低通過フィルターがレーザーのそれより低
い波長を効果的にブロックするからである。
て、シグナルＦ及びシグナルDkの相互相関は、ディテク
ターを通して流れる分子複合体AbDK（k,1）＋MK＋Ab
F（k,2）からの蛍光シグナルの分析にも適用され得る。
これは、かわりに先に記載されるのと同様に、共焦光学
構成物に基づく。自己及び相互相関に加えて、レーザー
パルス及び光子ディテクターからのパルスの同期条件
も、光子ディテクターからの熱ノイズを除去するのに用
いられる。この場合、熱ノイズは重大でない。先に言及
される相関及び同期法が、分子計数に適用される場合、
分子複合体の最も低い検出可能な濃度は、ラベルされた
生物特異性試薬の非特異的反応にのみ依存する。２光子
励起の使用は、特にサンプル中の蛋白質及び他の高分子
により引きおこされる散乱及びバックグラウンドノイズ
がかなり低いため、共焦法と比較して有利である。レー
ザーの波長において蛍光は発生せず、またレーザービー
ムにより引きおこされる散乱もディテクターに達し得な
い。それは、低通過フィルターがレーザーのそれより低
い波長を効果的にブロックするからである。
２光子励起のための装置は図１のものに類似するが、
レーザー（１）は、２光子励起のためのより適切なレー
ザーに置き換えられ、ピンホール（６）はより大きな開
口妨害物で置きかえられている。
レーザー（１）は、２光子励起のためのより適切なレー
ザーに置き換えられ、ピンホール（６）はより大きな開
口妨害物で置きかえられている。
実施例
いかにして有効に単一分子が２光子励起で検出され得
るかの例として、我々はクマリン溶液の測定の結果を供
する。２光子励起に基づく光学セット・アップを測定に
用い5nM,500nM及び50mMクマリン溶液をサンプルとして
用いた。焦点におけるアクティブな流体容量は約0.06立
法マイクロメーター（フェムトリッター）であり、平均
して、各々0.16,16及び1600蛍光分子を含んでいた。各
々102,104及び106パルス／秒のカウント比が先の濃度で
のクマリン溶液から得られ、他方光子カウンターのバッ
クグラウンドは30パルス／秒であった。この結果に基づ
いて、0.06フェムトリッターのアクテイブ容量を通して
熱拡散で動く単一分子が実験に用いられる装置において
２光子励起を用いることにより検出され得ることが言及
され得る。
るかの例として、我々はクマリン溶液の測定の結果を供
する。２光子励起に基づく光学セット・アップを測定に
用い5nM,500nM及び50mMクマリン溶液をサンプルとして
用いた。焦点におけるアクティブな流体容量は約0.06立
法マイクロメーター（フェムトリッター）であり、平均
して、各々0.16,16及び1600蛍光分子を含んでいた。各
々102,104及び106パルス／秒のカウント比が先の濃度で
のクマリン溶液から得られ、他方光子カウンターのバッ
クグラウンドは30パルス／秒であった。この結果に基づ
いて、0.06フェムトリッターのアクテイブ容量を通して
熱拡散で動く単一分子が実験に用いられる装置において
２光子励起を用いることにより検出され得ることが言及
され得る。
カテゴリーの同定
発色団D1,D2,D3,…Dkの１ユニット量又はそれらのな
いもののいずれかがプローブAb（１）にラベルされるよ
うに、例えば被検体のバイナリー検出のために、発色団
Dkを用いる。この場合、D1は２進数の第１のビットを表
し、D2は第２を表わし、D3は第３のビットを表し、以後
同様である。これにより、例えば３の発色団では、（ｋ
＝３）,2k＝23＝8,8の異なる２被検体が検出され得る。
その同定法の能力は、発色団Ｄの数ｋを増加するかわり
に、そしてバイナリーシステムを有するかわりに、3,4
又は一般的にｍ−ベースの数の表記システムを用いるよ
うに交換され得るように増加され得る。この場合、その
効果は各々3m,4m又はkmとなろう。
いもののいずれかがプローブAb（１）にラベルされるよ
うに、例えば被検体のバイナリー検出のために、発色団
Dkを用いる。この場合、D1は２進数の第１のビットを表
し、D2は第２を表わし、D3は第３のビットを表し、以後
同様である。これにより、例えば３の発色団では、（ｋ
＝３）,2k＝23＝8,8の異なる２被検体が検出され得る。
その同定法の能力は、発色団Ｄの数ｋを増加するかわり
に、そしてバイナリーシステムを有するかわりに、3,4
又は一般的にｍ−ベースの数の表記システムを用いるよ
うに交換され得るように増加され得る。この場合、その
効果は各々3m,4m又はkmとなろう。
実際に、発色団の数は適切な染料の利用性により、更
に容易に分離され得るのに必要とされるそれらの放出波
長によっても限定される。実際、必要とされる異なるカ
テゴリーの数も更に限定され、通常、それは10又は20を
超えない。この場合、ｋ及びｍのための最も大きな値は
各々３及び３である。即ち、カテゴリーの最大数33＝27
を与える３つの蛍光発色団の異なる濃度レベルが用いら
れる。
に容易に分離され得るのに必要とされるそれらの放出波
長によっても限定される。実際、必要とされる異なるカ
テゴリーの数も更に限定され、通常、それは10又は20を
超えない。この場合、ｋ及びｍのための最も大きな値は
各々３及び３である。即ち、カテゴリーの最大数33＝27
を与える３つの蛍光発色団の異なる濃度レベルが用いら
れる。
蛍光ラベルの選択
単一又は２光子励起のいずれかに関係なく、短い蛍光
減衰時間を有するいくつかの化合物はラベルＦ及びＤと
して用いられ得る。この方法において必要とされる測定
装置は、発色団Ｆ及びＤの全てについての励起波長が同
じであれば単純化され、それらがスペクトル的に容易に
分離され得るように放出波長が実質的に異なる。発色団
Ｆ及びＤが同じレーザービームで両方、励起され得るな
ら、測定装置が更に単純化される。これは、例えば、発
色団Ｆ及びＤの各々が２光子励起されるか、又はあるい
はＦが２光子励起されNIR領域の蛍光染料が発色団Ｄと
して用いられ、それらは同じレーザーの基本波長により
励起される単一光子であることを意味する。しかしなが
ら、先に記載されるものに類似する発色団が用いられな
いなら、動いているサンプルの同じ又は近隣の点に集中
される２つの分離したレーザーでそれらを励起すること
が必要である。点の励起、及びそれに続く放出は、時間
で分離される。
減衰時間を有するいくつかの化合物はラベルＦ及びＤと
して用いられ得る。この方法において必要とされる測定
装置は、発色団Ｆ及びＤの全てについての励起波長が同
じであれば単純化され、それらがスペクトル的に容易に
分離され得るように放出波長が実質的に異なる。発色団
Ｆ及びＤが同じレーザービームで両方、励起され得るな
ら、測定装置が更に単純化される。これは、例えば、発
色団Ｆ及びＤの各々が２光子励起されるか、又はあるい
はＦが２光子励起されNIR領域の蛍光染料が発色団Ｄと
して用いられ、それらは同じレーザーの基本波長により
励起される単一光子であることを意味する。しかしなが
ら、先に記載されるものに類似する発色団が用いられな
いなら、動いているサンプルの同じ又は近隣の点に集中
される２つの分離したレーザーでそれらを励起すること
が必要である。点の励起、及びそれに続く放出は、時間
で分離される。
化合物Ｆの選択の例として、クマリン及びロダミンの
誘導体が本明細書に供される。それらの蛍光は、350〜4
00nmの波長域で励起され得る。
誘導体が本明細書に供される。それらの蛍光は、350〜4
00nmの波長域で励起され得る。
潜在的な蛍光発色団Ｄは次の特性を示すべきである。
本発明に従う方法において:1）それらは、可能であれ
ば、バイオアフィニティラベルＦの励起範囲に、又はＦ
の２光子励起に用いられるレーザーの基本波長にある共
通の蛍光励起波長を有さなければならず;2）それらはＦ
のそれより高い分光的に分離した蛍光放射バントを有さ
なければならず;3）それらの蛍光励起状態の減衰時間が
短くなければならず、ナノ秒範囲にあり；更に、次のこ
とが本発明の優れた機能に有利である。即ち４）それら
がそれらの励起と放射波長との間に大きな差を有し;5）
それらが重大に長い減衰放出構成物を有さず；そして
６）それらが化学的に安定であり微小粒子に付着可能で
あることである。以下の市販の広く用いられる染料;Hoe
chst 33258,ロダミン（TRITC）,Texas Red and Quantum
Redがこれらの仕様にあう。これらの染料の最大励起は
異なる波長にあるが、それらは、なお、300〜450nmの範
囲内の単一波長において無理なく十分に励起され得る。
最大放射は各々470,570,620及び670nmの波長にある。先
に言及される染料のセットは、NIR領域の市販のレーザ
ー染料で、又はそれらの誘導体で、例えばIR132又はIR1
44で行われ得る。これらの化合物は、赤色又はNIR領域
において最大の主要な励起がある他は広い紫外範囲（32
0〜450nm）において通常、優れた吸収を有する。それら
のせまく、分離した放射バンドは825nm〜905nmの波長に
ある。
本発明に従う方法において:1）それらは、可能であれ
ば、バイオアフィニティラベルＦの励起範囲に、又はＦ
の２光子励起に用いられるレーザーの基本波長にある共
通の蛍光励起波長を有さなければならず;2）それらはＦ
のそれより高い分光的に分離した蛍光放射バントを有さ
なければならず;3）それらの蛍光励起状態の減衰時間が
短くなければならず、ナノ秒範囲にあり；更に、次のこ
とが本発明の優れた機能に有利である。即ち４）それら
がそれらの励起と放射波長との間に大きな差を有し;5）
それらが重大に長い減衰放出構成物を有さず；そして
６）それらが化学的に安定であり微小粒子に付着可能で
あることである。以下の市販の広く用いられる染料;Hoe
chst 33258,ロダミン（TRITC）,Texas Red and Quantum
Redがこれらの仕様にあう。これらの染料の最大励起は
異なる波長にあるが、それらは、なお、300〜450nmの範
囲内の単一波長において無理なく十分に励起され得る。
最大放射は各々470,570,620及び670nmの波長にある。先
に言及される染料のセットは、NIR領域の市販のレーザ
ー染料で、又はそれらの誘導体で、例えばIR132又はIR1
44で行われ得る。これらの化合物は、赤色又はNIR領域
において最大の主要な励起がある他は広い紫外範囲（32
0〜450nm）において通常、優れた吸収を有する。それら
のせまく、分離した放射バンドは825nm〜905nmの波長に
ある。
染料Dkに適切な化合物の群は、次のテトラピロールの
群；ポルフィリン、クロリン、バクテリオクロリン、プ
ルプリン、フェオホルバイド（pheophorbide）、フタロ
シアニン及びナフタロシアニンの中で見い出され得る。
これらの化合物は、近UV範囲（320〜450nm）並びに赤色
及びNIR範囲（600nm〜800nm）におけるせまい分離した
蛍光放出バンドにおいて重複する吸収バンドを一般に有
する。我々は、テトラピロール染料が２光子励起に対し
て極めて低い感受性を示すことを見い出した。それゆ
え、テトラピロール染料の使用は単一光子励起のみに限
定される。これらの化合物は合成又は微生物により生産
され得（Porphyrins,D.Dolphin,Ed.,Elsevier,Amsterda
m−N.−Y.−London,1980,V.1〜３）、それらは種々の分
析的適用に用いられている（D.B.Papkovsky,Appl.Fluo
r,Technology 3（1991）16〜23;EPO127797;EP0071997;
ロシア特許SU1,659,477）、テトラピロール染料の例
は： １）第２ポルフィリン（deuteroporphyrine）IX、
２）メソポルフィリンIX、３）プロト−ポルフィリン
（IX）ジメチルエステル、４）オクタエチルポルフィ
ン、５）テトラフェニルポルフィン、６）テトラ−（２
−メトキシ）−フェニル−ポルフィン、７）コプロポル
フィリンジメチルエステルのクロリン、８）コプロポル
フィリンジメチルエステルのバクテリオクロリン、９）
アルミニウムフタロシアニン及び10）亜鉛フタロシアニ
ンである。
群；ポルフィリン、クロリン、バクテリオクロリン、プ
ルプリン、フェオホルバイド（pheophorbide）、フタロ
シアニン及びナフタロシアニンの中で見い出され得る。
これらの化合物は、近UV範囲（320〜450nm）並びに赤色
及びNIR範囲（600nm〜800nm）におけるせまい分離した
蛍光放出バンドにおいて重複する吸収バンドを一般に有
する。我々は、テトラピロール染料が２光子励起に対し
て極めて低い感受性を示すことを見い出した。それゆ
え、テトラピロール染料の使用は単一光子励起のみに限
定される。これらの化合物は合成又は微生物により生産
され得（Porphyrins,D.Dolphin,Ed.,Elsevier,Amsterda
m−N.−Y.−London,1980,V.1〜３）、それらは種々の分
析的適用に用いられている（D.B.Papkovsky,Appl.Fluo
r,Technology 3（1991）16〜23;EPO127797;EP0071997;
ロシア特許SU1,659,477）、テトラピロール染料の例
は： １）第２ポルフィリン（deuteroporphyrine）IX、
２）メソポルフィリンIX、３）プロト−ポルフィリン
（IX）ジメチルエステル、４）オクタエチルポルフィ
ン、５）テトラフェニルポルフィン、６）テトラ−（２
−メトキシ）−フェニル−ポルフィン、７）コプロポル
フィリンジメチルエステルのクロリン、８）コプロポル
フィリンジメチルエステルのバクテリオクロリン、９）
アルミニウムフタロシアニン及び10）亜鉛フタロシアニ
ンである。
染料Dkのために適したテトラピロールの群は、先に言
及される化合物1,6及び10からなり得るだろう；それら
の放出波長は各々623nm,656nm及び689nmである。これら
のテトラピロール染料は、同じ励起波長を有し、テトラ
ピロール化合物の放射範囲のより低い又はより高い側内
のいずれかで放射バンドを示す他の周知の有機蛍光化合
物が補給され得るだろう。
及される化合物1,6及び10からなり得るだろう；それら
の放出波長は各々623nm,656nm及び689nmである。これら
のテトラピロール染料は、同じ励起波長を有し、テトラ
ピロール化合物の放射範囲のより低い又はより高い側内
のいずれかで放射バンドを示す他の周知の有機蛍光化合
物が補給され得るだろう。
単一分子複合体の検出効率及び方法のセンシティビテ
ィーは、単一蛍光染料Ｆ及びＤが先に言及される化合物
からなる染料クラスターで置換されるなら、増加され得
るだろう。それは、それらの蛍光放射が単一分子のそれ
より強いからである。天然の又は遺伝子技術により改変
された蛋白質構造は、染料クラスターの枠を典型的に形
成し得るだろう。ラベルＦを置換するのに適したクラス
ターの簡単な例は、フィコエリトリン（Phycoerythri
n）である。直鎖、分枝した分子クラスター、又はデン
ドリマー（dndrimer）もラベルＦ及びＤから合成され得
る。そのクラスターは、蛍光染料がそれらのポリマー構
造に添加されている小さなラテックス微小粒子でもあり
得る。
ィーは、単一蛍光染料Ｆ及びＤが先に言及される化合物
からなる染料クラスターで置換されるなら、増加され得
るだろう。それは、それらの蛍光放射が単一分子のそれ
より強いからである。天然の又は遺伝子技術により改変
された蛋白質構造は、染料クラスターの枠を典型的に形
成し得るだろう。ラベルＦを置換するのに適したクラス
ターの簡単な例は、フィコエリトリン（Phycoerythri
n）である。直鎖、分枝した分子クラスター、又はデン
ドリマー（dndrimer）もラベルＦ及びＤから合成され得
る。そのクラスターは、蛍光染料がそれらのポリマー構
造に添加されている小さなラテックス微小粒子でもあり
得る。
いかにして分子複合体AbDk（k,1）＋Mk＋AbF（k,2）
からの蛍光シグナルが、ラベルＦ及びＤの自己相関及び
相互相関の手段により散乱及びバックグラウンド蛍光か
ら分離されるかが先に説明されている。ラベルＤの放射
スペクトルが少しオーバーラップすることも説明されて
いる。これにより、ラベルD1の放射の10％がラベルD2の
放射ディテクター内に漏れる。この現象は、分離化の信
頼度を害する。しかしながら、その信頼度は、光子のよ
り多くの数が記録されるのを許容する染料クラスターを
用いることにより、大きく改良され得るだろう。これに
より、漏れ及び他の妨害ソースにより引きおこされる誤
差の確率は、自己及び相互相関を用いることにより最小
化され得る。
からの蛍光シグナルが、ラベルＦ及びＤの自己相関及び
相互相関の手段により散乱及びバックグラウンド蛍光か
ら分離されるかが先に説明されている。ラベルＤの放射
スペクトルが少しオーバーラップすることも説明されて
いる。これにより、ラベルD1の放射の10％がラベルD2の
放射ディテクター内に漏れる。この現象は、分離化の信
頼度を害する。しかしながら、その信頼度は、光子のよ
り多くの数が記録されるのを許容する染料クラスターを
用いることにより、大きく改良され得るだろう。これに
より、漏れ及び他の妨害ソースにより引きおこされる誤
差の確率は、自己及び相互相関を用いることにより最小
化され得る。
サンプルの取扱い
フローサイトメーターの分子計数は、キュベット内
で、又はフローキュベットのかわりに測定が反応チャン
バー内、流体チャンネル内もしくは分離した測定キュベ
ット内でガラススライドもしくはいくつかの他の支持体
上で行われ得る野外でのいずれかで行われ得る。分子の
検出は、サンプル溶液の動きに、分子の拡散に、サンプ
ル支持体又は光学構成物の機械的動きに基づき得る。各
々の被検体のための要求される統計的正確さを達成する
ために、十分な量の複合体が同定され、計数されるだろ
う。その結果は、標準的サンプルの測定と相互参照さ
れ、次に最終的な結果が計算されよう。
で、又はフローキュベットのかわりに測定が反応チャン
バー内、流体チャンネル内もしくは分離した測定キュベ
ット内でガラススライドもしくはいくつかの他の支持体
上で行われ得る野外でのいずれかで行われ得る。分子の
検出は、サンプル溶液の動きに、分子の拡散に、サンプ
ル支持体又は光学構成物の機械的動きに基づき得る。各
々の被検体のための要求される統計的正確さを達成する
ために、十分な量の複合体が同定され、計数されるだろ
う。その結果は、標準的サンプルの測定と相互参照さ
れ、次に最終的な結果が計算されよう。
本発明は、単一分子から生ずる光放出とその周囲の溶
液及び成分から生ずる光放出との間を任意に識別するこ
とができる測定システムも特徴とする。この選択性も、
時間における１分子のみが共焦光子ディテクターの焦点
領域内に適合し、遊離したラベルされた試薬により放射
されたバックグラウンドシグナルが最小化されるよう
に、極めて希釈された反応溶液に基づく。２光子励起が
用えられる場合、励起の効率は、その励起された光の効
率の平方根に直接比例する。２光子励起の特徴は、それ
が、媒体及び光学構成物からの散乱された光放出の識別
を根本的に改善することである。先に記載される分離方
法は、分離に対して本質的な改良を行う相関計算を含
む。本発明の大きな利点は、遊離した及び結合したプロ
ーブの適切な選択性が光学的識別及び相関計算に基づく
分離方法により達成され得るので、もはや化学的又は物
理的のいずれかで遊離した及び結合した画分を分離する
いずれの必要性もないことである。必要に応じて、選択
性は、洗浄、ろ過及び遠心のようないずれかの他の周知
の分離方法で改良され得る。
液及び成分から生ずる光放出との間を任意に識別するこ
とができる測定システムも特徴とする。この選択性も、
時間における１分子のみが共焦光子ディテクターの焦点
領域内に適合し、遊離したラベルされた試薬により放射
されたバックグラウンドシグナルが最小化されるよう
に、極めて希釈された反応溶液に基づく。２光子励起が
用えられる場合、励起の効率は、その励起された光の効
率の平方根に直接比例する。２光子励起の特徴は、それ
が、媒体及び光学構成物からの散乱された光放出の識別
を根本的に改善することである。先に記載される分離方
法は、分離に対して本質的な改良を行う相関計算を含
む。本発明の大きな利点は、遊離した及び結合したプロ
ーブの適切な選択性が光学的識別及び相関計算に基づく
分離方法により達成され得るので、もはや化学的又は物
理的のいずれかで遊離した及び結合した画分を分離する
いずれの必要性もないことである。必要に応じて、選択
性は、洗浄、ろ過及び遠心のようないずれかの他の周知
の分離方法で改良され得る。
流体の取扱いは、慣用的な方法により；即ち生物特異
性反応が反応溶液中でおこるようにサンプル及び試薬を
キュベット内に調薬することにより行われ得る。流体の
取扱いは、分子カウンターに接続されたフローチャンネ
ルの密閉系においても行われ得る。
性反応が反応溶液中でおこるようにサンプル及び試薬を
キュベット内に調薬することにより行われ得る。流体の
取扱いは、分子カウンターに接続されたフローチャンネ
ルの密閉系においても行われ得る。
本発明の方法及び必要な装置は、多くの異なる方法に
おいて実現され得る。しかしながら、反応の結果として
形成され、その１つが被検体を認識するのに用いられる
少くとも２つの蛍光ラベルを含む単一分子複合体が分子
計数の手段により蛍光分析で検出されることが本発明に
本質的である。検出された分子の数は、測定されるべき
被検体Mkの濃度に直接比例する。本分野の専門家にとっ
て、本発明の異なる適用が次に供される請求の範囲の範
囲内で種々であり得ることが明らかである。
おいて実現され得る。しかしながら、反応の結果として
形成され、その１つが被検体を認識するのに用いられる
少くとも２つの蛍光ラベルを含む単一分子複合体が分子
計数の手段により蛍光分析で検出されることが本発明に
本質的である。検出された分子の数は、測定されるべき
被検体Mkの濃度に直接比例する。本分野の専門家にとっ
て、本発明の異なる適用が次に供される請求の範囲の範
囲内で種々であり得ることが明らかである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/53
G01N 21/64
G01N 33/543
Claims (7)
- 【請求項１】同じ反応溶液中で多重の被検体Mk（ｋは１
以上の整数である）を同時に測定するための生物特異性
マルチパラメーターアッセイ方法であって、該方法が、 各々のサンプル分子Mkを、蛍光ラベルでラベルされた少
なくとも２の生物特異性プローブAb（ｊ）（ｊ＝1,2）
と反応させて、複合体Ab（k,1）＋Mk＋Ab（k,2）を供す
るステップと、 希釈剤を添加することにより前記反応を停止させるステ
ップと、 その希釈された溶液上に、励起及び放出波長に各々調整
されたレーザービーム及び光子ディテクターの焦点を合
わせるステップと、 前記焦点を通して動く単一分子からの単一光子の形態に
おける蛍光シグナル及びそれらの時間領域を記録するス
テップと、 を含み、 第１の生物特異性プローブが、Dkとして表される蛍光ラ
ベルの組合せ（ｋは１以上の整数である）でラベルさ
れ、そして第２のプローブが、蛍光ラベルＦでラベルさ
れ、そして前記複合体AbDk（k,1）＋Mk＋AbF（k,2）か
らのシグナルが、異なるラベルから得られたシグナルに
関して時間領域における自己相関及び相互相関を適用す
ることによって、バックグラウンドシグナルから、及び
他の分子のシグナルから分離され、そしてその相関シグ
ナルが、サンプル中の被検体分子Mkの数及びそれらの濃
度を決定するためにDkに従って分類され、 前記ラベルDk及びＦの励起及び検出が共焦光学システム
で行われるか、又は 前記ラベルDk及びＦの励起が２光子励起により行われる
ことを特徴とする方法。 - 【請求項２】同時干渉性照射及び／又は２以上の対物レ
ンズによる検出からなる共焦光学システムの使用を特徴
とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】前記蛍光ラベルＦ及びＤが蛍光分子のクラ
スターから構成されることを特徴とする請求項１に記載
の方法。 - 【請求項４】ホトディテクターの熱ノイズにより生ずる
シグナルのバックグラウンド識別のために用いられるパ
ルスレーザーにより制御される同期回路の使用を特徴と
する請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】単一蛍光分子又はそれらの複合体のための
計数方法であって、該方法が、レーザービーム及び光子
ディテクターの焦点を、ラベルされた蛍光分子を含む回
折制限された容量に合わせるステップと、 焦点容量を通して動く単一分子から単一光子シグナル及
びそれらの時間領域を記録するステップと、 を含み、 前記分子又はそれらの複合体の蛍光の励起が２光子励起
により行われ、その蛍光からのシグナルが時間領域にお
ける自己相関の手段によりバックグラウンドシグナルか
ら分離されることを特徴とする計数方法。 - 【請求項６】前記蛍光ラベルＦ及びＤが蛍光分子のクラ
スターから構成されることを特徴とする請求項５に記載
の方法。 - 【請求項７】ホトディテクターの熱ノイズにより生ずる
シグナルのバックグラウンド識別のために用いられるパ
ルスレーザーにより制御される同期回路の使用を特徴と
する請求項５に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI951040A FI101829B1 (fi) | 1995-03-07 | 1995-03-07 | Biospesifinen määritysmenetelmä |
| FI951040 | 1995-03-07 | ||
| PCT/FI1996/000005 WO1996027798A1 (en) | 1995-03-07 | 1996-01-03 | A biospecific assay method |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11503824A JPH11503824A (ja) | 1999-03-30 |
| JP3535174B2 true JP3535174B2 (ja) | 2004-06-07 |
Family
ID=8542990
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP52663096A Expired - Lifetime JP3535174B2 (ja) | 1995-03-07 | 1996-01-03 | 生物特異性アッセイ法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6204068B1 (ja) |
| EP (1) | EP0815447B1 (ja) |
| JP (1) | JP3535174B2 (ja) |
| DE (1) | DE69626803T2 (ja) |
| FI (1) | FI101829B1 (ja) |
| WO (1) | WO1996027798A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19649048C1 (de) | 1996-11-27 | 1998-04-09 | Evotec Biosystems Gmbh | Verfahren zur Unterscheidung oder Erfassung von Partikeln in einer Probe durch Identifizierung von Signalabschnitten zeitaufgelöster, optischer Rohsignale aus der Probe auf Basis von Einzelphotonendetektion |
| JP3761898B2 (ja) | 1996-12-03 | 2006-03-29 | ソイニ，エルッキ | 生体特異性二光子励起蛍光検出方法およびそのための装置 |
| US6310354B1 (en) | 1996-12-03 | 2001-10-30 | Erkki Soini | Method and a device for monitoring nucleic acid amplification reactions |
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| EP0884583A1 (en) * | 1997-06-10 | 1998-12-16 | Evotec BioSystems GmbH | A method for characterizing samples in at least two dimensional space of specific physical properties |
| US6342397B1 (en) | 1998-06-04 | 2002-01-29 | Erkki Soini | Homogeneous biospecific assay using a solid phase, two-photon excitation and confocal fluorescence detection |
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| AU5479599A (en) * | 1998-08-11 | 2000-03-06 | Caliper Technologies Corporation | Methods and systems for sequencing dna by distinguishing the decay times of fluorescent probes |
| US6716394B2 (en) | 1998-08-11 | 2004-04-06 | Caliper Technologies Corp. | DNA sequencing using multiple fluorescent labels being distinguishable by their decay times |
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| EP1311829B1 (de) * | 2000-08-22 | 2008-07-02 | Evotec AG | Verfahren und vorrichtung zum messen chemischer und/oder biologischer proben |
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