DE69911433T2 - Probenanalyse - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Analyse einer Probe, und insbesondere, obwohl nicht ausschließlich, die Fluoreszenzanalyse.
  • Die Fluoreszenzanalyse ist ein wichtiges experimentelles Werkzeug sowohl für Chemiker als auch für Biologen und ist von besonderem Interesse für die pharmazeutische Forschung.
  • Ein bekanntes Verfahren zur Analyse der Fluoreszenz beinhaltet die Anregung einer Probe aus vielen hundert Fluorophoren mit einem starken Lichtimpuls von einem Laser. Es wird die Intensität der Fluoreszenz erfaßt, die von der Probe mit einer gegebenen Verzögerung nach der Anregung emittiert wird. Die Probe wird erneut angeregt, und die Intensität der Fluoreszenz wird erfaßt, die von der Probe mit einer anderen Verzögerung nach der Anregung emittiert wird. Es wird eine Meßreihe mit verschiedenen Verzögerungen ausgeführt, und die Fluoreszenzintensität wird als Funktion der Verzögerung aufgetragen, und liefert eine zeitliche Verteilung der Fluoreszenzintensität. Aus dem Gradienten der Intensitätsverteilung kann eine Lebensdauercharakteristik für den oberen Zustand der die Probe bildenden Fluorophore hergeleitet werden (zum Beispiel durch Anpassen einer exponentiell abfallenden Kurve an die Verteilung).
  • Für die Messung charakteristischer Fluorophor-Lebensdauern sind verschiedene andere Verfahren bekannt, und in jedem Fall muß die Phasenverschiebung oder Demodulation eines erfaßten Signals im Vergleich zu einem Anregungssignal gemessen werden (siehe zum Beispiel J. R. Lacowitz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, New York & London). Gegenwärtig verfügbare Methoden erfordern jedoch vergleichsweise langwierige Mittelungsverfahren, die für die moderne Hochgeschwindigkeitsverarbeitung vieler Messungen ungeeignet sind (zum Beispiel beim Durchmusterungsverfahren mit hohem Durchsatz oder bei der Bilderzeugung).
  • Eine weitere Einschränkung des obigen Verfahrens ist, daß es eine Probe aus vielen hundert Fluorophoren und eine Beleuchtung von hoher Intensität erfordert. Eine Probe in der Größenordnung von 100 Fluorophoren liefert kein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis, um eine Fluoreszenzmessung zu ermöglichen. Die Methode kann daher nicht zur Messung von Effekten benutzt werden, die durch einen einzelnen Fluorophor oder durch eine Probe verursacht werden, die eine geringe Anzahl von Fluorophoren enthält, oder durch eine Probe mit schneller optischer Löschung. Außerdem erfordert die Methode die Verwendung von Impulslaserquellen und torgesteuerten Detektoren zur Messung von Zeitbereichs-Fluoreszenzparametern, wie z. B. der Abklingrate.
  • Ein weiteres bekanntes Verfahren, das als Zahlfluktuationsspektroskopie bezeichnet wird, kann zur Bestimmung der Diffusionskoeffizienten von Teilchen in einem Fluid angewandt werden. Die Zahlfluktuationsspektroskopie beinhaltet die Beleuchtung eines spezifizierten Fluidvolumens mit hinein- und herausdiffundierenden Teilchen sowie den Nachweis von Licht, das durch die Teilchen gestreut wird, wenn sie sich innerhalb des spezifizierten Volumens befinden. Eine Autokonelation des nachgewiesenen Streulichts mit sich selbst ergibt eine charakteristische Frequenz, die eine Funktion der Diffusionsgeschwindigkeit der Teilchen innerhalb des Fluids ist. Die Zahlfluktuationsspektroskopie kann zur Bestimmung eines mittleren Teilchendiffusionskoeffizienten und daher zur Bestimmung einer Teilchengröße benutzt werden.
  • WO 96/27 798 beschreibt ein als Fluoreszenzkonelationsspektroskopie bekanntes Verfahren, das als eine Variante der Zahlfluktuationsspektroskopie angesehen werden kann. Das Verfahren wird angewandt, wenn in dem Fluid andere streuende Teilchen vorhanden sind, die nicht erforderlich sind, um zu dem nachgewiesenen Signal beizutragen. Die interessierenden Teilchen werden zur Fluoreszenz angeregt, und das Fluoreszenzlicht wird spektral von dem Streulicht getrennt, so daß nur die Diffusion der interessierenden Teilchen gemessen wird. Die Fluoreszenzkonelationsspektroskopie ermöglicht die Bestimmung eines Diffusionskoeffizienten, liefert aber nicht die Messung von Fluoreszenzlebensdauern.
  • JP-A-61 277 060 beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der Antigenkonzentration in einer Probe aus einer Messung der Relaxationszeit und einer Eichkurve.
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens und einer Vorrichtung für die Probenanalyse, welche die obigen Nachteile überwinden oder mildern.
  • Nach einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Analyseverfahren zur Bestimmung einer charakteristischen Zykluszeit einer Probe bereitgestellt, wobei das Verfahren aufweist: Anregung aktiver Elemente in der Probe mit ausreichender Intensität, so daß zumindest einige von den aktiven Elementen im wesentlichen sofort nach der Relaxation zu einem Grundzustand erneut in einen angeregten Zustand angeregt werden, Nachweis von Quanten, die durch die aktiven Elemente in der Probe emittiert werden, um ein Nachweissignal zu erhalten, und Analyse des Nachweissignals zur Ableitung der charakteristischen Zykluszeit, wobei die Anzahl aktiver Elemente in der Probe und die Intensität der Anregung so beschaffen sind, daß Quanten in einem Strom nachgewiesen werden, in dem einzelne Quanten voneinander unterscheidbar sind.
  • Die charakteristische Zykluszeit ist definiert als die Zeit, die ein aktives Element benötigt, um nach Anregung in einen angeregten Zustand in einen Grundzustand zurückzukehren. Der Begriff "im wesentlichen sofort" soll eine Zeitspanne bedeuten, die kürzer ist als die Zeit, die nach Anregung des aktiven Elements aus dem Grundzustand bis zur Rückkehr des aktiven Elements in den Grundzustand verstreicht.
  • Geeigneterweise schließt die Analyse des nachgewiesenen Signals eine Korrelation des nachgewiesenen Signals mit sich selbst ein. Die Korrelation schließt in diesen Zusammenhang die Ausführung einer Fourier-Transformation unter Anwendung eines Fabry-Perot-Etalons oder irgendeine andere geeignete Signalverarbeitung ein. Zum Beispiel wird ein Signalstrom, der mindestens 100 erfaßte Quanten enthält, mit Hilfe der folgenden Gleichung mit sich selbst korreliert (autokorreliert): G12(u) = ΣN1(t)N2(t + τ)um Frequenzen innerhalb des Signalstroms zu bestimmen.
  • Das Verfahren kann ferner eine Eichung beinhalten, um die mittlere Verzögerung zumindest von einigen aktiven Elementen zwischen der Relaxation in den Grundzustand und der anschließenden Wiederanregung zu bestimmen. Dies ist nicht notwendig, wenn die Anregungsintensität ausreichend hoch ist, so daß die mittlere Verzögerung vernachlässigbar ist.
  • Die Erfindung ist vorteilhaft, weil sie das von den aktiven Elementen der Probe emittierte Signal maximiert, da die aktiven Elemente veranlaßt werden, im wesentlichen kontinuierlich einen Zyklus zu durchlaufen, und dadurch eine Serie von Quanten liefern (die aktiven Elemente sind weitgehend gesättigt). Die Messung einer charakteristischen Zykluszeit kann unter Anwendung der Erfindung sehr schnell ausgeführt werden. Zum Beispiel kann man in einem Zeitraum, der weniger als (100 × charakteristische Zykluszeit)2 entspricht, eine experimentelle Genauigkeit von 1% erreichen. Dies ist vergleichbar mit herkömmlichen Fluoreszenzlebensdauermessungen, wo die Beleuchtung gepulst ist und die Detektoren torgeschaltet sind und für jede Meßreihe zurückgesetzt werden müssen, um eine Lebensdauer zu messen. Zum Beispiel erfordert das Verfahren nach dem Stand der Technik, das als zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung bezeichnet wird, im allgemeinen eine Versuchsdauer von einigen Minuten.
  • Ein wichtiger Unterschied zwischen der Erfindung und dem Stand der Technik ist, daß die Erfindung keine Messung der Anregungsphase erfordert. Bei Messungen von charakteristischen Fluoreszenzlebensdauern nach dem Stand der Technik wird eine Probe mit einem Beleuchtungsimpuls angeregt, und die nach der Beleuchtung bis zur Emission eines Fluoreszenzphotons verstrichene Zeit wird gemessen. Dazu muß die relative Phase der Anregung und der Emission bestimmt werden. Dies erfordert komplizierte und teure elektronische Hochgeschwindigkeitsschaltkreise. Dagegen benötigt das erfindungsgemäße Verfahren keine Informationen über die Phase oder den Zeitpunkt der Anregung. Die charakteristische Zykluszeit einer Probe von Fluorophoren kann durch direkte Überwachung der Probe gemessen werden, und es besteht keine Notwendigkeit, die Anregungsquelle zu überwachen.
  • Wenn die Erfindung zur Messung einer charakteristischen Zykluszeit eines Fluorophors mittels Laserbeleuchtung benutzt wird, kann sie oberflächlich der Fluoreszenzkonelationsspektroskopie ähnlich erscheinen. Es gibt jedoch einige wichtige Unterschiede zwischen der Erfindung und der Fluoreszenzkonelationsspektroskopie. Die Fluoreszenzkonelationsspektroskopie wird angewandt, um Diffusionskoeffizienten von Teilchen zu bestimmen, und das erfaßte Versuchssignal wird durch Teilchen verursacht, die in den beleuchteten Bereich hinein und aus diesem heraus diffundieren, wobei die Diffusion typischerweise einen Zeitmaßstab in der Größenordnung von Millisekunden aufweist. Die Beleuchtung wird auf einer niedrigen Intensität gehalten, um die Löschung von Fluorophoren zu vermeiden, und muß auf einer festen Intensität stabilisiert werden, um das Einführen von experimentellen Fehlern durch Intensitätschwankungen zu vermeiden. Im Gegensatz dazu mißt die Erfindung eine charakteristische Lebensdauer einer Fluorophorprobe durch Beleuchten der Probe mit hoher Intensität, so daß sie im wesentlichen unablässig einen Zyklus durchläuft und eine Serie von Photonen emittiert. Eine Messung der charakteristischen Lebensdauer, die typischerweise in der Größenordnung einer Nanosekunde liegt, kann beispielsweise mit einer Genauigkeit von 1% in einem Zeitmaßstab ausgeführt werden, der weniger als (100 × charakteristische Lebensdauer)2 entspricht. Da die Messung während einer so kurzen Zeitdauer ausgeführt werden kann, wird die Messung durch das Löschen der Probe, das im Verlauf einer viel längere Zeitdauer stattfindet, nicht beeinflußt. Tatsächlich kann es durch Ausführen einer Meßreihe möglich sein, den Effekt der Löschung selbst zu messen. Eine Stabilisierung der Beleuchtungsintensität auf einen bestimmten Wert ist nicht erforderlich, vorausgesetzt, daß die Intensität ausreicht, um die Fluorophore der Probe ständig einen Zyklus durchlaufen zu lassen.
  • Vorzugsweise weist das Verfahren ferner die Wahl der Anzahl der aktiven Elemente und der Anregungsintensität auf, derart daß das Signal-Rausch-Verhältnis des erfaßten Signals maximiert wird.
  • Der Nachweis eines Quants kann mit dem Nachweis einer anderen Eigenschaft der Probe korreliert werden. Die Eigenschaft kann ein Analogsignal liefern, das erfaßt wird, wenn es über einen vorgegebenen Schwellwert ansteigt. Ein erfaßtes Signal kann autokorrliert oder mit einem Testsignal oder einer Digitalmaske kreuzkorreliert werden, oder es kann mit einem Signal korreliert werden, das von einer Vergleichsprobe erfaßt wird.
  • Die charakteristische Zykluszeit der Probe kann durch eine geeignete Modifikation der Umgebung der aktiven Elemente durch Mittel modifiziert werden, zu denen chemische oder physikalische Mittel gehören, und die modifizierte charakteristische Zykluszeit wird bestimmt.
  • Geeigneterweise weisen zumindest einige der aktiven Elemente ein Anregungsniveau, ein oberes Niveau eines Emissionsübergangs und ein unteres Niveau des Emissionsübergangs auf und emittieren bei der Relaxation vom oberen Niveau des Emissionsübergangs zum unteren Niveau des Emissionsübergangs ein nachweisbares Quant, wobei die Lebensdauer des unteren Niveaus des Emissionsübergangs oder eines anderen Energieniveaus mit einer niedrigeren Energie als der des unteren Niveaus des Emissionsübergangs durch die Modifikation der Umgebung der aktiven Elemente beeinflußt und deren Auswirkung bestimmt wird.
  • Geeigneterweise sind zumindest einige der aktiven Elemente durch ein Glied an ein Substrat gebunden, das eine Schwingungsbewegung des aktiven Elements zuläßt, wobei die Lebensdauer des unteren Niveaus des Emissionsübergangs oder eines anderen Energieniveaus mit einer niedrigeren Energie als der des unteren Niveaus des Emissionsübergangs durch Modifikation der Elektronenumgebung des aktiven Elements verändert werden kann.
  • Geeigneterweise wird die Modifikation der Elektronenumgebung durch die Gegenwart mindestens einer modifizierenden Komponente bewirkt, die in der Lage ist, die Elektronenumgebung des aktiven Elements zu beeinflussen.
  • Geeigneterweise ist die Änderung der Zykluszeit auf eine Energieübertragung vom unteren Niveau des Emissionsübergangs oder einem anderen Energieniveau mit niedrigerer Energie als der des unteren Niveaus der Emission zur modifizierenden Komponente zurückzuführen.
  • Geeigneterweise wird die Zykluszeit durch Änderungen in der Konformation des aktiven Elements bezüglich einer modifizierenden Komponente modifiziert.
  • Geeigneterweise bildet jedes aktive Element einen Teil einer Sonde, wodurch die Sonde zwischen verschiedenen dielektrischen Umgebungen bewegt wird, einschließlich derjenigen, die in einem Molekül oder seinem Lösungsmittel auftreten, wobei die charakteristische Zykluszeit der Sonde durch die Zeitmaßstäbe der Bewegung des aktiven Elements zwischen unterschiedlichen dielektrischen Umgebungen beeinflußt wird, wobei die Bewegung durch Modifikationen beeinflußt wird, zu denen mindestens eine der folgenden gehört:
    • (a) Änderung der Gesamtgröße der Sonde;
    • (b) Änderung des Abstands zwischen dem aktiven Element und dem Rest der Sonde;
    • (c) Änderung der Steifigkeit eines Brücken- bzw. Spacermoleküls zwischen dem aktiven Element und dem Rest der Sonde; oder
    • (d) Modifikation der Sonde oder eines Teils davon mit hydrophilen, polaren, geladenen oder hydrophoben Komponenten.
  • Geeigneterweise bildet das aktive Element einen Teil einer Spezies, die periodisch mit einer modifizierenden Komponente wechselwirkt, und es werden die Perioden gemessen, in deren Verlauf die Spezies mit der modifizierenden Komponente wechselwirkt bzw. nicht mit der modifizierenden Komponente wechselwirkt.
  • Geeigneterweise bildet das aktive Element einen Teil einer Spezies, die periodisch mit einer Löschkomponente wechselwirkt und dadurch nach einem statischen Löschmechanismus gelöscht wird, und es werden die Perioden gemessen, in deren Verlauf die Spezies aktiv ist bzw. inaktiv ist.
  • Geeigneterweise bildet das aktive Element einen Teil einer Spezies, die periodisch mit einer Löschkomponente wechselwirkt und dadurch nach einem Stoßlöschmechanismus gelöscht wird, und es werden die Perioden gemessen, in deren Verlauf die Spezies aktiv ist bzw. inaktiv ist.
  • Geeigneterweise wird die Periode der periodischen Wechselwirkung durch geeignete Modifikation einer Eigenschaft der Spezies oder der modifizierenden Komponente oder der Löschkomponente beeinflußt.
  • Geeigneterweise beinhaltet die Modifikation die Änderung der Länge eines Spacermoleküls, an dem das aktive Element sitzt, oder der Länge des Spacermoleküls, an dem die modifizierende Komponente oder die Löschkomponente sitzt.
  • Geeigneterweise beinhaltet die Modifikation die Änderung der Flexibilität eines Spacermoleküls, an dem das aktive Element sitzt, oder der Flexibilität des Spacermoleküls, an dem die modifizierende Komponente oder die Löschkomponente sitzt.
  • Geeigneterweise beinhaltet die Modifikation die Anlagerung einer modifizierenden Komponente an ein Spacermolekül, an dem das aktive Element sitzt, oder an ein Spacermolekül, an dem die modifizierende Komponente oder die Löschkomponente sitzt.
  • Geeigneterweise wird das aktive Element über ein Spacermolekül an eine Bindungsstelle angelagert, und die Modifikation resultiert aus einer Wechselwirkung mit der Bindungsstelle.
  • Geeigneterweise resultiert die Modifikation aus einer Beschränkung der periodischen Bewegung des Spacermoleküls, an dem das aktive Element sitzt, oder des Spacermoleküls, an dem die modifizierende Komponente oder die Löschkomponente sitzt.
  • Geeigneterweise wird das aktive Element über ein Spacermolekül an eine Bindungsstelle angelagert, und die Modifikation resultiert aus einer Wechselwirkung mit einer an die Bindungsstelle angelagerten modifizierenden Komponente.
  • Geeigneterweise wird das aktive Element über ein erstes Spacermolekül an eine erste Bindungsstelle angelagert, und eine modifizierende Komponente oder Löschkomponente wird über ein zweites Spacermolekül an eine zweite Bindungsstelle angelagert, wobei der Abstand zwischen den ersten und zweiten Bindungsstellen die Periodizität der Wechselwirkung zwischen dem aktiven Element und der modifizierenden Komponente oder der Löschkomponente bestimmt.
  • Die Bindung kann an gespaltene DNA/RNA-Sonden oder an komplementäre DNA/RNA erfolgen. Die Erfindung kann benutzt werden, um die Bindung eines Liganden (z. B. eines Medikaments, eines Hormons usw.) an ein Protein (z. B. einen Antikörper, Rezeptor oder einen synthetischen Imitator) entweder direkt oder indirekt (konkurrierend) zu überwachen.
  • Geeigneterweise wechselwirken erste und zweite Elemente periodisch miteinander, um das aktive Element zu bilden, und gemessen werden die Periode, in deren Verlauf die ersten und zweiten Elemente zur Bildung des aktiven Elements wechselwirken, sowie die Perioden, in deren Verlauf die ersten und zweiten Elemente nicht zur Bildung des aktiven Elements wechselwirken.
  • Jede der oben beschriebenen Modifikationen der Wechselwirkung zwischen einem aktiven Element und einer modifizierenden Komponente oder Löschkomponente kann auf die periodische Bildung eines aktiven Elements mittels Wechselwirkung der ersten und zweiten Elemente angewandt werden. Dies kann mittels Austausch des aktiven Elements durch das erste Element und mittels Austausch der modifizierenden Komponente oder Löschkomponente durch das zweite Element erfolgen.
  • Das durch die ersten und zweiten Elemente gebildete aktive Element kann eine Spezies mit resonanter Fluoreszenzenergieübertragung sein.
  • Das durch die ersten und zweiten Elemente gebildete aktive Element kann ein Excimer oder ein Exciplex sein.
  • Geeigneterweise wird der Anregungsquerschnitt eines Grundzustands eines aktiven Elements periodisch variiert, und die Variationsperiode wird gemessen.
  • Geeigneterweise emittiert das aktive Element Fluoreszenzphotonen, die mit einer Lösung wechselwirken, in der die aktiven Elemente gehalten werden, wird der Effekt der Lösung wird durch modulierende Eigenschaften der Lösung überwacht.
  • Geeigneterweise weist das Verfahren ferner die Anregung der aktiven Elemente unter Verwendung eines Anregungsimpulses sowie die Bestimmung der zwischen Anregung und Quantenemission aus dem aktiven Element verstrichenen Zeit und die anschließende Subtraktion dieser Zeit von der charakteristischen Zykluszeit auf.
  • Jede der obigen Modifikationen kann benutzt werden, um eine aktive Spezies mit einer charakteristischen Zykluszeit zu erzeugen, die als Marker verwendet werden soll, beispielsweise eine DNA-Sonde oder eine Ligandenbindungsprobe unter Verwendung von Antikörpern als Rezeptoren.
  • Die Erfindung kann zur Überwachung von Konformationsänderungen (zum Beispiel von Protein) als Abstands-/Anlagerungsänderungen benutzt werden. Die Erfindung kann zur Identifikation von in einem Polymer zusammengefügten Molekülresten angewandt werden (beispielsweise kombinatorische Synthese von Peptiden oder Oligonucleotiden oder Oligosacchariden).
  • Schwankungen des Photonenausstoßes, die sich aus periodischen Absorptionsprozessen und damit verbundenen Relaxationen ergeben, die über mechanische Schwankungen durch Phononen verursacht werden, können gemäß der vorliegenden Erfindung gemessen werden.
  • Die Anregung der Probe kann durch andere Energieformen erfolgen (zum Beispiel durch Röntgenfluoreszenz). Die Anregung der Probe kann mittels einer chemischen Reaktion (z. B. durch Chemilumineszenz) erfolgen oder kann mit anderen Energieformen verbunden sein (z. B. Phosphoreszenz). Die chemische Anregung kann einen Katalysator einschließen, der ein Enzym sein kann (zum Beispiel ATP- und NADH-gesteuerte Biolumineszenz).
  • Die Erfindung kann als Biotest für bestimmte Bakterien, Viren, eine chemische Familie oder Untergruppe eingesetzt werden. Die Erfindung kann zum Screenen bzw. zur Durchmusterung für Chemikalien, neuartige Medikamente, Agrochemikalien, Nahrungsmittelverunreinigungen, DNA, RNA, Bakterien, Viren oder für Nebenprodukte, welche die Gegenwart oder Aktivität dieser Bestandteile anzeigen, eingesetzt werden. Das Screenen kann seriell oder parallel ausgeführt werden.
  • Die aktiven Elemente können einen oberen angeregten Zustand, einen unteren angeregten Zustand und einen Grundzustand aufweisen und bei Relaxation vom oberen angeregten Zustand zum unteren angeregten Zustand ein nachweisbares Quant emittieren, wobei das Verfahren ferner die Anregung zweiter Elemente in einen angeregten Zustand aufweist, derart daß die zweiten Elemente Anregungsenergie auf die aktiven Elemente übertragen und dadurch die aktiven Elemente in den oberen angeregten Zustand anregen. Die Verwendung des zweiten Elements ist vorteilhaft, weil das zweite Element als Puffer wirkt, die Anregung speichert und die Anregung zu einem späteren Zeitpunkt auf das aktive Element überträgt. Dies ist besonders vorteilhaft, wenn die Probe durch Impulsanregung oder durch Anregung mit schwankender Intensität angeregt wird. Der Puffer glättet Welligkeiten eines Anregungssignals auf eine Weise, die dem Glätten von Welligkeiten in einem elektrischen Signal durch einen Kondensator analog ist.
  • Geeigneterweise können für jedes aktive Element viele zweite Elemente vorgesehen werden.
  • Der Nachweis eines Quants kann mit dem Nachweis einer anderen Eigenschaft der Probe korreliert werden.
  • Die Quanten können Photonen sein. Die aktiven Elemente können Fluorophore sein. Die Probe kann weniger als 100 aktive Elemente aufweisen. Die Probe kann weniger als 10 aktive Elemente aufweisen.
  • Die charakteristische Zykluszeit kann im Bereich von 10–1000 ns liegen. Das Verfahren kann zur Sondierung von biologischen Materialien, Biotestmaterialen oder zur Mehrfachsondierung von biologischen Materialien eingesetzt werden. Die natürliche Fluoreszenz einer Probe kann benutzt werden.
  • Nach einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Analysegerät zur Bestimmung der charakteristischen Zykluszeit aktiver Elemente in einer Probe bereitgestellt, das aufweist: eine Einrichtung zum Anregen aktiver Elemente in der Probe mit ausreichender Intensität, so daß zumindest einige der aktiven Elemente im wesentlichen sofort nach der Relaxation zu einem Grundzustand erneut in einen angeregten Zustand angeregt werden, eine Einrichtung zum Nachweis von Quanten, die durch die Probe emittiert werden, um ein Nachweissignal zu erhalten, eine Analyseneinrichtung für die Analyse des Nachweissignals zur Ableitung der charakteristischen Zykluszeit, wobei die Anzahl aktiver Elemente in der Probe und die Intensität der Anregung so beschaffen sind, daß Quanten in einem Strom nachgewiesen werden, in dem einzelne Quanten voneinander unterscheidbar sind.
  • Nachstehend werden konkrete Ausführungsformen der Erfindung anhand von Beispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Dabei zeigen:
  • 1 eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Fluoreszenznachweisgeräts;
  • 2 eine Gruppe von Diagrammen, welche die Arbeitsweise der Erfindung für eine sehr kleine Anzahl von Fluorophoren veranschaulichen;
  • 3 eine Gruppe von Diagrammen, welche die Arbeitsweise der Erfindung für eine größere Anzahl von Fluorophoren veranschaulichen;
  • 4 eine schematische Darstellung der Energiezustände eines Fluorophors;
  • 5 eine schematische Darstellung der Energiezustände eines Fluorophors und der Energiezustände eines Moleküls;
  • 6 eine schematische Darstellung der Energiezustände einer aktiven Spezies;
  • 7 eine schematische Darstellung verschiedener Konfigurationen von aktiven Spezies zusammen mit einem Diagramm zur Erläuterung des Löschens;
  • 8 eine schematische Darstellung verschiedener Konfigurationen von aktiven Spezies;
  • 9 eine schematische Darstellung verschiedener Konfigurationen von aktiven Spezies;
  • 10 eine schematische Darstellung verschiedener Konfigurationen von aktiven Spezies;
  • 11 eine schematische Darstellung verschiedener Konfigurationen von aktiven Spezies; und
  • 12 eine schematische Darstellung verschiedener Konfigurationen von aktiven Spezies.
  • Wie zunächst aus 1 erkennbar ist, weist ein Fluoreszenznachweisgerät eine Probe 1 und einen Laser 2 auf, der so angeordnet ist, daß er die Probe 1 mit einem kontinuierlichen Lichtstrahl beleuchtet. Ein Detektor 3 ist vorgesehen, um von der Probe 1 emittierte Photonen nachzuweisen. Der Detektor 3 kann mit einem Filter (nicht dargestellt) ausgestattet werden, um die Erfassung von Licht, das vom Laser 2 emittiert wird, zu verhindern. Ein Autokonelator 4 korreliert das erfaßte Signal und liefert eine Korrelation, und ein Prozessor 5 verarbeitet das Ausgangssignal des Detektors, um die charakteristische Lebensdauer der Fluorophore zu messen, welche die Probe 1 bilden. Die Arbeitsweise des Prozessors 5 wird weiter unten beschrieben. Das Ausgangssignal vom Prozessor 5 und/oder dem Autokonelator 4 kann an einem Monitor 6 angezeigt werden.
  • 2 veranschaulicht das Funktionsprinzip der Erfindung. 2a stellt das Ergebnis der Beleuchtung eines einzelnen Fluorophors mit einem kontinuierlichen Lichtstrahl von hoher Intensität dar. Ein Photon in dem Strahl mit hoher Intensität bringt den Fluorophor in einen angeregten Zustand, und nach einer für den Fluorophor charakteristischen Zeitdauer emittiert der Fluorophor ein Photon (d. h. er fluoresziert). Nach Emission des Photon relaxiert der Fluorophor in einen Zustand mit niedrigerer Energie und relaxiert anschließend in einen Grundzustand. Da der Fluorophor durch einen kontinuierlichen Photonenstrom vom Laser beleuchtet wird, wird er nach seiner Rückkehr in seinen Grundzustand sofort wieder in seinen angeregten Zustand gebracht. Der Fluorophor emittiert nach einer charakteristischen Zeitdauer wieder ein Photon. Auf diese Weise wird durch den Fluorophor eine Serie von Photonen emittiert, wobei jedes Photon von dem vorhergehenden Photon durch die gleiche Zeitdauer getrennt ist, wie in 2a dargestellt. Der Abstand der Photonen entspricht der Zeit, die ein Fluorophor benötigt, um nach Anregung aus dem Grundzustand in den Grundzustand zurückzukehren. Diese Periode wird als charakteristische Zykluszeit des Fluorophors bezeichnet.
  • In 2a sind Signale, die jeder Photonenemission entsprechen, in gleichen Abständen voneinander dargestellt. Tatsächlich ist die charakteristische Zykluszeit nicht konstant, sondern variiert um einen Mittelwert. Solche Schwankungen werden jedoch durch das oben beschriebene Autokorrelationsverfahren berücksichtigt. Daher sind zu Erläuterungszwecken nur die 2a bis 2e unter der Annahme dargestellt worden, daß die charakteristische Zykluszeit des Fluorophors konstant ist.
  • Das in 2a dargestellte Diagramm zeigt ein ideales Szenario, bei dem die Probe einen einzelnen Fluorophor aufweist, wobei jedes von dem Fluorophor emittierte Photon nachgewiesen wird, wobei der Fluorophor sofort angeregt wird, wenn er in seinen nicht angeregten Zustand zurückspringt, wobei der Fluorophor nicht weiter angeregt werden kann, wenn er sich im angeregten Zustand befindet, und wobei kein Licht von dem Laser 2 erfaßt wird.
  • 2b zeigt ein zweites Szenario, wobei die Probe zwei Fluorophore von einem Typ aufweist und alle anderen, oben angegebenen Annahmen nach wie vor gelten. In diesem Fall emittiert jeder Fluorophor wie oben eine Photonenserie. Die charakteristische Zykluszeit des Fluorophors ist aus dem (zeitlichen) Abstand der Photonen in jeder Serie ersichtlich, da eine Autokonelation der Photonenverteilung ein starkes Maximum bei einer Frequenz liefert, die der charakteristischen Zykluszeit des Fluorophors entspricht.
  • 2c zeigt einen dritten Fall, der dem in 2b dargestellten entspricht, wobei aber nicht alle von dem Fluorophor emittierten Photonen nachgewiesen werden. Obwohl nicht alle emittierten Photonen erfaßt werden, reicht die erfaßte Anzahl aus, damit eine Autokonelation des Signals von 2c ein Maximum bei der Frequenz liefert, die der charakteristischen Zykluszeit des Fluorophors entspricht, und daher treten jetzt ein weiteres Maximum bei der zweifachen Frequenz, ein Maximum bei der dreifachen Frequenz usw. auf.
  • Daher ist es nicht notwendig, daß jedes Photon erfaßt wird, das durch eine Probe von Fluorophoren emittiert wird, sondern statt dessen muß die Anzahl der erfaßten Photonen ausreichen, damit eine Autokonelation des erfaßten Signals meßbare Maxima bei Vielfachen der Frequenz liefert, die der charakteristischen Zykluszeit der Fluorophore entspricht.
  • Es gibt eine obere Grenze für die Anzahl von Fluorophoren, die in einer Probe enthalten sein können. Wenn z. B. eine Probe mehr als 100 Fluorophore aufweisen und der Detektor alle von den Fluorophoren emittierten Photonen erfassen würde, dann wäre die Anzahl der Photonen so groß, daß das erfaßte Signal "ausgewaschen" werden könnte und es schwierig wäre, irgendeine Information aus dem Signal zu erhalten.
  • Wie oben festgestellt, wird in einem idealen Szenario nur ein einzelner Fluorophor gemessen. In der Praxis sind jedoch die für dieses ideale Szenario getroffenen Annahmen nicht gültig. Zum Beispiel werden nicht alle von dem Fluorophor emittierten Photonen nachgewiesen. Außerdem sind nicht alle in einer Probe enthaltenen Fluorophore aktiv. Um das Signal-Rausch-Verhältnis des erfaßten Signals zu maximieren, kann eine optimale Kombination der Probengröße mit der Intensität der Laserbeleuchtung gewählt werden. Die Auswahl wird von dem verwendeten konkreten optischen Aufbau abhängen und wird z. B. durch den Wirkungsgrad des Photonennachweises und die Quantenausbeute der Fluorophorprobe beeinflußt. Daher wird die Anzahl der einzusetzenden Fluorophore experimentell bestimmt, indem das Signal-Rausch-Verhältnis des erfaßten Signals für gegebene Versuchsbedingungen maximiert wird. Der ideale Signalpegel entspricht im wesentlichen der Beobachtung eines einzelnen Fluorophors in dem oben beschriebenen idealen Szenario, obwohl dies eigentlich mit der Erfassung eines prozentualen Anteils der Emission von etwa 5 bis 50 Fluorophoren verbunden ist.
  • 3 zeigt die Funktionsweise der Erfindung dicht an ihrem oberen Grenzwert (hinsichtlich der Intensität des erfaßten Lichts). Wenn das in 1 dargestellte Gerät zum Nachweis von Photonen verwendet wird, die von einer Probe mit einer großen Anzahl von Fluorophoren emittiert werden, z. B. von 50 Fluorophoren, dann kann man ein Nachweissignal erhalten, wie es in 3a dargestellt ist. Statt einzelne Photonen nachzuweisen, die durch zeitliche Verzögerungen voneinander getrennt sind, ist die Anzahl der Fluorophore so groß, daß die Intensität des erfaßten Fluoreszenzlichts niemals auf null abfällt. Obwohl das erfaßte Signal zufällig zu sein scheint, ist aus den obigen Bemerkungen erkennbar, daß eine Autokonelation des Signals eine Serie von Maxima liefert, die Vielfache einer Frequenz sind, die der charakteristischen Zykluszeit des Fluorophors entspricht und daher die Charakterisierung des Fluorophors ermöglicht. Dies wird unter Bezugnahme auf 3b weiter veranschaulicht, wo das erfaßte Signal wieder zufällig zu sein scheint. Angenommen, die Probe, von der die Symbole von 3a und 3b abgeleitet werden, enthalte die gleiche Anzahl von Fluorophoren, dann entspricht das in 3b dargestellte Signal einem Fluorophor mit einer charakteristischen Zykluszeit, die zehnmal größer ist als die in dem Signal von 3a dargestellte charakteristische Zykluszeit. Obwohl beide 3a und 3b scheinbar zufällige Signale aufweisen, ist aus der Anzahl der Schnittpunkte des Signals mit seinem Mittelwert erkennbar, daß die charakteristische Zykluszeit der in 3b erfaßten Probe kürzer ist als die der in 3a erfaßten Probe.
  • Bei der oben beschriebenen Ausführungsform wird angenommen, daß die Intensität des auf eine Probe auffallenden Lichts ausreicht, um nach der Rückkehr eines gegebenen Fluorophors in seinen Grundzustand diesen sofort wieder in einen angeregten Zustand anzuheben. Dies ist der optimale Versuchsaufbau, da ein unter diesen Bedingungen erfaßtes Signal ausschließlich eine Funktion der charakteristischen Zykluszeit des Fluorophors ist. Würde eine niedrigere Intensität des einfallenden Lichts verwendet, dann wäre der (zeitliche) Abstand der von einem gegebenen Fluorophor emittierten Photonen eine Funktion von der charakteristischen Zykluszeit des Fluorophors und von der Zeit, die zwischen Zusammenstößen von Photonen mit dem Fluorophor verstrichen ist. Die Photonenstoßrate bzw. – stoßfrequenz ist für eine gegebene Laserintensität und einen gegebenen Versuchsaufbau konstant, und die Auswirkung einer niedrigeren als der optimalen Intensität von einfallendem Licht kann mittels einer geeigneten Eichung aus der gemessenen Zykluszeit entfernt werden, um die charakteristische Zykluszeit zu erhalten.
  • Der in 1 dargestellte Laser wird in einer Anordnung zur Beleuchtung einer Probe mit einem kontinuierlichen Lichtstrahl beschrieben. Dies ist eine vorteilhafte Anordnung, da kontinuierliche Laser (CW-Laser) billig und allgemein verfügbar sind. Es versteht sich jedoch, daß die Probe unter Verwendung von Impulslicht beleuchtet werden kann. Zum Beispiel kann Licht mit einem Impulsabstand in der Größenordnung der charakteristischen Zykluszeit der Probenfluorophore oder mit einem kürzeren Abstand verwendet werden. Wenn der Impulsabstand größer als dieser Wert wäre, dann würde die Zeitdauer, die jeder Fluorophor in einem nicht angeregten Zustand verbringt, ein so starkes Rauschen in das erfaßte Signal einführen, daß die Lebensdauermessung des Fluorophors gefährdet wäre.
  • Eine Fluorophorprobe kann mit Impulsen von einer Dauer beleuchtet werden, die viel länger ist als die charakteristische Zykluszeit der Fluorophore, welche diese Probe bilden. Zum Beispiel kann ein Impuls von 10 Mikrosekunden, der durch einen gütegesteuerten bzw. Q-Switch-Laser erzeugt wird, zur Messung charakteristischer Zykluszeiten von Fluorophoren in der Größenordnung von 1 Nanosekunde verwendet werden. Dies ist möglich, da der Impuls 10.000mal länger ist als die Zykluszeit und daher während eines gegebenen Anregungsimpulses ausreichend Photonen emittiert werden, um eine Messung der charakteristischen Zykluszeit zu erhalten.
  • Wenn die Dauer eines Anregungsimpulses gleich (100 × τ)2 ist, wobei τ die charakteristische Zykluszeit eines zu messenden Fluorophors ist, erlaubt dies ein größtmögliches Signal-Rausch-Verhältnis in der Größenordnung von einem Prozent. Die Impulsdauer muß zumindest in einer höheren Größenordnung als die zu messende charakteristische Zykluszeit liegen, um eine brauchbare Messung zu ergeben.
  • Die Messung einer charakteristischen Fluorophor-Zykluszeit unter Verwendung eines Einzelimpulses steht im Gegensatz zur herkömmlichen Fluoreszenzanalyse, wo viele Tausende von Beleuchtungsimpulsen benötigt werden, um die charakteristische Lebensdauer eines Fluorophors zu messen.
  • Die charakteristische Zykluszeit eines Fluorophors kann auf verschiedene Arten aus dem erfaßten Signal abgeleitet werden; dazu gehören die Verwendung von Signalanalysatoren, analogen Korrelatoren, Speicher- und Software-Korrrelation oder Fourier-Transformierten.
  • Die Erfindung kann zur Untersuchung der Quantenausbeute von Fluorophoren angewandt werden. Die Quantenausbeute ist ein Maß für die Anzahl der von einem Fluorophor emittierten Photonen im Verhältnis zur Anzahl der von diesem Fluorophor "absorbierten" Photonen.
  • Im allgemeinen wird ein Photon nach Absorption durch einen Fluorophor diesen Fluorophor in einen Zustand anregen, von dem er unter Emission eines Photons (dies ist die Fluoreszenz) in einen niedrigeren Zustand zurückspringt bzw. relaxiert. Bestimmte angeregte Zustände eines Fluorophors lassen jedoch keine Emission eines Photons zu, und die Anregung muß auf irgendeine andere Weise, z. B. als Wärme, abgeführt werden. Ein "nichtfluoreszierender" angeregter Zustand kann oder kann nicht dazu fähig sein, durch Absorption eines weiteren Photons weiter in einen "fluoreszierenden" angeregten Zustand angehoben zu werden. Ein bekanntes Fluoreszenznachweisgerät nach dem Stand der Technik erfordert eine aus vielen Fluorophoren bestehende Probe, und eine vollständige Untersuchung der Quantenausbeute eines gegebenen Fluorophor-Typs ist nicht möglich, da der Effekt der Anregung in "nichtfluoreszierende" Zustände für alle Fluorophore in der Probe ausgemittelt wird. Die Erfindung ermöglicht die Untersuchung einer Probe, die eine sehr kleine Anzahl von Fluorophoren aufweist und dadurch eine ausführlichere Untersuchung von "nichtfluoreszierenden" Zuständen zuläßt.
  • 4 zeigt schematisch die Energiezustände eines einfachen Fluorophors. Der Fluorophor beginnt bei einem Grundzustand 7, wird durch Energie aus einer externen Quelle in ein oberes Niveau 8 eines Emissionsübergangs angeregt und springt von dem oberen Niveau 8 des Emissionsübergangs in ein unteres Niveau 9 des Emissionsübergangs zurück, wobei er gleichzeitig ein Photon emittiert. Der Fluorophor springt dann von dem unteren Niveau 9 des Emissionsübergangs in den Grundzustand 7 zurück.
  • Bei einer herkömmlichen Messung der Fluoreszenzlebensdauer dient ein auffallender Laserstrahl zur Anregung eines Fluorophors (innerhalb einer Population) aus dem Grundzustand 7 in das obere Niveau 8 des Emissionsübergangs, und es wird eine Messung der Zeit ausgeführt, die bis zur Emission eines Photons aus dem Fluorophor verstreicht. Die gemessene Zeitspanne ist die Zeit von der Anregung aus dem Grundzustand 7 bis zum Auftreten des Emissionsübergangs. Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Erfassung einer Serie von Photonen, die von einem Fluorophor emittiert werden, der kontinuierlich angeregt wird, so daß er im Grundzustand 7 effektiv keine Zeit verbringt. Die unter Anwendung der Erfindung gemessene charakteristische Zykluszeit ist die Summe aller Lebensdauern des oberen Niveaus 8 des Emissionsübergangs und des unteren Niveaus 9 des Emissionsübergangs. Da die Lebensdauer des unteren Niveaus 9 des Emissionsübergangs nicht in der Zeitspanne enthalten ist, die unter Verwendung der herkömmlichen Fluoreszenzdetektion gemessen wird, kann die Lebensdauer dieses unteren Niveaus 9 bestimmt werden, indem die mit der herkömmlichen Fluoreszenzerfassung gemessene Lebensdauer von der unter Anwendung der Erfindung gemessenen charakteristischen Zykluszeit subtrahiert wird.
  • Die Lebensdauer des unteren Niveaus 9 des Emissionsübergangs könnte z. B. mit Hilfe eines Lasers gemessen werden, der für die Erzeugung einer Impulsstrahlung konfiguriert wird, um eine herkömmliche Fluoreszenzmessung zuzulassen, und dann für die Erzeugung von kontinuierlichem Licht konfiguriert wird, so daß die charakteristische Zykluszeit des Fluorophors unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens gemessen werden kann. Das Nachweisgerät kann so konfiguriert werden, daß es automatisch die auf herkömmliche Weise gemessene charakteristische Lebensdauer des Fluorophors von der charakteristischen Zykluszeit subtrahiert, um einen Meßwert für die Lebensdauer des unteren Niveaus 9 des Emissionsübergangs zu liefern. In einigen Fällen kann die auf herkömmliche Weise gemessene Fluoreszenzlebensdauer eines Fluorophors bereits bekannt sein, in welchem Fall die Lebensdauer des unteren Niveaus 9 des Emissionsübergangs durch Subtraktion der bekannten Lebensdauer von der Zykluszeit bestimmt werden kann.
  • Es ist vorteilhaft, den Fluorophor von 4 in einem weitgehend kontinuierlichen Anregungszyklus zu halten. Der Effekt einer weniger als optimalen Anregungsrate des Fluorophors aus dem Grundzustand wird in der gemessenen charakterstischen Zykluszeit enthalten sein und die Meßgenauigkeit der Zykluszeit vermindern. Dieser Effekt kann durch Anwendung einer experimentellen Eichung reduziert werden.
  • 5 zeigt eine vorteilhafte Methode zur Bereitstellung der erforderlichen kontinuierlichen Anregung. Eine Probe, die den Fluorophor X enthält, wird mit dem Molekül Z bereitgestellt. Das Molekül Z wird durch einfallende Lichtstrahlung aus einem Grundzustand 10 in ein angeregtes Niveau 11 angehoben. Der Fluorophor X wird durch Stoß mit dem Molekül Z in ein oberes Niveau 12 eines Emissionsübergangs angeregt, relaxiert durch Strahlungsemission in ein unteres Niveau 13 des Emissionsübergangs und relaxiert dann in den Grundzustand 10 (der Grundzustand 10 ist X und Z gemeinsam). Das angeregte Niveau 11 des Moleküls Z hat eine längere Lebensdauer als das obere Niveau 12 des Emissionsübergangs des Fluorophors X. Das Molekül Z wirkt daher als Puffer und speichert Energie in dem angeregten Niveau 11, bevor es die Energie zum Fluorophor X überträgt. Die Verwendung des Moleküls Z ist analog einem Kondensator in einem elektrischen Stromkreis, der elektrische Energie speichert und sie im Lauf der Zeit in den Stromkreis abgibt. Der Fluorophor X kann durch die Beleuchtung gelegentlich direkt in das obere Niveau 12 des Emissionsübergangs angeregt werden, wie in 5 dargestellt.
  • Für jeden Fluorophor X sollten sehr viele Moleküle Z bereitgestellt werden, um sicherzustellen, daß eine Menge angeregte Moleküle Z mit dem Fluorophor X wechselwirken und diesen in das obere Niveau 12 des Emissionsübergangs anregen, sobald er in den Grundzustand 10 zurückgekehrt ist. Das Molekül Z muß eine Lebensdauer des angeregten Niveaus 11 aufweisen, die länger ist als der Zeitabstand zwischen den Impulsen, wenn diese Anordnung verwendet werden soll, um die durch Impulsbeleuchtung verursachte Welligkeit zu vermeiden.
  • Falls für jeden Fluorophor X viele Moleküle Z vorgesehen sind, werden durch die Beleuchtung statt einer direkten Anregung der Fluorophore X zum größten Teil Moleküle Z angeregt. Wenn die Fluorophore X durch Beleuchtung direkt angeregt würden, dann würden mit einer beträchtlichen Wahrscheinlichkeit zwei Anregungsphotonen durch einen gegebenen Fluorophor X innerhalb kurzer Zeit absorbiert werden, so daß der Fluorophor in ein sehr hohes Energieniveau angeregt würde. Im Gegensatz dazu werden die Moleküle Z durch die Beleuchtung mit einem endlichen Energiebetrag versehen und können daher die Fluorophore X nicht in sehr hohe Zustände anregen. Die Verwendung von Molekülen Z, wie in 5 dargestellt, vermindert daher die Wahrscheinlichkeit, daß ein Fluorophor X zu stark angeregt und gelöscht wird.
  • Ein Beispiel für die Anregung eines Fluorophors X über ein Molekül Z ist die resonante Fluoreszenzenergieübertragung (FRET), wobei ein erster Fluorophor Energie mittels einer Dipol-Dipol-Wechselwirkung auf einen zweiten Fluorophor überträgt. Der FRET-Mechanismus wird weiter unten ausführlich beschrieben. Damit der FRET-Mechanismus als Puffer wirken kann, sind viele Donatormoleküle (der erste Fluorophor) für jedes Akzeptormolekül (den zweiten Fluorophor) erforderlich. Es kann ein Lysin-Baum konstruiert werden, indem man mit einem Akzeptor beginnt und am Rest des Baums Donatoren anordnet.
  • Falls ein Fluorophor einen signifikanten Energiezustand (oder mehrere Zustände) unterhalb des unteren Niveaus eines Emissionsübergangs oder oberhalb des oberen Niveaus eines Emissionsübergangs aufweist, kann beim Zurückspringen aus diesen Energieniveaus eine beträchtliche lokalisierte Erwärmung entstehen. Die lokalisierte Erwärmung kann eine Anzahl niederenergetischer Phononen erzeugen, die als Analogsignal in Erscheinung treten können. Der Effekt dieser Erwärmung kann auf verschiedene Weise gemessen werden, z. B. durch direkte Temperaturmessung, örtliche Druckdifferenzmessung und Veränderung des Brechungsindex. Das erfindungsgemäße Verfahren kann so modifiziert werden, daß ein Ereignis nur dann registriert wird, wenn ein Photon nachgewiesen wird und der Zustand der lokalisierten Erwärmung oberhalb eines vorgegebenen Zustands liegt. Als Alternative können der erfaßte Strom der ankommenden Photonen und die örtliche Temperatur kreuzkorreliert werden (zu diesem Zweck muß die örtliche Temperatur durch eine digitale Zahl dargestellt werden). Die Kombination eines Analogsignals mit einem erfindungsgemäß erfaßten Signal kann in jeder anderen geeigneten Anwendung benutzt werden. Außerdem versteht es sich, daß gemäß der Erfindung Schwankungen im Photonenausstoß gemessen werden können, die aus periodischen Absorptionsprozessen und damit verbundenen Relaxationen resultieren, die durch Phononen über mechanische Schwankungen verursacht werden.
  • Die Photonen, die von einer Fluorophorprobe emittiert werden, die gemäß der vorliegenden Erfindung angeregt wird, können in bestimmtem Umfang als kohärent angesehen werden. Dieses kohärente Fluoreszenzlicht kann mit kohärentem Licht aus einer zweiten Quelle (z. B. der Anregungsquelle, die ein Laser sein kann) zu einem Schwebungssignal vermischt werden. Das Schwebungssignal ist nützlich, da es eine niedrigere Frequenz als diejenige aufweist, die der Zykluszeit der Fluorophore entspricht, aus denen die Probe besteht. Wenn ein Teil des Anregungssignals zusammen mit dem Emissionssignal einem Detektor zugeführt wird, erkennt man Schwebungen an dem Detektor, wobei die Schwebungen eine Frequenz aufweisen, die der Differenz zwischen den Frequenzen der Anregungsimpulse und der charakteristischen Zykluszeit entspricht.
  • In einer alternativen Anordnung der ersten und zweiten Quellen von kohärentem Licht können erste und zweite Fluorophortypen in einer einzigen Probe enthalten sein. Die Verwendung von Schwebungsfrequenzen ist für den Nachweis kleiner Änderungen in der charakteristischen Zykluszeit eines Fluorophors ideal geeignet. Zum Beispiel kann eine Probe einen einzigen Fluorophortyp mit einer einzigen charakteristischen Zykluszeit von 100 ns aufweisen. Wenn die Eigenschaften einer Hälfte dieser Probe ein wenig modifiziert werden, um die charakteristische Zykluszeit dieser Hälfte der Probe geringfügig auf 95 ns zu ändern, dann wird eine Schwebungsfrequenz von 500 kHz erfaßt, welche die Änderung der Zykluszeit anzeigt.
  • Die Erfindung ermöglicht die Messung charakteristischer Zykluszeiten von Chemilumineszenz-Spezies (d. h. von Spezies, die chemisch angeregt werden und während der Relaxation in einen niedrigeren Zustand Photonen emittieren). In diesem Fall ist die gemessene Lebensdauer ein Übertrag von einem Katalysator (der ein Enzym sein kann), statt eines Rücksprungs eine Fluorophors. In Fällen, wo ausreichende Katalysator- oder Enzymmengen bereitgestellt werden, kann eine chemilumineszente Spezies im wesentlichen keine oder eine vergleichsweise kurze Zeit in einem Grundzustand verbringen, sondern wird in einem ständigen Kreislauf in ein oberes Niveau eines Emissionsübergangs angehoben und emittiert Photonen in einem zeitlichen Abstand, welcher der Zeit entspricht, welche die Spezies benötigt, um von einem Grundzustand in das obere Niveau des Emissionsübergangs angeregt zu werden und in den Grundzustand zurückzuspringen bzw. relaxieren. Entsprechend ermöglicht die Erfindung auch die Messung der Lebensdauern von biolumineszenten Spezies.
  • Lebensdauern von chemilumineszenten und biolumineszenten Spezies können nicht ohne weiteres unter Anwendung herkömmlicher Fluoreszenzlebensdauer-Meßverfahren gemessen werden. Der Grund dafür ist, daß die herkömmlichen Verfahren erfordern, daß die Anregung einer Spezies zu einem bekannten Zeitpunkt auftritt, so daß die Zeit im Anschluß an diese Anregung bis zur Photonenemission gemessen werden kann. Eine Anregung von chemilumineszenten und biolumineszenten Proben zu einem bestimmten vorgegebenen Zeitpunkt kann nicht ohne weiteres bereitgestellt werden.
  • Ein Beispiel einer durch ein Enzym ausgelösten Chemilumineszenzanalyse ist die Adenosintriphosphat-Analyse (ATP-Analyse), die das Vorhandensein von lebensfähigen Bakterien anzeigt. Einer zu untersuchenden Probe wird Luciferase-Enzym zusammen mit dem Substrat Luciferin zugesetzt. In Gegenwart von ATP wird das Luciferin aktiviert, und das aktivierte Luciferin erzeugt in Gegenwart von Sauerstoff ein Lumineszenz-Ausgangssignal: Luciferin + ATP + O2 ⇒ (in Gegenwart von Luciferase und Mg++ ⇒ Oxyluciferin + AMP + Ppi + CO2 + Photon (560 nm)
  • Das erfindungsgemäße Verfahren mißt eine Zeitsignatur, die von der mittleren Verzögerung zwischen dem ATP/Luciferin-Kontakt, der mittleren Verzögerung zwischen dem O2/Luciferin-Kontakt, der erforderlichen Zeit für den Luciferin-Katalyseumsatz (effektiv eine Enzymlebensdauer) und der Lebensdauer des oberen Zustands von Luciferin in Gegenwart von Sauerstoff abhängig ist. Der Zeitmaßstab der beiden Kontaktverzögerungen kann durch die Menge jeder vorhandenen Chemikalie modifiziert werden. Dies steht im Gegensatz zur Umsatzdauer und zur Lebensdauer des oberen Zustands, die charakteristische Lebensdauern und daher unabhängig von den Mengen jeder vorhandenen Chemikalie sind.
  • Im Fall der Chemilumineszenz kann die charakteristische Zykluszeit, die unter Anwendung des oben beschriebenen kontinuierlichen Detektionsverfahrens gemessen wird, eine chemische Reaktion einschließen, die auf eine chemische Wechselwirkung mit einem Katalysator, Umwandlung in eine neue Form und Emission eines Photons und anschließende Fortbewegung von dem Katalysator zurückzuführen ist, die ermöglicht, daß dieser eine neue Wechselwirkung beginnt.
  • Die Erfindung kann zur Ausführung von Fluoreszenzmessungen bei gestoppter Strömung angewandt werden. Messungen bei gestoppter Strömung dienen zur Messung von Wechselwirkungen zwischen einer Fluoreszenzsonde und einer Probe, die in einem schnellen Zeitmaßstab stattfinden. Eine Fluoreszenzsonde wird kontinuierlich angeregt, wobei die Notwendigkeit vermieden wird, die Anregung mit dem Vermischen der Sonde und der Probe zu synchronisieren. Das Verfahren ist vorteilhaft, da es Synchronisationsprobleme vermeidet, und hat den weiteren Vorteil, daß die Zeitspanne, in der die Wechselwirkung überwacht werden kann, unbegrenzt ist.
  • Wie aus 4 erkennbar, kann die charakteristische Zykluszeit eines Fluorophors durch Verändern der Lebensdauer des oberen Niveaus 8 des Emissionsübergangs oder der Lebensdauer des unteren Niveaus 9 des Emissionsübergangs modifiziert werden.
  • 6 zeigt eine schematische Darstellung einer aktiven Spezies, die komplizierter ist als der in 4 dargestellte einfache Fluorophor. Die in 6 dargestellte aktive Spezies weist einen Grundzustand 14 und eine Gruppe von angeregten Niveaus 15 auf. Die angeregten Niveaus 15 beinhalten einen angeregten Zustand, der durch einen Effekt wie z. B. die Schwingungsverbreiterung zu einer Gruppe von dicht beabstandeten Niveaus verbreitert ist. Nach Anregung der aktiven Spezies in eines der angeregten Niveaus 15 kann sie in eines der angeregten Niveaus 15 mit niedrigerer Energie relaxieren.
  • Die aktive Spezies springt von der Gruppe angeregter Niveaus 15 in ein oberes Niveau 16 eines Emissionsübergangs zurück. Die aktive Spezies springt dann unter Strahlungsemission in ein unteres Niveau 17 des Emissionsübergangs zurück. Weitere Niveaus 18, die eine etwas niedrigere Energie als das untere Niveau 17 des Emissionsübergangs aufweisen, werden als Nachemissionsniveaus 18 bezeichnet. Die aktive Spezies kann in ein oder mehrere dieser Nachemissionsniveaus 18 relaxieren, bevor sie in ein Grundniveau 19 zurückkehrt.
  • Das Grundniveau 19 ist als vom Grundzustand 14 verschieden dargestellt, um z. B. eine Konformationsänderung der aktiven Spezies darzustellen. Die aktive Spezies kann so beschaffen sein, daß sie sich in einer bestimmten Konformationsanordnung befinden muß, bevor sie in die angeregten Niveaus 15 angeregt werden kann. Nach Relaxation aus dem Nachemissionsniveaus 18 zum Grundniveau 19 befindet sich die aktive Spezies nicht in der erforderlichen Konformationsanordnung und kann daher nicht angeregt werden. Im Anschluß an eine Konformationsänderung der aktiven Spezies, die durch den Pfeil 20 dargestellt wird, der das Grundniveau 19 mit dem Grundzustand 14 verbindet, kann die aktive Spezies dann angeregt werden.
  • Die Begriffe Grundniveau 19 und Grundzustand 14 werden benutzt, um zwischen den Konformationsanordnungen zu unterscheiden. Konfonnationsänderungen der aktiven Spezies können auftreten, wenn die aktive Spezies zwei Teile aufweist. Andere Änderungen können periodische Änderungen der Wahrscheinlichkeit für das Auftreten einer Anregung aus dem Grundzustand 14 einschließen, z. B. aufgrund der zyklischen Bewegung eines Fluorophors zu einer Löschkomponente hin und von dieser weg (der Fluorophor und die Löschkomponente bilden zusammen die aktive Spezies). Dies ist effektiv eine periodische Veränderung des Anregungsquerschnitts der aktiven Spezies und ist in 6 nicht dargestellt.
  • Jedes der in 6 dargestellten Niveaus 14–19 weist eine Lebensdauer auf. Einige von den Lebensdauern können länger sein als andere, in Abhängigkeit von der Natur der aktiven Spezies. Die charakteristische Zykluszeit der aktiven Spezies ist die Zeit, die von einer Anregung der aktiven Spezies aus dem Grundzustand 14 bis zur nächsten Anregung der aktiven Spezies aus dem Grundzustand 14 verstreicht.
  • Die charakteristische Zykluszeit kann durch Änderung der Lebensdauer irgendeines der obenerwähnten Niveaus modifiziert werden. Dies steht im Gegensatz zu der auf herkömmliche Weise gemessenen charakteristischen Lebensdauer einer aktiven Spezies, die nur die Lebensdauern der angeregten Niveaus 15 und des oberen Niveaus 16 des Emissionsübergangs einschließt. Die Messung der charakteristischen Zykluszeit bietet daher eine viel größere Flexibilität hinsichtlich der Modifikation der Zeitcharakteristik einer aktiven Spezies. Die Modifikationen führen im allgemeinen zu einer Verlängerung der charakteristischen Zykluszeit der aktiven Spezies.
  • Die Lebensdauer des unteren Niveaus des Emissionsübergangs 17 und die Lebensdauern der Nachemissionsniveaus 18 können auf verschiedene Arten modifiziert werden. Dazu gehören Änderungen der lokalen Umgebung oder Änderungen der Temperatur, des pH-Werts, des Drucks, der Ionenstärke einer Lösung, welche die aktive Spezies enthält, oder das Anlegen eines magnetischen oder elektrischen Feldes. Die Lebensdauern können auch durch Änderungen der Konformation der aktiven Spezies verschoben werden. Nach dem Stand der Technik sind viele Verfahren zur Modifikation der Lebensdauern der angeregten Niveaus 15 und des oberen Niveaus 16 des Emissionsübergangs bekannt. Diese Verfahren können auch zur Modifikation der Lebensdauer des unteren Niveaus 17 des Emissionsübergangs sowie der Lebensdauern der Nachemissionsniveaus 18 benutzt werden.
  • Die Lebensdauer der Nachemissionsniveaus 18 kann eine Kombination von vielen Lebensdauern sein, z. B. Dissipation durch elektromagnetische Strahlung, Vibration, Rotation oder eine durch Löschung verkürzte Lebensdauer oder ein Übergang über ein anderes Element.
  • Während der Messung der charakteristischen Zykluszeit einer aktiven Spezies kann eine Verzögerung zwischen der Relaxation der aktiven Spezies in den Grundzustand 14 und der späteren Anregung aus dem Grundzustand 14 auftreten. Diese Verzögerung kann darauf zurückzuführen sein, daß die Anregungsintensität weniger als optimal ist. Die Verzögerung wird nichtsdestoweniger als Teil der charakteristischen Zykluszeit dieser aktiven Spezies registriert. Der Effekt dieser Verzögerung kann durch experimentelle Eichung aus der Messung der charakteristischen Zykluszeit eliminiert werden. Die Verzögerung kann z. B. auf eine periodische Änderung des Anregungsquerschnitts des Grundzustands 14 zurückzuführen sein. Diese Verzögerung ist wiederum in der Messung der charakteristischen Zykluszeit enthalten. Diese Verzögerung wird nicht durch experimentelle Eichung eliminiert, da sie eine Eigenschaft der aktiven Spezies ist.
  • Wie oben erwähnt, muß zum Erzielen einer sinnvollen Messung der charakteristischen Zykluszeit die Zeitdauer, in der sich eine aktive Spezies im Grundzustand 14 befindet, kürzer sein als die Summe der Lebensdauern der anderen Niveaus 15–18 (oder 15–19, wenn die aktive Spezies ein Grundniveau 19 aufweist, wie oben beschrieben). Wenn der Anregungsquerschnitt des Grundzustands 14 durch die Gegenwart einer interessierenden Substanz beeinflußt wird, dann wird die Lebensdauer des Grundzustands 14 modifiziert, wenn diese Substanz anwesend ist. Dies ergibt eine Änderung der charakteristischen Zykluszeit, die nachgewiesen werden kann. Die Lebensdauer des Grundzustands kann daher als Marker-Test verwendet werden. Im allgemeinen kann jeder Effekt, der die Lebensdauer des Grundzustands 14 modifiziert, unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens überwacht werden, vorausgesetzt, daß die Lebensdauer des Grundzustands 14 sowohl vor als auch nach der Modifikation kleiner oder gleich der Summe der Lebensdauern der anderen Niveaus 15–18 (oder 15–19) ist.
  • Eine aktive Spezies kann einen einfachen Fluorophor aufweisen. Alternativ kann die aktive Spezies eine Kombination von Elementen aufweisen, z. B. einen Fluorophor, eine Löschkomponente und ein weiteres Element, das die beiden miteinander verbindet. Mit anderen Worten, ein Fluorophor ist der Teil der aktiven Spezies, der ein Photon erzeugt, aber die Gesamtheit der Komponenten (Chemikalien, Teilchen usw.) die zusammen eine interessierende charakteristische Zykluszeit erzeugen, wird als aktive Spezies bezeichnet. Die charakteristische Zykluszeit der "aktiven Spezies" kann sich von derjenigen eines entsprechenden einfachen Fluorophors unterscheiden. Die charakteristische Zykluszeit kann z. B. durch eine Löschkomponente beeinflußt werden.
  • Eine Löschkomponente kann so angeordnet sein, daß sie auf mehrere unterschiedliche Arten eine Löschung herbeiführt. Zum Beispiel können in einer sogenannten "statischen Löschanordnung" ein Fluorophor und eine Löschkomponente sich zu einem inaktiven Komplex (Molekül) vereinigen, der nicht zur Emission eines Photons angeregt werden kann. Wie aus 6 erkennbar, bleibt der inaktive Komplex im Grundniveau 19 und kann nicht angeregt werden. Wenn der Komplex zerfällt, kann dann der Fluorophor angeregt werden. Die Periodizität des Komplexbildungs-/Komplexzerfalls-Prozesses kann gemäß der Erfindung gemessen werden, wie weiter unten beschrieben wird.
  • Eine Löschkomponente kann in der Nähe eines Fluorophors gehalten werden, so daß sie sich periodisch dem Fluorophor annähert und von diesem zurückweicht. Die Wahrscheinlichkeit dafür, daß sich die Löschkomponente und der Fluorophor zu einem inaktiven Komplex vereinigen, ändert sich periodisch mit dieser Bewegung. Die vor der Bildung des inaktiven Komplexes verstrichene Zeit ist charakteristisch für die Konfiguration des Fluorophors und der Löschkomponente. Im Anschluß an die Bildung des inaktiven Komplexes trennt sich nach einer weiteren charakteristischen Zeit der inaktive Komplex wieder in seine Bestandteile, nämlich den Fluorophor und die Löschkomponente.
  • Die Erfindung kann zur Messung der Perioden, in denen der Fluorophor aktiv ist, sowie der Perioden angewandt werden, in denen der Fluorophor wegen des Effekts der Löschkomponente inaktiv ist.
  • Da der Fluorophor kontinuierlich angeregt wird, emittiert er eine Serie von Fluoreszenzphotonen, die durch die charakteristische Zykluszeit des Fluorophors voneinander getrennt sind. Der Fluorophor emittiert weiter Photonen, bis er mit der Löschkomponente einen inaktiven Komplex bildet. Dann werden keine weiteren Photonen emittiert, bis sich der inaktive Komplex wieder in seine Bestandteile trennt. Eine Korrelation oder eine andere geeignete Transformation der nachgewiesenen Photonen liefert Komponenten, die Rückschlüsse auf die Periode zulassen, in der Photonen emittiert wurden, sowie auf die Perioden, in denen keine Photonen emittiert wurden.
  • Betrachtet man einen einzelnen Fluorophor, so ist offensichtlich, daß die Messung der Perioden, in denen der Fluorophor aktiv war, oder der Perioden, in denen der Fluorophor inaktiv war, unter Anwendung der herkömmlichen Fluoreszenzlebensdauermessung nicht möglich wäre. Dies ist darauf zurückzuführen, daß aufeinanderfolgende Anregungsimpulse, die bei der herkömmlichen Messung verwendet werden, zeitlich weit auseinander liegen. Die herkömmliche Messung kann nur eine einzige Größe messen, d. h. die Zeit, die von der Anregung aus dem Grundzustand eines Fluorophors bis zur Emission eines Fluoreszenzphotons verstrichen ist.
  • Eine Anordnung, über die statisches Löschen erreicht werden kann, ist schematisch in 7a dargestellt. Ein Fluorophor 21a ist durch ein flexibles Brücken- bzw. Spacermolekül 22a mit einer Bindungskomponente 23a verbunden (diese Elemente können zusammengenommen als Sonde beschrieben werden). Die Bindungskomponente 23a ist so konfiguriert, daß sie eine Bindung mit einer vorgegebenen Bindungsstelle 24a in einem vorgegebenen Molekül eingeht. Die gekrümmte Linie oberhalb des Fluorophors 21a stellt die periodische Bewegung des Fluorophors 21a durch eine Biegung des Spacermoleküls 22a dar.
  • An die Bindungsstelle 24a ist eine Löschkomponente 25a angelagert. Die Wahrscheinlichkeit dafür, daß sich der Fluorophor 21a und die Löschkomponente 25a zu einem inaktiven Komplex vereinigen, nimmt mit der Annäherung des Fluorophors 21a an die Löschkomponente 25a zu. Wenn ein inaktiver Komplex gebildet wird (nicht dargestellt), dann bleibt er während einer charakteristischen Zeit bestehen, wonach der Fluorophor 21a nicht mehr durch die Löschkomponente 25a beeinflußt wird und sich wieder durch Verbiegen des Spacermoleküls 22a periodisch frei bewegen kann.
  • In einer zweiten bekannten Form des Löschens, die als Stoßlöschen bezeichnet wird, stößt ein Fluorophor, der auf ein oberes Niveau eines Emissionsübergangs (d. h. das Niveau 16 in 6) angeregt worden ist, mit eine Löschkomponente zusammen. Bei dem Zusammenstoß mit der Löschkomponente wird Energie von dem Fluorophor auf die Löschkomponente übertragen, und der Fluorophor springt dadurch ohne Emission eines Photons in den Grundzustand zurück (Niveau 14 in 6). Die Anregung des Fluorophors in ein oberes Niveau eines Emissionsübergangs (Niveau 16 in 6) wird verhindert, wenn der Fluorophor der Löschkomponente benachbart ist, da der Fluorophor durch die Löschkomponente sofort wieder in den Grundzustand relaxiert. Die Löschkomponente kann eine zweite Form des Fluorophors sein, die nicht aktiv ist (wobei Energie durch eine Dipol-Dipol-Wechselwirkung übertragen wird).
  • Es ist wichtig, zwischen dem Stoßlöschen (auch als dynamisches Löschen bekannt), durch das ein Fluorophor ohne Emission eines Photons in seinen Grundzustand zurückgeführt wird, und dem statischen Löschen zu unterscheiden, durch das aus einem Fluorophor und einer Löschkomponente ein Komplex gebildet wird, der die Rückkehr des Fluorophors in seinen Grundzustand verhindert.
  • Die Häufigkeit, mit der das Stoßlöschen auftritt, kann unter Anwendung der Erfindung gemessen werden. Das Stoßlöschen kann so eingerichtet werden, daß es bei einer in 7a dargestellten Konfiguration des Fluorophors 21a und der Löschkomponente 25a auftritt. Die Konfiguration ist die gleiche, wie sie oben in Verbindung mit dem statischen Löschen beschrieben wurde, wobei der Hauptunterschied darin besteht, daß die Löschkomponente 25a so gewählt ist, daß sie mit dem Fluorophor 21a kein Molekül bildet. Der Fluorophor 21a bewegt sich periodisch mit der Biegung des Spacermoleküls 22a, so daß der Fluorophor 21a sich der Löschkomponente 25a nähert und von dieser zurückweicht. Wenn der Fluorophor 21a der Löschkomponente 25a ausreichend nahe kommt, wird Energie von dem Fluorophor 21a auf die Löschkomponente 25a übertragen, und der Fluorophor springt ohne Emission eines Photons in den Grundzustand zurück.
  • Die Auftrittshäufigkeit des Stoßlöschens kann unter Anwendung der Erfindung gemessen werden. Wenn z. B. die charakteristische Zykluszeit des Fluorophors 21a kurz im Vergleich zur Schwingungsperiode des Fluorophors 21a auf dem flexiblen Spacermolekül 22a ist, kann der Fluorophor 21a zum Beispiel neun Fluoreszenzphotonen emittieren, bevor die Stoßlöschung auftritt. Daher wird der Fluorophor 21a eine Serie von Photonen in regehnäßigen Abständen übertragen, wobei jedes zehnte Photon in der Serie fehlt. Die Photonen werden erfindungsgemäß nachgewiesen und unter Verwendung einer Korrelation oder einer anderen geeigneten Transformation transformiert. Die transformierten Daten enthalten eine Signatur, welche die Auftrittshäufigkeit des Stoßlöschens darstellt.
  • Die Auftrittshäufigkeit des Stoßlöschens kann unter Anwendung der Erfindung auch in Fällen gemessen werden, wo die Ausbeute des Photonennachweises nicht ausreicht, um jedes von dem Fluorophor emittierte Photon nachzuweisen. Dies ist darauf zurückzuführen, daß Photonen, die wegen experimenteller Beschränkungen nicht nachgewiesen werden, zufällig verteilt sind, während das Stoßlöschen regelmäßig beabstandete Lücken in der Photonenserie liefert, die bei der Transformation der Nachweisdaten eine Signatur ergeben.
  • Das Verfahren zur Messung von Fluoreszenzlebensdauern nach dem Stand der Technik ist, wenn man einen einzelnen Fluorophor betrachtet, nicht in der Lage, die Auftrittshäufigkeit des Stoßlöschens zu messen. Es bietet keinen Mechanismus zum tatsächlichen Messen der Periode, in deren Verlauf der Fluorophor Photonen emittieren kann, oder der Periode, in deren Verlauf der Fluorophor gelöscht ist.
  • Eine weitere Form des Löschens ist mit dem Stoßlöschen verwandt. In diesem Fall stoßen der Fluorophor und die Löschkomponente nicht wirklich zusammen (d. h. kommen einander nahe genug, damit eine Energieübertragung stattfindet), sondern kommen statt dessen einfach einander so nahe, daß sich die Löschkomponente auf die Energien und Lebensdauern der Niveaus des Fluorophors auswirkt (14–18 in 6). Verfahren nach dem Stand der Technik zur Messung von Fluoreszenzlebensdauern können den Effekt der Löschkomponente auf die Lebensdauern der angeregten Niveaus 15 und des oberen Niveaus 16 des Emissionsübergangs messen. Die Erfindung ist vorteilhaft, da sie den Effekt der Löschkomponente auf die Lebensdauern aller Niveaus des Fluorophors (14–18) mißt.
  • Bei Betrachtung von 7a ist offensichtlich, daß, wenn das Spacermolekül 22a starr wäre, der Effekt der Löschkomponente 25a dann konstant und nicht dynamisch wäre (d. h. sie würde sich nicht periodisch ändern). In dieser Situation würde die durch bekannte Verfahren gemessene charakteristische Lebensdauer des Fluorophors 21a als Exponentialgröße erscheinen. Wenn jedoch das Spacermolekül flexibel (oder länger) wäre, so daß die Wechselwirkung mit der Löschkomponente 25a periodisch wäre, dann wäre die durch bekannte Verfahren gemessene charakteristische Lebensdauer nicht mehr eine einfache Exponentialgröße. Mit zunehmender Komplexität der Wechselwirkung zwischen dem Fluorophor 21a und der Komponente 25a können die bekannten Verfahren die charakteristische Lebensdauer nicht mehr auf sinnvolle Weise messen. Dagegen bietet die Erfindung eine mikroskopische Analyse, die einzelne Relaxationen von Fluorophoren sichtbar machen kann.
  • Eine Form des scheinbaren Löschens tritt auf, wenn ein Medium, in dem Fluorophore enthalten sind, ausreichend trübe oder optisch dicht ist, um das beobachtete Fluoreszenzausgangssignal von den Fluorophoren zu reduzieren. Wenn der Real- oder Imaginärteil des Brechungsindex des Mediums moduliert wird, dann kann die Erfindung angewandt werden, um diese Modulation nachzuweisen.
  • Der Fluorophor kann mit einer modifizierenden Komponente wechselwirken, die keine Löschkomponente ist. Zum Beispiel kann Energie von einem niedrigeren Niveau des Emissionsübergangs (Niveau 17 in 6) während eines Stoßes mit einer Komponente übertragen werden. Dies hat die Wirkung, daß der Fluorophor schneller in den Grundzustand (Niveau 14 in 6) zurückgeführt wird, als dies in Abwesenheit der modifizierenden Komponente der Fall gewesen wäre, wodurch die charakteristische Zykluszeit des Fluorophors verkürzt wird.
  • Die charakteristische Zykluszeit des Fluorophors wird durch die dielektrische Umgebung beeinflußt, in der er sich befindet. Zum Beispiel ist aus den 7a–c erkennbar, daß die Ausdehnung des Fluorophors 21a–c von der Bindungsstelle aus seine charakteristische Zykluszeit beeinflußt, als Ergebnis der dielektrischen Kräfte sowohl innerhalb als auch außerhalb der Bindungsstelle. Das Spacermolekül 22a–c kann sich zusammenziehen und ausdehnen (typische Schwingungsbewegung), und dadurch kann eine Periodenänderung der charakteristischen Zykluszeit des Fluorophors 21a–c verursacht werden.
  • Die meisten Fluorophore sind selbstlöschend, wenn sie in hohen Konzentrationen bereitgestellt werden, z. B. Fluorescein. Eine Struktur kann so aufgebaut werden, daß ausreichend viele Fluorophore in enge Nachbarschaft zueinander gebracht werden, so daß eine Selbstlöschung auftritt. Selbstlöschung kann zwischen proximalen Fluorophoren, z. B. zwischen Fluorescein und Calcein, oder zwischen verschiedenen Fluorophormolekülen auftreten. Das Verfahren wird besonders häufig bei der Verwendung von Molecular Beacons ("molekularen Leuchtfeuern") angewandt, wie sie beispielsweise in S. Tyagi und F. R. Kramer, Nature Biotechnology, 1996, 14, 303, D. P. Bratu und F. R. Kramer, Nature Biotechnology, 1998, 16, 49, und L. G. Kostrikis et al., Science, 279, 1228, beschrieben werden. Gewöhnlich enthält die Molecular Beacon-Sonde einen Fluorophor in der Nähe eines Löschers, so daß bei einer Wechselwirkung der Sonde mit dem Target- bzw. Zielmolekül der Fluorophor und der Löscher voneinander getrennt werden und infolgedessen die Fluoreszenzemission zunimmt.
  • Die Form der Struktur, die aufgebaut wird, um ausreichende Mengen derartiger Fluorophore in enge Nachbarschaft zueinander zu bringen, so daß eine Selbstlöschung auftritt, kann so eingerichtet werden, daß eine Modulation der Selbstlöschung ermöglicht wird, die unter Anwendung der Erfindung gemessen werden kann.
  • Die Verwendung von Löschkomponenten ist bekannt, und dem Fachmann sind viele Löschkomponenten bekannt. Einige Gase sind Löscher: besonders molekularer Sauerstoff (von vielen Fluorophoren, z. B. von Perylen, Ethidiumbromid), aber auch Xenon, Distickstoffoxid und Nitromethan. Diese gasförmigen Löscher werden normalerweise nicht in Fluorophor-Löscher-Einheiten eingebaut, aber gasbindende oder interkalierende Strukturen (z. B. im Falle von Sauerstoffperfluorkohlenstoffen) können zur Modulation des Sauerstoffgehalts in der Nähe vieler Fluorophore verwendet werden. Im Falle von zweien Molekülgasen kann die Stoßhäufigkeit zwischen dem Fluorophor und Gasmolekülen unter Anwendung der Erfindung gemessen werden, während nur eine mittlere Verschiebung der herkömmlichen Lebensdauer als Streuung der Zerfallspopulation meßbar ist.
  • Aromatische und aliphatische Amine sind wirksame Löscher der meisten nichtsubstituierten Fluorophore. Zum Beispiel wird die Anthracen-Fluoreszenz in der Nähe einer Diethylanilin-Komponente gelöscht, wobei der Löschmechanismus eine Ladungsübertragung während der Bildung eines Komplex ist und der Fluorophor im angeregten Zustand ein Elektron von dem Amin übernimmt. In nichtpolaren Lösungsmitteln kann der gebildete Komplex selbst fluoreszierend sein. Bei einem polaren Lösungsmittel ist die Emission von Fluoreszenzphotonen aus dem Komplex viel weniger wahrscheinlich.
  • Weitere Löschkomponenten, die für eine Stoßlöschung sorgen, sind unter anderem Wasserstoffperoxid- und Peroxid-Komponenten (die oft auch zu Bleichwirkungen führen), Acrylamide, Tryptophan, N-Acetyl-L-tryptophanamid, Bromate, Iodide, Nitroxide, Olefine und sterisch gehinderte gesättigte Kohlenwasserstoffe. Zum Beispiel wird α-Cyanonapthalin durch eine Reihe von Olefinen gelöscht, die gewöhnlich einen nichtfluoreszierenden Exciplex bilden. Halogene (Chloroform, Trichlorethanol, Methylquecksilber(II)-chlorid) wirken als Stoßlöscher, und Modifikationen, die mehr als ein Chloratom tragen, wirken gewöhnlich als Löscher. Löschung durch große Halogen-Modifikationen kann das Ergebnis eines Zwischensystemübergangs zu einem angeregten Triplett-Zustand sein, der durch Spin-Bahn-Kopplung eine angeregten (Singulett-) Fluorophors und eines Halogens begünstigt wird. Da die Emission aus dem Triplett-Zustand langsam erfolgt, wird sie dann gewöhnlich durch viele andere Prozesse gelöscht.
  • Indol, Carbazol und deren Derivate sind empfindlich gegen Löschung durch chlorierte Kohlenwasserstoffe und durch Elektronenfänger (Histidin, Cystein, Fumarat, Kupfer, Blei, Cadmium und Mangan(II)-ionen), die mit der Abgabe eines Elektrons vom Fluorophor zum Löscher verbunden ist. Indol, Tryptophan und deren Derivate werden durch Succinimid, Dichloracetamid, Pyridiniumhydrochlorid, Imidazoliumhydrochlorid, Methionin, Europium-, Silber- und Cäsiumionen gelöscht.
  • Purine, Pyrimidine, N-Ethylnicotinamid, N-Alkylpyridinium- und Picolinium-Salze sind Löscher. Zum Beispiel werden Flavin und reduziertes Nicotinamid durch Adenin-Komponenten gelöscht, und 10-Methylacridinium wird durch Guanosin-5-monophosphat gelöscht.
  • In 7 sind verschiedene Anordnungen dargestellt, durch welche die Häufigkeit, mit der sich ein Fluorophor und eine Löschkomponente einander nähern, modifiziert werden kann. In jeder der 7a–g ist ein Fluorophor durch eine runde Scheibe 21a–g dargestellt, und eine Löschkomponente ist durch eine elliptische Scheibe 25a–g, 26g dargestellt. Flexible Spacermoleküle 22b–g, Bindungskomponenten 23b–g und Bindungsstellen 24b–g sind auf die gleiche Weise wie in 7a dargestellt.
  • Die 7a–c stellen die Verlängerung des flexiblen Spacermoleküls 22a–c dar. Mit der Verlängerung des Spacermoleküls verlängert sich die Zeitspanne zwischen aufeinanderfolgenden Wechselwirkungen des Fluorophors 21a–c und der Löschkomponente 25a–c.
  • Das Spacermolekül kann außerdem eine modifizierende Komponente enthalten, die ferner die dielektrische Umgebung der Bindungsstelle und infolgedessen die charakteristische Zykluszeit des Fluorophors beeinflußt. Die 7(d)–(e) zeigen eine mögliche Auswirkung einer modifizierenden Komponente 26e auf die Konfiguration des Fluorophors 21e innerhalb der Bindungsstelle 27e. In diesem Fall drückt die modifizierende Komponente den Fluorophor 21e näher an die Löschkomponente 25e heran und verkürzt dadurch die Zeitspanne zwischen aufeinanderfolgenden Wechselwirkungen des Fluorophors 21e und der Löschkomponente 25e.
  • Die 7(f)–(g) zeigen den Fall, wo ein Fluorophor 21f, g direkt an die Bindungsstelle 24f, g angelagert ist und ein Sondenmolekül eine Löschkomponente 25f, g aufweist, die durch ein flexibles Spacermolekül 22f, g und eine Bindungskomponente 23f, g an die Bindungsstelle 24f, g angelagert ist. Die Zeitspanne zwischen aufeinanderfolgenden Wechselwirkungen des Fluorophors 21f, g und der Löschkomponente 25f, g wird wie zuvor durch die Länge des flexiblen Spacermoleküls 22f, g beeinflußt. Eine modifizierende Komponente 26g kann an das flexible Spacermolekül 22g angelagert werden.
  • Die in 7 schematisch dargestellten Strukturen können unter Verwendung der obenerwähnten Fluorophore und Löschkomponenten aufgebaut werden. Bekannt ist, daß viele Fluorophore mit chemisch modifizierbaren Gruppen ausgestattet sind, die ihre Bindung an Strukturgerüste einfach machen (eine umfassende Liste von im Handel erhältlichen Fluorophoren wird in dem von Molecular Probes Inc., 4849 Pitchford Avenue, OR, 97402-9165 USA, herausgegebenen Katalog beschrieben). Molekulares Design und kernmagnetische Resonanz (NMR) sind bekannte Verfahren, die zur Entwicklung solcher Strukturen angewandt werden.
  • Das in 7 dargestellte System kann ein Medikament sein, das an ein Protein oder Peptid gebunden ist, das fluoreszierende Aminosäuren an der Bindungsstelle aufweist. Ein solches Beispiel wird durch die Peptidsequenz VCDWWGWGIC gegeben, die als Imitator der Bindung von Medikamenten durch das Medikamentenabflußprotein P-Glycoprotein bekannt ist und als Linearsequenz ausgebildet oder cyclisiert werden kann und deren natürliche Tryptophan-Fluoreszenz durch eine Kollektion von Medikamenten gelöscht wird (Doxorubicin, Vinblastine, Genistein, Cyclosporin A, Erythromycin, Verapamil, Colchicine, Reserpine, Digoxin, Novobiocin, Diazepam, Melphalan).
  • 7h zeigt ein Diagramm, das die Bindung an eine Peptidsequenz VCDWWGWGIC darstellt. In dem Diagramm zeigt die oberste Registrierkurve das Peptid VCDWWGWGIC-10-mer (49,1 μM, 2,9 ml) in 0,1 M Tris pH 7,5 an, angeregt bei 280 nm ohne Doxorubicin (der Löschungsgrad ist auf 999,99 normiert). Titration von Doxorubicin im stöchiometrischen Verhältnis zu dem Peptid: Doxorubicin ist in der Reihenfolge von der zweitobersten Registrierkurve zur unteren Registrierkurve wie folgt dargestellt: 1: 0,1 (917,99); 1: 0,2 (835,53); 1: 0,3 (769,34); 1: 0,4 (704,25); 1: 0,5 (633,91); 1: 0,6 (594,31); 1: 0,7 (547,73); 1: 0,8 (498,54); 1: 0,9 (457,70); 1: 1 (415,96); 1: 1,1 (390,24). Die in Klammern gesetzte Zahl nach jeder Titration ist die relative Intensität des Maximums bei 359,25 nm, die den Löschungsgrad anzeigt.
  • Die Bindung anderer xenobiotischer bzw. organismenfremder Verbindungen (typischerweise planare aromatische Kohlenwasserstoffe) an die Bindungsstelle von aromatischen Kohlenwasserstoffrezeptoren kann auf ähnliche Weise gemessen werden. Alternativ kann die Bindung fluoreszierender Verbindungen (z. B. Doxorubicin) durch ihre Löschung bei der Bindung an solche Stellen durch an diesen Stellen vorhandene Löschkomponenten gemessen werden. Entsprechend kann in Fällen, wo die bindende Komponente weder ein Löscher noch ein Fluorophor ist, die bindende Komponente an einen Fluorophor oder Löscher angelagert werden, so daß das modifizierte Bindemittel mit einem anderen Bindemittel konkurriert und auf diese Weise gemäß der vorliegenden Erfindung ein meßbares Signal erzeugt. Zum Beispiel kann die letztere Konfiguration verwendet werden, um die Bindung eines Liganden an einen Antikörper zu messen. Der Fachmann wird erkennen, daß die Messung der Bindung an eine Reihe von Liganden oder von Substraten an Proteine und Enzyme auf ähnliche Weise gemäß der vorliegenden Erfindung erreicht werden kann.
  • Unter Verwendung von Peptidstrukturen können verschiedene Nahdistanzen zwischen einem Fluorophor und einer Löschkomponente erreicht werden. Dies kann einfach dadurch erfolgen, daß Cystein-Analoge der Fluorophore gebildet und die Paare von Fluorophoren (oder Fluorophor-Löschkomponenten) bei der Bildung einer Cystin-Disulfidbrücke einander stark angenähert werden. Es können auch Polyglutaminsäure-Oligopeptide eingesetzt werden, welche die wechselwirkenden Komponenten in den gewünschten Abständen an die Seitenketten anlagern. Grundeinheiten von N-5-(2-Hydroxyethyl)-L-glutaminresten mit n zwischen 3 und 9 können gleichfalls verwendet werden, tun wechselwirkende Einheiten an einer Polypeptidkette, die in flüssigen Lösungsmitteln flexibel ist, voneinander zu trennen und bei der Relaxation der Kette in der Flüssigkeit veränderliche Kettenendenabstände zu liefern. Alternativ können unter Verwendung von (L-Prolin)n-Resten starre schraubenförmige. Strukturen ausgebildet werden, die wechselwirkende Strukturen um 1,2 nm (n = 1) bis 4,6 nm (n = 2) voneinander trennen. Die Fluorophore oder Löschkomponenten können an derartige Gerüste über verschieden lange Spacerketten gebunden werden, typischerweise Kohlenwasserstoffe mit Längen von C4 bis C16. Gesättigte Kohlenwasserstoffe bilden flexible Ketten, während eine erhöhte Steifigkeit und/oder Orientierungen durch Verwendung von cis- und trans-ungesättigten Ketten erzielt werden können. Seitengruppen am Kohlenwasserstoffgerüst können zur Erzeugung relativer Bindungs- oder sterischer Hinderungsgrade oder zwischen den Ketten verwendet werden (z. B. aromatische, Carboxyl-, Amino-, Nitro- und Chlorgruppen).
  • Die obenerwähnten Fluorophore und Löschkomponenten zusammen mit den obenerwähnten Strukturgerüsten können auch zum Aufbau der in den 8 und 9 dargestellten Konfigurationen benutzt werden.
  • 8 zeigt ein zweites Verfahren, mit dem die Periode zwischen aufeinanderfolgenden Wechselwirkungen zwischen einem Fluorophor und einer Löschkomponente modifiziert werden kann. In 8a ist ein Fluorophor 30a durch ein halbflexibles Spacermolekül 31a gebunden. Eine Löschkomponente 32a ist an das entgegengesetzte Ende des Spacermoleküls 31a gebunden. Der Fluorophor 30a und die Löschkomponente 32a bewegen sich bei der Durchbiegung des Spacerarms 31a periodisch aufeinander zu und voneinander weg. Die Löschung, entweder eine statische Löschung oder eine Stoßlöschung, tritt auf, wenn der Fluorophor 30a und die Löschkomponente 32a einander ausreichend nahe gekommen sind.
  • In den 8(a)–(e) ist ein Fluorophor 30a–c dargestellt, der jeweils an eine von drei verschiedenen Löschkomponenten 32a–c angrenzt. In jedem Fall weisen der Fluorophor 30a–c und die Löschkomponente 32a–c Spacerarme von gleicher Länge auf. Die Löschkomponenten 32 selbst haben jedoch unterschiedliche Eigenschaften. Zum Beispiel kann im Fall der statischen Löschung die charakteristische Periode, in deren Verlauf der Fluorophor und die Löschkomponente einen Komplex bilden, durch Verwendung einer anderen Löschkomponente verändert werden.
  • In den 8(d)–(f) ist der Fluorophor 30d–f von der Löschkomponente 32d–f durch Ipacermoleküle 31d–f von unterschiedlicher Länge getrennt. Mit abnehmender Länge der Spacermoleküle 31d–f wird die Zeit zwischen aufeinanderfolgenden Wechselwirkungen zwischen dem Fluorophor 30d–f und der Löschkomponente 32d–f entsprechend verkürzt.
  • In den 8(g)–(i) wird die Flexibilität des Teils des Spacermoleküls 31g–i variiert, an dem sich die Löschkomponente 32g–i befindet, wodurch die Löschwirkung der Löschkomponente 32g–i beeinflußt wird. Mit zunehmender Flexibilität der Spacermoleküle 31d–f verlängert sich entsprechend die Zeit zwischen aufeinanderfolgenden Wechselwirkungen zwischen dem Fluorophor 30d–f und der Löschkomponente 32d–f. Bei niedriger Flexibilität des Spacermoleküls, wie z. B. in 8g dargestellt, kann das Spacermolekül 31g so konfiguriert werden, daß sichergestellt wird, daß der Fluorophor 30d–f und die Löschkomponente 32d–f einander ausreichend annähern, um die erforderliche Wechselwirkung einzugehen. Die Konformation des Spacermoleküls (d. h. seine Konfiguration in Ruhe) kann gleichfalls verändert werden.
  • In den 8(j)–(l) werden sowohl die Länge als auch die Flexibilität der Spacerarme 31j–l verändert. In 8j werden der Fluorophor 30j und die Löschkomponente 32j in einem mittleren Abstand voneinander gehalten und weisen eine mittlere Flexibilität auf, wie durch die Länge der Kurven oberhalb des Fluorophors 30j und der Löschkomponente 32j angedeutet. Im Gegensatz dazu werden in 8k der Fluorophor 30k und die Löschkomponente 32k in einem kürzeren Abstand voneinander bei größerer Steifigkeit gehalten. Diese Modifikation des Abstands und der Bewegung des Fluorophors 30k und der Löschkomponente 32k verkürzt die Periode zwischen aufeinanderfolgenden Wechselwirkungen zwischen dem Fluorophor 30k und der Löschkomponente 32k. 8l zeigt einen Fluorophor 30l und eine Löschkomponente 32l, die in einem größeren Abstand und bei einer größeren Flexibilität gehalten werden, als in 8j dargestellt. Dadurch verlängert sich die Periode zwischen aufeinanderfolgenden Wechselwirkungen zwischen dem Fluorophor 30l und der Löschkomponente 32l.
  • In den 8(m)–(o) werden weitere Komponenten 33m–o, 34m–o an den Spacermolekülen 31m–o vorgesehen. Die Wirkung der weiteren Komponenten ist von ihren Eigenschaften abhängig, die dem Fachmann bekannt sind und zu denen beispielsweise die sterische Hinderung gehört.
  • Bei der Bindung an ein Targetmolekül kann eine Wechselwrikung zwischen einem Fluorophor und einer Löschkomponente durch Wechselwirkung zwischen der Bindungsstelle und dem Fluorophor oder der Löschkomponente oder beiden beeinflußt werden.
  • In 9 ist dargestellt, wie die Wechselwirkung zwischen einem Fluorophor, der durch ein Spacermolekül an eine Bindungskomponente gebunden ist, durch Bindung an eine molekulare Bindungsstelle verändert wird. Unter Bezugnahme auf den obigen Sachverhalt als typisches Beispiel können auf diese Weise Tryptophan und ein xenobiotischer Löscher (z. B. ein Medikament) vorher mit einem geeigneten Spacer zusammengefügt werden, so daß bei der Bindung der Medikamemt-Komponente an eine xenobiotische Bindungsstelle (z. B. eines Medikaments) die Einschränkung der Sondeneinheit oder der aktiven Spezies bei der Bindung geändert wird, um im Vergleich zu der ungebundenen Einheit eine andere Löschperiode zu erzeugen. Auf diese Weise kann das Verhältnis zwischen ungebundener und gebundener Einheit gemessen werden.
  • Zunächst ist in 9a im obigen Fall und im allgemeinen Fall ein Fluorophor 40a über ein erstes flexibles Spacermolekül 41a an eine Bindungskomponente 42a gebunden. Eine Löschkomponente 43a ist über ein zweites flexibles Spacermolekül 44a an die Bindungskomponente 42a gebunden. Der Fluorophor 40a und die Löschkomponente 43a führen aufgrund der Flexibilität der Spacermoleküle 41a, 44a beide eine periodische Bewegung aus.
  • Die gesamte in 9a dargestellte Einheit kann als eine Sonde betrachtet werden. 9b zeigt die Sonde 40a–44a an einer Bindungsstelle in einem Targetmolekül 45b. Das Targetmolekül tritt in Wechselwirkung mit der Löschkomponente 43a und modifiziert deren Eigenschaften. Zum Beispiel kann im Falle der statischen Löschung die Periode, in deren Verlauf der Fluorophor 40a an die Löschkomponente 43a gebunden bleibt, durch die Bindungsstelle 45b modifiziert werden.
  • Die 9c–d stellen eine Anordnung dar, wodurch ein Fluorophor 40c, der an ein erstes Spacermolekül 41d gebunden ist, mit einer Bindungsstelle 45d in Wechselwirkung tritt und dadurch die Eigenschaften des Fluorophors modifiziert. Die Modifikation kann einfach eine Änderung der Energie oder der Lebensdauer einiger von den Energieniveaus des Fluorophors sein (Niveaus 14–18 in 6).
  • Die 9c–f zeigen, wie der Bewegungsbereich einer Löschkomponente 43c, e, die an ein zweites Spacermolekül 44c, e gebunden ist, durch die Bindungsstelle 45d, f beeinflußt werden kann. In den dargestellten Beispielen wird die Periode zwischen aufeinanderfolgenden Wechselwirkungen zwischen dem Fluorophor 40c, e und der Löschkomponente 43c, e verkürzt.
  • 9g zeigt einen Fluorophor 40g, der durch ein erstes Spacermolekül 41g an eine erste Bindungskomponente 46g gebunden ist, und eine Löschkomponente 43g, die über ein zweites Spacermolekül 44g an eine zweite Bindungskomponente 47g gebunden ist. Ein Targetmolekül 48g ist mit ersten und zweiten Bindungsstellen ausgestattet, die so voneinander beabstandet sind, daß, wenn die Bindungskomponenten 46g, 47g an den Bindungsstellen sitzen, der Fluorophor 40g und die Löschkomponente 43g in einem vorgegebenen Abstand voneinander angeordnet sind. Eine Änderung des Abstands der Bindungsstellen verändert die Periode zwischen aufeinanderfolgenden Wechselwirkungen zwischen dem Fluorophor 40g und der Löschkomponente 43g.
  • In 9h weist eine erste Sonde einen Fluorophor 40h, der über ein erstes flexibles Spacermolekül 41h an eine Bindungskomponente 42h gebunden ist, und eine Löschkomponente 43h auf, die über ein zweites flexibles Spacermolekül 44h an die Bindungskomponente 42h gebunden ist. Die Bindungskomponente 42h der ersten Sonde ist so angeordnet, daß sie sich an einer ersten Bindungsstelle in einem Targetmolekül 49h befindet. Zweite und dritte Sonden mit einer der ersten Sonde ähnlichen Konfiguration werden mit verschiedenen Bindungskomponenten 50h, 51h versehen, die so angeordnet sind, daß sie an zweiten und dritten Bindungsstellen im Targetmolekül 49h sitzen. Die erste Löschkomponente 43h tritt periodisch in Wechselwirkung mit einem Fluorophor 52h, der Teil der zweiten Sonde ist. Eine zweite Löschkomponente 53h, die Teil der zweiten Sonde ist, tritt in Wechselwirkung mit einem dritten Fluorophor, der Teil der dritten Sonde ist. Auf diese Weise liefern die in 9h dargestellten drei Sonden ein Fluoreszenzausgangssignal, das von jeder der drei Sonden abhängig ist, die an ihren entsprechenden Bindungsstellen sitzen. Diese Herangehensweise ist nützlich beim Sequenzieren, wo Signaturen, die den zusammengesetzten Komponenten entsprechen, so eingerichtet werden können, daß sie ein Signal liefern, das den Ort und die Typen ihrer Nachbarn anzeigt.
  • Die in den 9g, h dargestellten Einheiten können Mittel bieten, um zu erkennen, welche Molekülreste in einer kombinatorischen Synthese nebeneinander zusammengefügt worden sind. Nach dem Stand der Technik müssen diese getrennt und analysiert werden, während bei Anwendung der Erfindung die Nähe von Molekülresten erkannt werden kann, die mit verschiedenen Fluorophoren und Löschern markiert sind.
  • Der Begriff "resonante Fluoreszenzenergieübertragung" (FRET) bezieht sich auf eine Konfiguration von zwei Fluorophoren, die so beschaffen ist, daß die Energie eines ersten Fluorophors (des Donators) durch einen zweiten Fluorophor (den Akzeptor) absorbiert wird. Der Mechanismus, über den die Energieübernagung stattfindet, ist hauptsächlich ein Ergebnis von Dipol-Dipol-Wechselwirkungen, sogenannter strahlungsloser Energieübertragung, die nicht das Auftreten eines Photons beinhaltet, obwohl erfindungsgemäß auch eine Übetragung auf Strahlungsbasis gemessen werden kann. Damit die Übertragung resonant ist, sollte die Energie des Akzeptors etwas niedriger sein als die Energie des Donators. Das heißt, die Energieübernagungsrate ist von dem Überlappungsgrad zwischen dem Emissionsspektrum des Donators und dem Absorptionsspektrum des Akzeptors abhängig. In der Terminologie, die in dieser Beschreibung benutzt wird, sind die beiden Fluorophore die aktive Spezies, wenn sie ausreichend dicht beieinander liegen, damit FRET auftreten kann. Mit anderen Worten, die in 6 dargestellten Energieniveaus beschreiben die beiden Fluorophore nur dann, wenn sie genügend dicht beieinander liegen, damit FRET auftreten kann.
  • Die beiden Fluorophore, die eine aktive FRET-Spezies bilden, können durch Anlagern an ein geeignet konfiguriertes Spacermolekül so angeordnet werden, daß sie sich periodisch einander nähern. Ein Beispiel einer solchen Konfiguration ist in 10a dargestellt, wo ein erster Fluorophor 60a und ein zweiter Fluorophore 61a durch ein Spacermolekül 62a voneinander getrennt und für eine Schwingung konfiguriert sind, so daß sie periodisch einander hinreichend nahe kommen, damit FRET auftreten kann.
  • Die Erfindung ermöglicht die Messung der Periode, in deren Verlauf die Fluorophore einander hinreichend nahe kommen, damit FRET auftreten kann (durch die aktive Spezies können während dieser Periode mehrere Photonen emittiert werden, wenn die Zykluszeit der aktiven Spezies kurz genug ist). Von der aktiven Spezies werden keine Photonen emittiert, wenn die Fluorophore voneinander beabstandet sind (während dieser Zeit existiert die aktive FRET-Spezies nicht). Die Zeit, in der Photonen von der aktiven Spezies emittiert werden, und die Zeit, in der keine Photonen von der aktiven Spezies emittiert werden, werden als zwei getrennte Datenkomponenten angesehen, die unter Anwendung der Erfindung erfaßt werden.
  • Im Gegensatz zur Erfindung sind Fluoreszenzmeßverfahren nach dem Stand der Technik nicht in der Lage, den oben beschriebenen Zyklus zu überwachen. FRET ist nur dann erkennbar, wenn die Fluorophore beim Auftreten einer Anregung einander hinreichend nahe kommen. Die Verfahren nach dem Stand der Technik können nicht die Periode zwischen aufeinanderfolgenden Bildungen einer aktiven FRET-Spezies durch zwei Fluorophore bestimmen.
  • Jeder Fluorophor kann als aktive Spezies eigenständig Photonen absorbieren und emittieren, wenn die Fluorophore voneinander beabstandet sind. Wenn Messungen unter Anwendung der Erfindung ausgeführt werden, können die Photonen an ihrer Trennung (d. h. den charakteristischen Zykluszeiten der Fluorophore) erkannt werden.
  • 10 zeigt verschiedene Anordnungen, durch welche die Zeitdauer zwischen aufeinanderfolgenden Bildungen einer aktiven FRET-Spezies durch zwei Fluorophore modifiziert werden kann. In den 10a–e wird die Länge des Spacermoleküls 62a–c modifiziert, das die beiden Fluorophore 60a–c, 61a–c verbindet. Dadurch ändert sich die Periode zwischen aufeinanderfolgenden Bildungen der aktiven Spezies, wobei ein längeres Spacermolekül 62a–c eine längere Periode ergibt.
  • Die Flexibilität des Spacermoleküls kann gleichfalls modifiziert werden, wie in den 10d–f dargestellt. Dadurch verändert sich wieder die Periode zwischen aufeinanderfolgenden Bildungen der aktiven Spezies, wobei ein flexibleres Spacermolekül 62d–f eine längere Periode ergibt.
  • In den Figuren 10g–i werden dem Spacermolekül 62g–i modifizierende Komponenten 63g–h zugesetzt. Dies wirkt sich wieder auf die Periode zwischen aufeinanderfolgenden Bildungen der aktiven Spezies aus, wobei die Wirkung durch die Eigenschaften der modifizierenden Komponente 63g–h bestimmt wird.
  • Zwei Fluorophore können mit Bindungskomponenten versehen werden, wobei jede Bindungskomponente so konfiguriert ist, daß sie an eine vorgegebene Bindungsstelle in einem vorgegebenen Molekül bindet. In diesem Fall sind die beiden Bindungsstellen in einem vorgegebenen Abstand angeordnet, der so gewählt wird, daß die beiden Fluorophore durch eine Distanz getrennt werden, die eine aktive FRET-Spezies mit erwünschten Eigenschaften liefert. Zum Beispiel sind in den 10j– l erste und zweite Fluorophore 60j, 61j über erste und zweite Spacermoleküle 64j, 65j an erste und zweite Bindungskomponenten 66j, 67j gebunden. Die Bindungskomponenten sind so angeordnet, daß sie an Bindungsstellen in einem Targetmolekül 68j in einem Abstand voneinander sitzen, der eine aktive FRET-Spezies mit erwünschten Eigenschaften ergibt.
  • In den 10k, l ist der Abstand zwischen den Bindungsstellen vergrößert, woraus sich eine entsprechende Verlängerung der Periode zwischen aufeinanderfolgenden Bildungen der aktiven FRET-Spezies ergibt. Die 10m–o veranschaulichen Änderungen der Flexibilität der Spacermoleküle 64m– o, 65m–o, bei der die Fluorophore gehalten werden. Die 10p–r veranschaulichen die Wirkung der Beimengung von modifizierenden Komponenten 66p–r zu den Spacermolekülen.
  • In den 11a wird eine aktive FRET-Spezies durch erste und zweite Fluorophore 70a, 71a gebildet. Jeder der Fluorophore ist über ein Spacermolekül 72a, 73a an eine Bindungskomponente 74a, 75a gebunden. Jede Bindungskomponente 74a, 75a ist außerdem mit einer Löschkomponente 76a, 77a ausgestattet, die über ein Spacermolekül 78a, 79a an die Bindungskomponente 74a, 75a gebunden ist. Die Bindungskomponenten sind so angeordnet, daß sie an Bindungsstellen in einem Targetmolekül 80a binden, die so voneinander beabstandet sind, daß die Fluorophore 70a, 71a periodisch eine aktive FRET-Spezies mit erwünschten Eigenschaften bilden. Die Löschkomponenten 76a, 77a sind so gewählt, daß sie die Wechselwirkung modifizieren, die zur Bildung der aktiven FRET-Spezies führt.
  • Ein typisches Beispiel mit Verwendung von FRET wäre die Kopplung oder Markierung von 5-[2-(Iodacetyl)aminoethyl]-5-aminonaphthalin-1-sulfonsäure (1,5-IAEDANS) und Iodacetamidfluorescein an Proteinmoleküle, um Änderungen des Trennungsabstandes bei Konformationsänderungen des Proteins zu untersuchen, oder regiospezifisch an eine Peptidkette mit unterschiedlichen Längen, um unterschiedliche Trennungsabstände zu erhalten (z. B. unter Verwendung der obigen Prolinstruktur, um definierte Trennungsabstände zu erhalten). Ein weiteres Beispiel, das durch 10j–r angedeutet ist, wäre die Bindung von Donator- und Akzeptorfluorophoren über DNA-Sonden an Positionen, die an komplementäre Bereiche auf Einzelstrang-DNA angrenzen, gemäß bekannten Verfahren, die oft als geteilte DNA-Sonde bezeichnet werden. Der Grad der benachbarten Bindung und die Komplementarität der geteilten Sonde und der Target-DNA können dann erfindungsgemäß gemessen werden.
  • 11b entspricht 11a, wobei aber nur einer der Fluorophore 70b, 71b mit einer Löschkomponente 77b versehen ist.
  • 11c entspricht 11b, wobei aber das Targetmolekül 80c so angeordnet ist, daß es die Bewegung der Fluorophore 70c, 71c und der Löschkomponente 77c beschränkt.
  • In 12a wird eine aktive FRET-Spezies durch erste und zweite Fluorophore 90a, 91a gebildet. Jeder der Fluorophore ist über ein Spacermolekül 92a, 93a an eine Bindungskomponente 94a, 95a gebunden. Die Bindungskomponenten sind so angeordnet, daß sie an Bindungsstellen in einem Targetmolekül 96a binden, die so voneinander beabstandet sind, daß die Fluorophore 90a, 91a periodisch eine aktive FRET-Spezies mit erwünschten Eigenschaften bilden. Die Form des Targetmoleküls 96a ist so beschaffen, daß die ersten und zweiten Fluorophore 90a, 91a in Wechselwirkung mit dem Targetmolekül 96a treten und die Eigenschaften der aktiven FRET-Spezies modifizieren. In 12a wird die Periode zwischen aufeinanderfolgenden Bildungen der aktiven FRET-Spezies durch die Wechselwirkung mit dem Targetmolekül 96a verändert.
  • 12b entspricht 12a, wobei aber eine modifizierende Komponente 97b an eines der Spacermoleküle 92b gebunden ist. Die modifizierende Komponente 97b tritt in Wechselwirkung mit dem Targetmolekül 96b und verkürzt die Bewegungsperiode des Spacermoleküls 92b. Die Periode zwischen aufeinanderfolgenden Bildungen der aktiven FRET-Spezies wird entsprechend verkürzt.
  • 12c entspricht 12b, wobei aber eine modifizierende Komponente 97c, 98c an jedes der Spacermoleküle 92c, 93c gebunden ist. Die modifizierenden Komponenten 97c, 98c treten in Wechselwirkung mit dem Targetmolekül 96c und verkürzen die Bewegungsperiode der Spacermoleküle 92c, 93c. Die Periode zwischen aufeinanderfolgenden Bildungen der aktiven FRET-Spezies wird entsprechend verkürzt.
  • Typische Beispiele von Donator-Akzeptor-Paaren sind die folgenden: Fluorescein-Teramethylrhodamin, IAEDANS-Fluorescein und EDANS-DABCYL. Diese und weitere Donator-Akzeptor-Paare sind beziehbar von Molecular Probes Inc., 4849 Pitchford Avenue, OR, 97402-9165 USA, und werden in dem von dem Unternehmen herausgegebenen Katalog beschrieben. Die obigen Strukturen können unter Verwendung bekannter Donator-Akzeptor-Paare zusammen mit den obenerwähnten Strukturgerüsten hergestellt werden.
  • Die Bildung von Excimer- oder Exciplex-Strukturen zwischen einer oder mehreren Komponenten zur Bereitstellung eines Fluorophors ist dem Fachmann bekannt, beispielsweise Pyren-Dimere und Pyren-DMA. Die Moleküle, die sich zur Bildung einer Excimer/Exciplex-Struktur vereinigen, können eigenständige Fluorophore sein. Wo dies der Fall ist, führt die Bildung eines Excimers oder eines Exciplexes zu einer Rotverschiebung (Stokes-Verschiebung) des emittierten Fluoreszenzlichts (wie man bei der resonanten Fluoreszenzenergieübergragung (FRET) erkennt). Excimere und Exciplexe weisen gewöhnlich eine größere Spezifität als FRET-Moleküle auf, wenn sie als biologische Sonden eingesetzt werden. Ebenso wie bei anderen fluoreszierenden Materialien sind die charakteristischen Lebensdauern von Excimeren und Exciplexen allgemein bekannt und können auf die gleiche Weise beeinflußt werden, z. B. durch Änderung ihrer dielektrischen Umgebung.
  • Die Periode zwischen aufeinanderfolgenden Wechselwirkungen zwischen den Excimer- und Exciplex-Partnern kann durch eines der folgenden Verfahren modifiziert werden: Änderung der Länge eines oder beider Spacermoleküle, an welche die Excimer- oder Exciplex-Partner gebunden sind; Änderung der Flexibilität eines oder beider Spacermoleküle, an welche die Excimer- oder Exciplex-Partner gebunden sind; Modifikation der Sonde oder eines Teils davon mit hydrophilen, polaren, geladenen oder hydrophoben Komponenten; und Modifikation eines der Excimer- oder Exciplex-Partnerkomponenten.
  • Die Modifikation der Wechselwirkung zwischen den Partnern bei der Bildung des Excimers oder Exciplexes ermöglicht eine Beeinflussung der Periode zwischen aufeinanderfolgenden Wechselwirkungen. Die Modifikation der Wechselwirkung kann auch die Lebensdauern des Excimers oder Exciplexes ändern. Die Periode zwischen aufeinanderfolgenden Wechselwirkungen der Excimer- oder Exciplex-Moleküle wird außerdem durch die Bindung der Komponentenmoleküle an ein Targetmolekül beeinflußt.
  • Die in den 10 bis 12 dargestellten und im Sinne der aktiven FRET-Spezies beschriebenen Anordnungen funktionieren auf die gleiche Weise bei der Modifikation von Eigenschaften von Excimeren oder Exciplexen.
  • Pyren und Perylen und ihre vielen Derivate eignen sich für den Zusammenbau zu wechselwirkenden Paaren. Beispiele sind 1-Pyrenessigsäure und ihr Succinimidylester, 1-Pyrenbutansäure, 1-Pyrenbutanol, N-(1-Pyrenbutanoyl)cysteinsäure und ihr Succinimidylester, 1-Pyrencarbonsäure, 1-Pyrendecansäure, 1-Pyrenhexansäure, N-(1-Pyren)iodacetamid, N-(1-Pyren)maleimid, 1-Pyrenmethylamid.
  • Exciplex-Paare können auf verschiedene Weise aus Perylen, Pyren, N,N-Dimethylanilin und zwischen Thiocyanin und Acridinorange gebildet werden.
  • Obwohl sich die obige Beschreibung hauptsächlich auf Fluoreszenz konzentriert hat, kann die Erfindung auch zur Messung der Phosphoreszenz oder Lumineszenz benutzt werden. Die Komponenten und Strukturen, die zur Erzeugung und/oder Modifikation von Phosphoreszenz- oder Lumineszenz- Emissionen erforderlich sind, werden im Lichte der obigen Beschreibung für den Fachmann offensichtlich sein.
  • Obwohl die obige Beschreibung die Erzeugung von Fluoreszenzlicht aus Strukturen diskutiert hat, zu denen ein Fluorophor und eine Löschkomponente oder eine andere, für die Wechselwirkung mit dem Fluorophor angeordnete Komponente gehören, versteht es sich, daß ähnliche Effekte ohne die Strukturen mittels Diffusion von Fluorophoren und modifizierenden Komponenten in einer Lösung erzielt werden können. Im Fall der Stoßlöschung werden das Volumen von Fluorophoren und die Entfernung, die sie zwischen Stößen mit Löschkomponenten zurücklegen, die gemessene Fluoreszenzintensität beeinflussen. Im Falle von Fluorophoren mit langen charakteristischen Lebensdauern kann eine Diffusion über beträchtliche Entfernungen erfolgen, die im allgemeinen für eine bestimmte Löscherkonzentration und einen bestimmten Diffusionskoeffizienten eine stärkere Löschung hervorruft. Im Falle von Fluorophoren mit kürzeren Lebensdauern wird der gleiche Löschungsgrad nur erkennbar sein, wenn die Konzentration von Löschkomponenten größer oder die Diffusionsgeschwindigkeit größer ist.
  • Ein Fluorophor kann sich in einer Lösung befinden, die einen Puffer enthält, der für eine Wechselwirkung mit dem Fluorophor ausgelegt ist. Die aktive Spezies in diesem Fall ist effektiv die Summe aus dem Fluorophor und dem Teil des Puffers, mit dem er in Wechselwirkung tritt.
  • Man wird erkennen, daß die charakteristische Zykluszeit eines Fluorophors auch durch physikalische Modifikation einer Eigenschaft des Fluorophors verändert werden kann, z. B. durch Modifikation der elektromagnetischen, magnetischen, akustischen oder Wärmeenergie. Einige von diesen Modifikationen sind oben beschrieben worden. Andere geeignete Modifikationen werden für den Fachmann offensichtlich sein.
  • Die charakteristischen Zykluszeiten geeigneter Materialien können durch Ultraschallbestrahlung modifiziert werden. Das Material muß so ausgewählt werden, daß eine Ultraschallbestrahlung mechanische und thermomechanische Wechselwirkungen innerhalb und zwischen den Materialien modifiziert.
  • Eine Wechselwirkung zwischen einem Fluorophor und einem Molekül kann durch Einfügen einer lichtempfindlichen Gruppe zwischen dem Fluorophor und dem Molekül erzielt werden. Ein Beispiel eines derartigen Moleküls ist Stilben. Die periodische Absorption von Energie durch ein solches Molekül modifiziert die charakteristische Zykluszeit der Fluoreszenzemission, indem sie eine lokalisierte periodische Änderung der Wärmeenergie erzeugt und auf diese Weise die Wechselwirkung zwischen dem Fluorophor und dem Molekül auf charakteristische Weise polarisiert. Entsprechend können elektrische Felder erfindungsgemäß zur Modifikation der Wechselwirkung zwischen aktiven Spezies benutzt werden, wie z. B. durch Bindung der aktiven Spezies an Flüssigkristallaggregate erreicht werden kann.
  • Obwohl sich die oben beschriebenen konkreten Ausführungsformen der Erfindung auf die kontinuierliche Anregung einer Probe durch einfallendes Licht oder einen Katalysator bezogen haben, soll die Erfindung nicht auf diese Anregungsarten beschränkt sein und schließt andere geeignete Anregungsarten ein, z. B. Alphastrahlung, Betastrahlung, Chemikalienzusatz, Wärme, Vibration, ein elektrisches Feld oder ein Magnetfeld. Einfallendes Licht kann durch Leuchtdioden (LED), Superlumineszenzdioden, Glühlampen oder Spektrallampen geliefert werden.
  • Obwohl sich die oben beschriebenen konkreten Beispiele der Erfindung auf die Emission und den Nachweis von Photonen beziehen, kann die Erfindung auch auf die Emission und den Nachweis irgendwelcher geeigneter Quanten angewandt werden, z. B. von Elektronen, Neutronen oder Phononen. In bestimmten Anwendungen kann möglicherweise ein Schwellwert festgelegt werden, über den ein Analogsignal in Quanten umgewandelt werden kann, um die Anwendung der Erfindung zu ermöglichen.

Claims (29)

  1. Analyseverfahren zur Bestimmung einer charakteristischen Zykluszeit einer Probe, wobei das Verfahren aufweist: Anregung aktiver Elemente in der Probe mit ausreichender Intensität, so daß zumindest einige von den aktiven Elementen im wesentlichen unmittelbar nach der Relaxation zu einem Grundzustand erneut in einen angeregten Zustand angeregt werden, Nachweis von Quanten, die durch die aktiven Elemente in der Probe emittiert werden, um ein Nachweissignal zu erhalten, und Analyse des Nachweissignals zur Ableitung der charakteristischen Zykluszeit, wobei die Anzahl aktiver Elemente in der Probe und die Intensität der Anregung so beschaffen sind, daß Quanten in einem Strom nachgewiesen werden, in dem einzelne Quanten voneinander unterscheidbar sind.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Analyse des Nachweissignals eine Korrelation des Nachweissignals mit sich selbst aufweist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die charakteristische Zykluszeit der Probe durch eine geeignete Modifikation der Umgebung der aktiven Elemente durch Mittel modifiziert wird, zu denen chemische und physikalische Mittel gehören, und wobei die modifizierte charakteristische Zykluszeit bestimmt wird.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei zumindest einige der aktiven Elemente ein Anregungsniveau, ein oberes Niveau eines Emissionsübergangs und ein unteres Niveau des Emissionsübergangs aufweisen und bei der Relaxation vom oberen Niveau des Emissionsübergangs zum unteren Niveau des Emissionsübergangs ein nachweisbares Quant emittieren, wobei die Lebensdauer des unteren Niveaus des Emissionsübergangs oder eines anderen Energieniveaus mit einer niedrigeren Energie als der des unteren Niveaus des Emissionsübergangs durch die Modifikation der Umgebung der aktiven Elemente beeinflußt und deren Auswirkung bestimmt wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei zumindest einige der aktiven Elemente durch ein Glied an ein Substrat gebunden sind, das eine Schwingungsbewegung des aktiven Elements zuläßt, wobei die Lebensdauer des unteren Niveaus des Emissionsübergangs oder eines anderen Energieniveaus mit einer niedrigeren Energie als der des unteren Niveaus des Emissionsübergangs durch Modifikation der Elektronenumgebung des aktiven Elements verändert werden kann.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Modifikation der Elektronenumgebung durch die Gegenwart mindestens einer modifizierenden Komponente bewirkt wird, die in der Lage ist, die Elektronenumgebung des aktiven Elements zu beeinflussen.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Änderung der Zykluszeit auf Übertragung von Energie vom unteren Niveau des Emissionsübergangs oder einem anderen Energieniveau mit niedrigerer Energie als der des unteren Niveaus der Emission auf die modifizierende Komponente zurückzuführen ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Zykluszeit durch Änderungen in der Konformation des aktiven Elements bezüglich der modifizierenden Komponente modifiziert wird.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei jedes aktive Element einen Teil einer Sonde bildet, wodurch die Sonde zwischen verschiedenen dielektrischen Umgebungen bewegt wird, einschließlich derjenigen, die in einem Molekül oder seinem Lösungsmittel auftreten, wobei die charakteristische Zykluszeit der Sonde durch die Zeitmaßstäbe der Bewegung des aktiven Elements zwischen unterschiedlichen dielektrischen Umgebungen beeinflußt wird, wobei die Bewegung durch Modifikationen beeinflußt wird, zu denen mindestens eine der folgenden gehört: (e) Änderung der Gesamtgröße der Sonde; (f) Änderung des Abstands zwischen dem aktiven Element und dem Rest der Sonde; (g) Änderung der Steifigkeit eines Brücken- bzw. Spacermoleküls zwischen dem aktiven Element und dem Rest der Sonde; oder (h) Modifikation der Sonde oder eines Teils davon mit hydrophilen, polaren, geladenen oder hydrophoben Komponenten.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei das aktive Element einen Teil einer Spezies bildet, die periodisch mit einer modifizierenden Komponente wechselwirkt, und wobei die Perioden gemessen werden, in deren Verlauf die Spezies mit der modifizierenden Komponente wechselwirkt bzw. nicht mit der modifizierenden Komponente wechselwirkt.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei das aktive Element einen Teil einer Spezies bildet, die periodisch mit einer Löschkomponente wechselwirkt und dadurch nach einem statischen Löschmechanismus gelöscht wird, und wobei die Perioden gemessen werden, in deren Verlauf die Spezies aktiv ist bzw. inaktiv ist.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei das aktive Element einen Teil einer Spezies bildet, die periodisch mit einer Löschkomponente wechselwirkt und dadurch nach einem Stoßlöschmechanismus gelöscht wird, und wobei die Perioden gemessen werden, in deren Verlauf die Spezies aktiv ist bzw. inaktiv ist.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die Periode der periodischen Wechselwirkung durch geeignete Modifikation einer Eigenschaft der Spezies oder der modifizierenden Komponente oder der Löschkomponente beeinflußt wird.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Modifkation die Änderung der Länge eines Spacermoleküls, an dem das aktive Element sitzt, oder der Länge des Spacermoleküls aufweist, an dem die modifizierende Komponente oder die Löschkomponente sitzt.
  15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei die Modifikation die Änderung der Flexibilität eines Spacermoleküls, an dem das aktive Element sitzt, oder der Flexibilität des Spacermoleküls aufweist, an dem die modifizierende Komponente oder die Löschkomponente sitzt.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei die Modifikation die Anlagerung einer modifizierenden Komponente an das Spacermolekül, an dem das aktive Element sitzt, oder an ein Spacermolekül aufweist, an dem die modifizierende Komponente oder die Löschkomponente sitzt.
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16, wobei das aktive Element über ein Spacermolekül an eine Bindungsstelle angelagert wird und die Modifikation aus einer Wechselwirkung mit der Bindungsstelle resultiert.
  18. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 17, wobei die Modifikation aus einer Beschränkung der periodischen Bewegung des Spacermoleküls, an dem das aktive Element sitzt, oder des Spacermoleküls resultiert, an dem die modifizierende Komponente oder die Löschkomponente sitzt.
  19. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 18, wobei das aktive Element über ein Spacermolekül an eine Bindungsstelle angelagert ist und die Modifikation aus einer Wechselwirkung mit einer an die Bindungsstelle angelagerten modifizierenden Komponente resultiert.
  20. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 19, wobei das aktive Element über ein erstes Spacermolekül an eine erste Bindungsstelle angelagert ist und eine modifizierende Komponente oder Löschkomponente über ein zweites Spacermolekül an eine zweite Bindungsstelle angelagert ist, wobei der Abstand zwischen den ersten und zweiten Bindungsstellen die Periodizität der Wechselwirkung zwischen dem aktiven Element und der modifizierenden Komponente oder der Löschkomponente bestimmt.
  21. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei erste und zweite Elemente periodisch miteinander wechselwirken, um das aktive Element zu bilden, und wobei die Periode, in deren Verlauf die ersten und zweiten Elemente zur Bildung des aktiven Elements wechselwirken, sowie die Perioden gemessen werden, in deren Verlauf die ersten und zweiten Elemente nicht zur Bildung des aktiven Elements wechselwirken.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei das aktive Element eine Spezies mit resonanter Fluoreszenzenergieübertragung ist.
  23. Verfahren nach Anspruch 21, wobei das aktive Element ein Excimer oder ein Exciplex ist.
  24. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Anregungsquerschnitt eines Grundzustands eines aktiven Elements periodisch variiert wird und die Variationsperiode gemessen wird.
  25. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das aktive Element Fluoreszenzphotonen emittiert, die mit einer Lösung wechselwirken, in der die aktiven Elemente gehalten werden, und wobei der Effekt der Lösung durch modulierende Eigenschaften der Lösung überwacht wird.
  26. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, das ferner die Anregung der aktiven Elemente unter Verwendung eines Anregungsimpulses und die Bestimmung der zwischen der Anregung und der Emission von Quanten aus dem aktiven Element verstrichenen Zeit und die anschließende Subtraktion dieser Zeit von der charakteristischen Zykluszeit aufweist.
  27. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die Anregung der Probe durch eine chemische Reaktion erfolgt.
  28. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die aktiven Elemente einen oberen angeregten Zustand, einen unteren angeregten Zustand und einen Grundzustand aufweisen und bei Relaxation vom oberen angeregten Zustand zum unteren angeregten Zustand ein nachweisbares Quant emittieren, wobei das Verfahren ferner die Anregung zweiter Elemente in einen angeregten Zustand aufweist, derart daß die zweiten Elemente Anregungsenergie auf die aktiven Elemente übertragen und dadurch die aktiven Elemente in den oberen angeregten Zustand anregen.
  29. Analysegerät zur Bestimmung der charakteristischen Zykluszeit aktiver Elemente in einer Probe, das aufweist: eine Einrichtung zum Anregen aktiver Elemente in der Probe mit ausreichender Intensität, so daß zumindest einige der aktiven Elemente im wesentlichen unmittelbar nach der Relaxation zu einem Grundzustand erneut in einen angeregten Zustand angeregt werden, eine Einrichtung zum Nachweis von Quanten, die durch die Probe emittiert werden, um ein Nachweissignal zu erhalten, eine Analyseneinrichtung für die Analyse des Nachweissignals zur Ableitung der charakteristischen Zykluszeit, wobei die Anzahl aktiver Elemente in der Probe und die Intensität der Anregung so beschaffen sind, daß Quanten in einem Strom nachgewiesen werden, in dem einzelne Quanten voneinander unterscheidbar sind.
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