JPS61277060A - 酵素免疫定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、臨床検査等の分野において、サンプル中の抗
原または抗体を定量する際に適用される。

酵素を標識体とした免疫定量法に関するものであス　− 従来の技術 臨床検査等において、サンプル中の微量な抗原または抗
体を定量する場合、従来、ラジオ・イムノ・アッセイ（
ＲＩＡ”）法、エイザイム・イムノ・アッセイ（ＥＩＡ
）法、ルミネセンス・イムノ・アッセイ（ＬＩＡ）法等
が広く用いられているＲＩＡ法は、ラジオアイソトープ
で標識した抗原または抗体とサンプル中の抗体または抗
原とを抗原抗体反応により結合させ、その後過剰な標識
抗原または標識抗体を洗浄除去し、いわゆるＢ／Ｆ分離
を行い、残った標識体をシンチレーションカウンタ等を
用いて測定する、いわゆる放射性イムノアッセイ法であ
る。

ＥＩＡ法は、ラジオアイソトープで標識するかわりに、
抗原または抗体を酵素で標識し、Ｂ／’Ｆ分離後、揮識
された酵素に基質を加え、酵素反応により生成物の増量
を測定する、いわゆる非放射性イムノアッセイである。

ＬＩＡ法は、いわばＥＩＡ法の変形ともいうべきもので
、化学発光や生物発光を用いる臨床分析法として近年盛
んに開発されて来た。この定量法は、酵素反応の生成物
を測定するかわりに、酵素による化学発光反応または生
物発光反応の発光強度を測定する定量法であり、ＥＩＡ
法などの非放射性イムノアッセイ法に比べて一般に高感
度である。

発明が解決しようとする問題点 しかし、上記のＲＩＡ法は高感度である反面、ラジオア
イソトープを使用するため、非常に危険であり、かつ特
別な許可を要すると共に高価な設備を必要とし、限定さ
れてしまうことになり、簡便さに欠けると同時にコスト
高につぐ。また、ＥＩＡ法は、ＲＩＡ法に比べて安全で
あるが、感度が低い。更に、ＬＩＡ法は、ＲＩＡ法と略
同様に高感度であるが、後に述べるようにやっかいなり
／Ｆ’分離の操作を要する。

しかも、上記の３法はいずれも遊離した状態にある標識
抗原または標識抗体と、結合した状態にあるものとを分
離し、過剰な標識抗原まだは標識゛抗体を洗浄除去する
Ｂ／Ｆ分離の工程が必要である。

また、抗原あるいは抗体量を測定するに至る全工程も多
い。そのため、処理操作が複雑で処理に時間を要し、迅
速処理の面で問題があり、かつ洗浄除去工程で折角結合
した標識抗原または抗体が脱落し、感度が低下するとい
う問題もあった。

本発明は以上のような従来法の問題点を解消するために
提案されたもので、高感度かつ簡易迅速にサンプル中の
抗原または抗体を定量分析し得る免疫定量法を提供する
ことを目的とする。

問題点を解決するための手段 以上の目的を達成するために、本発明は、化学発光また
は生物発光物質で標識した抗原または抗体とサンプル中
の抗体または抗原とを抗原・抗体反応させた後、この反
応液に基質液を加えて発光反応させ、その発光量を連続
測定し、その発光量の時系列データについてのゆらぎ・
変動ヲスヘクトル分析して自己相関関数を求め、これよ
り得られた緩和時間に基づいてサンプル中の抗原または
抗体の濃度を測定することを特徴としている。

作　　用 本発明方法によると、酵素標識抗原または抗体（標識体
）とサンプル中の抗体または抗原とによる抗原・抗体反
応後、防分離を行うととなく、直ちに基質液添加による
発光反応を開始させることができ、同時に発光量の連続
測定がなされる。

したがって、時間と手間を要するル乍分離工程を省き、
遊離の標識体と結合した標識体とが混在したままの状態
で、発光量の連続測定から実際の抗原または抗体の濃度
測定に至る工程が行える。

また、発光しているもの自体の発光量を直接測定する手
法であり、外乱（光）の影響は全く受けないので、フォ
トンのレベルまで高感度で測定できる。したがって、吸
光度分析の手法を用いる従来法に比べて２〜３桁穆度の
オーダーで感度が飛躍的にアップする。

そして、発光量の平均レベルに対する時系列的なレベル
変動の測定結果は信号処理系で分析演算されてディジタ
、ル的な信号処理により、抗原また。

は抗体の濃度データに変換される。

実施例 以下に本発明方法を、従来環もポピユラーに用いられて
いるＥＩＡ法との対比において図面を参照しながら説明
する。

先ず、本発明方法の一基本構成・原理について説明する
。

酵素で標識した抗原または抗体（標識体）とサンプル中
の抗体または抗原とを反応させる。抗原・抗体反応した
酵素標識体は基質を添加することにより化学発光または
生物発光する。この時発生する光の光量レベルは平均レ
ベルに対して統計的にゆらいだものとなる。このゆらぎ
（時系列的なレベル変動）は発光を触媒する標識酵素の
濃度ゆらぎ（平均値に対する時系列的なレベル変動）に
依存し、両者は相関関係にある。したがって、発光量の
レベル変動を分析測定することによって標識酵素の濃度
ゆらぎを算出することができる。この濃度ゆらぎから酵
素標識体の拡散速度が求まる。

ところで、遊離の標識体と結合した標降体とでは拡散速
度が異なり、この相異で発光量にレベル変動が生じ、ゆ
らいだものとなる。したがって、発光量の変動レベルを
分析測定することにより両標識体の拡散速度がどの程度
のレベル値で相異しているかが求まる。この求められた
相異レベルで標識体が結合したサンプル中の抗原または
抗体の濃度を算出測定することができる。

以上が本発明法の基本構成・原理である。

次に本発明方法を従来のＥＩＡ法と比較しなが１ら説明
する。

第１図は従来のＥＩＡ法による抗原または抗体濃度の測
定手順を示すフローチャート図である。

〔第１反応〕 先ス、抗体をビーズ、プレートなどの固相にコーティン
グし固定化する。この固定化されたものの中にサンプル
抗原を入れると、抗原抗体反応により、固定化された抗
体にサンプル抗原が付着結合する。その後、室温で約−
昼夜インキュベーションする。これはキュベツト中で行
われる。

〔洗浄〕・〔第２反応〕 その後、洗浄してＢａ１ｌ’分離したものに、酵素標識
抗体（ＰＯＤなどの酵素で標識された抗体）を加える。

そうすると、松原が結合している抗体には、更に標識抗
体がサンドウィッチ状に付着結合する。その後、約４０
℃の雰囲気中で緩和しながら１時間程度インキュベーシ
ョンする。

〔洗浄〕・〔第３反応〕 第２反応が終ると、両度洗浄しＢ／Ｆ分離する。

次に、室温の下で酵素に対）る基質溶液を添加すると、
酵素反応により基質が・分解し光吸収物質が生成する。

その後、一定時間２いて酵素反応が停止する。その剖、
約３０分根度の時間が必要である。

〔吸光度測定〕

次に、光源から被検溶液に一定強度の光を照射すると、
基質の分解により生成した光吸収物質が入射する光を吸
収する。その吸収の度合い（吸光度）を光度計で測定し
、そこに入っていた酵素の量を求める。それに基づいて
サンプ抗原の濃度が算出される。

以上の全工程で、約１日生根度の時間が必要である０ しかし、以上の従来法は上記説明でも明らかなように、
ル今゛分離工程が必要不可欠であり、また工程数も多く
、処理操作が複雑で手間を要すると共に、時間もかかり
、しかも吸光度分析で発光強度を測定するために、外乱
の影響を受は易く感度が低下する問題がある。

以上の従来法に対して、本方法は第２図のフローチャー
トで示す手順により実行される。

〔第１反応〕 室温下で所要量のサンプル抗原と抗体とをキュベツト中
に入れて抗原抗体反応させ、約１時間程度インキュベー
ションする。・・・・・・従来法に比べておよそ１／２
４に時間が短縮される。

〔基質の添加〕

第１反応終了後、酵素発光基質液を所定量添加すると、
数分後に酵素反応により基質が分解して発光が始まる。

〔発光測定〕

発光開始と同時に、その光がフォトディテクタ（フオト
ナウンタ）で弓光輸出七れ一登光−’Ｉ／ｒ（強度）が
連続測定される。これは発光しているもの自体の発光量
の直接測定である。したがって、外　　　□光などの外
乱の影響は全くなく、略フォトンのレベルまで極めて高
感度−に測定できる。この測定結果は、以下のような手
法により信号処理系でディジタル処理されてサンプル抗
原の濃度データに変換出力される。

〔発光光量のレベル変動の自己相関演算〕連続測定され
た発光量（強度）Ｉ（ｔ）の時系列データは、平均値レ
ベルに対して時間と共に変動する。これは種々の周波数
成分を持っており、これをスペクトル分析すると数種の
成分の波に分解される。この成分の波は、系に固有の緩
和時間τに関係している。緩和時間τ亀ハ発光ゆらぎの
自己相関関数Ｃ（ｔ）から求められる。

この自己相関関数Ｃ（ｔ）は次式で計算される。

ｃ　（ｔ）＝Ｊゴ（ｔ）　ニー　Ｉ　Ｃｔ＋τ）ｄｔ・
・・・・・・・・　■一般に緩和時間τの不規則過程に
ついてはガウス型分布になることが知られている。これ
によると、自己相関関数Ｃ（ｔ）は次式■で表わすこと
ができる。

Ｃ（ｔ）＝　　Ａ−ｅ　Ｘ　ｐ　（−ｔ／ｒ　）　　　
−・−・−−−−■（ここで、Ａ；定数） そこで、上式■により実際に算出した自己相関関数Ｃ（
ｔ）を■式にあてはめ、非線形最小二乗法の手法を用い
て計算機等により演算処理すると、緩和時間でか求めら
れる１ 以上のようにして求められた緩和時間τを個々の抗原に
ついて予め実験的に求めた検量線にあてはめ推定すると
、実際のサンプル抗原の濃度を定量することができる。

第３図はその際に用いられる検量線を示すものである。

この検量線は略Ｓ字カーブ的な特性を持っている。図に
示すものけ、縦軸にサンプル抗原の濃度、横軸に緩和時
間ｆを採ったものである。

上記の各工程において、基質溶液の添加・発光開始から
発光量の測定に至る工程は数分、また自己相関関数の算
出からサンプル抗原の濃度測定に至る工程は数分で行わ
れる。したがって、全工程に要する時間はおよそ１時間
数分〜数十分程度となり、従来法に比べて処理時間が大
幅に短縮されたことが理解されよう。

次に本発明法を適用した実験例について説明する。

〔実験例１〕 ■抗体にＰＯＤ（ペルオキシダーゼ）を標識する。

■ＰＯＤ標職抗休職抗体溶液プル抗原を添加する。

■両者を抗原抗体反応により結合させる。

■この反応液に（ルミノール十週酸化水素）を主成分と
する発光性基質溶液を加えて発光させる０この基質溶液
としては、その他（ローダミン＋過酸化水素）を主成分
とするもの哨、種々掲げることができる。

■発光量をフォトカウンターで連続測定する。

■発光量の時系列データについて平均値レベルに対する
レベル変動をスペクトル分析し、これより自己相関関数
を求める。

■自己相関関数より系に固有の緩和時間を求め、これよ
り検量線を用いてサンプル抗原の量（濃度）を推定算出
する。

〔実験例２〕 ■抗体をビーズ、プレートなどの固相に固定化する。

■ＰＯＤ標識抗体溶液とサンプル抗原とを同時に加えて
競反応させる。

■この反応液に（ルミノール＋過酸化水集）を主成分と
する発光基質液を加えて発光させる。

実験例１は酵素標識抗体を単純に液体中に浮遊させるも
のであり、また実験例２はビーズのような固相に付着固
定化するものであるが、本法はそのいずれの場合でも実
施可能である。

なお、上記の説明では本法をサンプル抗原の定量に適用
にた場合について述べたが、同様の手法でサンプル抗体
の定量にも適用できることは勿論である。その場合は、
酵素標識物が上記の抗体から抗原に変わる程度の手順で
実施できる。

〔発明の効果〕　− 以上説明したとおり、本発明によれば、従来法、特にＥ
ＩＡ法、ＬＩＡ法に比べて高感度かつ簡易迅速にサンプ
ル抗原または抗体を定量できる免疫定量法を提供するこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は従来のＥＩＡ法の処理手順を示すフローチャ−
ト図、第２図は本発明法の処理手順を示すフローチャー
ト図、第３図は本発明法で用いられる検量線の特性図で
ある。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）、化学発光または生物発光性を有する酵素で標識
   した抗原または抗体とサンプル中の抗体または抗原とを
   抗原・抗体反応させた後、この反応液に基質液を添加し
   て発光反応させ、その発光量を連続測定し、その発光量
   の時系列データについてのゆらぎ・変動をスペクトル分
   析によつて測定することにより自己相関関数を求め、こ
   れより得られた緩和時間に基づいてサンプル中の抗原ま
   たは抗体の濃度を測定することを特徴する酵素免疫定量
   法。