JPH052107B2 - - Google Patents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は酵素免疫測定法に関し、さらに詳しく
は新しい化学発光法を利用した酵素免疫測定法に
関する。
は新しい化学発光法を利用した酵素免疫測定法に
関する。
（従来の技術）
近年、免疫学的測定法の進歩には目覚ましいも
のがあり、特に酵素を標識物として用いる酵素免
疫測定法はアイソトープを標識として用いる放射
免疫測定法に比して、被爆の心配のないこと、特
別の設備を要しないこと、廃棄物の問題のないこ
となどの理由により着実にその用途を拡大しつつ
ある。
のがあり、特に酵素を標識物として用いる酵素免
疫測定法はアイソトープを標識として用いる放射
免疫測定法に比して、被爆の心配のないこと、特
別の設備を要しないこと、廃棄物の問題のないこ
となどの理由により着実にその用途を拡大しつつ
ある。
一方、臨床検査の分野においては、多くのホル
モン、血清蛋白質等の生体液中生理活性物質が
種々の免疫学的手法により測定されているが、な
かでもα−フエトプロテイン、CEA等の腫瘍マ
ーカーは、その生体液中濃度が極めて微量である
ため感度の高い測定法が要求されている。そのた
め酵素免疫測定法についても種々の改良がなされ
ているが、いまだ全ての測定物質を高感度に測定
できる手法は確立されていない。
モン、血清蛋白質等の生体液中生理活性物質が
種々の免疫学的手法により測定されているが、な
かでもα−フエトプロテイン、CEA等の腫瘍マ
ーカーは、その生体液中濃度が極めて微量である
ため感度の高い測定法が要求されている。そのた
め酵素免疫測定法についても種々の改良がなされ
ているが、いまだ全ての測定物質を高感度に測定
できる手法は確立されていない。
いま酵素免疫測定法における改良の一例を「酵
素免疫測定法（第２版）」、医学書院（1982年）、
P.50〜66に記載している例を引用して説明する。
それによると、従来のサンドイツチ法による酵素
免疫測定法においては、酵素標識抗体の固相への
非特異的吸着が大きく、測定のパツクグランドを
高くするため、測定感度を十分高くすることは難
しかつたが、抗体のFab′フラグメントにβ−ガ
ラクトシダーゼやペルオキシダーゼなどの酵素を
標識した酵素標識抗体を用いることにより、固相
への非特異的吸着が小さくなり、測定のバツクグ
ランドが低下し、測定感度が高くなる、と記載さ
れている。
素免疫測定法（第２版）」、医学書院（1982年）、
P.50〜66に記載している例を引用して説明する。
それによると、従来のサンドイツチ法による酵素
免疫測定法においては、酵素標識抗体の固相への
非特異的吸着が大きく、測定のパツクグランドを
高くするため、測定感度を十分高くすることは難
しかつたが、抗体のFab′フラグメントにβ−ガ
ラクトシダーゼやペルオキシダーゼなどの酵素を
標識した酵素標識抗体を用いることにより、固相
への非特異的吸着が小さくなり、測定のバツクグ
ランドが低下し、測定感度が高くなる、と記載さ
れている。
（発明が解決しようとする問題点）
しかしながら、β−ガラクトシダーゼやペルオ
キシダーゼを標識した酵素標識抗体では、その酵
素活性を測定する場合、たとえばβ−ガラクトシ
ダーゼでは螢光基質を用いる方が感度は十分高く
なるが、高価な螢光光度計を必要とすること、た
とえばペルオキシダーゼではｏ−フエニレンジア
ミンを基質とすると非常に感度が高く、通常の分
光光度計で測定できるが、ｏ−フエニレンジアミ
ンは非常に不安定で、時間とともにバツクグラン
ドが上昇したり、ときに不明の原因で高くなつた
りすることがあり、常に感度を高くすることがで
きないなどの欠点を有していた。
キシダーゼを標識した酵素標識抗体では、その酵
素活性を測定する場合、たとえばβ−ガラクトシ
ダーゼでは螢光基質を用いる方が感度は十分高く
なるが、高価な螢光光度計を必要とすること、た
とえばペルオキシダーゼではｏ−フエニレンジア
ミンを基質とすると非常に感度が高く、通常の分
光光度計で測定できるが、ｏ−フエニレンジアミ
ンは非常に不安定で、時間とともにバツクグラン
ドが上昇したり、ときに不明の原因で高くなつた
りすることがあり、常に感度を高くすることがで
きないなどの欠点を有していた。
（問題点を解決するための手段）
本発明者の一部はすでに化学発光法による過酸
化水素の定量法として、過酸化水素を含む試料
に、酸化触媒を介して被酸化性の非螢光物質を反
応させて、非螢光物質を螢光物質に転換させ、次
いで酸化触媒の阻害条件下に該螢光物質を修酸ジ
エステル類および過酸化水素と反応させ、生成す
る発光量を測定することによる試料中の過酸化水
素の定量法を提案した（特願昭59−56719号（特
公平３−54304号））。
化水素の定量法として、過酸化水素を含む試料
に、酸化触媒を介して被酸化性の非螢光物質を反
応させて、非螢光物質を螢光物質に転換させ、次
いで酸化触媒の阻害条件下に該螢光物質を修酸ジ
エステル類および過酸化水素と反応させ、生成す
る発光量を測定することによる試料中の過酸化水
素の定量法を提案した（特願昭59−56719号（特
公平３−54304号））。
本発明者らは、酵素免疫測定法において用いる
標識酵素として、過酸化水素を発生する酵素を用
いて酵素免疫測定を行い、その酵素の活性を発生
する過酸化水素の量として測定する際、上述の化
学発光法によつて行うことにより、極めて高感度
で、しかも全ての生体液中の生理活性物質の測定
に利用できることを見出し、本発明に到達した。
標識酵素として、過酸化水素を発生する酵素を用
いて酵素免疫測定を行い、その酵素の活性を発生
する過酸化水素の量として測定する際、上述の化
学発光法によつて行うことにより、極めて高感度
で、しかも全ての生体液中の生理活性物質の測定
に利用できることを見出し、本発明に到達した。
さらに本発明者らは、過酸化水素を発生せずと
も、過酸化水素の存在下にその反応を触媒するペ
ルオキシダーゼを標識酵素とする酵素免疫測定に
おいても上述の化学発光法が利用できることを見
出し、本発明に到達した。
も、過酸化水素の存在下にその反応を触媒するペ
ルオキシダーゼを標識酵素とする酵素免疫測定に
おいても上述の化学発光法が利用できることを見
出し、本発明に到達した。
すなわち本発明は生体液中の生理活性物質を酵
素免疫測定法により測定する方法において、標識
酵素として過酸化水素を発生する酵素を用いて免
疫反応を行わせた後、該酵素の基質を加えて過酸
化水素を発生せしめ、次いで酸化触媒存在下、被
酸化性の非螢光物質を発生した過酸化水素に反応
させて非螢光物質を螢光物質に転換させ、次いで
酸化触媒の阻害条件下、該螢光物質に修酸ジエス
テル類および過酸化水素を加えて反応させ、生成
する発光量を測定することにより生体液中の生理
活性物質を測定することを特徴とする化学発光法
による酵素免疫測定法である。
素免疫測定法により測定する方法において、標識
酵素として過酸化水素を発生する酵素を用いて免
疫反応を行わせた後、該酵素の基質を加えて過酸
化水素を発生せしめ、次いで酸化触媒存在下、被
酸化性の非螢光物質を発生した過酸化水素に反応
させて非螢光物質を螢光物質に転換させ、次いで
酸化触媒の阻害条件下、該螢光物質に修酸ジエス
テル類および過酸化水素を加えて反応させ、生成
する発光量を測定することにより生体液中の生理
活性物質を測定することを特徴とする化学発光法
による酵素免疫測定法である。
さらに本発明は生体液中の生理活性物質を酵素
免疫測定法により測定する方法において、標識酵
素としてペルオキシダーゼを用いて免疫反応を行
わせた後、過酸化水素と被酸化性の非螢光物質を
添加し、非螢光物質を螢光物質に転換せしめ、次
いでペルオキシダーゼの阻害条件下、該螢光物質
に修酸ジエステル類および過酸化水素を加えて反
応させ、生成する発光量を測定することにより、
生体液中の生理活性物質を測定することを特徴と
する化学発光法による酵素免疫測定法である。
免疫測定法により測定する方法において、標識酵
素としてペルオキシダーゼを用いて免疫反応を行
わせた後、過酸化水素と被酸化性の非螢光物質を
添加し、非螢光物質を螢光物質に転換せしめ、次
いでペルオキシダーゼの阻害条件下、該螢光物質
に修酸ジエステル類および過酸化水素を加えて反
応させ、生成する発光量を測定することにより、
生体液中の生理活性物質を測定することを特徴と
する化学発光法による酵素免疫測定法である。
本発明において生体液とは血清、血漿、尿など
であり、生体液中の生理活性物質としては、種々
のペプチドホルモン、ステロイドホルモン、α−
フエトプロテイン・CEAなどの胎児性蛋白質、
免疫グロブリン、種々の感染症で出現する抗ウイ
ルス抗体、膠原病で出現する自己抗体などが挙げ
られる。
であり、生体液中の生理活性物質としては、種々
のペプチドホルモン、ステロイドホルモン、α−
フエトプロテイン・CEAなどの胎児性蛋白質、
免疫グロブリン、種々の感染症で出現する抗ウイ
ルス抗体、膠原病で出現する自己抗体などが挙げ
られる。
本発明における酵素免疫測定法とは生体液中の
生理活性物質に選択的に働く抗体、標識物質とし
ての酵素を結合した抗原又は抗体、酵素基質およ
び必要により不溶性担体（固体相）を使用し、特
異度の高い抗原抗体反応を応用して生体液中の生
理活性物質を測定する方法を意味する。
生理活性物質に選択的に働く抗体、標識物質とし
ての酵素を結合した抗原又は抗体、酵素基質およ
び必要により不溶性担体（固体相）を使用し、特
異度の高い抗原抗体反応を応用して生体液中の生
理活性物質を測定する方法を意味する。
酵素免疫測定法に代表的な方法として競合法と
サンドイツチ法とがあるが、ここではサンドイツ
チ法を例にとり説明する。さらに便宜的に、測定
しようとする生理活性物質をAg、該生理活性物
質と特異的に結合する抗体をAbとして表す。
サンドイツチ法とがあるが、ここではサンドイツ
チ法を例にとり説明する。さらに便宜的に、測定
しようとする生理活性物質をAg、該生理活性物
質と特異的に結合する抗体をAbとして表す。
まず、Abを適当な固体相に結合させるが、固
体相ならびにそれに結合させる方法は公知方法で
十分である。すなわち、ポリスチレンボール、ポ
リスチレンチユーブのような固体相を適当な緩衝
液に溶解したAbに浸漬し、４℃〜室温に数時間
から一夜放置後洗浄して得られる。このようにし
て得たAb結合固体相に未知量のAgを含む試料を
反応させた後、余剰の試料を洗浄して除去する。
しかる後過酸化水素を発生する酵素をAbに標識
した酵素標識抗体を反応させると、さきに結合し
ているAgに酵素標識抗体が結合する。反応後余
剰の酵素標識抗体は洗浄して除去する。
体相ならびにそれに結合させる方法は公知方法で
十分である。すなわち、ポリスチレンボール、ポ
リスチレンチユーブのような固体相を適当な緩衝
液に溶解したAbに浸漬し、４℃〜室温に数時間
から一夜放置後洗浄して得られる。このようにし
て得たAb結合固体相に未知量のAgを含む試料を
反応させた後、余剰の試料を洗浄して除去する。
しかる後過酸化水素を発生する酵素をAbに標識
した酵素標識抗体を反応させると、さきに結合し
ているAgに酵素標識抗体が結合する。反応後余
剰の酵素標識抗体は洗浄して除去する。
ここで、過酸化水素を発生する酵素としては、
グルコースオキシダーゼ、コレステロール、オキ
シダーゼ、コリンオキシダーゼ、アミノ酸オキシ
ダーゼなどが挙げられるが、これらは一例であつ
て本発明はこれらに限定されるものではない。こ
れらの内、グルコースオキシダーゼは入手が容易
であること、安価であること、酵素が安定である
ことなどの理由により極めて好適である。
グルコースオキシダーゼ、コレステロール、オキ
シダーゼ、コリンオキシダーゼ、アミノ酸オキシ
ダーゼなどが挙げられるが、これらは一例であつ
て本発明はこれらに限定されるものではない。こ
れらの内、グルコースオキシダーゼは入手が容易
であること、安価であること、酵素が安定である
ことなどの理由により極めて好適である。
このようにして反応させた固体相上にはAb−
Ag−Ab−酵素なる複合体が形成され、固体相に
結合している酵素の量は試料中のAg量と比例関
係にあることから試料中のAgを測定できる。
Ag−Ab−酵素なる複合体が形成され、固体相に
結合している酵素の量は試料中のAg量と比例関
係にあることから試料中のAgを測定できる。
本発明では前記酵素の量を化学発光法により測
定する。
定する。
まず、前記のようにして得た複合体が形成され
ている固体相に、酵素の基質となる物質を添加す
る。一例を挙げると、酵素がグルコースオキシダ
ーゼである場合には基質は適当な緩衝液に溶解し
たグルコース溶液である。しかる後、４℃〜40
℃、好ましくは25〜37℃にて数10分から一夜、好
ましくは１時間以上反応させる。本発明の利点
は、過酸化水素を発生する酵素を用いることによ
り、前記の酵素反応において、過酸化水素を十分
蓄積させられ、その結果、測定感度を十分高くす
ることができる点にある。
ている固体相に、酵素の基質となる物質を添加す
る。一例を挙げると、酵素がグルコースオキシダ
ーゼである場合には基質は適当な緩衝液に溶解し
たグルコース溶液である。しかる後、４℃〜40
℃、好ましくは25〜37℃にて数10分から一夜、好
ましくは１時間以上反応させる。本発明の利点
は、過酸化水素を発生する酵素を用いることによ
り、前記の酵素反応において、過酸化水素を十分
蓄積させられ、その結果、測定感度を十分高くす
ることができる点にある。
次に、前記過酸化水素が蓄積した反応液に酸化
触媒および被酸化性の非螢光物質を添加し、非螢
光物質を螢光物質に転換させる。この反応を式で
示すと次の通りとなる。
触媒および被酸化性の非螢光物質を添加し、非螢
光物質を螢光物質に転換させる。この反応を式で
示すと次の通りとなる。
非螢光物質＋H2O2酸化触媒
――――――→
物質＋2H2O
…(1) ここで、酸化触媒としては、ペルオキシダー
ゼ、ミクロペルオキシダーゼ、ヘミンなどが挙げ
られるが、特にペルオキシダーゼが安定性の点か
ら好適である。またペルオキシダーゼの添加量は
１〜100単位／mlが好適である。さらに被酸化性
の非螢光物質としてはロイコフルオレセイン（フ
ルオレシン）、2′，7′−ジクロロフルオレシン−
ジアセテートなどが挙げられ、これらの添加量は
0.001〜5mMが好適である。
…(1) ここで、酸化触媒としては、ペルオキシダー
ゼ、ミクロペルオキシダーゼ、ヘミンなどが挙げ
られるが、特にペルオキシダーゼが安定性の点か
ら好適である。またペルオキシダーゼの添加量は
１〜100単位／mlが好適である。さらに被酸化性
の非螢光物質としてはロイコフルオレセイン（フ
ルオレシン）、2′，7′−ジクロロフルオレシン−
ジアセテートなどが挙げられ、これらの添加量は
0.001〜5mMが好適である。
次に前記の反応液に酸化触媒の阻害条件下、例
えば阻害剤を加えて酸化触媒を阻害しておき、修
酸ジエステル類および改めて過酸化水素を添加し
て発光させる。この反応を式で示すと次の通りと
なる。
えば阻害剤を加えて酸化触媒を阻害しておき、修
酸ジエステル類および改めて過酸化水素を添加し
て発光させる。この反応を式で示すと次の通りと
なる。
螢光物質＋修酸ジエステル＋H2O2―――→hν
（発光）＋生成物 …(2) この発光量は式(1)で示したH2O2の量に比例し、
ひいては標識酵素の量、すなわち試料中のAgの
量に比例している。
（発光）＋生成物 …(2) この発光量は式(1)で示したH2O2の量に比例し、
ひいては標識酵素の量、すなわち試料中のAgの
量に比例している。
ここで用いる修酸ジエステル類としては、ビス
（２，４，６−トリクロロフエニル）オキザレー
ト（以下TCPOと略する）、ビス（２，４−ジニ
トロフエニル）オキザレートなどが挙げられるが
特にTCPOが好適である。修酸ジエステル類の添
加量は0.1〜50mMが好適である。
（２，４，６−トリクロロフエニル）オキザレー
ト（以下TCPOと略する）、ビス（２，４−ジニ
トロフエニル）オキザレートなどが挙げられるが
特にTCPOが好適である。修酸ジエステル類の添
加量は0.1〜50mMが好適である。
さらに、本発明で用いる酸化触媒の阻害剤とし
ては、シアン化カリウム、シアン化ナトリウム、
ナトリウムアジド、酢酸エチル、アセトニトリ
ル、アセトンなどが挙げられる。本発光反応で
は、式(1)に示した反応終了後、酸化触媒は阻害さ
れなければならない。なぜなら失活されない酸化
触媒が残存すると式(2)の反応において、改めて添
加した過酸化水素と残存する非螢光物質とが反応
して、過剰量の螢光物質を生成してしまうからで
ある。
ては、シアン化カリウム、シアン化ナトリウム、
ナトリウムアジド、酢酸エチル、アセトニトリ
ル、アセトンなどが挙げられる。本発光反応で
は、式(1)に示した反応終了後、酸化触媒は阻害さ
れなければならない。なぜなら失活されない酸化
触媒が残存すると式(2)の反応において、改めて添
加した過酸化水素と残存する非螢光物質とが反応
して、過剰量の螢光物質を生成してしまうからで
ある。
また、式(2)において改めて添加する過酸化水素
の量は0.1〜50mMが好適である。
の量は0.1〜50mMが好適である。
発光量の測定は、通常の測定法によつて実施で
き、たとえば、ピーク発光量をルミフオトメータ
ーTD4000（ラボサイエンス社製）などにより測
定する。
き、たとえば、ピーク発光量をルミフオトメータ
ーTD4000（ラボサイエンス社製）などにより測
定する。
また本発明は、前記酸化触媒として説明したペ
ルオキシダーゼを標識酵素として用いた酵素免疫
測定法においても好適に実施できる。以下その方
法について前記と同じくサンドイツチ法により説
明する。
ルオキシダーゼを標識酵素として用いた酵素免疫
測定法においても好適に実施できる。以下その方
法について前記と同じくサンドイツチ法により説
明する。
ペルオキシダーゼをAbに標識する方法として
は、前記過酸化水素を発生する酵素を標識する方
法と同様、公知の方法で十分である。たとえばペ
ルオキシダーゼに含有される糖鎖を過ヨウ素酸に
て酸化させた後、生成したアルデヒド基とAbの
アミノ基とを結合させることにより容易に調製す
ることができる。
は、前記過酸化水素を発生する酵素を標識する方
法と同様、公知の方法で十分である。たとえばペ
ルオキシダーゼに含有される糖鎖を過ヨウ素酸に
て酸化させた後、生成したアルデヒド基とAbの
アミノ基とを結合させることにより容易に調製す
ることができる。
このようにして得られたペルオキシダーゼ標識
Abを用いて前記と同様にして、サンドイツチ法
による酵素免疫測定を行い、固体相上に結合した
Ab−Ag−ペルオキシダーゼ標識Abを得る。次
いで、過酸化水素と被酸化性の非螢光物質を添加
し、式(1)の反応を行わせる。本法では前記過酸化
水素を発生する酵素を用いる場合とは異なり、酵
素反応により過酸化水素を発生させるステツプが
無いだけ有利である。
Abを用いて前記と同様にして、サンドイツチ法
による酵素免疫測定を行い、固体相上に結合した
Ab−Ag−ペルオキシダーゼ標識Abを得る。次
いで、過酸化水素と被酸化性の非螢光物質を添加
し、式(1)の反応を行わせる。本法では前記過酸化
水素を発生する酵素を用いる場合とは異なり、酵
素反応により過酸化水素を発生させるステツプが
無いだけ有利である。
次いで、ペルオキシダーゼの阻害剤を添加し、
ペルオキシダーゼを失活させた上で修酸ジエステ
ル類を添加して、式(2)の反応を行わせる。ここで
は式(1)で添加した過酸化水素が反応に参加するの
で改めて過酸化水素を添加する必要はない。しか
る後、生成する発光量を前記と同様にして測定
し、試料中のAg量を決定する。
ペルオキシダーゼを失活させた上で修酸ジエステ
ル類を添加して、式(2)の反応を行わせる。ここで
は式(1)で添加した過酸化水素が反応に参加するの
で改めて過酸化水素を添加する必要はない。しか
る後、生成する発光量を前記と同様にして測定
し、試料中のAg量を決定する。
本発明の酵素免疫測定法として固体相を使用す
るサンドイツチ法を説明してきたが、本発明を競
合法、二抗体サンドイツチ法などにも応用するこ
とができる。
るサンドイツチ法を説明してきたが、本発明を競
合法、二抗体サンドイツチ法などにも応用するこ
とができる。
（作 用）
以上のように、本発明は過酸化水素を発生する
酵素ないしはペルオキシダーゼを標識する酵素と
して用いて通常の酵素免疫測定法を実施し、該酵
素の活性を化学発光法で測定することにより、極
めて高感度で、しかもあらゆる生体液中の生理活
性物質の微量定量を可能にする新規な化学発光法
による酵素免疫測定法である。
酵素ないしはペルオキシダーゼを標識する酵素と
して用いて通常の酵素免疫測定法を実施し、該酵
素の活性を化学発光法で測定することにより、極
めて高感度で、しかもあらゆる生体液中の生理活
性物質の微量定量を可能にする新規な化学発光法
による酵素免疫測定法である。
（実施例）
以下、実施例を用いて本発明を説明するが、本
発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。
発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。
実施例 １
α−フエトプロテイン（AFP）の測定
(a) 抗AFP結合固体相の調製
ポリスチレンボール（直径6.4mm）100個に
0.1MNaHCO3に溶解した抗AFP抗体20mlを添
加し、４℃に一夜放置後、生食水で洗浄して抗
AFP結合ポリスチレンボールを得た。
0.1MNaHCO3に溶解した抗AFP抗体20mlを添
加し、４℃に一夜放置後、生食水で洗浄して抗
AFP結合ポリスチレンボールを得た。
(b) グルコースオキシダーゼ標識抗AFPの調製
抗AFP抗体20mgにペプシン１mgを加えて37℃
で一夜分解後、セフアデツクスＧ−150にてゲ
ル過し、抗AFP抗体のＦ（ab′）2フラグメント
を得た。このようにして得たＦ（ab′）2に0.1M2
−メルカプトエチルアミン0.2mlを加え、37℃、
90分反応させ、セフアデツクスＧ−25にてゲル
過し、抗AFP抗体のFab′フラグメント7.3mg
を得た。次にグルコースオキシダーゼ（東洋紡
製）５mgにＮ−ハイドロキシサクシニミジル−
Ｎ−（４−カルボキシシクロヘキシルメチル）
マレイミド１mg（ジオキサンに溶解）を３〜４
回に分けて添加し、セフアデツクスＧ−25によ
りゲル過を行つて、マレイミド化グルコース
オキシダーゼを得た。このようにして得られた
マレイミド化グルコースオキシダーゼと前記抗
AFP抗体のFab′フラグメント５mgとを４℃、
一夜反応させ、セフアデツクスＧ−200にてゲ
ル過を行い、活性画分を集めて、グルコース
オキシダーゼ標識抗AFPを得た。
抗AFP抗体20mgにペプシン１mgを加えて37℃
で一夜分解後、セフアデツクスＧ−150にてゲ
ル過し、抗AFP抗体のＦ（ab′）2フラグメント
を得た。このようにして得たＦ（ab′）2に0.1M2
−メルカプトエチルアミン0.2mlを加え、37℃、
90分反応させ、セフアデツクスＧ−25にてゲル
過し、抗AFP抗体のFab′フラグメント7.3mg
を得た。次にグルコースオキシダーゼ（東洋紡
製）５mgにＮ−ハイドロキシサクシニミジル−
Ｎ−（４−カルボキシシクロヘキシルメチル）
マレイミド１mg（ジオキサンに溶解）を３〜４
回に分けて添加し、セフアデツクスＧ−25によ
りゲル過を行つて、マレイミド化グルコース
オキシダーゼを得た。このようにして得られた
マレイミド化グルコースオキシダーゼと前記抗
AFP抗体のFab′フラグメント５mgとを４℃、
一夜反応させ、セフアデツクスＧ−200にてゲ
ル過を行い、活性画分を集めて、グルコース
オキシダーゼ標識抗AFPを得た。
(c) 発光試薬の調製
試薬Ａ…５mgのフレオレシンを25mMリン酸緩
衝液200mlに溶解した。
衝液200mlに溶解した。
試薬Ｂ…100mMH2O2600μ、5mMTCPO溶
液３ml、アセトニトリル26mlを混合し
て調製した。
液３ml、アセトニトリル26mlを混合し
て調製した。
本試薬は測定時アセトニトリルで５倍に希釈し
て用いた。
て用いた。
試薬Ａ、試薬Ｂは共に測定直前に調製した。
(d) AFPの測定
ポリスチレンチユーブ（12×75mm）に(a)で調
製した抗AFP結合ポリスチレンボール１個、
未知試料50μ、0.01Mリン酸緩衝液200μを
添加して37℃で１時間反応させ、生食水で洗浄
した。次に(b)で得たグルコースオキシダーゼ標
識抗AFPを0.5％牛血清アルブミンカロリン酸
緩衝液で500倍に希釈して、250μ添加し、37
℃で１時間反応させ、生食水で洗浄した。次に
0.1M酢酸緩衝液に溶解した２％グルコース溶
液を250μ添加して37℃で２時間反応させた。
製した抗AFP結合ポリスチレンボール１個、
未知試料50μ、0.01Mリン酸緩衝液200μを
添加して37℃で１時間反応させ、生食水で洗浄
した。次に(b)で得たグルコースオキシダーゼ標
識抗AFPを0.5％牛血清アルブミンカロリン酸
緩衝液で500倍に希釈して、250μ添加し、37
℃で１時間反応させ、生食水で洗浄した。次に
0.1M酢酸緩衝液に溶解した２％グルコース溶
液を250μ添加して37℃で２時間反応させた。
次に、この反応液100μを別の試験管に採
り、５単位／mlのペルオキシダーゼ溶液を
100μ、試膜Ａを200μ添加して25℃で１時
間反応させた。次にこの反応液300μをルミ
フオトメーターTD4000（ラボサイエンス社製）
の測定用バイアルに採り、試薬B500μを注入
し、発光量を測定した。別にAFP濃度既知の
標識液を用いて前記と同様に操作して標準曲線
を作成し、その標準曲線より未知試料中の
AFP濃度を求めた。第１図にその標準曲線を
示す。
り、５単位／mlのペルオキシダーゼ溶液を
100μ、試膜Ａを200μ添加して25℃で１時
間反応させた。次にこの反応液300μをルミ
フオトメーターTD4000（ラボサイエンス社製）
の測定用バイアルに採り、試薬B500μを注入
し、発光量を測定した。別にAFP濃度既知の
標識液を用いて前記と同様に操作して標準曲線
を作成し、その標準曲線より未知試料中の
AFP濃度を求めた。第１図にその標準曲線を
示す。
比較例として「イムノボール・AFP
」（東洋
紡製）にり、同社の取扱い説明書に従つてARP
を測定した結果を示した。
紡製）にり、同社の取扱い説明書に従つてARP
を測定した結果を示した。
第１図から明らかなように、本発明方法では
0.2〜0.5ng／mlのAFPを測定でき、比較例と比べ
て極めて高感度である。
0.2〜0.5ng／mlのAFPを測定でき、比較例と比べ
て極めて高感度である。
実施例 ２
CEAの測定
(a) 抗CEA結合固体相の調製
抗AFP抗体の替りに抗CEA抗体を用いる他
は実施例１(a)と同様にして調製した。
は実施例１(a)と同様にして調製した。
(b) ペルオキシダーゼ標識抗CEAの調製
抗CEA抗体20mgにペプシン１mgを加えて37
℃で一夜分解後、セフアデツクスＧ−150にて
ゲル過し、抗CEA抗体のＦ（ab′）2フラグメン
トを得た。このようにして得たＦ（ab′）2に
0.1M2−メルカプトエチルアミンを0.2ml加え
て37℃で90分反応させ、セフアデツクスＧ−25
にてゲル過し、抗CEA抗体のFab′フラグメ
ント6.8mgを得た。次にペルオキシダーゼ（東
洋紡製）２mgにＮ−ハイドロキシサクシニミジ
ル−Ｎ−（４−カルボキシシクロヘキシルメチ
ル）マレイミド1.6mg（Ｎ，N′−ジメチルホル
ムアミドに溶解）を加えて30℃で60分反応さ
せ、セフアデツクスＧ−25にてゲル過を行
い、マレイミド・ペルオキシダーゼを得た。こ
のようにして得たマレイミド・ペルオキシダー
ゼと前記抗CEA抗体のFab′フラグメント２mg
とを４℃で１夜反応させ、ウルトロゲル
AcA44にてゲル過を行い、活性画分を集め
てペルオキシダーゼ標識抗CEAを得た。
℃で一夜分解後、セフアデツクスＧ−150にて
ゲル過し、抗CEA抗体のＦ（ab′）2フラグメン
トを得た。このようにして得たＦ（ab′）2に
0.1M2−メルカプトエチルアミンを0.2ml加え
て37℃で90分反応させ、セフアデツクスＧ−25
にてゲル過し、抗CEA抗体のFab′フラグメ
ント6.8mgを得た。次にペルオキシダーゼ（東
洋紡製）２mgにＮ−ハイドロキシサクシニミジ
ル−Ｎ−（４−カルボキシシクロヘキシルメチ
ル）マレイミド1.6mg（Ｎ，N′−ジメチルホル
ムアミドに溶解）を加えて30℃で60分反応さ
せ、セフアデツクスＧ−25にてゲル過を行
い、マレイミド・ペルオキシダーゼを得た。こ
のようにして得たマレイミド・ペルオキシダー
ゼと前記抗CEA抗体のFab′フラグメント２mg
とを４℃で１夜反応させ、ウルトロゲル
AcA44にてゲル過を行い、活性画分を集め
てペルオキシダーゼ標識抗CEAを得た。
(c) 発光試薬の調製
実施例１(c)と同様にして調製した。
(d) CEAの測定
ポリスチレンチユーブ（12×75mm）に(a)で調
製した抗CEA結合ポリスチレンボール１個、
未知試料50μ、0.01Mリン酸緩衝液200μを
加えて37℃で１時間反応させ、生食水で洗浄し
た。次に(b)で得たペルオキシダーゼ標識抗
CEAを0.5％牛血アルブミンカロリン酸緩衝液
で750倍に希釈して、250μを添加し、37℃で
１時間反応させ、生食水で洗浄した。次に、
5mMH2O2溶液100μおよび(c)で得た試薬
A300μを添加して25℃で１時間反応させた。
次にこの反応液300μをルミフオトメーター
TD4000（ラボサイエンス社製）の測定用バイ
アルに採り、試薬Ｂを500μ注入し、発光量
を測定した。別にCEA濃度既知の標準液を用
いて前記と同様に操作して標準曲線を作成し、
その標準曲線より未知試料中のCEA濃度を求
めた。この方法により0.1ng／mlのCEAを測定
することができた。
製した抗CEA結合ポリスチレンボール１個、
未知試料50μ、0.01Mリン酸緩衝液200μを
加えて37℃で１時間反応させ、生食水で洗浄し
た。次に(b)で得たペルオキシダーゼ標識抗
CEAを0.5％牛血アルブミンカロリン酸緩衝液
で750倍に希釈して、250μを添加し、37℃で
１時間反応させ、生食水で洗浄した。次に、
5mMH2O2溶液100μおよび(c)で得た試薬
A300μを添加して25℃で１時間反応させた。
次にこの反応液300μをルミフオトメーター
TD4000（ラボサイエンス社製）の測定用バイ
アルに採り、試薬Ｂを500μ注入し、発光量
を測定した。別にCEA濃度既知の標準液を用
いて前記と同様に操作して標準曲線を作成し、
その標準曲線より未知試料中のCEA濃度を求
めた。この方法により0.1ng／mlのCEAを測定
することができた。
（発明の効果）
本発明では例えばAFPを0.2〜0.5ng／ml又は
CEAを0.1ng／mlの低濃度まで測定することがで
き、従来の吸光度測定法に比べて感度が向上す
る。
CEAを0.1ng／mlの低濃度まで測定することがで
き、従来の吸光度測定法に比べて感度が向上す
る。
第１図は本発明方法によるAFP測定の標準曲
線と比較例による「イムノボール・AFP での
標準曲線を示す。
線と比較例による「イムノボール・AFP での
標準曲線を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 生体液中の生理活性物質を酵素免疫測定法に
より測定する方法において、標識する酵素として
過酸化水素を発生する酵素を用いて免疫反応を行
わせた後、該酵素の基質を加えて過酸化水素を発
生せしめ、次いで酸化触媒存在下、被酸化性の非
螢光物質を発生した過酸化水素に反応させて非螢
光物質を螢光物質に転換させ、次いで酸化触媒の
阻害条件下、該螢光物質に修酸ジエステル類およ
び過酸化水素を加えて反応させ、生成する発光量
を測定することにより、生体液中の生理活性物質
を測定することを特徴とする化学発光法による酵
素免疫測定法。 ２ 過酸化水素を発生する酵素がグルコースオキ
シダーゼであることを特徴とする特許請求の範囲
第１項記載の方法。 ３ 酸化触媒がペルオキシダーゼであることを特
徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ 生体液中の生理活性物質を酵素免疫測定法に
より測定する方法において、標識する酵素として
ペルオキシダーゼを用いて免疫反応を行わせた
後、過酸化水素と被酸化性の非螢光物質を添加
し、非螢光物質を螢光物質に転換せしめ、次いで
ペルオキシダーゼの阻害条件下、該螢光物質に修
酸ジエステル類および過酸化水素を加えて反応さ
せ、生成する発光量を測定することにより、生体
液中の生理活性物質を測定することを特徴とする
化学発光法による酵素免疫測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3078085A JPS61189453A (ja) | 1985-02-19 | 1985-02-19 | 化学発光法による酵素免疫測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3078085A JPS61189453A (ja) | 1985-02-19 | 1985-02-19 | 化学発光法による酵素免疫測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61189453A JPS61189453A (ja) | 1986-08-23 |
| JPH052107B2 true JPH052107B2 (ja) | 1993-01-11 |
Family
ID=12313192
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3078085A Granted JPS61189453A (ja) | 1985-02-19 | 1985-02-19 | 化学発光法による酵素免疫測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61189453A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3058673B2 (ja) * | 1989-11-10 | 2000-07-04 | 株式会社明電舎 | サイトカインの測定方法及びその測定用キット |
| JP4889712B2 (ja) * | 2008-12-01 | 2012-03-07 | 株式会社エイコー・エンジニアリング | スパッタリング用マルチターゲット装置 |
-
1985
- 1985-02-19 JP JP3078085A patent/JPS61189453A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61189453A (ja) | 1986-08-23 |
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