JPH02302667A - ハプテンの免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はハプテンの免疫測定法に関する。さらに詳しく
は血清または血漿中のハプテンの免疫測定法に関する。

［従来の技術］ 従来、ハプテンの免疫測定法としては、試料中のハプテ
ンと標識されたハプテンを同時に抗体に対して競合反応
させる方法が知られている（例えばロイ　エフ　シャル
　エト　オール　Ｃｌ１ｎ。

Ｃｈｅｍ、　２４．１８０１　（１９７８）　）。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、従来測定法では、試料中のハプテンと標
識されたハプテンが接触した状態で抗体と反応するため
、特殊な検体を測定する際、その検体中の血清成分の影
響により酵素活性または発光もしくは蛍光の発現が著し
く阻害される場合がある。その結果、測定値異常が生じ
、測定結果が臨床所見と一致しないという重大な問題を
生じる。

［課題を解決するための手段］ 本発明者等は測定値異常の発生という問題のない、ハプ
テンの免疫測定法について鋭意検討した結果、本発明に
到達した。すなわち本発明は血清または血漿中のハプテ
ンを定量する免疫測定法において、 （１）血清または血漿（Ａ）を、血清まは血漿中に含ま
れるハプテンとキャリアー蛋白との結合を解離する解離
剤を場合により含む緩衝液（Ｂ）とともに不溶化された
ハプテンに対する抗体（Ｃ）と接触させ、不溶化された
ハプテンに対する抗体とハプテンとの複合体（Ｄ）を反
応、形成させ、 （２）前記（１）の工程における未反応物を洗浄、除去
し、（３）複合体（Ｄ）をハプテンまたはその類縁体の
標識物（Ｅ）と反応、接触させ、 （４）前記（３）の工程における未反応標識物を洗浄、
除去し、 （５）不溶化されたハプテンに対する抗体に結合した標
識物の量を測定し、 （６）前記（５）の工程において測定した標識物の量を
血清または血漿中のハプテンの量と相関させることによ
りハプテンの量を測定するハプテンの免疫測定法である
。

本発明において、測定対象となるハプテンとしては、甲
状腺ホルモン（Ｔ３、Ｔ４）　、ステロイドホルモン（
コーチゾール、エストラジオール、テストステロン、ア
ルドステロン、プロゲステロンおよびそれらの誘導体な
ど）、薬剤（ジゴキシン、ジギトキシン、ジフェニルヒ
ダントイン、テオフィリン、モルフインなど）が挙げら
れる。

ハプテンと結合しているキャリアー蛋白としては、甲状
腺ホルモンとサイロキシン結合蛋白（ＴＢＰ）、アルド
ステロン、プロゲステロン、およびテストステロンと性
ホルモン結合グロブリン、ジフェニルヒダントインとア
ルブミン、コーチゾールとコーチゾール結合蛋白などが
挙げられる。

ハプテンは血液中では一部は遊離状態で存在するが、大
部分はそのハプテンに特異的なキャリアー蛋白に結合し
た状態で存在する。本発明においては、ハプテンとは遊
離状態で存在するものと、キャリアー蛋白に結合した状
態で存在するものの総和を指す。

解離剤を含む緩衝液において、解離剤はバブテンとキャ
リアー蛋白の結合を切断するものであれば特に限定され
ない。例えばＴ３およびＴ４の測定の際に用いられる８
−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸塩およびサリチ
ル酸塩などが挙げられる。

緩衝液としてはバルビタール緩衝液、リン酸緩衝液、ホ
ウ酸緩衝液、グルタミン酸緩衝液、グリシン−塩酸緩衝
液、トリス−塩酸緩衝液などが挙げられるが、特にこれ
らに限定されるものではない。緩衝液のうち、好ましい
ものはＴ３およびＴ４の測定の際に用いられるバルビタ
ール緩衝液であり、ステロドホルモンの測定においては
グルタミン酸緩衝液およびグリシン−塩酸緩衝液であり
、さらに薬剤測定の際に用いられるリン酸緩衝液、トリ
ス−塩酸緩衝液である。

解離剤の緩衝液中の濃度は解離剤の種類にかかわらず通
常ｏ、　ｏｏｓ〜０．５ｗ／ｖχ、好ましくは０．叶〜
０．３ｗ／ｖχである。

緩衝液のｐＨはそれぞれの緩衝液で最も緩衝能力が高く
、ステロイドホルモンおよび薬剤の測定においては（キ
ャリアー蛋白との解離能を高めるｐＨを選択することが
重要である。即ち、好ましくは、バルビタール緩衝液に
おいてはｐＨ８〜９・リン酸緩衝液においてはｐＨ６〜
８、ホウ酸緩衝液においてはｐＨ７，５〜８．５、グル
タミン酸緩衝液およびグリシン−塩酸緩衝液においては
ｐＨ２〜５、トリス−塩酸緩衝液においてはｐＨ７，５
〜８．５である。

不溶化されたハプテンに対する抗体において、抗体はポ
リクローナル抗体でもモノクローナル抗体でも可能であ
る。これらの抗体を得る免疫動物はウサギ、ヤギ、ヒツ
ジ、マウス、モルモット、ブタ、サルが好ましい。

不溶化されたハプテンに対する抗体として、このハプテ
ンに対する抗体を固相化担体に結合させたものを使用す
ることができる。

この固相化担体としてはケイ酸質無機担体［ガラス（ポ
ーラス、ツヤ消しガラスなど）、シリカゲル、ベントナ
イトなどコ、磁性体、有機高分子化合物もしくはポリマ
ー担体（ポリエチレン、ポリスチレン、デキストラン、
口紙なと）などが挙げられる。これらのうち、好ましい
ものは、ガラス、有機高分子化合物もしくはポリマー担
体である。

その形態としてはビーズ、チューブ、試験管などが挙げ
られる。

いずれの固相化担体においてもサンドブラスト加工など
により表面積をおおきくする処置を施したものを使用す
ることも可能である。

この抗体を固相化担体に結合させる方法としては、抗体
を化学的に結合させる方法［シランカップリング剤、架
橋剤（グルタルアルデヒドなど）を用いて担体と共有結
合させる方法など］、物理吸着により結合させる方法、
容器（試験管、チューブ、トレイなと）の内表面の一部
に抗体を塗布する方法が挙げられる。

触させ、不溶化されたハプテンに対する抗体とハ゛ブテ
ンとの複合体（Ｄ）を形成させるには、（Ａ）と（Ｂ）
と（Ｃ）を適当な容器中で５〜５０℃で５分〜２日程度
、反応、接触させる方法で行うことができる。接触、反
応により不溶化された抗体とハプテンとの複合体を得る
。

次いで、上記反応における未反応物［（Ａ）、（Ｂ）な
ど）を洗浄、除去する。洗浄は通常脱イオン水、生理食
塩水、リン酸緩衝液などの緩衝液で行い、洗浄回数は通
常１〜１０回である。

次いで、複合体（Ｄ）をハプテンまたはその類縁体の標
識物（Ｅ）と反応、接触させる。上記ハプテンの類縁体
としてはＴ３、Ｔ４のアミノ基がアシル型あるいはウレ
タン型の保護基で修飾されたものなどが挙げられる。

ハプテンまたはハプテンの類縁体の標識物（Ｅ）として
は酵素、蛍光体または発光体による標識物が挙げられる
。酵素、蛍光体および発光体はいずれも公知のものを使
用することができる。例えば酵素としてはホースラディ
ツシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β
−ガラクトシダーゼなど；蛍光体としてはユーロピウム
誘導体など；発光体としてはＮ−メチルアクリジウム誘
導体などが挙げられる。標識物の製造は従来の方法と同
様な方法で行うことができる。

反応、接触は通常、（Ｄ）と（Ｅ）を適当な容器中で５
〜５０℃で５分〜２日程度、反応、接触させる。

次いで、上記反応における未反応物［（Ｄ）、（Ｅ）な
どコを洗浄、除去する。洗浄は通常脱イオン水、生理食
塩水、リン酸緩衝液などの緩衝液で行い、洗浄回数は通
常１〜１０回である。

不溶化された抗体に結合した標識物の量の測定は適当な
基質（０−フェニレンジアミン／過酸化水素など）と反
応させ、酵素活性または吸光度、発光強度、蛍光強度を
測定することにより行うことができる。

測定した標識物の量は血清、血漿中のハブテン濃度に反
比例するので予め作成された適当な検量線から血清、血
漿中のハブテン量を読みとシバ求めることができる。

［実施例］ 以下、実施例によシへ本発明をさらに説明するが、本発
明はこれに限定されるものではない。

実施例１　Ｔ３（トリヨードサイロニン）の測定■　抗
Ｔ３抗体結合スリガラスビーズの調製サンドブラスト処
理をしたスリガラスビーズ１００ｇを０．５％３−アミ
ノプロピルトリエトキシシラン（以下γ−ＡＰＳと略す
）アセトン溶液に１０時間浸漬し、ガラスビーズ表面に
アミノ基を導入する。未反応のγ−ＡＰＳを脱イオン水
を用い洗浄した後、アミノ化ガラスビーズを５ｚグルタ
ルアルデヒド（以下ＧＡと略す）水溶液に浸漬しガラス
ビーズ表面にアルデヒド基を導入した。

未反応のＧＡを脱イオン水により洗浄した後、ビーズを
０．０５■／ｍｌ抗Ｔ３抗体溶液に浸漬し、抗体をガラ
スビーズ表面に結合させた。反応終了後ビーズを０．１
ｚ牛血清アルブミン、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含有す
る０、０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）に−夜浸漬し
、抗Ｔ３抗体結合ガラスビーズを得た。

■　酵素標識Ｔ３の合成 東洋紡社製ペルオキシダーゼ（以下ＰＯＤと略す）ｌｏ
ｍｇを０．０２Ｍ＋ノン酸緩衝液（ｐＨ８，０）　２　
ｍｌに溶解し、これに１．５ｚグルタルアルデヒド水溶
液２００μｌを投入、室温で２００時間反応せた。反応
終了後、反応液を透析チューブに入れ、０．０２Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ８，０）を外液として透析を行い未反応
のグルタルアルデヒドを除去し、活性化ＰＯＤを得た。

Ｔ３　（カルバイオケミストリー社製）　１　ｍｇにジ
メチルホルムアミド（以下ＤＭＦと略す）　（１ｍｌ）
を加え、攪拌、溶解した。そのＴ３／ＤＭＦ溶液全量を
先の活性化ＰＯＤ溶液に投入し、室温で１２時間反応さ
せた。

反応終了後、反応混合物をセファデックスＧ−２５カラ
ムに通し、酵素活性および免疫活性の両方を有する両分
を集めて酵素標識Ｔ３とした。

■　標準サンプルの作製 標準サンプルについては、Ｔ３をＤＭＦに溶解させたち
の適当量をＴ３フリー血清に添加し調製した。

■　血清または血漿中Ｔ３濃度の測定 （ａ）　　■で得たＰＯＤ標識Ｔ３を０．２％ＢＳＡ。

０．０５χ８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸ア
ンモニウム含有０．１２Ｍバルビタール緩衝液（ｐＨ８
，６）で希釈し、測定に必要な濃度に調整した。

（ｂ）　　測定操作 試験管に標準液または検体（血清または血漿）を５０μ
ｌサンプリングし、（ａ）で調製した０、２＄Ｂ５Ａ１
０．０５χ８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸ア
ンモニウム含有０．１２Ｍバルビタール緩衝液（ｐＨ８
，６）　５００μｌを加え、よく攪拌し、均一溶液とし
た。これに抗Ｔ３抗体結合ガラスビーズ１個を加え攪拌
した後、３７℃で１５分間振盪、攪拌した。反応終了後
、反応液を吸引除去し、生理食塩水２ｍｌを加えて再び
吸引除去した。この操作を２回繰り返し検体中の様々な
血清成分を除去した。

その後、このビーズを新しい試験管に移しくａ）の酵素
標識抗原Ｔ３液５００μｌを加え３７℃で１５分間振盪
、攪拌した。反応終了後、反応液を吸引除去し、生理食
塩水２　ｍｌを加えて再び吸引した。

この操作を２回繰り返した後、抗体結合ガラスビーズを
別の試験管に移し３　ｍｇ／ｍｌの。−フェニレンジア
ミンと０．０２Ｘの過酸化水素を基質として含ム、０．
１　Ｍ（Ｄ’）：ｒ−ン酸緩衝液（ｐＨ４，８）を５０
０μｌ加え、３７℃で１５分間振盪、攪拌した。

反応終了後、１．５Ｎ硫酸を３　ｍｌ加え、反応停止後
、４９２　ｎｍにおける吸光度を測定した。グラフ用紙
に標準ポイントとそのポイントにおける吸光度をプロッ
トした検量線（Ｆｉｇ、−１）から検体（血清または血
漿）中のＴ３濃度を読みとった。

実施例２　Ｔ４（サイロキシン）の測定■　抗Ｔ４抗体
結合スリガラスビーズの調製サンドブラスト処理をした
スリガラスビーズ１００ｇを０．５χ３−アミノプロピ
ルトリエトキシシラン（以下γ−ＡＰＳと略す）アセト
ン溶液に１０時間浸漬し、ガラスビーズ表面にアミノ基
ヲ導入する。未反応のγ−ＡＰＳを脱イオン水を用い洗
浄した後、アミノ化ガラスビーズを５χグルタルアルデ
ヒド（以下ＧＡと略す）水溶液に浸漬しガラスビーズ表
面にアルデヒド基を導入した。

未反応のＧＡを脱イオン水により洗浄した後、ビーズを
０．０５■／ｍｌ抗Ｔ４抗体溶液に浸漬し、抗体をガラ
スビーズ表面に結合させた。反応終了後ビーズを０．１
χ牛血清アルブミン、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含有す
る０、０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）に−夜浸漬し
、抗Ｔ４抗体結合ガラスビーズを得た。

■　酵素標識Ｔ４の合成 東洋紡社製ペルオキシダーゼ（以下ＰＯＤと略す）１０
ｍｇを０．０２ＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ８，０）　２　
ｍｌに溶解し、これに１．５χグルタルアルデヒド水溶
液２００μｌを投入、室温で２００時間反応せた。反応
終了後、反応液を透析チューブに入れ、０．０２Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ８，０）を外液として透析を行い未反応
のグルタルアルデヒドを除去し、活性化ＰＯＤを得た。

Ｔ４　（カルバイオケミストリー社製）１■にＤＭＦ　
（１ｍｌ）を加え、攪拌、溶解、した。そのＴ４／ＤＭ
Ｆ溶液全量を先の活性化ＰＯＤ溶液に投入し、室温で１
２時間反応させた。

反応終了後、反応混合物をセファデックスＧ−２５カラ
ムに通し、酵素活性および免疫活性の両方を有する両分
を集めて酵素標識Ｔ４とした。

■　標準サンプルの作製 標準サンプルについては、Ｔ４をＤＭＦに溶解させたち
の適当量をＴ４フリー血清に添加し調製した。

■　血清または血漿中Ｔ４濃度の測定 （ａ）　　■で得たＰＯＤ標識Ｔ４を０，２％ＢＳＡ。

０．０５％８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸ア
ンモニウム含有０．１２Ｍバルビタール緩衝液（ｐＨ８
，６）で希釈し、測定に必要な濃度に調製した。

（ｂ）測定操作 試験管に標準液または検体（血清または血漿）を２０μ
ｌサンプリングし、（ａ）で調製した０、２％ＢＳ　Ａ
１０．０５　％８−７−ＩＪ　／−１−す）’）　レン
スルホン酸アンモニウム含有０．１２Ｍバルビタール緩
衝液（ｐＨ８，６）’　５００μｌを加え、よく攪拌し
、均一溶液とした。これに抗Ｔ４抗体結合ガラスビーズ
１個を加え攪拌した後、３７℃で１５分間振盪、攪拌し
た。反応終了後、反応液を吸引除去し、生理食塩水２ｍ
ｌを加えて再び吸引除去した。この操作を２回繰り返し
検体中の様々な血清成分を除去した。

その後、このビーズを新しい試験管に移しくａ）の酵素
標識抗原Ｔ４液５００μｌを加え３７℃で１５分間振盪
、攪拌した。反応終了後、反応液を吸引除去し、生理食
塩水２ｍｌを加えて再び吸引した。

この操作を２回繰り返した後、抗体結合ガラスビーズを
別の試験管に移し３　ｍｇ／ｍｌのＯ−フェニレンジア
ミンと０．０２χの過酸化水素を基質として含む０．１
Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ４，８）を５００μｌ加え、
３７℃で１５分間振盪、攪拌した。

反応終了後、１．５Ｎ硫酸を３　ｍｌ加え反応停止後４
９２　ｎｍにおける吸光度を測定した。グラフ用紙に標
準ポイントとそのポイントにおける吸光度をプロットし
た検量線から検体中のＴ４濃度を読みとった。

実施例３　コーチゾールの測定 ■　抗コーチゾール抗体結合スリガラスビーズの調製 抗Ｔ３、Ｔ４抗抗結合スリガラスビーズの調製の項に示
したものと同様な方法で抗コーチゾール抗体結合スリガ
ラスビーズを得た。

■　酵素標識コーチゾールの合成 牛丼化学社製コーチゾールのヘミサクシネートを常法に
従い合成し、これに東洋紡社製ペルオキシダーゼを酸無
水物法により導入し酵素標識コーチゾールを得た。

■　標準サンプルの調製 標準サンプルについてはコーチゾールをジオキサンに溶
解させたちの適当量をコーチゾールフリー血清に添加し
調製した。

■　血清または血漿中コーチゾール濃度の測定（ａ）　
　■で得たＰＯＤ標識コーチゾールを０．２％ＢＳＡ含
有０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）で希釈し、測
定に必要な濃度に調整した。

（ｂ）　　測定操作 試験管に標準液または検体（血清または血漿）を１００
μｌサンプリングし、０．２χＢＳＡ含有０．０５Ｍグ
ルタミン酸緩衝液（ｐＨ３，０）　　５００μｍを加え
、よく攪拌し均一溶液とした。これに抗コーチゾール抗
体結合ガラスビーズ１個を加えよく攪拌した後、３７℃
で１５分間振盪、攪拌した。反応終了後、反応液を吸引
除去し、生理食塩水２　ｍｌを加えて再び吸引除去した
。この操作を２回繰り返し検体中の様々な血清成分を除
去した。

その後、このビーズを別の新しい試験管に移しくａ）の
酵素標識抗原コーチゾール液５００μｍを加え３７℃で
１５分間振盪、攪拌した。反応終了後、反応液を吸引除
去し、生理食塩水２　ｍｌを加えて再び吸引除去した。

この操作を２回繰り返した後、抗体結合ガラスビーズを
別の試験管に移し３■／ｍｌの０−フェニレンジアミン
と０．０２χの過酸化水素を基質として含む０．１Ｍの
クエン酸緩衝液（ｐ）１４．８）を５００μｌ加え、３
７℃で１５分間振盪、攪拌した。反応終了後、１．５Ｎ
硫酸を３ｍｌ加え反応停止後、４９２　ｎｍにおける吸
光度を測定した。グラフ用紙に標準ポイントとそのポイ
ントにおける吸光度をプロットした検量線から検体（血
清または血漿）中のコーチゾール濃度を読みとった。

［発明の効果］ 本発明の免疫測定法は未知の血清成分の影響受けないハ
プテンの免疫測定が可能となった方法である。即ち、特
殊な検体を測定する際でも、その検体中の血清成分の影
響により酵素活性または発光もしくは蛍光の発現が著し
く阻害されることがなく、測定結果が臨床所見と一致す
る方法であり、測定値異常の発生という問題のないハプ
テンの免疫測定法である。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１の検量線を示すグラフであり第２図は
血清測定値の相関を示すグラフである。 第１図 Ｔ３　ｃｏｎｃ、　（ｎｇ／ｄｌ） ＲＩＡ　　　　’１′μ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、血清または血漿中のハプテンを定量する免疫測定法
   において、 （１）血清または血漿（Ａ）を、血清または血漿中に含
   まれるハプテンとキャリアー蛋白との結合を解離する解
   離剤を場合により含む緩衝液（Ｂ）とともに、不溶化さ
   れたハプテンに対する抗体（Ｃ）と接触させ、不溶化さ
   れたハプテンに対する抗体とハプテンとの複合体（Ｄ）
   を反応、形成させ、 （２）前記（１）の工程における未反応物を洗浄、除去
   し、（３）複合体（Ｄ）をハプテンまたはその類縁体の
   標識物（Ｅ）と反応、接触させ、 （４）前記（３）の工程における未反応標識物を洗浄、
   除去し、 （５）不溶化されたハプテンに対する抗体に結合した標
   識物の量を測定し、 （６）前記（５）の工程において測定した標識物の量を
   血清または血漿中のハプテンの量と相関させることによ
   りハプテン量を測定するハプテンの免疫測定法。 ２、ハプテンが甲状腺ホルモン、ステロイドホルモンお
   よび薬剤から成る群より選ばれるものである請求項１、
   記載の測定法。 ３、標識物が酵素、蛍光体、または発光体で標識された
   ものである請求項１、または２記載の測定法。 ４、不溶化されたハプテンに対する抗体がガラスビーズ
   またはポリマービーズに共有結合または物理吸着させた
   抗体、または容器の内表面の一部に塗布された抗体であ
   る請求項１〜３いずれか記載の測定法。