JP2002296278A - 医療用キット - Google Patents
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
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- G01N33/942—Serotonin, i.e. 5-hydroxy-tryptamine
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 非特異的な結合および相互作用に関する問題
点を克服し、それによって、生物体液中の薬物を定性的
あるいは定量的に測定するための、信頼性の高い方法を
もたらす新規な医療用キットを提供する。 【解決手段】 非特異的な結合および相互作用について
の問題点を克服し、それによって、生物体液中の薬物を
定性的あるいは定量的に測定するための、信頼性の高い
方法をもたらす新規な医療用キットが提供されている。
この医療用キットは、薬物結合体で被覆した第１部分
と、標識化した抗薬物抗体が含まれている第２部分とを
含み、前記抗薬物抗体が、金材料および／またはラテッ
クス粒子で標識化されているとともに、前記生物体液を
収容するように適合されている。
点を克服し、それによって、生物体液中の薬物を定性的
あるいは定量的に測定するための、信頼性の高い方法を
もたらす新規な医療用キットを提供する。 【解決手段】 非特異的な結合および相互作用について
の問題点を克服し、それによって、生物体液中の薬物を
定性的あるいは定量的に測定するための、信頼性の高い
方法をもたらす新規な医療用キットが提供されている。
この医療用キットは、薬物結合体で被覆した第１部分
と、標識化した抗薬物抗体が含まれている第２部分とを
含み、前記抗薬物抗体が、金材料および／またはラテッ
クス粒子で標識化されているとともに、前記生物体液を
収容するように適合されている。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生物体液中の薬物
を定性的あるいは定量的に測定するための医療用キット
及びそのための方法に関するものである。
を定性的あるいは定量的に測定するための医療用キット
及びそのための方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】薬物の有効治療投与量の決定は、多くの
場合、困難であるが、これは主に、薬物の吸収および代
謝に関する個人差が大きいためである。個人差は、例え
ば、食べ物、体重および存在する他の薬剤との起り得る
相互作用の影響によってもまた、普通に認められる。こ
のような個人差は、いくつかの薬、例えばアスピリンに
ついては主要な懸念とはならないが、それでもなお、他
のほとんどの薬剤については重要なものである。実際、
きわめて強力な薬物、とりわけ癌や心臓病の治療に用い
られる薬物では、最適でない投与量では、有害で、さら
に命に関わる結果が生じるおそれがある。従って、生物
体液中の薬物を定性的あるいは定量的に測定するため
に、きわめて多数の種々の方法が開発されてきた。
場合、困難であるが、これは主に、薬物の吸収および代
謝に関する個人差が大きいためである。個人差は、例え
ば、食べ物、体重および存在する他の薬剤との起り得る
相互作用の影響によってもまた、普通に認められる。こ
のような個人差は、いくつかの薬、例えばアスピリンに
ついては主要な懸念とはならないが、それでもなお、他
のほとんどの薬剤については重要なものである。実際、
きわめて強力な薬物、とりわけ癌や心臓病の治療に用い
られる薬物では、最適でない投与量では、有害で、さら
に命に関わる結果が生じるおそれがある。従って、生物
体液中の薬物を定性的あるいは定量的に測定するため
に、きわめて多数の種々の方法が開発されてきた。
【０００３】生物体液中の薬剤を測定するために用いら
れる現在の多くの方法は、ＨＰＬＣ、ＧＣあるいはＧＣ
／ＭＳ装置を要するような、どちらかというと複雑な処
理に基づいている。明らかに、このような処理は、家庭
におけるような、あるいは基本的には健康管理施設の内
部あるいは外部の任意の場所におけるような看護場所で
直接行う個人の薬物機器測定および迅速な薬物機器測定
の両方にとって不便なものである。従って、周知のよう
に、そのような看護場所で薬物測定をすることのできる
さまざまな医療用キットが開発されてきた。中でも、こ
れらのキットのうち最もよく知られたものはおそらく、
妊娠検査用クリアブルー（Ｃｌｅａｒｂｌｕｅ（登録商
標））であろう。
れる現在の多くの方法は、ＨＰＬＣ、ＧＣあるいはＧＣ
／ＭＳ装置を要するような、どちらかというと複雑な処
理に基づいている。明らかに、このような処理は、家庭
におけるような、あるいは基本的には健康管理施設の内
部あるいは外部の任意の場所におけるような看護場所で
直接行う個人の薬物機器測定および迅速な薬物機器測定
の両方にとって不便なものである。従って、周知のよう
に、そのような看護場所で薬物測定をすることのできる
さまざまな医療用キットが開発されてきた。中でも、こ
れらのキットのうち最もよく知られたものはおそらく、
妊娠検査用クリアブルー（Ｃｌｅａｒｂｌｕｅ（登録商
標））であろう。
【０００４】この医療用キットは普通、ある種の免疫学
的検定法に基づいている。さらにまた、これらのキット
では、適切に機能するためには、担体や膜を介し横方向
への流れあるいは拡散を要するのが普通である（ヨーロ
ッパ特許第８３３１５９号公報を参照のこと）。しかし
ながら、相当な横方向への流れあるいは拡散を要するこ
れらの医療用キットに伴う主な問題は、存在する試薬あ
るいは分析物および担体の間に非特異的な結合および相
互作用が頻繁に認められることにある。そのような不特
定の結合および相互作用は分析の信頼性を低減する。
的検定法に基づいている。さらにまた、これらのキット
では、適切に機能するためには、担体や膜を介し横方向
への流れあるいは拡散を要するのが普通である（ヨーロ
ッパ特許第８３３１５９号公報を参照のこと）。しかし
ながら、相当な横方向への流れあるいは拡散を要するこ
れらの医療用キットに伴う主な問題は、存在する試薬あ
るいは分析物および担体の間に非特異的な結合および相
互作用が頻繁に認められることにある。そのような不特
定の結合および相互作用は分析の信頼性を低減する。
【０００５】その上、次のようなことを可能にする医療
用キットの需要が常にある。
用キットの需要が常にある。
【０００６】すなわち、薬物濃度の迅速な測定であっ
て、この時の「迅速」が生物体液のサンプリングからそ
の結果を得るまで、通常で６０分未満であることを意味
する測定、簡単で信頼性のある使用であって、医療に関
していかなる知識ももたない個人にも使用でき、使用時
におけるエネルギー入力が低く、および／または加熱制
御が不要、温度依存性が低いかあるいは無視可能、貯蔵
安定性、および低コストでの製造、そして第三世界の国
々での使用にも利点のある医療用キットの作製。
て、この時の「迅速」が生物体液のサンプリングからそ
の結果を得るまで、通常で６０分未満であることを意味
する測定、簡単で信頼性のある使用であって、医療に関
していかなる知識ももたない個人にも使用でき、使用時
におけるエネルギー入力が低く、および／または加熱制
御が不要、温度依存性が低いかあるいは無視可能、貯蔵
安定性、および低コストでの製造、そして第三世界の国
々での使用にも利点のある医療用キットの作製。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明によれば、非特
異的結合および相互作用に関する問題点を克服し、それ
によって、生物体液中の薬物を定性的あるいは定量的に
測定するための、信頼性の高い方法を提供する新規な医
療用キットが提供されている。また、従来技術の前記要
望は、本発明によって良好に満たされる。より具体的に
は本発明は、生物体液中の薬物を定性的あるいは定量的
に測定するための医療用キットに関するものであって、
この医療用キットが、 ｉ）薬物結合体で被覆された第１部分および ｉｉ）標識化された抗薬物抗体を含み、かつ、前記生物
体液を受容するように適合させた第２部分であって、標
識化された前記抗薬物抗体が金材料および／またはラテ
ックス粒子で標識化されている第２部分を備えてなる医
療用キットである。前記薬物結合体は、前記薬物と、タ
ンパク質、ペプチド、ポリアミン、セラミド、アルキル
鎖あるいは炭水化物との間の結合体であるのが好まし
い。前記タンパク質は、ウサギ血清アルブミン（ＲＳ
Ａ）、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、ガンマグ
ロブリンおよびサイログロブリンから選ばれているのが
もっとも好ましい。
異的結合および相互作用に関する問題点を克服し、それ
によって、生物体液中の薬物を定性的あるいは定量的に
測定するための、信頼性の高い方法を提供する新規な医
療用キットが提供されている。また、従来技術の前記要
望は、本発明によって良好に満たされる。より具体的に
は本発明は、生物体液中の薬物を定性的あるいは定量的
に測定するための医療用キットに関するものであって、
この医療用キットが、 ｉ）薬物結合体で被覆された第１部分および ｉｉ）標識化された抗薬物抗体を含み、かつ、前記生物
体液を受容するように適合させた第２部分であって、標
識化された前記抗薬物抗体が金材料および／またはラテ
ックス粒子で標識化されている第２部分を備えてなる医
療用キットである。前記薬物結合体は、前記薬物と、タ
ンパク質、ペプチド、ポリアミン、セラミド、アルキル
鎖あるいは炭水化物との間の結合体であるのが好まし
い。前記タンパク質は、ウサギ血清アルブミン（ＲＳ
Ａ）、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、ガンマグ
ロブリンおよびサイログロブリンから選ばれているのが
もっとも好ましい。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明における一実施形
態では、ラテックス粒子は着色されている。着色された
ラテックス粒子は、英国、シュロップシャー、エセック
スロードにあるポリマー・ラボラトリーズ・リミテッ
ド、あるいはアメリカ合衆国のバングス・ラボラトリー
ズ・インコーポレーテッドのような、いくつかの供給者
から市販されている。ラテックス粒子の例としては、ア
メリカ合衆国のバングス・ラボラトリーズ・インコーポ
レーテッドのカタログ番号ＤＳ０３Ｂから得られる、直
径０．５〜０．９μｍの「着色ポリマーマイクロスフェ
ア」である。これらのマイクロスフェア粒子は、濃い青
色に着色されている。これらの粒子は、吸収によってタ
ンパク質に結合する。英国、シュロップシャーにあるポ
リマー・ラボラトリーズ・リミテッドによれば、抗体標
識化のためのラテックス粒子、例えば、カタログ番号６
００４−４１２における４００ｎｍ（ナノメートル）の
ＰＬ−ラテックス・プレーン・ハイダイプ（ＰＬ−Ｌａ
ｔｅｘ Ｐｌａｉｎ ＨｉＤｙｐｅ（登録商標）・ブル
ー（Ｂｌｕｅ）もまた、供給される。
態では、ラテックス粒子は着色されている。着色された
ラテックス粒子は、英国、シュロップシャー、エセック
スロードにあるポリマー・ラボラトリーズ・リミテッ
ド、あるいはアメリカ合衆国のバングス・ラボラトリー
ズ・インコーポレーテッドのような、いくつかの供給者
から市販されている。ラテックス粒子の例としては、ア
メリカ合衆国のバングス・ラボラトリーズ・インコーポ
レーテッドのカタログ番号ＤＳ０３Ｂから得られる、直
径０．５〜０．９μｍの「着色ポリマーマイクロスフェ
ア」である。これらのマイクロスフェア粒子は、濃い青
色に着色されている。これらの粒子は、吸収によってタ
ンパク質に結合する。英国、シュロップシャーにあるポ
リマー・ラボラトリーズ・リミテッドによれば、抗体標
識化のためのラテックス粒子、例えば、カタログ番号６
００４−４１２における４００ｎｍ（ナノメートル）の
ＰＬ−ラテックス・プレーン・ハイダイプ（ＰＬ−Ｌａ
ｔｅｘ Ｐｌａｉｎ ＨｉＤｙｐｅ（登録商標）・ブル
ー（Ｂｌｕｅ）もまた、供給される。
【０００９】本発明の別の実施形態では、標識化用材料
として使われた金材料はコロイド金である。このコロイ
ド金は、金イオン及び遊離金からなるものでもよい。本
発明による固相／液相における分析物検出のための、金
で標識化されかつ／または着色されたラテックス粒子で
標識化された抗体には、従来技術にまさる多くの利点が
備わっている。第１に、標識として酵素の代わりにコロ
イド金を使うと、この実施形態は、通常の温度変動によ
って実質的に影響されなくなるが、このことは、再現可
能性、貯蔵性及び使用者の観点から格別に有利である。
第２に、この実施形態によれば、この発色には、標識化
用酵素のための基質が関係する付加的なステップが必要
でないので、きわめて速い分析（サンプリングから結果
獲得まで５〜１５分）がもたらされる。実際、コロイド
金のような金材料の使用は、本発明にとって、特に好ま
しい。
として使われた金材料はコロイド金である。このコロイ
ド金は、金イオン及び遊離金からなるものでもよい。本
発明による固相／液相における分析物検出のための、金
で標識化されかつ／または着色されたラテックス粒子で
標識化された抗体には、従来技術にまさる多くの利点が
備わっている。第１に、標識として酵素の代わりにコロ
イド金を使うと、この実施形態は、通常の温度変動によ
って実質的に影響されなくなるが、このことは、再現可
能性、貯蔵性及び使用者の観点から格別に有利である。
第２に、この実施形態によれば、この発色には、標識化
用酵素のための基質が関係する付加的なステップが必要
でないので、きわめて速い分析（サンプリングから結果
獲得まで５〜１５分）がもたらされる。実際、コロイド
金のような金材料の使用は、本発明にとって、特に好ま
しい。
【００１０】前記薬物は、コルチコステロイド、単糖な
いしオリゴ糖、ビタミン、プロビタミン類およびホルモ
ンを含んでいる抗高血圧剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗
真菌剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤および向精神薬から選ばれ
るのが好ましい。
いしオリゴ糖、ビタミン、プロビタミン類およびホルモ
ンを含んでいる抗高血圧剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗
真菌剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤および向精神薬から選ばれ
るのが好ましい。
【００１１】前記薬物は、５０〜６０００ｇ／モルの範
囲、好ましくは、１００〜１０００ｇ／モルの範囲にあ
るモル重量を有しているのが特に好ましい。
囲、好ましくは、１００〜１０００ｇ／モルの範囲にあ
るモル重量を有しているのが特に好ましい。
【００１２】前記薬物は普通、リシノプリル、アムロジ
ピン、カプトプリル、エナラプリル、エナラプリラー
ト、ケトチフェン、シルデナフィルおよびフルオゼチン
から選ばれる。
ピン、カプトプリル、エナラプリル、エナラプリラー
ト、ケトチフェン、シルデナフィルおよびフルオゼチン
から選ばれる。
【００１３】本発明の医療用キットでは、前記第２部分
は、標識化された前記抗薬物抗体の溶液を収容している
か、あるいは少なくとも一部が被覆された内部を有して
いるかのいずれかの容器であるのが好ましい。この容器
は普通、チューブ状のものである。
は、標識化された前記抗薬物抗体の溶液を収容している
か、あるいは少なくとも一部が被覆された内部を有して
いるかのいずれかの容器であるのが好ましい。この容器
は普通、チューブ状のものである。
【００１４】一例を挙げれば、前記第１部分は普通、ス
ティック、ストリップ、へら状スティックあるいはプレ
ート状の形状を有している。ヌンク−イムノ（Ｎｕｎｃ
−Ｉｍｍｕｎｏ（登録商標））スティック（以下を参照
のこと）の形状が特に好ましい。
ティック、ストリップ、へら状スティックあるいはプレ
ート状の形状を有している。ヌンク−イムノ（Ｎｕｎｃ
−Ｉｍｍｕｎｏ（登録商標））スティック（以下を参照
のこと）の形状が特に好ましい。
【００１５】前記第１部分の好ましい材料については、
その表面は普通、最大結合のために化学処理されたポリ
スチレン、ポリプロピレン、ニトロセルロースの材料か
ら選ばれる材料からなる。
その表面は普通、最大結合のために化学処理されたポリ
スチレン、ポリプロピレン、ニトロセルロースの材料か
ら選ばれる材料からなる。
【００１６】その表面の下の材料は、表面のものと同じ
材料であってもよく、異なる材料であってもよい。従っ
て、前記第１部分の表面は、その下にある材料と完全に
一体化されていてもよく、すなわち、前記第１部分は単
一型の材料から作られていてもよく、あるいは、事実
上、任意の種類の有用材料が施された１つの層であって
もよい。この第１部分の表面は、ヌンク−イムノ（Ｎｕ
ｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ（登録商標））スティックの表面に
ついて用いられたものであるのが好ましい。好ましい一
実施形態では、前記第１部分は、下に例示されたよう
に、ヌンク−イムノ（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ（登録商
標））スティックである。本発明に係る固相の免疫学的
検定法について、先に言及された第１部分（ｉ）として
ヌンク−イムノ（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ（登録商
標））スティックを使うことで、驚くほど良好な結果が
得られた。これは、患者の生物体液中の薬物濃度をモニ
ターする患者が手近に用いる迅速な医療用キットの利点
があることから、特に好ましい。
材料であってもよく、異なる材料であってもよい。従っ
て、前記第１部分の表面は、その下にある材料と完全に
一体化されていてもよく、すなわち、前記第１部分は単
一型の材料から作られていてもよく、あるいは、事実
上、任意の種類の有用材料が施された１つの層であって
もよい。この第１部分の表面は、ヌンク−イムノ（Ｎｕ
ｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ（登録商標））スティックの表面に
ついて用いられたものであるのが好ましい。好ましい一
実施形態では、前記第１部分は、下に例示されたよう
に、ヌンク−イムノ（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ（登録商
標））スティックである。本発明に係る固相の免疫学的
検定法について、先に言及された第１部分（ｉ）として
ヌンク−イムノ（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ（登録商
標））スティックを使うことで、驚くほど良好な結果が
得られた。これは、患者の生物体液中の薬物濃度をモニ
ターする患者が手近に用いる迅速な医療用キットの利点
があることから、特に好ましい。
【００１７】その上、本発明は、生物体液中の薬物を定
性的あるいは定量的に測定するための方法であって、薬
物結合体で被覆された第１部分、すなわち、先に定義さ
れた第１部分ｉ）と、金材料および／またはラテックス
粒子で標識化された標識化抗薬物抗体とを利用する方法
に関するものでもある。
性的あるいは定量的に測定するための方法であって、薬
物結合体で被覆された第１部分、すなわち、先に定義さ
れた第１部分ｉ）と、金材料および／またはラテックス
粒子で標識化された標識化抗薬物抗体とを利用する方法
に関するものでもある。
【００１８】前記方法によれば、前記第１部分は、好ま
しくは、標識化された抗薬物抗体を含有するとともに、
前記生物体液を収容するように適合された第２部分、す
なわち、先に定義された第２部分ｉｉ）の内側に配置さ
れており、前記第２部分が、前記生物体液を収容してお
り、前記第１部分が、所定時間後に前記第２部分から取
り除かれる。
しくは、標識化された抗薬物抗体を含有するとともに、
前記生物体液を収容するように適合された第２部分、す
なわち、先に定義された第２部分ｉｉ）の内側に配置さ
れており、前記第２部分が、前記生物体液を収容してお
り、前記第１部分が、所定時間後に前記第２部分から取
り除かれる。
【００１９】前記所定時間は普通、５〜６０分の範囲に
ある。
ある。
【００２０】前記方法によれば、前記生物体液中の前記
薬物の濃度を表示する潜在的色変化を起こすために、前
記第１部分は、次に、すなわち、前記ステップが実行さ
れた後に、発色される。
薬物の濃度を表示する潜在的色変化を起こすために、前
記第１部分は、次に、すなわち、前記ステップが実行さ
れた後に、発色される。
【００２１】本発明に関連させて抗薬物抗体を標識化す
るときにコロイド金を用いると、図４に見られるよう
に、きわめて良好な結果、すなわち暗赤褐色が得られ
た。金は、とりわけ、標識化材料として多くの場合に用
いられるある種の高価な精製酵素に比べて、標識化に用
いる比較的安価な物質とみなすこともできる。
るときにコロイド金を用いると、図４に見られるよう
に、きわめて良好な結果、すなわち暗赤褐色が得られ
た。金は、とりわけ、標識化材料として多くの場合に用
いられるある種の高価な精製酵素に比べて、標識化に用
いる比較的安価な物質とみなすこともできる。
【００２２】本発明に係るキットには、生物試料、すな
わち、尿、血液あるいは唾液の中の薬物を自分でモニタ
ーするのに慣れていない人が、更に何ら機器の補助を要
することなく、容易に使うことができるという利点があ
る。
わち、尿、血液あるいは唾液の中の薬物を自分でモニタ
ーするのに慣れていない人が、更に何ら機器の補助を要
することなく、容易に使うことができるという利点があ
る。
【００２３】通常、前記方法は全体として、周囲温度で
実行される。前記生物体液は、典型的には、血液、血
清、尿あるいは唾液である。
実行される。前記生物体液は、典型的には、血液、血
清、尿あるいは唾液である。
【００２４】本明細書に用いる「薬物」という用語は、
とりわけ生体へ投与されたときに、生理学的な反応ある
いは状態を生じるかあるいはそのような反応あるいは状
態に関与する任意の物質を含む。従って、本発明の目的
には、代謝産物（活性体、あるいは不活性体）、プロド
ラッグおよび抗原もまた、薬物とみなされる。
とりわけ生体へ投与されたときに、生理学的な反応ある
いは状態を生じるかあるいはそのような反応あるいは状
態に関与する任意の物質を含む。従って、本発明の目的
には、代謝産物（活性体、あるいは不活性体）、プロド
ラッグおよび抗原もまた、薬物とみなされる。
【００２５】本発明は、添付図面とともに、非限定的な
以下のいくつかの実施例によってさらに示されている。
以下のいくつかの実施例によってさらに示されている。
【００２６】
【発明の実施の形態】実施例 材料および方法 基本的に、アメリカ合衆国のアカデミックプレスにより
１９９６年に出版された、Ｅｄ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、
Ｇ．による「Bioconjugate Techniques」に紹介された
方法論に従い、薬物結合体を、調製した。抗薬物抗体の
調製は、基本的にオランダのエルスビアー出版社により
１９８８年に出版された、Ｅｄｓ．ｖａｎ Ｒｅｇｅｎ
ｍｏｒｔｅｌ、Ｍ．Ｈ．Ｖ．、Ｂｒｉａｎｄ、Ｊ．
Ｐ．、Ｍｕｌｌｅｒ、Ｓ．およびＰｌａｕｅ、Ｓ．によ
る「Synthetic Polypeptides as antigens」に記載され
た方法に従った。抗薬物抗体の調製については、一般
に、オランダのエルスビアー出版社により１９８５年に
出版された、Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｐ．による「Practice a
nd theory of enzyme immunoassays」の第５章および第
１２章も参照のこと。先に言及されたすべての刊行物の
教示は、参照により本明細書に全体に組み込まれる。
１９９６年に出版された、Ｅｄ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、
Ｇ．による「Bioconjugate Techniques」に紹介された
方法論に従い、薬物結合体を、調製した。抗薬物抗体の
調製は、基本的にオランダのエルスビアー出版社により
１９８８年に出版された、Ｅｄｓ．ｖａｎ Ｒｅｇｅｎ
ｍｏｒｔｅｌ、Ｍ．Ｈ．Ｖ．、Ｂｒｉａｎｄ、Ｊ．
Ｐ．、Ｍｕｌｌｅｒ、Ｓ．およびＰｌａｕｅ、Ｓ．によ
る「Synthetic Polypeptides as antigens」に記載され
た方法に従った。抗薬物抗体の調製については、一般
に、オランダのエルスビアー出版社により１９８５年に
出版された、Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｐ．による「Practice a
nd theory of enzyme immunoassays」の第５章および第
１２章も参照のこと。先に言及されたすべての刊行物の
教示は、参照により本明細書に全体に組み込まれる。
【００２７】前記第１部分（ｉ）としてヌンク−イムノ
スティックを使うときの本発明の原理 この検定法では、生物体液中に存在する分析物は、酵素
で標識化された、好ましくは金で標識化された抗薬物抗
体と結合において、前記スティックに固定化された基準
分析薬と競合する。リシノプリルに関して、その方法を
説明する。ヌンクへら状スティックは、タンパク質−リ
シノプリル結合体で被覆されている。これは、共有結合
によらない相互作用で、強く結合している。過剰タンパ
ク質−薬物結合体を洗い流し、また、前記スティックに
おけるフリーの結合部位を、タンパク質及び界面活性剤
含有緩衝液、例えばカゼインおよびトゥイーン−２０
（Ｔｗｅｅｎ−２０）でインキュベートすることによっ
てブロックする。ブロックした後に、前記スティックを
水洗、乾燥し、次に使用する時まで、乾燥状態で保管す
ることができる。この検定法では、前記スティックを、
酵素で標識化された、好ましくは金で標識化された抗リ
シノプリル抗体の希釈物及び２〜３滴の生物体液が含ま
れているチューブの中に入れる。抗原−抗体反応を起こ
させるために５〜１０分間インキューベートした後、前
記スティックを、水道水で洗浄し、過剰の標識化抗体を
除去する。前記生物体液に薬物が入っていないときに
は、標識化抗体のほとんどは、前記スティックに固定化
された薬物に結合する。金で標識化された抗体の場合に
は、金−抗体が赤みを帯びた濃い色を示すため、この結
合が直接、明らかになる。酵素で標識化された抗体の場
合には、前記抗体の結合は、ある物質（セイヨウワサビ
ペルオキシダーゼの場合にはＴＭＢ）を添加すること
で、明らかになる。スティックに固定化された薬物に今
や結合した酵素標識化抗体は、可溶性物質を青色の不溶
性生成物に転化する。この不溶性生成物は、前記スティ
ックの表面に沈着する。前記スティックを、水で洗浄
し、余分な基質溶液を除去し乾燥する。前記生物体液に
薬物が含まれているときには、この薬物が固定化した薬
物と、抗体結合体との結合について競合する。このこと
は、前記スティックに固定化した薬物に結合する抗体結
合体がより少ないことを意味している。従って、前記ス
ティックの発色の濃さは低下する。前記生物体液中の遊
離した薬物量が多いほど、発色の濃さはいっそう薄いと
思われる。実際、抗体結合体希釈物は、カットオフ濃度
以下で濃い色がもたらされるように、また、「陽性」濃
度、例えばリシノプリルについては選ばれたカットオフ
が５０ｎｇ／ｍｌで全く呈色しないかあるいはわずかに
呈色するように、選ばれている。これ以下の濃度では、
充分な抗体結合体が結合して、濃い色がもたらされるの
に対して、１００ｎｇ／ｍｌでは、その色の濃さは、わ
すかであるか、あるいは認められない。
スティックを使うときの本発明の原理 この検定法では、生物体液中に存在する分析物は、酵素
で標識化された、好ましくは金で標識化された抗薬物抗
体と結合において、前記スティックに固定化された基準
分析薬と競合する。リシノプリルに関して、その方法を
説明する。ヌンクへら状スティックは、タンパク質−リ
シノプリル結合体で被覆されている。これは、共有結合
によらない相互作用で、強く結合している。過剰タンパ
ク質−薬物結合体を洗い流し、また、前記スティックに
おけるフリーの結合部位を、タンパク質及び界面活性剤
含有緩衝液、例えばカゼインおよびトゥイーン−２０
（Ｔｗｅｅｎ−２０）でインキュベートすることによっ
てブロックする。ブロックした後に、前記スティックを
水洗、乾燥し、次に使用する時まで、乾燥状態で保管す
ることができる。この検定法では、前記スティックを、
酵素で標識化された、好ましくは金で標識化された抗リ
シノプリル抗体の希釈物及び２〜３滴の生物体液が含ま
れているチューブの中に入れる。抗原−抗体反応を起こ
させるために５〜１０分間インキューベートした後、前
記スティックを、水道水で洗浄し、過剰の標識化抗体を
除去する。前記生物体液に薬物が入っていないときに
は、標識化抗体のほとんどは、前記スティックに固定化
された薬物に結合する。金で標識化された抗体の場合に
は、金−抗体が赤みを帯びた濃い色を示すため、この結
合が直接、明らかになる。酵素で標識化された抗体の場
合には、前記抗体の結合は、ある物質（セイヨウワサビ
ペルオキシダーゼの場合にはＴＭＢ）を添加すること
で、明らかになる。スティックに固定化された薬物に今
や結合した酵素標識化抗体は、可溶性物質を青色の不溶
性生成物に転化する。この不溶性生成物は、前記スティ
ックの表面に沈着する。前記スティックを、水で洗浄
し、余分な基質溶液を除去し乾燥する。前記生物体液に
薬物が含まれているときには、この薬物が固定化した薬
物と、抗体結合体との結合について競合する。このこと
は、前記スティックに固定化した薬物に結合する抗体結
合体がより少ないことを意味している。従って、前記ス
ティックの発色の濃さは低下する。前記生物体液中の遊
離した薬物量が多いほど、発色の濃さはいっそう薄いと
思われる。実際、抗体結合体希釈物は、カットオフ濃度
以下で濃い色がもたらされるように、また、「陽性」濃
度、例えばリシノプリルについては選ばれたカットオフ
が５０ｎｇ／ｍｌで全く呈色しないかあるいはわずかに
呈色するように、選ばれている。これ以下の濃度では、
充分な抗体結合体が結合して、濃い色がもたらされるの
に対して、１００ｎｇ／ｍｌでは、その色の濃さは、わ
すかであるか、あるいは認められない。
【００２８】代替法としては、抗薬物抗体（例えば、ウ
サギ抗リシノプリル抗体）を直接標識化する代わりに、
間接標準免疫学的検定法を用いることができる。この実
施形態では、標識化された第２の抗体、例えば、酵素標
識化あるいは金標識化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を用いる
ことができる。この場合、検定は、前と同じように行う
が、余分のステップを追加して行う。従って、被覆され
たストリップを、抗薬物抗血清（ウサギ抗リシノプリ
ル）で５〜１０分間インキュベートし、次に、水で１０
秒間洗浄した後、標識化ヤギ抗ウサギＩｇＧでさらに５
〜１０分間インキュベートして洗浄し、金標識化抗体に
ついては直接、酵素標識化抗体の場合には基質の添加の
後に読取る。
サギ抗リシノプリル抗体）を直接標識化する代わりに、
間接標準免疫学的検定法を用いることができる。この実
施形態では、標識化された第２の抗体、例えば、酵素標
識化あるいは金標識化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を用いる
ことができる。この場合、検定は、前と同じように行う
が、余分のステップを追加して行う。従って、被覆され
たストリップを、抗薬物抗血清（ウサギ抗リシノプリ
ル）で５〜１０分間インキュベートし、次に、水で１０
秒間洗浄した後、標識化ヤギ抗ウサギＩｇＧでさらに５
〜１０分間インキュベートして洗浄し、金標識化抗体に
ついては直接、酵素標識化抗体の場合には基質の添加の
後に読取る。
【００２９】この間接検定のさらに別の変形例は、ビオ
チンで抗薬物抗体を標識し、第２抗体の代わりに、金標
識化あるいは酵素標識化アビジンあるいはストレプトア
ビジンを用いることである。
チンで抗薬物抗体を標識し、第２抗体の代わりに、金標
識化あるいは酵素標識化アビジンあるいはストレプトア
ビジンを用いることである。
【００３０】２段階グルタルアルデヒド法によるウサギ
血清アルブミン−リシノプリルジ結合体の調製 １．１０ｍｇのウサギ血清アルブミンを１ｍｌのＰＢＳ
（リン酸緩衝化食塩水：０．０２モルのＮａ２ＨＰＯ４
／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．４、０．１５モルＮ
ａＣｌ）に穏やかに溶解させる。
血清アルブミン−リシノプリルジ結合体の調製 １．１０ｍｇのウサギ血清アルブミンを１ｍｌのＰＢＳ
（リン酸緩衝化食塩水：０．０２モルのＮａ２ＨＰＯ４
／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．４、０．１５モルＮ
ａＣｌ）に穏やかに溶解させる。
【００３１】２．新たに調製された１ｍｌの１％（ｗ／
ｖ）グルタルアルデヒドを、そのタンパク質に滴下して
添加し、攪拌する。攪拌は室温で２時間、行われる。
ｖ）グルタルアルデヒドを、そのタンパク質に滴下して
添加し、攪拌する。攪拌は室温で２時間、行われる。
【００３２】３．余分のグルタルアルデヒドを、セファ
デックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５Ｆあるいはセフ
ァデックスＧ−５０Ｍを用いて、ＰＢＳ中でのゲル濾過
によって除去する。少なくとも２０ｍｌのゲルの入った
カラム（１．５×２０ｃｍのものが推奨される）が必要
になる。２８０ｎｍでタンパク質のピークを測定する。
デックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５Ｆあるいはセフ
ァデックスＧ−５０Ｍを用いて、ＰＢＳ中でのゲル濾過
によって除去する。少なくとも２０ｍｌのゲルの入った
カラム（１．５×２０ｃｍのものが推奨される）が必要
になる。２８０ｎｍでタンパク質のピークを測定する。
【００３３】４．タンパク質を含有している分画をプー
ルし、また、ＰＢＳ中リシノプリル溶液を添加する。リ
シノプリル：ＲＳＡのモル比は、２００：１が用いられ
た。攪拌しながら、室温で２４時間インキュベートす
る。
ルし、また、ＰＢＳ中リシノプリル溶液を添加する。リ
シノプリル：ＲＳＡのモル比は、２００：１が用いられ
た。攪拌しながら、室温で２４時間インキュベートす
る。
【００３４】５．ＰＢＳに対して、４℃で４８時間の透
析を行う。
析を行う。
【００３５】６．２８０ｎｍで光学密度を測定する。１
ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度についての吸光係数：２８
０ｎｍで０．６７を用いて、結合体濃度を求める。
ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度についての吸光係数：２８
０ｎｍで０．６７を用いて、結合体濃度を求める。
【００３６】アジ化ナトリウムを０．１％（ｗ／ｖ）で
添加し、アリコートを−２０℃で貯蔵する。
添加し、アリコートを−２０℃で貯蔵する。
【００３７】２段階グルタルアルデヒド法によるＩｇＧ
−セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合体（ＨＲＰ−Ｉ
ｐＧ）の調製 １．１０ｍｇのＨＲＰを1ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝化
食塩水：Ｎａ２ＨＰＯ ４／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ
７．４、０．１５モルＮａＣｌ）に穏やかに溶解する。
−セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合体（ＨＲＰ−Ｉ
ｐＧ）の調製 １．１０ｍｇのＨＲＰを1ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝化
食塩水：Ｎａ２ＨＰＯ ４／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ
７．４、０．１５モルＮａＣｌ）に穏やかに溶解する。
【００３８】２．新たに調製された１ｍｌの１％（ｗ／
ｖ）グルタルアルデヒドを前記酵素に滴下状に添加し、
攪拌する。攪拌は室温で２時間、行われる。
ｖ）グルタルアルデヒドを前記酵素に滴下状に添加し、
攪拌する。攪拌は室温で２時間、行われる。
【００３９】３．余分のグルタルアルデヒドを、セファ
デックスＧ−２５ＦあるいはセファデックスＧ−５０Ｍ
を用いる、ＰＢＳ中でのゲル濾過によって除去する。少
なくとも２０ｍｌのゲルの入ったカラム（１．５×１０
ｃｍのものが推奨される）が必要になる。４０３ｎｍで
同酵素のピークを測定する。
デックスＧ−２５ＦあるいはセファデックスＧ−５０Ｍ
を用いる、ＰＢＳ中でのゲル濾過によって除去する。少
なくとも２０ｍｌのゲルの入ったカラム（１．５×１０
ｃｍのものが推奨される）が必要になる。４０３ｎｍで
同酵素のピークを測定する。
【００４０】４．同酵素を含む分画をプールし、ＰＢＳ
中の抗体溶液を添加する。ＨＲＰ：ＩｇＧのモル比は、
４〜６：１を用いる。ＩｇＧが不安定なものであれば、
これらのタンパク質は、攪拌しながら、室温あるいは４
℃で２４時間インキュベートする。
中の抗体溶液を添加する。ＨＲＰ：ＩｇＧのモル比は、
４〜６：１を用いる。ＩｇＧが不安定なものであれば、
これらのタンパク質は、攪拌しながら、室温あるいは４
℃で２４時間インキュベートする。
【００４１】５．ＰＢＳに対して４℃で４８時間透析す
る。
る。
【００４２】６．４０３ｎｍと２７８ｎｍでＯ．Ｄ．を
測定する。この結合体におけるＨＲＰの濃度およびＩｇ
Ｇの濃度を、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度についての
吸光係数を用いて、求められた。
測定する。この結合体におけるＨＲＰの濃度およびＩｇ
Ｇの濃度を、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度についての
吸光係数を用いて、求められた。
【００４３】ＨＲＰ４０３ｎｍ＝２．２、ＨＲＰ
２７８ｎｍ＝０．７５、ＩｇＧ２７８ｎｍ＝１．４ ７．ＢＳＡを１０ｍｇ／ｍｌ、トゥイーン−２０を０．
０５％（ｗ／ｖ）、また、防腐剤：０．００５％チオメ
ルサル、あるいは、好ましくは０．０２％（ｗ／ｖ）ブ
ロモ−ニトロ−ジオキサン（ＢＮＤ）を添加する。アリ
コートが−２０℃で貯蔵された。
２７８ｎｍ＝０．７５、ＩｇＧ２７８ｎｍ＝１．４ ７．ＢＳＡを１０ｍｇ／ｍｌ、トゥイーン−２０を０．
０５％（ｗ／ｖ）、また、防腐剤：０．００５％チオメ
ルサル、あるいは、好ましくは０．０２％（ｗ／ｖ）ブ
ロモ−ニトロ−ジオキサン（ＢＮＤ）を添加する。アリ
コートが−２０℃で貯蔵された。
【００４４】注：ＨＲＰ薬物結合体は、薬物：モル比が
５：１のＨＲＰを用いて、同じ方法に従って作られた。
５：１のＨＲＰを用いて、同じ方法に従って作られた。
【００４５】ウサギ抗リシノプリル抗体は、英国、ウェ
ールズ、カーディフにあるブリティシュ・バイオセル・
インターナショナルによって供給された、金で標識化さ
れたものであった。
ールズ、カーディフにあるブリティシュ・バイオセル・
インターナショナルによって供給された、金で標識化さ
れたものであった。
【００４６】感度評価：従来のミクロ滴定容器のウェル
の内壁を、この内壁に前記結合体の溶液（１μｇ／ｍ
ｌ；０．１ｍｌ）を添加し、次いで、３７℃で１時間で
インキュベートすることにより、ＲＳＡ−リシノプリル
結合体で被覆した。２５０μｌ／ウェルの洗浄用緩衝液
（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝食塩水、ｐＨ７．４、
０．０５％アジ化ナトリウム及び０．０５％トゥイーン
−２０含有ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した後に、これらの
ウェルは、ヒトの全血（２５μｌ）中のリシノプリルの
量を変えて、ＨＲＰ標識化抗リシノプリル抗体の存在
（洗浄用緩衝液中に２５ｎｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェ
ル）において、室温で３０分間、インキュベートした。
洗浄用緩衝液で洗浄した後に、これらのウェルを、基質
であるテトラメチルベンジジン溶液１００μｌ／ウェル
で、室温で３０分間インキュベートした。２モルの硫酸
を１００μｌ／ウェル添加することで発色を停止させ、
ダイネックス（Ｄｙｎｅｘ）ミクロ滴定プレート読取装
置を使って、４５０ｎｍの波長で色強度を測定した。そ
の結果を図１に示す。１００ｐｇ／ｍｌのような低い濃
度を検出することができるので、この実験によれば、本
発明の検定システムの感度がきわめて高いことが証明さ
れた。
の内壁を、この内壁に前記結合体の溶液（１μｇ／ｍ
ｌ；０．１ｍｌ）を添加し、次いで、３７℃で１時間で
インキュベートすることにより、ＲＳＡ−リシノプリル
結合体で被覆した。２５０μｌ／ウェルの洗浄用緩衝液
（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝食塩水、ｐＨ７．４、
０．０５％アジ化ナトリウム及び０．０５％トゥイーン
−２０含有ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した後に、これらの
ウェルは、ヒトの全血（２５μｌ）中のリシノプリルの
量を変えて、ＨＲＰ標識化抗リシノプリル抗体の存在
（洗浄用緩衝液中に２５ｎｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェ
ル）において、室温で３０分間、インキュベートした。
洗浄用緩衝液で洗浄した後に、これらのウェルを、基質
であるテトラメチルベンジジン溶液１００μｌ／ウェル
で、室温で３０分間インキュベートした。２モルの硫酸
を１００μｌ／ウェル添加することで発色を停止させ、
ダイネックス（Ｄｙｎｅｘ）ミクロ滴定プレート読取装
置を使って、４５０ｎｍの波長で色強度を測定した。そ
の結果を図１に示す。１００ｐｇ／ｍｌのような低い濃
度を検出することができるので、この実験によれば、本
発明の検定システムの感度がきわめて高いことが証明さ
れた。
【００４７】起り得る非特異的結合の評価：ヌンク−イ
ムノ（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ（登録商標））スティッ
ク（英国のライフテクノロジーズ社により製造された）
を炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中ＲＳＡ−リシノプリル
結合体溶液（５μｇ／ｍｌ）の中へ浸し、次いで、３７
℃で１時間でインキュベートすることによって、ＲＳＡ
−リシノプリル結合体で被覆したスティックを調製し
た。リン酸塩緩衝化食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）は、
溶媒として任意選択的に用いることができ、また、代替
法として、室温で２４時間インキュベートしてもよい。
インキュベートした後、前記スティックを、水道水で洗
浄し、０．２％カゼイン、０．０５％トゥイーン−２０
および０．０５％ＮａＮ３（防腐剤）を含有するＰＢＳ
の中で、室温で１時間ブロック処理した。次いで、これ
らのスティックを、水道水で１回すすぎ、室温で乾燥
し、次に使用する時まで、乾燥環境で保管した。
ムノ（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ（登録商標））スティッ
ク（英国のライフテクノロジーズ社により製造された）
を炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中ＲＳＡ−リシノプリル
結合体溶液（５μｇ／ｍｌ）の中へ浸し、次いで、３７
℃で１時間でインキュベートすることによって、ＲＳＡ
−リシノプリル結合体で被覆したスティックを調製し
た。リン酸塩緩衝化食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）は、
溶媒として任意選択的に用いることができ、また、代替
法として、室温で２４時間インキュベートしてもよい。
インキュベートした後、前記スティックを、水道水で洗
浄し、０．２％カゼイン、０．０５％トゥイーン−２０
および０．０５％ＮａＮ３（防腐剤）を含有するＰＢＳ
の中で、室温で１時間ブロック処理した。次いで、これ
らのスティックを、水道水で１回すすぎ、室温で乾燥
し、次に使用する時まで、乾燥環境で保管した。
【００４８】上記では、一般に適用することのできる被
覆処理について説明しており、また、同処理に完全に従
って用意されたＲＳＡ被覆されたスティックを説明して
いる。
覆処理について説明しており、また、同処理に完全に従
って用意されたＲＳＡ被覆されたスティックを説明して
いる。
【００４９】さらに、前記被覆処理のいくつかの細部
は、追加説明を受けるに値するものである。第１に、薬
物をスティックに直接結合すると、有用な生成物が生じ
ることはない、と思われる。なぜなら、前記薬物のモル
重量がかなり低いため、固定化された薬物に抗体が直接
結合することがほとんど不可能になるからである。この
ような理由から、スティックは、代わりに、薬物結合
体、好ましくはＲＳＡ−リシノプリルのようなタンパク
質−薬物結合体で被覆された。薬物とポリアミン、ある
いは炭水化物との間の結合体は、同程度に有用である。
第２に、ｉ）多量の結合体で被覆することおよびｉｉ）
前記結合体における高い薬物／タンパク質比は、高い感
度を獲得するためには絶対的に重大であることもまた明
らかになった。典型的には、前記被覆用溶液中の結合体
の濃度は、１〜５μｇ／ｍｌの範囲にあるべきであるの
に対し、前記結合体における有用な薬物／タンパク質比
は、１０：１〜２００：１であるべきである。
は、追加説明を受けるに値するものである。第１に、薬
物をスティックに直接結合すると、有用な生成物が生じ
ることはない、と思われる。なぜなら、前記薬物のモル
重量がかなり低いため、固定化された薬物に抗体が直接
結合することがほとんど不可能になるからである。この
ような理由から、スティックは、代わりに、薬物結合
体、好ましくはＲＳＡ−リシノプリルのようなタンパク
質−薬物結合体で被覆された。薬物とポリアミン、ある
いは炭水化物との間の結合体は、同程度に有用である。
第２に、ｉ）多量の結合体で被覆することおよびｉｉ）
前記結合体における高い薬物／タンパク質比は、高い感
度を獲得するためには絶対的に重大であることもまた明
らかになった。典型的には、前記被覆用溶液中の結合体
の濃度は、１〜５μｇ／ｍｌの範囲にあるべきであるの
に対し、前記結合体における有用な薬物／タンパク質比
は、１０：１〜２００：１であるべきである。
【００５０】前記のようにして調製されたスティック
を、次に、さまざまな濃度のＨＲＰ標識化抗リシノプリ
ル抗体、リン酸緩衝化食塩水（０．５ｍｌ）中１０％
（ｖ／ｖ）ヒト全血を含有し、０．０５％のトゥイーン
−２０、０．２％のカゼインおよび１０ｍＭのＥＤＴＡ
（ｐＨ７．４）を含有しているチューブの中に挿入し
た。室温で５分間インキュベートした後に、それぞれの
スティックを、取り出し、水道水の中で１０秒間すすぎ
洗いし、次に、テトラメチルベンジジン基質を含有する
チューブの中へ５分間挿入し、その後、前記と同様にす
すぎ洗いし乾燥し、写真を撮影した。図２に示されてい
るこれらの結果から、スティックへの非特異的抗体結合
が、きわめて度合いの高い特異的抗体の結合に比べて重
要でないことが確かめられた。本発明の多用性について
の主な前提条件は、それによってもたらされる。実際的
な目的のためには、ＨＲＰ標識化抗リシノプリル抗体の
濃度が２５０ｎｇ／ｍｌであるときに、もっとも適切な
色鮮明度が得られた。
を、次に、さまざまな濃度のＨＲＰ標識化抗リシノプリ
ル抗体、リン酸緩衝化食塩水（０．５ｍｌ）中１０％
（ｖ／ｖ）ヒト全血を含有し、０．０５％のトゥイーン
−２０、０．２％のカゼインおよび１０ｍＭのＥＤＴＡ
（ｐＨ７．４）を含有しているチューブの中に挿入し
た。室温で５分間インキュベートした後に、それぞれの
スティックを、取り出し、水道水の中で１０秒間すすぎ
洗いし、次に、テトラメチルベンジジン基質を含有する
チューブの中へ５分間挿入し、その後、前記と同様にす
すぎ洗いし乾燥し、写真を撮影した。図２に示されてい
るこれらの結果から、スティックへの非特異的抗体結合
が、きわめて度合いの高い特異的抗体の結合に比べて重
要でないことが確かめられた。本発明の多用性について
の主な前提条件は、それによってもたらされる。実際的
な目的のためには、ＨＲＰ標識化抗リシノプリル抗体の
濃度が２５０ｎｇ／ｍｌであるときに、もっとも適切な
色鮮明度が得られた。
【００５１】ヒト全血中のリシノプリルの検出 前記のようにＲＳＡ−リシノプリル結合体で被覆された
スティックを、ＨＲＰで標識化された抗リシノプリル抗
体（２５０ｎｇ／ｍｌ；４００μｌ：０．０５％のトゥ
イーン−２０、０．２％カゼインおよび１０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ（ｐＨ７．４）を含有するリン酸緩衝化食塩水
（０．５ｍｌ）にある）及びさまざまな濃度のリシノプ
リルを含有しているヒトの全血（１００μｌ）との混合
液（５００μｌ）の中に浸した。５分間インキュベート
した後に、スティックを取り出し、水道水中で洗浄した
後、前記と同様にテトラメチルベンジジンで染色した。
これらの結果は図３に示されている。これらは、評価し
たさまざまなリシノプリル濃度の間に顕著な色強度の差
のあることをはっきりと示している。とりわけ、５０ｎ
ｇ／ｍｌのリシノプリルを含有した血液試料と１００ｎ
ｇ／ｍｌのリシノプリルを含有した血液試料との間に
は、はっきりした色強度の差があることに留意すべきで
ある。これらの濃度によってこの薬物の有効治癒量の範
囲が含まれるので、前記の結果は医療上、かなりの関連
性があるはずである。
スティックを、ＨＲＰで標識化された抗リシノプリル抗
体（２５０ｎｇ／ｍｌ；４００μｌ：０．０５％のトゥ
イーン−２０、０．２％カゼインおよび１０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ（ｐＨ７．４）を含有するリン酸緩衝化食塩水
（０．５ｍｌ）にある）及びさまざまな濃度のリシノプ
リルを含有しているヒトの全血（１００μｌ）との混合
液（５００μｌ）の中に浸した。５分間インキュベート
した後に、スティックを取り出し、水道水中で洗浄した
後、前記と同様にテトラメチルベンジジンで染色した。
これらの結果は図３に示されている。これらは、評価し
たさまざまなリシノプリル濃度の間に顕著な色強度の差
のあることをはっきりと示している。とりわけ、５０ｎ
ｇ／ｍｌのリシノプリルを含有した血液試料と１００ｎ
ｇ／ｍｌのリシノプリルを含有した血液試料との間に
は、はっきりした色強度の差があることに留意すべきで
ある。これらの濃度によってこの薬物の有効治癒量の範
囲が含まれるので、前記の結果は医療上、かなりの関連
性があるはずである。
【００５２】金標識化ウサギ抗リシノプリル抗体の結合
特異性の評価 コロイド金は金イオンのクラスターからできている。コ
ロイド金は、構造のはっきりした分子ではなく、遊離金
の性質がいくらか備わっている懸濁粒子である。溶液中
では、コロイド金は負の電荷を採り、粒子の表面を形成
する塩化金ヨウ素（ＡｕＩＣｌ２）から生じると考えら
れている。このような負の電荷のために、コロイド金に
は、生理学的ｐＨで正電荷あるいは中性電荷を持つ傾向
がある多くのタンパク質に対する親和性がある。このこ
とによって、抗体がコロイド金粒子へ吸収される。コロ
イド金粒子自体には、濃い赤色が備わっている。従っ
て、金で標識化された抗体が対応抗原の部位で濃縮され
ると、濃い赤褐色が得られ、その鮮明度は明らかにが結
合した抗体分子の数に依存する。
特異性の評価 コロイド金は金イオンのクラスターからできている。コ
ロイド金は、構造のはっきりした分子ではなく、遊離金
の性質がいくらか備わっている懸濁粒子である。溶液中
では、コロイド金は負の電荷を採り、粒子の表面を形成
する塩化金ヨウ素（ＡｕＩＣｌ２）から生じると考えら
れている。このような負の電荷のために、コロイド金に
は、生理学的ｐＨで正電荷あるいは中性電荷を持つ傾向
がある多くのタンパク質に対する親和性がある。このこ
とによって、抗体がコロイド金粒子へ吸収される。コロ
イド金粒子自体には、濃い赤色が備わっている。従っ
て、金で標識化された抗体が対応抗原の部位で濃縮され
ると、濃い赤褐色が得られ、その鮮明度は明らかにが結
合した抗体分子の数に依存する。
【００５３】コロイド金で標識化された抗体は、ある種
の抗原に対しては市販されている。例えば、薬物乱用に
関与する薬物に対する抗体のコロイド金標識化抗薬剤
は、イギリス、ウェールズ、カーディフにあるブリティ
シュ・バイオセル・インターナショナル（ＢＢＩ）のよ
うな多くの会社から購入することができる。本発明で
は、標識化は、ＢＢＩによって、適正な技術を用いるこ
とで行われた。このことは、それぞれの抗体には標識化
のためのある手段が必要であるため、重要である。しか
しながら、ＢＢＩから購入することのできるコロイド金
の懸濁液を用いて、金を直接標識化することは可能であ
る。
の抗原に対しては市販されている。例えば、薬物乱用に
関与する薬物に対する抗体のコロイド金標識化抗薬剤
は、イギリス、ウェールズ、カーディフにあるブリティ
シュ・バイオセル・インターナショナル（ＢＢＩ）のよ
うな多くの会社から購入することができる。本発明で
は、標識化は、ＢＢＩによって、適正な技術を用いるこ
とで行われた。このことは、それぞれの抗体には標識化
のためのある手段が必要であるため、重要である。しか
しながら、ＢＢＩから購入することのできるコロイド金
の懸濁液を用いて、金を直接標識化することは可能であ
る。
【００５４】ＲＳＡ−リシノプリル結合体あるいはＲＳ
Ａだけのいずれかで被覆されたスティックを、前記のよ
うにして調製した。次に、これらは、金で標識化したウ
サギ抗リシノプリル抗体（０．２あるいは０．１の光学
密度単位／ｍｌの２００μｌ：０．０５％トゥイーン−
２０、０．２％カゼインおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ７．４）含有リン酸緩衝食塩水（０．５ｍｌ）中）
で、ヒト全血（５０μｌ）の存在において、室温で２０
分間インキュベートした。インキュベートした後に、こ
れらのスティックを、取り出し、水道水中で１０秒間洗
い、それによって、潜在的な色（赤）がすぐに発現し
た。これらの結果は図４に示されており、これらは、こ
のシステムについても、きわめて高い結合特異性のある
ことが証明されている。０．２／ｍｌの光学密度がある
金標識化ウサギ抗リシノプリル抗体の溶液が、別の使用
のためにもっとも好ましい。
Ａだけのいずれかで被覆されたスティックを、前記のよ
うにして調製した。次に、これらは、金で標識化したウ
サギ抗リシノプリル抗体（０．２あるいは０．１の光学
密度単位／ｍｌの２００μｌ：０．０５％トゥイーン−
２０、０．２％カゼインおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ７．４）含有リン酸緩衝食塩水（０．５ｍｌ）中）
で、ヒト全血（５０μｌ）の存在において、室温で２０
分間インキュベートした。インキュベートした後に、こ
れらのスティックを、取り出し、水道水中で１０秒間洗
い、それによって、潜在的な色（赤）がすぐに発現し
た。これらの結果は図４に示されており、これらは、こ
のシステムについても、きわめて高い結合特異性のある
ことが証明されている。０．２／ｍｌの光学密度がある
金標識化ウサギ抗リシノプリル抗体の溶液が、別の使用
のためにもっとも好ましい。
【００５５】金標識化抗体の利用によるヒト全血中リシ
ノプリルの検出 ＲＳＡ−リシノプリル結合体で被覆されたスティック
が、金標識化ウサギ抗リシノプリル抗体（０．２透明度
単位／ｍｌの２００μｌ：０．０５％トゥイーン−２
０、０．２％カゼインおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ
７．４）含有リン酸緩衝化食塩水（０．５ｍｌ）中にあ
る）と、０．２０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌの
濃度のリシノプリルをそれぞれ含有するヒトの全血（５
０μｌ）との混合液の中に、前記のように浸した。１５
分間インキュベートした後に、これらのスティックを、
取り出し、水道水の流水中で約１０秒間洗ったところ、
色がすぐに発現した。これらの結果は図５に示されてお
り、これらは、評価したいくつかのリシノプリル濃度の
間に、識別可能な色強度の差のあることがはっきりと示
されている。
ノプリルの検出 ＲＳＡ−リシノプリル結合体で被覆されたスティック
が、金標識化ウサギ抗リシノプリル抗体（０．２透明度
単位／ｍｌの２００μｌ：０．０５％トゥイーン−２
０、０．２％カゼインおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ
７．４）含有リン酸緩衝化食塩水（０．５ｍｌ）中にあ
る）と、０．２０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌの
濃度のリシノプリルをそれぞれ含有するヒトの全血（５
０μｌ）との混合液の中に、前記のように浸した。１５
分間インキュベートした後に、これらのスティックを、
取り出し、水道水の流水中で約１０秒間洗ったところ、
色がすぐに発現した。これらの結果は図５に示されてお
り、これらは、評価したいくつかのリシノプリル濃度の
間に、識別可能な色強度の差のあることがはっきりと示
されている。
【００５６】金標識化抗薬物抗体を利用する、本発明の
実施形態の特性については、追加の論評が必要である。
第１に、標識として酵素の代わりに金を用いると、この
実施形態が通常の温度変動によって実質的に影響されな
くなり、このことは、使用者の観点と共に、再現可能
性、貯蔵性の観点からも格別有利である。第２に、この
実施形態によれば、標識化用酵素のための基質が関係す
る付加的なステップはまったく必要でないので、きわめ
て速い分析（サンプリングから結果獲得まで５〜１５
分）がもたらされる。実際、この実施形態は、特に好ま
しい。
実施形態の特性については、追加の論評が必要である。
第１に、標識として酵素の代わりに金を用いると、この
実施形態が通常の温度変動によって実質的に影響されな
くなり、このことは、使用者の観点と共に、再現可能
性、貯蔵性の観点からも格別有利である。第２に、この
実施形態によれば、標識化用酵素のための基質が関係す
る付加的なステップはまったく必要でないので、きわめ
て速い分析（サンプリングから結果獲得まで５〜１５
分）がもたらされる。実際、この実施形態は、特に好ま
しい。
【００５７】予備実験によれば、ラテックス粒子（例え
ば、アメリカ合衆国のバングス・ラボラトリーズ・イン
コーポレーテッドによるカルボキシ活性化ビーズ）で標
識化された抗薬物抗体を用いると、先に開示された金標
識化抗薬物抗体の生成物とほとんど同じ性質の備わった
生成物が生じる。
ば、アメリカ合衆国のバングス・ラボラトリーズ・イン
コーポレーテッドによるカルボキシ活性化ビーズ）で標
識化された抗薬物抗体を用いると、先に開示された金標
識化抗薬物抗体の生成物とほとんど同じ性質の備わった
生成物が生じる。
【００５８】要約すると、本発明の医療用キットは、次
のようにして実用されるのが普通である。
のようにして実用されるのが普通である。
【００５９】通常はチューブである第２部分へ、約２０
０〜５００μｌの標識化抗薬物抗体の溶液を加え、次
に、通常は血液である約５０〜１００μｌの試験ずみ生
物体液を添加する。１〜３分間インキュベートした後
に、第１部分、すなわち前記のように調製した被覆ステ
ィックを、チューブの内側に置き、５〜１０分間、イン
キュベートする。次に、スティックを取り出し、水道水
の中で１０秒間、すすぎ洗いした後、染色する。この標
識化抗薬物抗体の溶液の濃度は好ましくは、有効治療投
与量よりも低い薬物濃度を含有する試験試料により、か
なり濃く染色されたスティックが生じるか、あるいは、
有効治療投与量の範囲内の薬物濃度を含有する試験試料
により、淡く染色されるかあるいはまったく染色されな
いスティックが生じるように、選ぶべきである。方法全
体は、通常、周囲温度で、血液サンプリングからその結
果を得るまで、６０分未満を要する。従って、本発明の
概念は当業界へかなりの貢献をもたらすとことは明らか
である。
０〜５００μｌの標識化抗薬物抗体の溶液を加え、次
に、通常は血液である約５０〜１００μｌの試験ずみ生
物体液を添加する。１〜３分間インキュベートした後
に、第１部分、すなわち前記のように調製した被覆ステ
ィックを、チューブの内側に置き、５〜１０分間、イン
キュベートする。次に、スティックを取り出し、水道水
の中で１０秒間、すすぎ洗いした後、染色する。この標
識化抗薬物抗体の溶液の濃度は好ましくは、有効治療投
与量よりも低い薬物濃度を含有する試験試料により、か
なり濃く染色されたスティックが生じるか、あるいは、
有効治療投与量の範囲内の薬物濃度を含有する試験試料
により、淡く染色されるかあるいはまったく染色されな
いスティックが生じるように、選ぶべきである。方法全
体は、通常、周囲温度で、血液サンプリングからその結
果を得るまで、６０分未満を要する。従って、本発明の
概念は当業界へかなりの貢献をもたらすとことは明らか
である。
【図１】図１は、２５ｎｇ／ｍｌの濃度で存在するＨＲ
Ｐ標識化抗リシノプリル抗体の標準曲線を示す。検出さ
れたリシノプリル濃度（ｐｇ／ｍｌ）は４５０ｎｍの波
長でモニターした。
Ｐ標識化抗リシノプリル抗体の標準曲線を示す。検出さ
れたリシノプリル濃度（ｐｇ／ｍｌ）は４５０ｎｍの波
長でモニターした。
【００６０】
【図２】図２は、ＲＳＡ−リシノプリル結合体あるいは
ＲＳＡだけのいずれかで被覆されたスティックに対する
ＨＲＰ標識化抗リシノプリル抗体の滴定を示している。
ＲＳＡだけのいずれかで被覆されたスティックに対する
ＨＲＰ標識化抗リシノプリル抗体の滴定を示している。
【００６１】
【図３】図３は、ＲＳＡ−リシノプリル結合体で被覆さ
れた前記第１部分を利用して、ヒト全血中における相異
なる濃度のリシノプリルを検出するとともに識別する、
本発明の医療用キットの性能を示す。ＨＲＰ標識化抗リ
シノプリル抗体は検出のために用いられた。
れた前記第１部分を利用して、ヒト全血中における相異
なる濃度のリシノプリルを検出するとともに識別する、
本発明の医療用キットの性能を示す。ＨＲＰ標識化抗リ
シノプリル抗体は検出のために用いられた。
【００６２】
【図４】図４は、ＲＳＡ−リシノプリル結合体あるいは
ＲＳＡだけのいずれかで被覆されたスティックに対する
金標識化（Ａｕ３＋）ウサギ抗リシノプリル抗体の滴定
を示している。
ＲＳＡだけのいずれかで被覆されたスティックに対する
金標識化（Ａｕ３＋）ウサギ抗リシノプリル抗体の滴定
を示している。
【００６３】
【図５】図５は、ＲＳＡ−リシノプリル結合体で被覆さ
れた前記第１部分と、検出のための金標識化ウサギ抗リ
シノプリル抗体を含有する前記第２部分とを利用して、
ヒト全血中の相異なる濃度のリシノプリルを検出するこ
とを示している。
れた前記第１部分と、検出のための金標識化ウサギ抗リ
シノプリル抗体を含有する前記第２部分とを利用して、
ヒト全血中の相異なる濃度のリシノプリルを検出するこ
とを示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アハメツド・イエハンリ イギリス国、サリー・シー・アール・４・ ４・ビー・エル、ミツチヤム、クレツセン ト・グローブ・１ (72)発明者 アドナン・バドワン ヨルダン国、アンマン、オフ・メツカ・ス トリート、イエベナート・ストリート、ス ライマン・５ (72)発明者 ムハメツド・サリーム ヨルダン国、アンマン、アブダウン、アシ ーシユ・ストリート・４
Claims (21)
- 【請求項１】 生物体液中の薬物を定性的あるいは定量
的に測定するための医療用キットであって、この医療用
キットが、 ｉ）薬物結合体で被覆された第１部分および ｉｉ）標識化した抗薬物抗体を含み、かつ、前記生物体
液を受容するように適合させた第２部分であって、標識
化された前記抗薬物抗体が金材料および／またはラテッ
クス粒子で標識化されている第２部分を備えてなる医療
用キット。 - 【請求項２】 前記薬物結合体が、前記薬物と、タンパ
ク質、ペプチド、ポリアミン、セラミド、アルキル鎖あ
るいは炭水化物との間の結合体である、請求項１に記載
の医療用キット。 - 【請求項３】 前記タンパク質が、ウサギ血清アルブミ
ン、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、ガンマグロ
ブリンおよびサイログロブリンから選ばれる、請求項２
に記載の医療用キット。 - 【請求項４】 前記ラテックス粒子が着色されている、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の医療用キット。 - 【請求項５】 前記金材料がコロイド金である、請求項
１〜４のいずれか１つに記載の医療用キット。 - 【請求項６】 前記薬剤が、コルチコステロイド、単糖
ないしオリゴ糖、ビタミン類、プロビタミンおよびホル
モンを含む、抗高血圧剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真
菌剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤および向精神薬から選ばれ
る、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医療用キッ
ト。 - 【請求項７】 前記薬物が、５０〜６０００ｇ／モルの
範囲、好ましくは、１００〜１０００ｇ／モルの範囲に
あるモル重量を有する、請求項１〜６のいずれか一項に
記載の医療用キット。 - 【請求項８】 前記薬物が、リシノプリル、アムロジピ
ン、カプトプリル、エナラプリル、エナラプリラート、
ケトチフェン、シルデナフィルおよびフルオゼチンから
選ばれる、請求項７に記載の医療用キット。 - 【請求項９】 前記第２部分が、標識化された前記抗薬
物抗体の溶液を収容している、又は少なくとも部分的に
被覆された内部を有しているかのいずれかの容器であ
る、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医療用キッ
ト。 - 【請求項１０】 前記第１部分が、スティック、ストリ
ップ、へら状スティックあるいはプレート状の形状を有
している、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医療用
キット。 - 【請求項１１】 前記第１部分が、ヌンク−イムノ（Ｎ
ｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ（登録商標））スティックの形状
を有する、請求項１０に記載の医療用キット。 - 【請求項１２】 前記第１部分が、最大結合のために化
学処理されたポリスチレン、ポリプロピレン、ニトロセ
ルロースの材料から選ばれた材料からなる表面を有す
る、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の医療用キッ
ト。 - 【請求項１３】 前記材料が、ヌンク−イムノ（Ｎｕｎ
ｃ−Ｉｍｍｕｎｏ（登録商標））スティック表面のため
に用いられた材料である、請求項１２に記載の医療用キ
ット。 - 【請求項１４】 前記容器がチューブ状のものである、
請求項９に記載の医療用キット。 - 【請求項１５】 前記生物体液が、血液、血清又は尿で
ある、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の医療用キ
ット。 - 【請求項１６】 生物体液中の薬物を定性的あるいは定
量的に測定する方法であって、薬物結合体で被覆した第
１部分、すなわち、請求項1〜１３のいずれか一項に定
義された第１部分ｉ）及び標識抗薬物抗体とを利用する
方法。 - 【請求項１７】 前記第１部分が、請求項１〜１４のい
ずれか一項に定義される第２部分ｉｉ）の内側に配置さ
れており、前記第２部分が、前記生物体液を収容してお
り、前記第１部分が、所定時間後に前記第２部分から取
り除かれる、請求項１６に記載の方法。 - 【請求項１８】 前記所定時間が、５〜６０分の範囲に
ある請求項１７に記載の方法。 - 【請求項１９】 前記第１部分が、前記生物体液中の前
記薬物の濃度を表示する潜在的な色の変化を生じさせる
ために、ひき続き染色される、請求項１６〜１８のいず
れか一項に記載の方法。 - 【請求項２０】 前記方法が、全体として周囲温度で実
施される、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方
法。 - 【請求項２１】 前記生物体液が、血液、血清、尿ある
いは唾液である、請求項１６〜２０のいずれか一項に記
載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE0002820A SE0002820L (sv) | 2000-08-04 | 2000-08-04 | Medicinskt kit |
| SE0002820-9 | 2000-08-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002296278A true JP2002296278A (ja) | 2002-10-09 |
| JP2002296278A5 JP2002296278A5 (ja) | 2008-04-03 |
Family
ID=20280626
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001228330A Pending JP2002296278A (ja) | 2000-08-04 | 2001-07-27 | 医療用キット |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20020025538A1 (ja) |
| EP (1) | EP1178316B1 (ja) |
| JP (1) | JP2002296278A (ja) |
| AT (1) | ATE287083T1 (ja) |
| DE (1) | DE60108316T2 (ja) |
| DK (1) | DK1178316T3 (ja) |
| ES (1) | ES2231426T3 (ja) |
| SE (1) | SE0002820L (ja) |
Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO2020045524A1 (ja) * | 2018-08-29 | 2020-03-05 | 富士フイルム株式会社 | クロマトグラフキットおよびクロマトグラフ方法 |
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| WO2005111616A1 (ja) * | 2004-05-14 | 2005-11-24 | Toray Industries, Inc. | 標的物質を迅速簡便に検出する方法およびそのための酵素免疫学的キット |
| GB2404022B (en) | 2004-06-14 | 2005-08-10 | Cozart Bioscience Ltd | Competitive assays for the detection of methamphetamine group drugs |
| GB2404023B (en) * | 2004-07-02 | 2005-07-06 | Cozart Bioscience Ltd | Delta-9-tetrahydrocannabinol detection method |
| CN103389377A (zh) * | 2012-05-08 | 2013-11-13 | 上海大学 | 液相芯片检测水产品中氯霉素的方法 |
| CN103389378A (zh) * | 2012-05-08 | 2013-11-13 | 上海大学 | 检测水产品中氯霉素残留的试剂盒 |
| CN105319353A (zh) * | 2014-07-23 | 2016-02-10 | 江苏维赛科技生物发展有限公司 | 一种检测二氢吡啶类药物残留的酶联免疫试剂盒的制备 |
| CN105353095B (zh) * | 2015-11-16 | 2017-10-20 | 华南农业大学 | 一种西地那非及其结构类似物的免疫检测方法 |
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| EP3724636A4 (en) | 2017-12-15 | 2021-08-18 | Evanostics, LLC | OPTICAL READER FOR ANALYTE TEST |
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| JPS5463796A (en) * | 1977-06-10 | 1979-05-22 | Piasio Roger Norman | Method and device for inbitro clinical testing through solidus analysis system |
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-
2000
- 2000-08-04 SE SE0002820A patent/SE0002820L/ not_active Application Discontinuation
-
2001
- 2001-07-27 JP JP2001228330A patent/JP2002296278A/ja active Pending
- 2001-08-01 US US09/918,637 patent/US20020025538A1/en not_active Abandoned
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- 2001-08-03 DE DE60108316T patent/DE60108316T2/de not_active Expired - Fee Related
- 2001-08-03 AT AT01850136T patent/ATE287083T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-08-03 DK DK01850136T patent/DK1178316T3/da active
- 2001-08-03 EP EP01850136A patent/EP1178316B1/en not_active Expired - Lifetime
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