JPH056664B2 - - Google Patents
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- JPH056664B2 JPH056664B2 JP58244732A JP24473283A JPH056664B2 JP H056664 B2 JPH056664 B2 JP H056664B2 JP 58244732 A JP58244732 A JP 58244732A JP 24473283 A JP24473283 A JP 24473283A JP H056664 B2 JPH056664 B2 JP H056664B2
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規な抗原定量法に関するものであ
る。
る。
近年医療分野においては病気の診断等を行なう
に際し、高度の信頼性をもつて抗原を簡便迅速に
定量することが極めて重量な課題になつてきた。
に際し、高度の信頼性をもつて抗原を簡便迅速に
定量することが極めて重量な課題になつてきた。
従来免疫化学的測定法による抗原の定量法とし
ては、(A)放射化免疫測定法（ラジオイムノアツセ
イ）、(B)酵素免疫測定法、(C)逆受身赤血球凝集反
応法、及び(D)一元放射状免疫拡散法等により行わ
れているが、これらの方法は次の如き欠点を有す
るものであつた。即ち Ａ方法：洗浄操作を必要とし、またラジオアイソ
トープを使用するため特別の設備を必要とする
等莫大な設備費と繁雑な手数を要する。
ては、(A)放射化免疫測定法（ラジオイムノアツセ
イ）、(B)酵素免疫測定法、(C)逆受身赤血球凝集反
応法、及び(D)一元放射状免疫拡散法等により行わ
れているが、これらの方法は次の如き欠点を有す
るものであつた。即ち Ａ方法：洗浄操作を必要とし、またラジオアイソ
トープを使用するため特別の設備を必要とする
等莫大な設備費と繁雑な手数を要する。
Ｂ方法：一般的に洗浄の操作を必要とし且つ判定
まで長前間を要する。
まで長前間を要する。
Ｃ方法：ダイリユーターにて試料を２倍に階段希
釈する操作及びドロツパーにて希釈液等を滴下
する操作を必要とするため繁雑な手数を要す
る。又判定までに長時間を要すると共に抗原量
を２倍階段希釈の終末値で判定するため雑駁な
判定になるおそれがある。
釈する操作及びドロツパーにて希釈液等を滴下
する操作を必要とするため繁雑な手数を要す
る。又判定までに長時間を要すると共に抗原量
を２倍階段希釈の終末値で判定するため雑駁な
判定になるおそれがある。
Ｄ方法：判定までに多大な時間を要すると共に感
度的にも不十分である。
度的にも不十分である。
またリポソームを使用して抗体又は抗原を定量
する方法がある。リポソームは主として脂質より
なる閉鎖小胞であり、リポソームの形状として多
重層リポソーム、小さな１枚膜リポソーム、大き
な１枚膜リポソームに分類される。リポソーム膜
は多くの水溶性物質に対してバリヤー能を有して
いるため、リポソーム内の水相には水溶性物質を
保持することができる。リポソームの研究は
Banghamが主としてイオンの透過性を生体膜レ
ベルで研究するためのモデルとして用いたのには
じまる。その後Kinsky等がリポソームに糖脂質
の抗原（ハプテン）を導入すると抗体及び補体の
存在下でリポソーム内の水層に保持された物質が
膜外に遊離する現象を見い出し、リポソームを抗
脂質抗体の検出系として用いたものである。しか
しKinsky等の方法は抗体を定量するものであり、
抗原を定量するものではない。更にその後リポソ
ームを使用し抗原を定量する方法がいくつか報告
されている。例えばケイイチ・ウエムラ等の方法
（ジヤーナル・オブ・イムノロジカル・メソツド，
J.Immunol.Methods，53，1982，221−232）、フ
ランシス・エツクス・コール，Francis.X.Cole等
の方法（ユナイテツド・ステート・パテント，
United.States.Patent，No4342826）などがあ
る。この方法は試料（抗原）と抗体とを反応さ
せ、次いで抗原を結合させたリポソーム及び補体
を反応させるものであり、このとき試料中に抗原
が存在しないと抗体とリポソームに結合させた抗
原とが抗原抵抗反応をおこし、補体の作用によつ
てリポソームは破壊される。しかし抗原が試料中
に存在すると試料中の抗原が抗体と反応し抗体は
消費されリポソームに結合させた抗原と反応しな
くなり、リポソームは破壊されない。即ち抗原量
とリポソームの破壊量とが反比例することにより
抗原を定量する方法である。
する方法がある。リポソームは主として脂質より
なる閉鎖小胞であり、リポソームの形状として多
重層リポソーム、小さな１枚膜リポソーム、大き
な１枚膜リポソームに分類される。リポソーム膜
は多くの水溶性物質に対してバリヤー能を有して
いるため、リポソーム内の水相には水溶性物質を
保持することができる。リポソームの研究は
Banghamが主としてイオンの透過性を生体膜レ
ベルで研究するためのモデルとして用いたのには
じまる。その後Kinsky等がリポソームに糖脂質
の抗原（ハプテン）を導入すると抗体及び補体の
存在下でリポソーム内の水層に保持された物質が
膜外に遊離する現象を見い出し、リポソームを抗
脂質抗体の検出系として用いたものである。しか
しKinsky等の方法は抗体を定量するものであり、
抗原を定量するものではない。更にその後リポソ
ームを使用し抗原を定量する方法がいくつか報告
されている。例えばケイイチ・ウエムラ等の方法
（ジヤーナル・オブ・イムノロジカル・メソツド，
J.Immunol.Methods，53，1982，221−232）、フ
ランシス・エツクス・コール，Francis.X.Cole等
の方法（ユナイテツド・ステート・パテント，
United.States.Patent，No4342826）などがあ
る。この方法は試料（抗原）と抗体とを反応さ
せ、次いで抗原を結合させたリポソーム及び補体
を反応させるものであり、このとき試料中に抗原
が存在しないと抗体とリポソームに結合させた抗
原とが抗原抵抗反応をおこし、補体の作用によつ
てリポソームは破壊される。しかし抗原が試料中
に存在すると試料中の抗原が抗体と反応し抗体は
消費されリポソームに結合させた抗原と反応しな
くなり、リポソームは破壊されない。即ち抗原量
とリポソームの破壊量とが反比例することにより
抗原を定量する方法である。
然しながらこの方法は抗原を結合させたリポソ
ームを使用するため多量の抗原を必要とし、特に
抗原の入手が困難な抗原を定量する方法としては
工業的に適用し難いものであつた。
ームを使用するため多量の抗原を必要とし、特に
抗原の入手が困難な抗原を定量する方法としては
工業的に適用し難いものであつた。
本発明はかかる現状に鑑み鋭意研究を行つた結
果、感度よくしかも簡便迅速にして抗原を定量す
る方法を開発したものである。即ち、本発明の抗
原定量法は、定量しようとする抗原に対する第１
の抗体を結合させたリポソームに抗原を反応せし
めた後、更に、定量しようとする抗原に対する第
２の抗体及び補体を添加して該リポソームを破壊
せしめ、該リポソーム内に内蔵される物質を遊離
させて該物質を測定する抗原定量方法であつて、
該第１の抗体と該第２の抗体とは各々起源とする
動物種が異なることを特徴とするものである。
果、感度よくしかも簡便迅速にして抗原を定量す
る方法を開発したものである。即ち、本発明の抗
原定量法は、定量しようとする抗原に対する第１
の抗体を結合させたリポソームに抗原を反応せし
めた後、更に、定量しようとする抗原に対する第
２の抗体及び補体を添加して該リポソームを破壊
せしめ、該リポソーム内に内蔵される物質を遊離
させて該物質を測定する抗原定量方法であつて、
該第１の抗体と該第２の抗体とは各々起源とする
動物種が異なることを特徴とするものである。
本発明方法においてリポソームに抗体を結合さ
せる方法としてはレイザーマン（Leserman）等
の方法（ネイチヤー，Nature，288，602−604，
1980）、マルチン（Martin）等の方法（バイオケ
ミストリー，Biochemistry 20，4229−4238，
1981）などがある。
せる方法としてはレイザーマン（Leserman）等
の方法（ネイチヤー，Nature，288，602−604，
1980）、マルチン（Martin）等の方法（バイオケ
ミストリー，Biochemistry 20，4229−4238，
1981）などがある。
即ちホスフアチジルエタノールアミンにSH基
と反応する試薬｛Ｎ−ハイドロキシスクシニル−
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート
（SPDP）｝を共有結合させたものを合成し、リポ
ソームに組み込んでおく。これに抗体をSH化し
たものあるいは抗体間のＳ−Ｓ結合をはずして
SH化したものを結合させる方法である。
と反応する試薬｛Ｎ−ハイドロキシスクシニル−
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート
（SPDP）｝を共有結合させたものを合成し、リポ
ソームに組み込んでおく。これに抗体をSH化し
たものあるいは抗体間のＳ−Ｓ結合をはずして
SH化したものを結合させる方法である。
本発明方法において使用するリポソームとして
は多重層リポソーム、小さな１枚膜リポソーム又
は大きな１枚膜リポソームの何れでもよい。又リ
ポソームの成分としてはシリンダー型に属する脂
質例えばレシチン、スフインゴエミエリン、ホス
フアチジルセリンの内１種又は２種以上を単独又
は主体とし、これに他の脂質例えばコレステロー
ル、ステアリルアミンなどの内１種又は２種以上
を組合せてなるものである。
は多重層リポソーム、小さな１枚膜リポソーム又
は大きな１枚膜リポソームの何れでもよい。又リ
ポソームの成分としてはシリンダー型に属する脂
質例えばレシチン、スフインゴエミエリン、ホス
フアチジルセリンの内１種又は２種以上を単独又
は主体とし、これに他の脂質例えばコレステロー
ル、ステアリルアミンなどの内１種又は２種以上
を組合せてなるものである。
ただし抗体をリポソームと結合させるため例え
ばマルチン等の方法の場合にはＮ−｛３−（２−ピ
リジルチオ）プロピオニルホスフアチジルエタノ
ールアミン｝（PDP−PE）を使用することが必要
である。
ばマルチン等の方法の場合にはＮ−｛３−（２−ピ
リジルチオ）プロピオニルホスフアチジルエタノ
ールアミン｝（PDP−PE）を使用することが必要
である。
又本発明方法において使用する補体は限定され
るものではなく補体活性の高い補体が望ましく、
例えばモルモツト補体等である。
るものではなく補体活性の高い補体が望ましく、
例えばモルモツト補体等である。
又本発明方法において定量できる抗原として
は、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭ、免疫
グロブリンＡ、ミオグロビン、HBs抗原、α−
フエトプロテイン、Ｃ−反応性蛋白、フエリチン
などがあげることができるが、これらの抗原に限
定されるものではなく抗原抗体反応に補体が関与
するすべての種類の抗原を定量することができ
る。
は、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭ、免疫
グロブリンＡ、ミオグロビン、HBs抗原、α−
フエトプロテイン、Ｃ−反応性蛋白、フエリチン
などがあげることができるが、これらの抗原に限
定されるものではなく抗原抗体反応に補体が関与
するすべての種類の抗原を定量することができ
る。
又リポソーム内に内蔵する物質及びその測定方
法としては次の如く知られている。
法としては次の如く知られている。
Ａ スピンラベル試薬
電子スピン共鳴（ESR）で行う方法（ローゼン
クイスト，Rosenquist等、ジヤーメル・オブ・
イムノロジカル・メソツド，J.Immounol.
Methods，15，147，1977） Ｂ グルコース グルコース酸素電極で行う方法（梅沢等：日本化
学会誌、10：1437，1980） Ｃ 酵素 比色法により行う。
クイスト，Rosenquist等、ジヤーメル・オブ・
イムノロジカル・メソツド，J.Immounol.
Methods，15，147，1977） Ｂ グルコース グルコース酸素電極で行う方法（梅沢等：日本化
学会誌、10：1437，1980） Ｃ 酵素 比色法により行う。
Ｄ 蛍光色素
分光蛍光光度計により行う。（上村等：免疫実験
操作法、P2235，日光免疫学会 1978） Ｅ 塩化テトラペンチルアンモニウム 薄層ポテンシオメトリーにより行う。（チバ
Chiba等：アナリテイカルケミストリー，Anal.
Chem52：1610，1980） 本発明方法において使用する内蔵物質及びその
測定方法は上記の内何れでもよく、特に限定され
るものではない。
操作法、P2235，日光免疫学会 1978） Ｅ 塩化テトラペンチルアンモニウム 薄層ポテンシオメトリーにより行う。（チバ
Chiba等：アナリテイカルケミストリー，Anal.
Chem52：1610，1980） 本発明方法において使用する内蔵物質及びその
測定方法は上記の内何れでもよく、特に限定され
るものではない。
次に本発明方法の実施例について説明する。
実施例
フラスコ内に10mMコレステロール（クロロフ
オルムで溶解した）100μl、5mMレシチン（クロ
ロフオルムで溶解した）200μl、100mMジセチル
ホスフエイト（クロロフオルムで溶解した）
50μl、50mMPDP−PE（マルチン等の方法で調製
したもの）100μlとエタノール／mlとを混合し、
ロータリーエバポレータにて溶媒を完全に除去す
ることによつてフラスコ内面に脂質膜を作製し
た。これに酵素パーオキシターゼ溶液（1000単
位／ml）1.0mlを加え、50℃に加温し、その後
30000Xg30分間遠心し、上清をすてた後、沈渣に
生理食塩液を加え再び遠心した。この操作をパー
オキシダーゼ活性が遠心上清になくなるまで行な
い、最後に生理食塩液500μlを加え、リポソーム
懸濁液とした。このリポソーム懸濁液に抗ヒト−
α−フエトプロテインヤギ抗体Ｆ（ab）′2
（200μg）をジチオスレイトール（DTT）によつ
て処理したものと反応せしめ、リポソームに抗体
を結合させた。その後30000Xg、30分間遠心し、
上清をすて、抗体結合リポソーム沈渣を生理食塩
液で懸濁し、再び30000Xg、30分間遠心し、上清
をすてた。この操作を更に２回繰り返し生理食塩
液にて抗体結合リポソーム懸濁液（20％Ｖ／Ｖ）
とした。なおこれらの操作はすべて窒素ガスの存
在下で行つた。
オルムで溶解した）100μl、5mMレシチン（クロ
ロフオルムで溶解した）200μl、100mMジセチル
ホスフエイト（クロロフオルムで溶解した）
50μl、50mMPDP−PE（マルチン等の方法で調製
したもの）100μlとエタノール／mlとを混合し、
ロータリーエバポレータにて溶媒を完全に除去す
ることによつてフラスコ内面に脂質膜を作製し
た。これに酵素パーオキシターゼ溶液（1000単
位／ml）1.0mlを加え、50℃に加温し、その後
30000Xg30分間遠心し、上清をすてた後、沈渣に
生理食塩液を加え再び遠心した。この操作をパー
オキシダーゼ活性が遠心上清になくなるまで行な
い、最後に生理食塩液500μlを加え、リポソーム
懸濁液とした。このリポソーム懸濁液に抗ヒト−
α−フエトプロテインヤギ抗体Ｆ（ab）′2
（200μg）をジチオスレイトール（DTT）によつ
て処理したものと反応せしめ、リポソームに抗体
を結合させた。その後30000Xg、30分間遠心し、
上清をすて、抗体結合リポソーム沈渣を生理食塩
液で懸濁し、再び30000Xg、30分間遠心し、上清
をすてた。この操作を更に２回繰り返し生理食塩
液にて抗体結合リポソーム懸濁液（20％Ｖ／Ｖ）
とした。なおこれらの操作はすべて窒素ガスの存
在下で行つた。
抗体結合リポソーム懸濁液25μlに種々の濃度即
ち50ng／ml、100ng／ml、200ng／ml、300ng／
ml、400ng／mlのヒト−α−フエトプロテイン溶
液25μlを添加し、更に抗ヒト−α−フエトプロテ
インウサギ抗体（200μgml）25μlとベロナール緩
衝液に30倍希釈したモルモツト補体1.0mlを加え
37℃、15分間反応さした。その後発色試薬（４−
アミノアンチピリン−フエノール−H2O2系）（P.
Trinder，Ann，Clin，Biochem，６，24 1969）
1.0mlを添加し、37℃５分間反応した後、吸光度
（500nm）を測定し、リポソーム内に内蔵せる物
質（パーオキシターゼ）の遊離割合（％）を求め
た。その結果は図面に示す通りである。
ち50ng／ml、100ng／ml、200ng／ml、300ng／
ml、400ng／mlのヒト−α−フエトプロテイン溶
液25μlを添加し、更に抗ヒト−α−フエトプロテ
インウサギ抗体（200μgml）25μlとベロナール緩
衝液に30倍希釈したモルモツト補体1.0mlを加え
37℃、15分間反応さした。その後発色試薬（４−
アミノアンチピリン−フエノール−H2O2系）（P.
Trinder，Ann，Clin，Biochem，６，24 1969）
1.0mlを添加し、37℃５分間反応した後、吸光度
（500nm）を測定し、リポソーム内に内蔵せる物
質（パーオキシターゼ）の遊離割合（％）を求め
た。その結果は図面に示す通りである。
ただし抗体結果リポソーム懸濁液25μlにベロナ
ール懸濁液25μlを加え、更に抗ヒト−α−フエト
プロテインウサギ抗体25μlとベロナール緩衝液に
て30倍希釈したモルモツト補体1.0mlに加え、ト
リトンＸ−100（Rohm and HaSS）にて抗体結
合リポソームを完全に破壊させた後、発色試薬
1.0mlを添加し37℃、５分間反応後、吸光度
（500nm）を測定し、この吸光度をリポソーム内
に内蔵せる物質（パーオキシターゼ）の遊離割合
100％とした。
ール懸濁液25μlを加え、更に抗ヒト−α−フエト
プロテインウサギ抗体25μlとベロナール緩衝液に
て30倍希釈したモルモツト補体1.0mlに加え、ト
リトンＸ−100（Rohm and HaSS）にて抗体結
合リポソームを完全に破壊させた後、発色試薬
1.0mlを添加し37℃、５分間反応後、吸光度
（500nm）を測定し、この吸光度をリポソーム内
に内蔵せる物質（パーオキシターゼ）の遊離割合
100％とした。
図面に示す如く抗ヒト−α−フエトプロテイン
の濃度と遊離割合（％）との比例関係によつてヒ
ト−α−フエトプロテインを定量することができ
た。
の濃度と遊離割合（％）との比例関係によつてヒ
ト−α−フエトプロテインを定量することができ
た。
以上詳述した如く本発明方法によれば洗浄、或
は固液分離などの煩雑な操作を全く必要とするこ
となく、簡単迅速に抗原を定量することが出来る
等顕著な効果を有する。
は固液分離などの煩雑な操作を全く必要とするこ
となく、簡単迅速に抗原を定量することが出来る
等顕著な効果を有する。
図面は本発明抗原定量法の１例におけるヒト−
α−フエトプロテインの濃度とポーオキシターゼ
の遊離割合との関係を示す曲線図である。
α−フエトプロテインの濃度とポーオキシターゼ
の遊離割合との関係を示す曲線図である。
Claims (1)
- １ 定量しようとする抗原に対する第１の抗体を
結合させたリポソームに抗原を反応せしめた後、
更に、定量しようとする抗原に対する第２の抗体
及び補体を添加して該リポソームを破壊せしめ、
該リポソーム内に内蔵される物質を遊離させて該
物質を測定する抗原定量方法であつて、該第１の
抗体と該第２の抗体とは各々起源とする動物種が
異なることを特徴とする新規な抗原定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24473283A JPS60138465A (ja) | 1983-12-27 | 1983-12-27 | 新規な抗原定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24473283A JPS60138465A (ja) | 1983-12-27 | 1983-12-27 | 新規な抗原定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60138465A JPS60138465A (ja) | 1985-07-23 |
| JPH056664B2 true JPH056664B2 (ja) | 1993-01-27 |
Family
ID=17123065
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24473283A Granted JPS60138465A (ja) | 1983-12-27 | 1983-12-27 | 新規な抗原定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60138465A (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0799373B2 (ja) * | 1984-12-13 | 1995-10-25 | 日水製薬株式会社 | 抗原の定量法 |
| JPH079428B2 (ja) * | 1985-04-30 | 1995-02-01 | 株式会社東芝 | 免疫分析方法 |
| JPH0799374B2 (ja) * | 1987-02-06 | 1995-10-25 | 株式会社日立製作所 | 免疫分析用試薬およびこれを用いる免疫分析方法 |
| JPS63246670A (ja) * | 1987-04-02 | 1988-10-13 | Toshiba Corp | 免疫分析用試薬 |
| US5173406A (en) * | 1987-05-06 | 1992-12-22 | Teijin Limited | Liposome immunoassay method and kit therefor |
| EP0301333A3 (en) * | 1987-07-29 | 1992-07-01 | Abbott Laboratories | Liposome based homogeneous immunoassay for diagnostic tests |
| JPH01230621A (ja) * | 1988-03-10 | 1989-09-14 | Toyo Ink Mfg Co Ltd | 活性エネルギー線硬化性樹脂，その樹脂を含む硬化性被覆組成物および印刷インキ組成物 |
| JP2505853B2 (ja) * | 1988-03-10 | 1996-06-12 | 株式会社日立製作所 | 免疫分析用試薬及びそれを用いた免疫分析方法 |
| US5256532A (en) * | 1988-05-02 | 1993-10-26 | Zynaxis Technologies, Inc. | Methods, reagents and test kits for determination of subpopulations of biological entities |
| CH680275A5 (ja) * | 1990-03-05 | 1992-07-31 | Tet Techno Investment Trust |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56132564A (en) * | 1980-02-04 | 1981-10-16 | Koraboreiteibu Research Inc | Product for and method of immunity analysis |
-
1983
- 1983-12-27 JP JP24473283A patent/JPS60138465A/ja active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56132564A (en) * | 1980-02-04 | 1981-10-16 | Koraboreiteibu Research Inc | Product for and method of immunity analysis |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60138465A (ja) | 1985-07-23 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |