JPH04501760A - 流体中の反応性リガンドを定性的ないし定量的に迅速測定する装置及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 流体中の反応性リガンドを定性的ないし定量的に迅速測定する装置及び方法 本発明は流体中に存在する反応性リガンド（ｒｅａｃＨ，ｖｅｌ　ｉｇａｎｄ） を定性的ないし定量的に迅速測定する装置および方法に関する。本発明は特に、 しかし限定としてではなく、生物流体（ｂｔｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｌｕｉｄ）中 の抗体もしくは抗原の存在の検出、あらゆる種類の流体（水。

農−食品産業の流体産物、産業廃水、生物流体等）中の毒性物質、ウィルスない し細菌の検出、及び、流体（生物流体等）中に存在する物質（ホルモン、ビタミ ン、酵素、薬物等）の化学的検定（ｃｈｅ＋＋＋１ｃａｌ　ａｓｓａｙ）に関す る。

生物流体中の抗原物質の存在もしくは濃度を測定する免疫学的方法はすでによく 知られている。それらの方法は、測定されるべき抗原物質と、一つもしくは複数 の抗体の間での複合体の形成を利用するものである。

複合体の構成要素の一つを放射性元素（例えばＩｔｓＩ）で標識し、複合体を形 成した標識抗原もしくは抗体を複合体を形成しなかった標識抗原もしくは抗体か ら分離した後で、抗原物質の検出および／または定量分析を行なうことができる 。

免疫学的競合測定法（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏ ｎｂｙ　ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ　）は、限定された数の抗体結合部位に対して 、被分析流体試料に含まれる抗原物質と既知の量の標識抗原とを競合させるもの である。抗体と結合した標識抗原の量は、試料に含まれる抗原の量に逆比例する 。

免疫測定試験（ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ　ｔｅｓｔｓ）においては、標識抗体 が使用される。複合体に関係した標識抗体の量は試料に含まれる抗原＠ｆｆ質の 量に正比例する。

同時に二つ以上の抗体と結合して複合体を形成することのできる抗原物質である 多価抗原の検出に特に適した免疫測定試験においては、被分析流体に不溶性であ る固相の支持体と結合した非標識抗体と、放射性同位元素等の指示物を含む可溶 性の抗体とが使用される。

この場合には、固相にある非標識抗体と、抗原と、標識抗体とから三元複合体が 形成され、それが検出もしくは定量測定される。それらの方法においては、まず 、被分析試料が固相左結合した抗体と接触させられることにより、試料中の抗原 と固相にある抗体とから二元複合体が形成され、試料から抗原が抽出される。一 定時間のインキュベーションの後で固相を洗い、反応しなかった抗原を含む残留 流体試料を除去し、さらに、既知の量の標識抗体を含む溶液と接触させる。二回 目のインキュベーションによって、標識抗体は、固相の支持体に非標識抗体を介 して結合する抗原と結合し、三元複合体が形成される。さらに、固相の二回目の 洗浄を行い反応しなかった標識抗体を除き、その後、固相とで標識抗体の存在を 検出しく例えば指示物とじて放射性元素が使用された場合には放射線を測定する ）、さらに、適宜、標識抗体の定量測定をも実施する。

上記の方法は、抗原がその表面の異なる二つの部位で二つの抗体に結合するとこ ろから、サンドインチ法または二部位（ｂｉ−ｓｉｔｅ　）法として知られてい る。それらの方法は、ワイド（ＷＩＤＥ）の”放射免疫検定法（Ｒａｄｉｏｉｍ ｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ）″［カークハム（Ｋｉｒｋｈａｍ）とハ ング（Ｈｕｎｔｅｒ）　＋発行Ｅ、アンドＳ、リビングストン、ニシンバラ、１ ９７０．ｐ、１９９−２０６１に記載されている。それらの具体的な適用例（肝 炎ウィルスの結合抗原の検出試験）が米国特許第３８６７５１７号に記載されて おり、また、それらの変形法［“同時的（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）″もしく は“逆（ｉｎｖｅｒｓｅ）”変形法］がジェオング（Ｊｅｏｎｇ　）らのＲＩＡ と、ヒト甲状腺刺激ホルモン（ＨＴＳＨ）の測定に適用された単回インキュベー ション二部位免疫ラジオメトリック検定法（ｓｉｎｇｌｅ−ｉｎｃｕｂａｔｔｏ ｎ　ｔｗｏ−ｓｉｔｅ　ｉｍｍｕｎｏｒａｄｉ。

ｍｅｔｒｉｃ　ａｓｓａｙ）　（ＲＩ　ＭＡ）との比較”　［バイオ−ラドラボ ラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　、１９７９コに記 載され、さらに、米国特許第４１７４３８４号［螢光発色基（フルオレセイン） を有する抗体と、フルオレセインから発せられた光を吸収する発色基を有する抗 体の二つの抗体を標識する］と、米国特許第４０９８８７６号に記載されている 。それらの方法においては当初はポリクローナル抗体が使用されていたが、この 抗体は他の抗原との間で交差反応（ｃｒｏｓｓｒｅａｃＨｏｎ）を示すところか ら感度において充分とは言えなかった。ハイブリチック（ＨＹＢＲＩＴＥＣ）ｌ 　）に付与されらフランス特許第８１１５０３０号（公開番号第２４８７９８３ 号）には、それらの免疫測定試験において、ポリクローナル抗体の代わりにモノ クローナル抗体を使用することにより、測定の感度を実質的に改善することが提 案されている。

リオッタ（ＬＩＯＴＴＡ）に付与されたフランス特許第８２１６９７３号（公開 番号第２５１４５１１号）には、エリザ（ＥＬＩＳＡ）法で必要な希釈および洗 浄の操作を不要にしまたインキュベーションの時間を短縮した、生物流体中の抗 原の存在を測定する装置および方法（エリザ法）が記載されている。提案された 装置には、ポリアクリルアミド、アガロース、コラーゲン等の多孔性のゲルの中 に置かれたニトロセルロースもしくはジアゾベンジルオキシメチル（ＤＢＭ）の 紙片よりなるマトリックス、または、セルロースもしくはプラスチックの繊維片 よりなるマトリックスが使用される。前者の場合には、抗原を、ゲルの孔の中に 捕捉するかまたはりガントのアミン基とマトリックスのカルボキシル基とによっ てゲルと架橋結合させることができる。後者の場合には、その繊維片の内部にリ ガンドを含む粒子（ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　）もしくはビーズ（ｂｅａｄｓ　）が 捕捉される。リオッタの特許による装置には第一ゾーンと第二ゾーンとが含まれ る。第一ゾーンは抗原と、酵素に結合させられた抗体とを担持し、その抗体はそ れが被試験試料に含まれる（非結合の）抗原と反応した場合には第一ゾーンを通 過してそこから除去されるように、他方、抗原が存在しない場合にはそのような 除去がなされないように、その第一ゾーン内に保持される。また、第二ゾーンは 酵素に結合させられた抗体と反応し得る物質を担持し、それによりその抗体の存 在を明らかにする発色反応が生じさせられる。さらに詳述すれば、リオッタの特 許に記載された免疫検定装置には、三層の多孔性マトリックスよりなる層構造体 が使用される。第一層には酵素と結合させられた特定の抗体が植え込まれ、第二 多孔層は固定された（結合させられた）基準抗原を担持し、第三層は抗体と結合 させられた酵素と反応する発色基質を含む、被分析試料中に存在する被検定遊離 抗原が第一層と接触させられると、それは第二層へその後第三層へと拡散する。

試料中に存在する遊離抗原は、酵素結合抗体との結合反応において、第二層に固 定された結合基準抗原と競合する。酵素結合抗体が遊離抗原と結合すれば、それ は自由に第三層へ拡散し、発色反応が生じさせられる。

他方、被分析試料に抗原が含まれていなければ、すべての酵素結合抗体がいまだ 結合していない結合部位を有し従って第二層に存在する固定抗原と結合する。第 二層の固定抗原と結合した酵素結合抗体は第三層に拡散できず、発色反応は生じ ない。リオッタに付与されたフランス特許第８７０８００７号（公開番号第２５ ９９８４５号）には、二層のみを含む上記装置の変形例が記載されている。その 上層は抗原と二種類の反応性抗体とを担持し、下層には発色基質が含まれる。そ の二つのゾーン、つまり、捕捉ゾーンと基質ゾーンとは並置されることも可能で ある。酵素結合抗体と結合した試料中の抗原が拡散する多孔性層は、このように 、酵素によって標識された抗体と結合した抗原のみを通過させる選択フィルタと して作用し、試料中に抗原が存在しないために抗体が抗原と結合しない場合には そのような機能を示さない。

ハイブリチックに付与された米国特許第４６３２９０１号（およびそれに対応す るＰＣＴ国際出願第８５１０５４５１号）には、長時間のインキュベーションや それに関係した洗浄操作が不要で、その簡易性によって医師が手術中に使用でき 、さらには患者が自宅で使用することもできる免疫検定実施方法および装置が記 載されている。この装置には第一多孔性要素と第二吸収性要素とが含まれる。前 者は、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体が結合させられた膜もし くはフィルタによって構成され、その抗体が同定されるべき抗原を識別する。後 者は、その上面および下面に垂直な毛細管通路を有し、本装置の前記第一要素を 構成する多孔性膜等と毛細管連通状態にある。第一要素の孔のサイズは、他の手 段を使用しないでもその中を液体が通過するように誘導することができる程度と されている。多孔性のフィルタ膜はＮＨ，ｉを有するナイロンにより構成するこ とができ、抗体はそのＮＨｚ基にグルタルアルデヒドの存在下でカップリングに より共有結合させられる。また、吸収性要素は、セルロースアセテート、ポリエ テル、ポリオレフィン等の繊維などの繊維性フィルタ材料により構成することが できる。これら二つの要素は、抗体と非特異的には結合せず、標識抗体を吸収性 要素の上面に非特異的には結合させない別の多孔性要素（例えばポリエチレンに より構成される）によって互いに分離させることができる。

同様に、アボットラボラトリーズ（ＡＢＢＯＴＴ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ　 ）のヨーロッパ特許出願第１８６１００号には、被試験試料中の物質の存在もし くは量を測定する装置が記載されている。この装置には、疏水性のポリマが、植 え込まれたガラス等の非吸収性多孔繊維性マトリックスが使用され、その疏水性 のポリマがマトリックスの少なくとも一部を被覆しそれに対して試料中の被同定 物質と反応し得る抗体もしくは抗原等の試薬が結合させられる。この装置は、吸 収性材料よりなる基底層および／または、前記繊維性マトリックスを被覆して“ 前フィルタ”として作用し得るグラスファイバもしくはセルロースフィルタ紙等 の繊維性材料の層と関係させることができる。

また、ミュレックスコーポレーション（ＭＵＲＥＸＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ　） 　（７）　ヨー　ｏ　７　ハ特許出願第２０６５６１号には、少なくとも一つの 反応ゾーンとそれに関係させられた少なくとも一つの周辺ゾーンとを有するフィ ルタ要素と、その第一要素の周辺ゾーンにのみ関係させられた吸収性ゾーンと、 そのフィルタを適当な位置に保持する要素とを含む診断装置が開示されている。

その反応ゾーンで生じる”反応”もまた等しく、免疫的カップリングとしての濾 過による分離であり得、その反応を読み取るための信号がそのゾーン内に現れる 。

試験用液体試料は漏斗通過後フィルタに到達するが、その漏斗の出口オリフィス の径は、漏斗における液体の圧力との関係において、液体がフィルタの上面に落 下するには充分であるがそれを通過してしまうことがないように計算される。さ らに、流体静力学的圧力が調節されて、その液体が重力下でフィルタに浸透し、 フィルタをそのまま垂直的に通過してしまうことなく、毛細管作用によってその 中を拡散するようにされている。

上記の全ての装置に共通する特徴は、試験用液体試料が流通する多孔性フィルタ 要素が使用されることと、その液体流速を低下させる手段が適宜設けられること とである。しかしながら、この型のフィルタ要素では、それと結合させられた試 薬と液体試料中の被同定物質との間で充分な接触時間を確保することができず、 そのために、試料に含まれる極めて低濃度の物質をも測定できるような怒度を示 す反応を得ることができない。

さらに、抗原−抗体複合体等のりガント−受容体複合体が適宜含まれた液体試料 がフィルタ要素を流通することから読み取り誤差が生じ易くなる。

従って本発明の目的は、流体中の反応性リガンドを定性的ないし定量的に迅速測 定する装置および方法であって、従来の技術において同一の目的のために提案さ れた装置および方法よりも一層実際的なニーズをみたす装置および方法を提供す ることである。本発明の装置においては、生物流体等の流体中に存在する抗原等 の非常に低濃度のリガンドを検出できることから、その怒度は従来の装置に比較 して極めて高い。本発明による検出可能な濃度は例えば５ピコグラム程度の低さ であるのに対し、従来の方法ではそれほど低い濃度を検出することができず、精 々数マイクログラム（μｇ）に止まる。また、本発明によれば被検出物質と試薬 の間での２つの反応が各々別の完全に独立した場所で行なわれ、それらの反応が 極めて特異的な反応であることから、交差反応の生じる危険性も完全に回避され 、競合法を用いないでも間違った陰性もしくは陽性結果を示すことがない。さら に、複数の型のモノクローナル抗体を同時に使用することができ、また、その結 果を読み取る方法としては、比色法、螢光分析法。

化学発光法、放射能測定法等のあらゆる方法を適用することができる。加えて、 定量的検定を行なうこともできる。

本発明は、流体中の反応性リガンドを定性的ないし定量的に迅速測定する装置で あって、同定されるべき前記リガンドと反応する標識された抗体もしくは抗原等 の標識された試薬を担持する（ｃｏｎｔａｉｎ　）反応ゾーンと、発現（ｄｅｖ ｅｌｏｐｅｍｅｎｔ）ゾーンとを含む装置であって、 少なくとも一時的に不透過性である膜を含み、前記流体の被検査試料を受け入れ るようにされ、がっ、前記試料中に存在するかも知れない前記被同定リガンドを 識別し得る少なくとも１つの適当に標識された試薬（ｒｅａｇｅｎｔ　）と前記 膜を透過性とする手段とに関係させられる第一反応ゾーンと、 その第一反応ゾーンから独立であって前記膜によって少なくとも一時的にその第 一ゾーンから隔離され、前記被同定リガンドを識別し得る非標識基準試薬を担持 する固相を含み、かっ、少なくとも一時的に不透過性である第二膜によって前記 第−膜と反対の側で少なくとも一時的に閉鎖される第二反応ゾーンと、前記第二 膜によって少なくとも一時的に前記第二反応ゾーンから隔離さるとともに、前記 第一もしくは第二反応ゾーンで生じたかも知れない反応を発現させる手段を有す る第三反応ゾーンと を含み、かつ、前記膜の少なくとも一方が、前記各反応ゾーンにおいて前記反応 が生じるのに充分な第一時間不透過性である材料によって構成され、その材料が その第一時間の経過後透過性とさせられることによって前記反応の結果として生 じる反応生成物が次の反応ゾーンに到達し、前記各層の一方もしくは両方を透過 性とする手段がその一方もしくは両方の膜を溶解させる物質（ｓｕｂｓ　ｔａｎ ｃｅ）かもしくは分解させる物質（ａｇｅｎｔ）であることを特徴とする測定装 置に関する。

本発明の装置のある実施例においては、前記各層の一方もしくは両方を透過性と する手段が、その膜から独立している。

本発明の装置の他の有利な実施例においては、前記各層の一方もしくは両方を透 過性とする手段が、その膜に内包されている。

本発明の有利な構成例においては、前記一方もしくは両方の膜を製造するために 使用される少なくとも一時的に不透過性である材料が、炭水化物、蛋白質、ゼラ チン、脂質、プラスチックスを含む群の中から選択され、特に、ゼラチン、脂質 、プラスチックスの中から選択される。

本発明の装置の他の有利な実施例においては、前記第一反応ゾーンが、もし適当 であれば前記各層を分解する前記分解物質との関係において、望ましくは前記第 −膜により支持されて、前記すくなくとも１つの適当な標識試薬を担持する固相 を収容するに通したものである。

本発明によれば、好ましくは、標識試薬としては、特に酵素、放射性同位元素、 螢光もしくは化学発光発色性物質によって標識されたものが有利に使用され、ま た、抗体もしくは抗原がそのような標識試薬として有利に使用される。

また、本発明によれば、好ましくは、少なくとも前記第−膜を構成する材料が、 その第−膜が適当な時間の後に前記被検査用試料の水性液相によって溶解される ものである。

本発明によれば、好ましくは、前記膜を透過性とする物質がその膜を分解する適 当な酵素等の作用物質からなり、その物質が当該膜の中に内包させられるか、本 装置に導入されることによってその膜と関係させられるものであるか、あるいは 前記試薬を含む固相に関係させられるものである。

本発明の装置の他の有利な実施例においては、前記第二反応ゾーンに存在する前 記非標識基準試薬を担持する前記固相が１、前記被同定リガンドに対応する非標 識基準試薬（特に抗体もしくは抗原等）が結合させられた不溶性の支持体から成 り、当該不溶性の支持体が、マイクロスフェア、マイクロプレートを含む群から 選択される。

本発明の装置の他の有利な実施例においては、前記反応が比色法によって測定さ れる場合に、前記第三反応ゾーンが発色基質（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ　５ｕｂ ｓｔｒａｔｅ　）を含む。

本発明の装置の他の有利な実施例においては、前記第一反応ゾーンと第二反応ゾ ーンとの間にＭ識された試薬を含む中間ゾーンを有し、その場合に、前記第一反 応ゾーンが非標識試薬を含む。

上記実施例の有利な態様においては、前記中間ゾーンが、酵素等の適当な分解物 質により適当な時間の後に放出され得る少なくとも１つの試薬を内包する少なく とも一重の多層小胞状構造体を含む。

上記実施例の他の有利な態様においては、前記中間ゾーンが、前記第−膜と前記 第二反応ゾーンとの間に設けられた中間膜にて構成され、その中間膜が好適には 前記標識試薬と関係させられ、その場合に、前記第−膜が前記中間膜と同一種類 の試薬と関係させられる。

本発明の装置の３つの反応ゾーンを有する実施例においては、生物流体中の抗原 もしくは抗体など、流体中の反応性リガンドの存在もしくは不存在の定性的な測 定を行なうことができる。さらにもう一つの反応ゾーンを有する実施例において は、そのようなリガンドの半定量的検定を行なうことができる。

本発明によれば、前記第三反応ゾーンが、ＲＩＡ。

分光光度計等の既存の定量装置に関係させられることによって、定量的検定を行 なうことができる。

本発明の装置の他の有利な実施例においては、前記各反応ゾーンを重ねることに より、前記第一反応ゾーンを含む上段と、前記第二反応ゾーンを含む中段と、前 記第三反応ゾーンを含む下段とが形成され、適当であればその上段と中段との間 に前記中間反応ゾーンを含む中間段が形成される。

本発明はまた、流体中の反応性リガンドを定性的ないし定量的に迅速測定する方 法であって、その第一工程において、前記流体の分析用試料が、本工程に続く各 工程が行われる各ゾーンから一時的に隔離されたゾーンにおいて、標識された抗 体もしくは抗原等の標識された試薬と、リガンド−試薬反応が生ずるに充分な時 間接触させられ、その後、その反応が生じた前記ゾーンの前記隔離が破壊される ことにより、第二工程において、後続ゾーンから一時的に隔離された第二ゾーン において、前記反応の結果として生じるいかなる反応生成物も、同定されるべき 前記リガンドに対応する非標識第二試薬との接触を許容され、その後、その第二 ゾーンの前記隔離が破壊されることにより、第三工程において、前記第一もしく は第二反応の生成物が、前記被検出リガンドの存在もしくは不存在を明らかにす る手段と接触させられることを特徴とする測定方法に関する。

本発明の方法を実施するある実施例においては、前記流体試料が、前記第一工程 において、非標識試薬と接触させられ、前記第二工程に先行して中間工程が行な われ、その中間工程において、第一工程において形成されたりガント−非標識試 薬複合体が、次の工程から一時的に隔離されたゾーンにおいて、第一工程におい て使用された試薬と同一種類であって標識された試薬と接触させられる。

本発明の方法を実施する上記実施例の有利な態様においては、前記第一工程にお いて前記分析用流体試料と接触させられる前記非標識試薬が、被検出リガンド等 の既知の量のりガントに対応する所定量にて使用され、その第一工程において前 記試薬と結合しない過剰のりガントが、前記中間工程において、前記標識試薬と 結合することによってそれに捕捉され、その結果、前記分析用流体試料中におけ る前記リガンドの存在の可能性を明らかにする反応がその試料中のりガントの量 が前記所定量を上回る場合にのみ陽性を示し、それにより前記流体中に存在する りガントが半定量的に測、定される。

本発明の方法を実施する他の有利な実施例においては、前記第一工程が吸収損で あり、前記第二工程が放出相であり、前記第三工程が吸収損である。

本発明の方法が前記第一工程と前記第二工程との間に前記中間工程を含む場合に おいて、当該中間工程が前記第一工程と同様に吸収損である。

上記の諸態様に加えて、本発明は、以下の記載から明らかとなるその他の態様を も含むものである。

本発明は以下の記載によってより明確に理解されるであろう。その記載中以下の 図面が参照される。

第１図は、本発明の装置のある実施例の継断面概略図である。

第２図は、抗原の存在を定性的に測定する方法の各工程を示す略図である。

第３図は、抗体の存在を定性的に測定する方法の各工程を示す略図である。

第４図は、ヒトの血清中に存在するＡＣＥの定量的検定のためのグラフである。

但し、それらの図面及びそれに対応する記載とは本発明の内容を詳しく説明する ためのものであって、何らの限定も意図しないことが明確に理解されるべきであ る。

第１図に示されている本発明の装置は、下から順に、支持部材７と、その支持部 材７に支持された発色基質としてのベレット６と、そのペレット６の上に設けら れた第一の膜３°を含む。第一の膜３°については後に詳述する。第一の膜３° の上にはマイクロスフェア層５が設けられている。この層５についても後に詳述 するが、マイクロスフェア層５の両面は好ましくは、従って必ずそうでなければ ならないということではなく、織物等の適当な材料からなる保護層によって保護 される。マイクロスフェア層５の上には第二の膜３が設けられる。本装置の枠組 みは構造部材２と支持部材７と中間枠部材８とによって構成される。構造部材２ の杯状凹部９には、本装置によって検出されるべきりガントを識別する試薬のベ レット１が挿入される。ベレット１は好ましくは凍結乾燥されたものが使用され る。

本装置によって検出されるリガンドは、あらゆる種類の化学物質および生物物質 であり、特に抗原および抗体である。本発明の方法および装置の適用範囲は極め て広い、その中から具体例を挙げれば、ウィルス性および微生物性愁訴の診断、 酵素検定、自己免疫疾患およびアルツハイマ病の診断、癌の早期発見、迅速な血 液型判定、血液中の薬物の検定、アレルゲンの検出およびアレルギーの診断、膜 受容体の検定、ホルモンの検定、エレクトロフェロダラムにおける陰イオン。

陽イオン等の化学成分の検定等である。勿論これらは例示にすぎず、網羅的なも のでも限定的なものでもない。

被検出リガンドを識別する試薬としては特に抗体もしくは抗原があり、これらは 好ましくは凍結乾燥され、ペレット１の形態で使用される。

ペレット１に内包（（ｏｎｔａｔｎ　）される抗体もしくは抗原は、放射性同位 元素、酵素、螢光物質、適当な物質との間で発色反応を呈する化学物質等の適当 な標識で標識された抗体ないしは抗原である。

本装置の上段を構成する第二の膜３は、一時的に不透過性である材料から作られ る。第二の膜３が不透過である時間は、検査される流体試料の一滴がペレット１ と接触し、その流体が被検出リガンドを含んでいた場合にはそれと反応してリガ ンド−標識抗体ないしは標識抗原複合体を形成するに充分な時間である。第二の 膜３はその時間の経過後に不透過性を失い、流体はそれが前記複合体を含むか否 かに関わらずその膜３を通過して装置の中段に達する。

第二の膜３の材料としては好ましくは、通常の状態では不透過性であるが、適当 な酵素によって２０秒〜１分以内で分解させられるものが使用される。第二の膜 ３がゼラチンからなる場合には、それを分解させる酵素としてコラゲナーゼの使 用が適している。この場合に、ゼラチンを分解する酵素は抗体もしくは抗原のペ レット１に内包させるのが好ましい。というのは、リガンドと、ペレッｌ−１に 内包された試薬（抗体もしくは抗原）との反応に要する時間が、この分解酵素が 第二の膜３を分解させるのに必要な時間と同じオーダだからである。また、好ま しくは、ゼラチンの膜３の中にグラスファイバの構造体をを埋め込みその強度を 改善する。その場合には、ゼミ７チンの分解後もそのグラスファイバ構造体が第 二の膜３の骨格として残る。

他にも本発明の枠内において使用される膜の例が以下の記載中に開示される。

本発明装置の中段に含まれるマイクロスフェア層５は、金属もしくは合金、ポリ アクリルアミド等の適当な材料によって構成され、その径は例えば１０〜２５０ μｍの範囲とされる。そのマイクロスフェアは被検出リガンドと同一もしくは類 似の試薬（抗原もしくは抗体）を担持（ｃａｒｒｙ　）する。マイクロスフェア 層５を設ける目的は、上段において遊離のまま残された標識試薬をこれで捕捉す ることである。

上記の条件下で、生物流体の一滴を用いてその中の抗原について検査する場合に おいて、陽性反応が示される場合の一連の現象は以下の通りである。流体中に存 在する抗原が、第二の膜３上においてペレット１に内包された抗体と結合し、第 二の膜３はその結合反応が起きると直ちに適当な酵素によって分解させられる。

次いで、抗原−抗体複合体を含む流体が、マイクロスフェアＮ５をそれで捕捉さ れることなく通過し、第一の膜３′に達する。第一の膜３゛はその流体に含まれ る前記酵素によって分解され、それにより流体は発色基質６を担持する発現ゾー ンに到達する。発色基質６は被検査流体と接触することにより発色する。

それに対して、陰性反応の場合、すなわち、被検査流体に抗原が含まれていない 場合には、上段の標識抗体が中段のマイクロスフェア層５に結合させられた非標 識抗原によって捕捉され、そのために発色基質６は発色しない。

流体中の抗体を検出する場合にも、上記の方法を必要な変更を加えた上で適用し 得る。

半定量的測定を行なう場合には、上段の試薬を非標識とし、上段の次に、多層小 胞状構造体もしくはマイクロカプセルを含む中間段を設けてそこに標識試薬を内 包（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅ　）させる。第二の膜３に関係させられる抗体等の 試薬は、１０ｎｇ／ｍ１などのｘｎｇ／ｍｆｆ１程度の所定の量の抗原に対応す る量で使用される。被検査流体がその所定量を上回る看の抗原を含んに内包され た標識抗体と結合し、そし、て直ちにその小胞状構造体が分解酵素の作用の下で 開放させられる。

こうして得られる測定結果は、ある閾値に対する相対的なものであって、そこで 本測定は半定量的測定である。

第２図においては、陽性反応が得られる場合の抗原の定性的検定が説明される。

図において符号１０は形成された抗体−抗原複合体を示す。複合体１０はマイク ロスフェア層５に捕捉されずに中段１１を通過し、下段１６において陽性反応を 示す。詳述すると、ペレット１のすべての標識抗体が血清中に存在する抗原によ って約３０秒で飽和させられ、第二の膜（上の膜）３の分解とともにすなわち当 該３０秒の時間の経過の後、その飽和複合体がマイクロスフェア層５に達する。

マイクロスフェア層５には血清中の被検出抗原と同一種類の抗原が結合させられ ているが、マイクロスフェア層５は飽和複合体とは結合することができず、従っ て複合体は分解された第一の膜３“を通過して発現ゾーンに到達する。

第２図に示された検定方法は例えば梅毒抗原の存在の定性的検定に適用され得る 。

上段１３の試薬として使用される標識抗体は、正の制御（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃ ｏｎｔｒｏＩ）血清（パスツールコード７６７５１）由来のヒトの！ｇＧｓ　（ ５００ピコグラム）を用い、これをコンカナバリンＡ上でペルオキシダーゼ［メ ルク（Ｍｅｒｃｋ　）　］で標識した［グエスドン（ＧＵＥＳＤＯＮ　）とアヴ ’ｙメ７：ｌ　（ＡＶＲＡＭＥＭＳ）　（１）方法、１９８０］ものである。試 薬を内包するペレット１はまた、膜３．３′を分解させる酵素をも内包する。膜 ３，３′がゼラチンからなる場合には、この酵素にはコラゲナーゼが使用され、 その場合、ペレット１には好ましくは５単位のコラゲナーゼ［カルバイオケム（ Ｃａ　ｌ　ｂ　ｉｏｃｈｅｍ）のコラゲナーゼクロストリディウム（Ｃｏｌｌａ ｇｅｎａｓｅＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　）　］を内包させる。第二の膜３はまた 、厚さ１０μｍ、３μｍの多数の孔を有するポリカルボネート−ＤＭＦ製の膜と されてよく、その孔はゼラチンの熱（ｈｏｔ　）　３％エタノール溶液によって ブロックされ、孔をブロックするゼラチンは３０秒でコラゲナーゼによって分解 される。第二の膜３はグラスファイバの構造体によって補強される。試薬として 使用される標識ポリクローナル抗体１４は、その試薬１４を含むベレット１に血 清の滴に含まれた血清抗原１５が接触させられることにより、標識抗体−抗原複 合体１゜を形成する。ＶＤＲＬ抗原陽性の血液は５０マイクロリツトルの滴当た り約２００ピコグラムのＶＤＲＬ抗原を含むので、上段１３に導入される標識抗 体としては５００ピコグラムで充分に血清抗原１５を捕捉することができる。ま た、過剰の抗体は、Ａ　ｇ　−Ａ　ｂ反応を加速させる効果を有する。詳述する と、上段１３の５００ピコグラムの標識抗体１４の中、２００ピコグラムが血清 抗原１５と結合してＡｇ−Ａｂ複合体１゜を形成し、そのＡｇ−Ａｂ複合体１ｏ は中段１１のマイクロスフェア層５を構成する固相とは結合しない。

“マグノゲル（Ｍａｇｎｏｇｅｌ　）″　（ＩＢＦ）のマイクロスフェア（５μ りは、プロティンＡ＋グルタルアルデヒド（ＩＢＦ試薬）およびＶＤＲＬ　［ダ イアグ、　（Ｄｉａｇ。

）パスツールコード５２６７５コのＶＤＲＬ−ラテックス抗原（ｌｎｇ１５μり によるコーティングを含む。第二の膜３のゼラチンが分解させられると直ぐに、 遊離状態にある３００ピコグラムの標識抗体は中段１１のマイクロビーズ５に担 持されたＶＤＲＬ−ラテックス抗原と結合する。他方、面清抗原１５によって飽 和させられた２００ピコグラムの標識抗体１４　（１０）は、孔をブロックして いるゼラチンが分解させられるとともに、第一の膜（下の膜）３°　（第二の膜 ３と同じ材料よりなる）を通過して基質（Ｓ）８を含む発現ゾーンとしての下段 １６に到達する。基質（Ｓ）８は好ましくは、ホヮットマン第１号紙（Ｗｈａｔ ｍａｎ　ｎｏ。

ｌ　ｐａｐｅｒ　）等の適当な支持体上に担持された安定３゜３’　、５，５” −テトラメチルベンジジン［ＩＣＮ−マイルズラブ、（ＭＩＬＥＳ　ＬＡＢ、） 　］よりなる。複合体１０は基質８と結合することにより発色反応（１２）を呈 する。基質８が３．３’　、５．５’　−ＴＭＢに加えてグルコースオキシダー ゼ／β−ローグルコース複合体を含む場合には、わずか２０ピコグラムで発色反 応が生じ得る。グルコースオキシダーゼ／β−ローグルコース複合体が血清に接 すると過酸化水素が発生し、それにより発色反応が強められるのである。

第３図においては、陽性反応が得られる場合の抗体の定性的検定が説明される。

約３０秒ですべての標識抗原が血清抗体によって飽和させられ、その後、第二の 膜（上の膜）３が分解させられ、それによりすべて、の抗体−標識抗原複合体が 中段１１のマイクロスフェア層５に達する。そのマイクロスフェア層５には被検 出抗体と同一種類の抗体が結合させられているが、エピトープ（抗原部位）はす でに血清抗体によって飽和させられているので、マイクロスフェア層５と結合し た抗体によっては識別されず、複合体は発現ゾーンに到達し、そこで基質８と反 応して発色する。

第３図に示された検定方法は例えばトキソプラズマ病の抗体の検出に適用される 。

標識抗原として使用される試薬として、上段１３は。

好ましくは凍結乾燥（２５０ピコグラム）されるとともにペルオキシダーゼ（メ ルク）で標識された１−キラプラズマ病抗原（ダイアグ０．パスツールコード５ ２７２１）を担持する。抗原１７を内包する凍結乾燥ベレットにはさらに、分解 酵素が内包させられる。膜３゜３′が第２図との関係において記載したものであ る場合には、分解酵素としては特にコラゲナーゼ（５単位）（カルバイオケムの ７ラゲナーゼクロスＩ・リゾイウム）が使用される。試薬として使用される標識 抗原１７は、当該試薬１７を含むベレット１に血清の滴に含まれた（ポリクロー ナル）血清抗原１８が接触させられることにより、標識抗原−血清抗体複合体１ ９を形成する。抗トキソプラズマ病抗体陽性の血液は１ｏＯ〜１５０ピコグラム の抗トキソプラズマ病抗体を含むので、２５０ピコグラムの標識抗原で充分に血 清抗体１８を飽和させることができ、血清抗体１８が中段１１のマイクロビーズ （５μ２）２０と結合することはない。マイクロビーズ２０としては、例えば、 プロティンＡ＋グルタルアルデヒド（ＩＢＦ試薬、パスツール研究所抗体））の 抗トキソプラズマ病抗体（ｌｎｇ１５μりによるコーティングを含む゛′マグノ ゲル”（ＩＢＦ）のマイクロビーズが使用される。非限定的具体例として記載し たポリカーボネート膜３が、その孔をブロックしているゼラチンの分解によって 透過性とさせられることにより、血清抗体１８によって飽和させられなか、った 標識抗原１７がマイクロビーズ２゜によって支持された抗体と結合し、他方、標 識抗原−抗体複合体１９は第一の膜（下の膜）３”をぞれが透過性とされる直ち に通過し、第２図との関係で記載したものと同一であってよい基質（Ｓ）と結合 して発色する。この発色反応もまた、第２図との関係で記載した手段によって、 適宜、増幅され得る。

以上、本発明の装置を第１図〜・第３図に示された実施例について記述したが、 これまでは計画された分解膜（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　Ｉｙｓｉｓ　ｍｅｍｂｒ ａｎｅｓ）の具体例とし°ζ概してゼラチンのみにてなるかもしくはゼラチンを 含むもののみを記載した。しかし、本発明においてはそのよ−）な計画分解膜は その他の材料によっても構成され得ることは明らかである。以下、本発明による 非限定的具体例について記述するが、その目的は、本発明の枠内で使用され得る 他の計画分解膜の例について記載することと、本発明の検定装置および方法を血 清もしくは尿中に存在する抗原もしくは抗体の検定に適用した例について記載す ることとである。

■↓　脂質膜の調製 脂質膜は、種々の両親媒性脂質ないしは脂質の混合物から調製され得る。

不透過性膜の調製に最も適した脂質は燐脂質であり、それはコレステロールと関 係させられたものであってもよい。それは細胞膜の基本構成要素である。

天然（非合成）の燐脂質は共通のラジカル（基）Ｒと互いに異なる末端基（ｔｅ ｒｍｉｎａｌ　ｇｒｏｕｐ）とを以下のように有する。

Ｒ−Ｈホスファチジン酸 ＲＣＨｚ　ＣＨｚ　Ｎ　（ＣＨ３）３ ホスフアチジルコリン ＲＣＨｚ　ＧＨｚ　ＮＩ（ｓ ホスファチジルエタノールアミン Ｒ−ＣＨ，−ＣＨｏＨ−ＣＨ，−ＯＨ ホスファチジルグリセロール ＲＣＨｚ　ＣＨＯＨ’ＣＨｚ　ＯＲ’ カルジオライピン Ｒ−Ｒ，複合体　スフィンゴミエリン 合成の燐脂質が存在し、それらは優れた抵抗性、特性保持性等を示す。それを以 下に示す。

ＤＭＰＣジミリストイルフォスファチジルコリンＤＰＰＣジパルミトイルフォス ファチジルコリンＤＳＰＣジステアロイルフォスファチジルコリン１、脂質溶液 の調製 一燐脂質　１０μｍｏｌ −ベンゼン　１ｍｆｆ１ 溶液はヴオルテックス（Ｖｏｒｔｅｘ）上で１分間撹拌される。

２、次いで４０°Ｃの水浴中で数分間加熱される。

３．１２μｌが、ナイロン、ニトロセルロース、セルロース紙、ポリエステルの 各支持体の中の一つ［直径１３ｍｍ、０．４５μ程度の孔度（ｐｏｒｏｓｉｔｙ ）　＋厚さ１００μ［上に適用される。

４、高真空（６０ｍｍＨｇ）下でベンゼンが蒸発させられ、残留物がそのまま真 空下ないしはアルゴン中に保持される。

５、この種の膜の分解は、適当な洗剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）および／またはペ ルオキシダーゼによって行なわれる。

分解試験 １０μ２の水がペレット上に適用された場合、その滴は少なくとも１時間の間不 動のままであった。

１０μ２のトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ　）　２０もしくはトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ ）　Ｘ　１００．０．０２％および／またはペルオキシダーゼ１ｎｇ／μ２がベ レット上に適用された場合、１０μｉの滴は４５秒間不動であったがその後直ち に支持膜を通過した。

６、膜のキヤリブレーシヨン　膜の分解時間は、以下に示される諸態様のように 、燐脂質の濃度もしくは洗剤／ペルオキシダーゼの濃度を変化させることにより 変更することができる。

６．１　ベンゼン１ｍｆｆ１中に１０μｍｏｌの燐脂質を含む溶液から膜を調製 した場合、トリトンＸ−１００，０，０２％の滴は９０秒後に通過する。

６．２　同じ濃度の燐脂質に対してトリトンｘ−ｉ００．０．０１％を適用した 場合には、分解は５分後に生じる。

６．３　ベンゼン１ｒｒ＋４２中に５μｍｏｌの燐脂質を含む溶液から膜を調製 した場合、ｌ・リドンｘ−ｉｏｏ。

０．０２％はその膜を１５秒で通過し、他方、トリトンＸ−１００，０，０１％ を使用した場合は５０秒必要である。

重要注記−非イオン性洗剤はある種の溶液（ペルオキシダーゼで標識された抗体 等）を適当に保護するとともに、当該ペルオキシダーゼと関係して膜を分解する 。

■１　アクリレート共重合体膜の調製 １、以下の貯蔵溶液が調製される。

−プロパン−２−オール（イソプロパツール）３０％ −アクリル酸／アクリレート共重合体　４０％−ヒドロキシプロビルメチルセル ロース　２０％−クエン酸アセチルトリエチル　５％ −塩酸アルミニウム（Ａｌｍｉｎｕｍ　ｃｈｌｏｒｈｙｃｌｒａｔｅ）　５％溶 液は４０°Ｃの水浴中で１０分間加熱される。

さらにジオルテックス上で１分間撹拌される。

そして密閉容器中に保持される。

２、前記の例で記載した支持体の中の一つに通用される前に、貯蔵溶液は純粋エ タノールを用いて、貯蔵溶液１体積に対して純粋エタノール５体積の割合で希釈 される。

３．１０μ℃が、直径１３ｍｍの支持体の上に適用される。

４、支持体が真空下で乾かされ、乾燥剤が存在させられた真空下に保持される。

５、この種の膜は、ｐ　Ｈ７，２のＰＢＳで分解される。

分解試験 ｐ　Ｈ７のＰＢＳ　１０μ！の滴が通用された場合、それはゆっくりと（約１分 で）膜を通過する。

Ｐ　Ｈ７，２のＰＢＳ　１０μＰの滴が適用された場合、それは数秒で支持体を 通過する。

６、以下のものを変更することによってアクリルフィルムの分解時間を短縮もし くは延長することができる。

一貯蔵溶液の組成（例えば、プロパン−２−オールの割合の増減） −エタノールの割合２例えば１０体積中９体積がエタノールとされた場合、フィ ルムは極めて急速に通過し、５体積中４体積がエタノールとされた場合、通過は 遅くなる。

７、クエン酸アセチルトリエチルの濃度を変えることによって分解のｐＨを変更 することができる。

ｌ　タンパク質膜の調製 第１図〜第３図の装置に関連して記載されたゼラチンの膜は、以下のようにして 有利に調製される。

以下の組成を有する貯蔵溶液が調製される。

−寒天　５ｍｆ −脱塩された水　９５ｍｆ 溶液は磁気撹拌（ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｓｔｉｒｒｉｎｇ　）によって５０°Ｃに 加熱される。

１０μ２が、例えば例１に記載されている支持体上に適用される。

支持体は真空下で乾かされる。

次いで、乾燥剤が存在する真空下に保持される。

寒天はコラゲナーゼによって分解される。

分解試験 このようにして用意されたベレットの上に１０μ！の水が適用された場合、その 水は一時間以上不動のままである。

１１Ｕ／μｌを含むコラゲナーゼの溶液１０μｌが適用された場合、その滴は４ ５秒間で支持体を通過する。

タンパク質膜の流体による通過は、それを通過する溶液にコラゲナーゼのほかに 他のどのようなタンパク質分解酵素を含ませることによっても調節することがで きる。ここでコラゲナーゼが選択される理由は、それが膜の上もしくは下で生ず ると予想される生物反応に適合的であるのに対して、他のタンパク質分解酵素は 抗体ないし標識としてのタンパク質等に有害であるからである。

また、ゼラチンの濃度もしくはコラゲナーゼの濃度を変えることによって膜の通 過時間を変更することが−ゼの量を増やせば時間は短縮され、ゼラチンの量を増 やすかコラゲナーゼの量を減らせば時間は延長される。

ｌ　炭水化物膜の調製 以下の貯蔵溶液が調製される。

−Ｄ−グルコース　ｌＯダラム、 −脱塩された水　５ｍｌ、 が７０°Ｃに加熱される。ジオルテックス上で撹拌されている状態で、１０ｇの Ｄ−グルコースが少量ずつ添加される。連続的な添加の間も撹拌は継続される。

その結果、シロップ様の粘度を持つ高濃度の溶液が得られる。

このシロップ様溶液１体積が９９％純粋エタノールの１体積で希釈され、その後 、この溶液ｉ　ｏｕｌが例１に記載されている支持体の上に適用される。支持体 は真空下において３７℃の温度で乾かされる。この種の膜は水の存在下で分解さ れる。

分解試験 １０μ２の水が適用される。

１−Ｄ−グルコース不適用で同じ支持体の場合、直ぐに通過する。

２−Ｄ−グルコースが適用された支持体の場合、３５秒後に通過する。

とりわけ粗いＤ−グルコースは適している。というのは、それがグルコースオキ シダーゼと接触して過酸化物が生じ、その結果として、ペルオキシダーゼを標識 に使用する検定では信号を増幅することになるからである。

１、−　血清中に存在するＡＣＥの検出第４図はヒトの血清試料中に含まれるＡ ＣＥの検定のためのグラフである。

検査用試料の体積は５０μ！である。各々同じ体積のヒト血清試料ＪＯサンプル と、ＡＣＥを含まないヒト血清試料１す〉′プルとが、各々以下の手順で処理さ れる。

各試料は凍結乾燥されたべＬ・ット】の上に滴下される。べＩ／フットは第二の 膜３によって支持されており、マウスのＩｇＧ１を１２５０ピコグラム内包して いる。

このＩｇＧ１はＡＣＥのエピトープ３２８．Ｃに対応し、ペルオキシダーゼで標 識されている。

３０秒で標識抗体はすべて血清抗原によって飽和させられる。ゼラチン等からな る（グラスファイバ網により補強された）第二の膜３のコラゲナーゼによる分解 は、当該３０秒の経過によって生じ、その結果、血清抗原によって飽和させられ た標識抗体を含む流体が第二反応ゾーンに到達し、そこでマイクロビーズＮ５と 接触する。マイクロビーズ層５は同一の抗原でコーティングされているが、飽和 標識抗体はマイクロビーズ５をコーティングするこの抗原によって捕捉されない 。というのは、抗体のＦａｂ部が既に血清抗原によって飽和させられているから である。他方、第二反応ゾーンに流れ込んだ流体中に存在する酵素は第一の膜３ ′を溶解させ、その結果、流体は第三反応ゾーンに達する。このゾーンにおいて は、血清抗原と結合した標識抗体がすべて基質８のベレットと接触する。このベ レットは例えば３．３’　、５．５’　−テトラメチルベンジジンである。そこ で、ペルオキシダーゼの存在の下に準瞬間的に発色が生ずる。本装置の下に小さ なストリップ（片）を置き当該装置で濾過されたものを集め、その反応信号を検 出することにより、マイクロビーズ層５を通過した被標識物質の量を測定する。

被分析試料に含まれるＡＣＥの各濃度が第４図６ご示されている。血清（ｍｌ） 中のＡＣＥの各濃度は、０゜５．１．Ｌ５，２．２．５，５，１０，１５．２０ ｎｇ／ｍ！８すなわち、被検定試料５０ｕｌ中のＡＣＥは各々２５，５０，７５ ，１００，１２５，２５０，５００，７５０．１０００ピコグラムである。

本発明の装置および方法における検出の閾値は極めて低いので、本発明の枠内に おいて、体積にしてわずか５０μｌという血液−滴を用いて、測定を行なうこと が可能である。

また、異なった診断標識を担持するマイクロスフェアを使用することにより同時 に複数種類の診断を行なうこともできる。

本検定の感度は、使用されるモノクローナル抗体の感度により５〜１２５ピコグ ラムのオーダとなる。そのため、超特異的なモノクローナル抗体を使用すること が好ましい。

前記のように、本発明の装置の連続する各段階は、水に対して異なった親和性を 示す複数の相を構成する。

すなわち、上段は吸収相であり、中段は放出相であり、下段は吸収相である。こ の変化は、記載の例について言えば、例えばグルコースによる浸透圧勾配を形成 することにより達成される。その結果、液体はすべて下段の基質に向かって吸収 され、他方、陰性の場合には、被標識物質のみがマイクロスフェア層５に捕捉さ れる。

ｔ６　全血中の抗ＨＩＶ抗体を検出する定性試験６．１　全血中の抗ＨＩＶ抗体 を検出する装置Ｄ１２２祇は以下の溶液によって処理される。

−スキムミルク　１０％ｗ　／　ｖ −ゼラチン　１％ −Ｅｘｃ、無菌蒸溜水 積層されたペレット上に全血の滴が適用されると、第一のＰＬＭの存在のために ３０秒間は不動のままである。

第一のＰＬＭは３０秒後に、標識抗原を適用するための溶液（トウイーン２０， ０．１％）に含まれた洗剤によって分解される。この洗剤は他に３つの極めて重 要な機能を持つ。すなわち、 一ペルオキシダーゼを抗原から保護すること、−溶血反応を促進すること、 一遮断剤として作用して、長期に渡って保存する場合に標識抗原がＤ１２２紙と 結合することを防止すること、である。

抗体はすべて、Ｄ１２２紙上に適用された溶液に含まれる標識抗原と結合する。

その溶液の組成は以下の通りである。

一トウイーン２０．０．１％ 一ゼラチン　１％ 一グルコースオキシダーゼで標識された抗原この溶液５μ２が適用される。

反応が陰性の場合は、標識抗原は３０秒（第二のＰＬＭの分解時間）で固相の抗 体と結合する。

反応が陽性の場合には、血清抗体／標識抗原複合体は固相とは結合せず、抗原を 標識するグルコースオキシダーゼが発現ベレットのＤ−グルコースと接触して過 酸化水素を生じさせ、それが、ヘモグロビンのペルオキシダーゼがＴＭＢを発色 させるための基質（Ｈ２０□）となる。

３０秒後、第二のＰＬＭは分解され、被検査抗体とグルコースオキシダーゼで標 識された抗原との複合体が発現ベレットに到達する。

±ユ　全血中のＡＣＥを検定する半定量試験第１図について記載したように、本 発明の半定量試験に使用される装置には、正常値に対応する所定の量の抗原を予 め捕捉する第一の固相が含まれ、その所謂正常値を超える血液中の抗原が第二の 固相によって捕捉される。

本試験において使用される装置を以下に示ｔ。

装置■構成 固相　処理されたす　結合抗ＡＣＥ抗体が血液（ｍイロン　２）中のＡＣＥを５ ｎｇ／ｍ ２で捕捉 第一の脂質ＰＬＭ　グルコースオキシダーゼで種処理されたＤ１２２　ｍされた 抗ＡＣＥ抗体５０ｎ紙　ｇが過剰のＡ　ＣＥと結合 第二の脂質ＰＬＭ 第二の固相　結合抗原がＡＣＥで飽和されていない標識抗体を捕捉 第三の脂質ＰＬＭ ナイロンの支持体　ＴＭＢ　３μ！ ク工ン酸緩衝液ＩＭ　１０μ２ Ｄ−グルコース　１０μＥ 別」−尿中のＨＣＧを検出する定性試験（定性妊娠試験） 本装置は以下の構成を有する。

のオリフィスが形成されたプレキシガラスのスライドとともに押圧される。

ギルソン（Ｇｉｌｓｏｎ）ピペットを使用して、新鮮な尿試料９０μ２が採取さ れ、静かにそのオリフィス内に適用される。

尿の一部が直ぐに吸収され、適用された滴は２０秒間は不動のままであり、その 後、急速かつ部分的に崩れる。上方のペレットは湿った状態にある。２０秒後、 尿のレベルが再び下がり、上方から観察すると装置は全く乾燥しているように見 える。

以上の２つのステップは明らかに２つの膜、すなわち標識抗体の下に置かれた膜 と固相の下に置かれた膜との各々の計画的分解を示す。

結果が陰性である場合には、生成される過酸化水素は、ペルオキシダーゼで標識 された抗体が存在しないことから（光とＴＭＢ上のＨｚＯ□の結果として）１〜 ２分後にサケ肉色を呈する。

反応が陽性の場合には、強いスカイブルーのスポットが直ちに現れる。

呈色を保存するためには、それらを乾燥した場所であって特に暗所に保存するこ とが必要である。その結果を後で観察したい場合、実際には、試験装置をそのパ ッケージに戻し、しっかり密封しておけばよい。発色はこの状態で数日間消失し ない。

ｌ　尿中のＬＨのピークを検出する半定量試験尿中のＬＨは全周期を通じて最小 のレベルでは存在する。そして、排卵の前と排卵中に顕著なピークを示す。従っ て本試験の要点は、ＬＨのレベルが最小の時には発色せず、ＬＨのレベルがピー クに達した時に発色信号を示すようにすることである。

これは標識抗体の上にさらに一段を設けることにより達成される。当該段には以 下のものが含まれる。

−最小レベルに対応する量のＬＨのみをそのレベルで捕捉するように抗ＬＨ抗体 を担持する固相と、−固相の抗Ｌ　Ｈ抗体が最小レベルのＬＨを捕捉するような 時間を許容する計画分解膜と、である。

本装置の残余の部分は定性試験装置の対応部分と同一である。

一乳！ リポソーム中に担持されるようにし、それにより、第−ＳＰの抗ＬＨ抗体が予め 最小レベルのＬＨを捕捉するようにすることもできる。

上記の記載から明らかなように、本発明は、明示的に記載された実施の態様、実 施例もしくは適用の態様に同等限定されるものでなく、本発明の枠組もしくは範 囲を逸脱しない限り、当業者に自明のあらゆる変更を含むものである。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成２年１０月２６日 ＰＣＴ／ＦＲ８９１００１５６ ２、発明の名称 流体中の反応性リガンドを定性的ないし定量的に迅速測定する装置及び方法 ３、特許出願人 名　称　シス・ビオ−アンチルナショナル（ほか１名ン１９９０年３月２９日 ６、添付書類の目録 （１）補正書の写しく翻訳文）　１通 請求の範囲（補正） １．流体中の反応性リガンドを定性的ないし定量的に迅速測定する装置であって 、同定されるべき前記リガンドと反応する標識された抗体もしくは抗原等の標識 された試薬を担持する反応ゾーンと、発現ゾーンとを含む装置であって、 少なくとも一時的に不透過性である膜（３）を含むとともに、前記流体の被検査 試料を受け入れるようにされ、かつ、前記膜が、前記試料中に存在するかも知れ ない前記被同定リガンドを識別し得る少なくとも１つの適当に標識された試薬と 当該膜を溶解させる物質かもしくは分解させる物質とに関係させられるようにさ れた第一反応ゾーン（１３）と、 その第一反応ゾーンから独立であって前記膜（３）によって少なくとも一時的に その第一反応ゾーンから隔離され、前記被同定リガンドを識別し得る非標識基準 試薬（５もしくは２０）を担持する固相を含み、かつ、少なくとも一時的に不透 過性である第二膜（３゛）によって前記第−膜と反対の側で少なくとも一時的に 閉鎖される第二反応ゾーン（１１）と、前記第二膜（３”）によって少なくとも 一時的に前記第二反応ゾーンから隔離されるとともに、前記第一もしくは第二反 応ゾーンで生じたかも知れない反応を発現させる手段を有する第三反応ゾーン（ １６）とを含み、かつ、前記各層（３，３’　）が、前記各反応ゾーンにおいて 前記反応が生じるのに充分な第一時間不透過性である材料によって構成され、そ の材料がその第一時間の経過後前記溶解物質もしくは分解物質によって溶解もし くは分解させられることにより前記反応の結果として生じる反応生成物が次の反 応ゾーンに到達し、その溶解もしくは分解が前記各反応ゾーンで生ずる前記反応 と同時的に始まることを特徴とする測定装置。

２、前記各層の溶解物質もしくは分解物質が、その膜から独立している請求項１ の測定装置。

３、前記各層の溶解物質もしくは分解物質が、その膜に内包されている請求項１ もしくは請求項２の測定装置。

４、前記第一反応ゾーン（１３）が、もし適当であれば前記各層を分解する前記 分解物質との関係において、望ましくは前記第−膜（３）により支持されて、前 記膜なくとも１つの適当な標識試薬を担持する固相（１）を収容するに適したも のである請求項１ないし３の何れかの測定装置。

５、前記第二反応ゾーン（１１）に存在する前記非標識基準試薬を担持する前記 固相が、前記被同定リガンドに対応する非標識基準試薬（特に抗体もしくは抗原 等）が結合させられた不溶性の支持体（５もしくは２０）から成る請求項１ない し４の何れかの測定装置。

６、前記反応が比色法によって測定される場合に、前記第三反応ゾーン（１６） が発色基質を含む請求項１ないし５の何れかの測定装置。

７、前記第一反応ゾーンと第二反応ゾーンとの間に標識された試薬を含む中間ゾ ーンを有し、その場合に、前記第一反応ゾーンが非標識試薬を含む請求項１ない し６の何れかの測定装置。

８、前記中間ゾーンが、酵素等の適当な分解物質により適当な時間の後に放出さ れ得る少なくとも１つの試薬を内包する少なくとも一重の多層小胞状構造体を含 む請求項７の測定装置。

９、前記中間ゾーンが、前記第−膜と前記第二反応ゾーンとの間に設けられた中 間膜にて・構成され、その中間膜が好適には前記標識試薬と関係させられ、その 場合に、前記第−膜が前記中間膜と同一種類の試薬と関係させられる請求項８の 測定装置。

１０、前記第三反応ゾーンが、ＲＴＡ、分光光度計等の既存の定量装置に関係さ せられる請求項１ないし９の何れかの測定装置。

１１、前記各反応ゾーンを重ねることにより、前記第一反応ゾーンを含む上段と 、前記第二反応ゾーンを含む中段と、前記第三反応ゾーンを含む下段とが形成さ れ、適当であればその上段と中段との間に前記中間反応ゾーンを含む中間段が形 成される請求項１ないし１０の何れかの測定装置。

１２、流体中の反応性リガンドを定性的ないし定量的に迅速測定する方法であっ て、その第一工程において、前記流体の分析用試料が、本工程に続く各工程が行 われる各ゾーンから一時的に隔離されたゾーンにおいて、標識された抗体もしく は抗原等の標識された試薬と、リガンド−試薬反応が生ずるに充分な時間接触さ せられ、その後、その反応が生じた前記ゾーンの前記隔離が、前記ゾーンに存在 しかつ前記流体と同時に一時的に不透過性である膜に到達してその膜との接触に よりその膜を溶解させる物質かもしくは分解させる適当な分解物質によって破壊 される−その隔離膜の漸進的で計画された溶解もしくは分解は前記反応と同時に 生ずるーことにより、第二工程において、後続ゾーンから一時的に隔離された第 二ゾーンにおいて、前記反応の結果として生じるいかなる反応生成物も、同定さ れるべき前記リガンドに対応する非標識第二試薬との接触を許容され、その後、 その第二ゾーンの前記隔離が前記溶解物質もしくは分解物質によって、漸進的で 計画されかつ同時的な態様で破壊されることにより、第三工程において、前記第 一もしくは第二反応の生成物が、前記被検出リガンドの存在もしくは不存在を明 らかにする手段と接触させられることを特徴とする測定方法。

１３、前記流体試料が、前記第一工程において、非標識試薬と接触させられ、前 記第二工程に先行して中間工程が行なわれ、その中間工程において、第一工程に おいて形成されたりガント−非標識試薬複合体が、次の工程から一時的に隔離さ れたゾーンにおいて、第一工程において使用された試薬と同一種類であって標識 された試薬と接触させられる請求項１２の測定方法。

１４、前記第一工程において前記分析用流体試料と接触させられる前記非標識試 薬が、被検出リガンド等の既知の量のリガンドに対応する所定量にて使用され、 その第一工程において前記試薬と結合しない過剰のりガントが、前記中間工程に おいて、前記標識試薬と結合することによってそれに捕捉され、その結果、前記 分析用流体試料中における前記リガンドの存在の可能性を明らかにする反応がそ の試料中のりガントの量が前記所定量を上回る場合にのみ陽性を示し、それによ り前記流体中に存在するリガンドが半定量的に測定される請求項１３の測定方法 。

１５、前記第一工程が吸収相であり、前記第二工程が放出相であり、前記第三工 程が吸収相である請求項１２ないし１４の何れかの測定方法。

１６、前記第一工程と前記第二工程の間に前記中間工程が含まれる場合において 、その中間工程が前記第一工程と同様に吸収相である請求項１５の測定方法。

国際調査報告 ″ｗ′ＡＨｋ″□　ＰＣＴ／ＦＲＢｇ　１００１５６国際ｖ４斎報告 ゛第１頁の続き ０発　明　者　トレダーノ、ジャック ＠出願人　クイック−テスト フランス国　７５０２０　バリ　リュ・デ・オルト−５５フランス国　９２５３ ２　ルヴアロアーペレ　リュ・ニドワール・ヴアイヤン　舅

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．流体中の反応性リガンドを定性的ないし定量的に迅速測定する装置であって 、同定されるべき前記リガンドと反応する標識された抗体もしくは抗原等の標識 された試薬を担持する反応ゾーンと、発現ゾーンとを含む装置であって、 少なくとも一時的に不透過性である膜（３）を含み前記流体の被検査試料を受け 入れるようにされ、かつ、前記試料中に存在するかも知れない前記被同定リガン ドを識別し得る少なくとも１つの適当に標識された試薬と前記膜を透過性とする 手段とに関係させられる第一ゾーン（１３）と、 その第一ゾーンから独立であって前記膜（３）によって少なくとも一時的にその 第一ゾーンから隔離され、前記被同定リガンドを識別し得る非標識基準試薬（５ もしくは２０）を担持する固相を含み、かつ、少なくとも一時的に不透過性であ る第二膜（３′）によって前記第一膜と反対の側で少なくとも一時的に閉鎖され る第二反応ゾーン（１１）と、 前記第二膜（３′）によって少なくとも一時的に前記第二反応ゾーンから隔離さ るとともに、前記第一もしくは第二反応ゾーンで生じたかもしれない反応を発現 させる手段を有する第三反応ゾーン（１６）とを含み、かつ、前記各膜（３，３ ′）が、前記各反応ゾーンにおいて前記反応が生じるのに充分な第一時間不透過 性である材料によって構成され、その材料がその第一時間の経過後透過性とさせ られることによって前記反応の結果として生じる反応生成物が次の反応ゾーンに 到達し、前記各膜の一方もしくは両方を透過性とする手段がその一方もしくは両 方の膜を溶解させる物質かもしくは分解させる物質であることを特徴とする測定 装置。
2. ２．前記各膜の一方もしくは両方を透過性とする手段が、その膜から独立してい る請求項１の測定装置。
3. ３．前記各膜の一方もしくは両方を透過性とする手段が、その膜に内包されてい る請求項１もしくは請求項２の測定装置。
4. ４．前記第一反応ゾーン（１３）が、もし適当であれば前記各膜を分解する前記 分解物質との関係において、望ましくは前記第一膜（３）により支持されて、前 記すくなくとも１つの適当な標識試薬を担持する固相（１）を収容するに適した ものである請求項１ないし３の何れかの測定装置。
5. ５．前記第二反応ゾーン（１１）に存在する前記非標識基準試薬を担持する前記 固相が、前記被同定リガンドに対応する非標識基準試薬（特に抗体もしくは抗原 等）が結合させられた不溶性の支持体（５もしくは２０）から成る請求項１ない し４の何れかの測定装置。
6. ６．前記反応が比色法によって測定される場合に、前記第三反応ゾーン（１６） が発色基質を含む請求項１ないし５の何れかの測定装置。
7. ７．前記第一反応ゾーンと第二反応ゾーンとの間に標識された試薬を含む中間ゾ ーンを有し、その場合に、前記第一反応ゾーンが非標識試薬を含む請求項１ない し６の何れかの測定装置。
8. ８．前記中間ゾーンが、酵素等の適当な分解物質により適当な時間の後に放出さ れ得る少なくとも１つの試薬を内包する少なくとも一重の多層小胞状構造体を含 む請求項７の測定装置。
9. ９．前記中間ゾーンが、前記第一膜と前記第二反応ゾーンとの間に設けられた中 間膜にて構成され、その中間膜が好適には前記標識試薬と関係させられ、その場 合に、前記第一膜が前記中間膜と同一種類の試薬と関係させられる請求項８の測 定装置。
10. １０．前記第三反応ゾーンが、ＲＩＡ，分光光度計等の既存の定量装置に関係さ せられる請求項１ないし９の何れかの測定装置。
11. １１．前記各反応ゾーンを重ねることにより、前記第一反応ゾーンを含む上段と 、前記第二反応ゾーンを含む中段と、前記第三反応ゾーンを含む下段とが形成さ れ、適当であればその上段と中段との間に前記中間反応ゾーンを含む中間段が形 成される請求項１ないし１０の何れかの測定装置。
12. １２．流体中の反応性リガンドを定性的ないし定量的に迅速測定する方法であっ て、その第一工程において、前記流体の分析用試料が、本工程に続く各工程が行 われる各ゾーンから一時的に隔離されたゾーンにおいて、標識された抗体もしく は抗原等の標識された試薬と、リガンドー試薬反応が生ずるに充分な時間接触さ せられ、その後、その反応が生じた前記ゾーンの前記隔離が破壊されることによ り、第二工程において、後続ゾーンから一時的に隔離された第二ゾーンにおいて 、前記反応の結果として生じるいかなる反応生成物も、同定されるべき前記リガ ンドに対応する非標識第二試薬との接触を許容され、その後、その第二ゾーンの 前記隔離が破壊されることにより、第三工程において、前記第一もしくは第二反 応の生成物が、前記被検出リガンドの存在もしくは不存在を明らかにする手段と 接触させられることを特徴とする測定方法。
13. １３．前記流体試料が、前記第一工程において、非標識試薬と接触させられ、前 記第二工程に先行して中間工程が行なわれ、その中間工程において、第一工程に おいて形成されたリガンドー非標識試薬複合体が、次の工程から一時的に隔離さ れたゾーンにおいて、第一工程において使用された試薬と同一種類であって標識 された試薬と接触させられる請求項１２の測定方法。
14. １４．前記第一工程において前記分所用流体試料と接触させられる前記非標識試 薬が、被検出リガンド等の既知の量のリガンドに対応する所定量にて使用され、 その第一工程において前記試薬と結合しない過剰のリガンドが、前記中間工程に おいて、前記標識試薬と結合することによってそれに捕捉され、その結果、前記 分析用流体試料中における前記リガンドの存在の可能性を明らかにする反応がそ の試料中のリガンドの量が前記所定量を上回る場合にのみ陽性を示し、それによ り前記流体中に存在するリガンドが半定量的に測定される請求項１３の測定方法 。
15. １５．前記第一工程が吸収相であり、前記第二工程が放出相であり、前記第三工 程が吸収相である請求項１２ないし１４の何れかの測定方法。
16. １６．前記第一工程と前記第二工程の間に前記中間工程が含まれる場合において 、その中間工程が前記第一工程と同様に吸収相である請求項１５の測定方法。