JP2688529B2 - 流体中の反応性リガンドを定性的ないし定量的に迅速測定する装置及び方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は流体中に存在する反応性リガンド（reactive
ligand）を定性的ないし定量的に迅速測定する装置お
よび方法に関する。本発明は特に、しかし限定としてで
はなく、生物流体（biological fluid）中の抗体もしく
は抗原の存在の検出、あらゆる種類の流体（水，農−食
品産業の流体産物，産業廃水，生物流体等）中の毒性物
質，ウィルスないし細菌の検出、及び、流体（生物流体
等）中に存在する物質（ホルモン，ビタミン，酵素，薬
物等）の化学的検定（chemical assay）に関する。

生物流体中の抗原物質の存在もしくは濃度を測定する
免疫学的方法はすでによく知られている。それらの方法
は、測定されるべき抗原物質と、一つもしくは複数の抗
体の間での複合体の形成を利用するものである。複合体
の構成要素の一つを放射性元素（例えば¹²⁵I）で標識
し、複合体を形成した標識抗原もしくは抗体を複合体を
形成しなかった標識抗原もしくは抗体から分離した後
で、抗原物質の検出および／または定量分析を行なうこ
とができる。

免疫学的競合測定法（immunological determination
by competition）は、限定された数の抗体結合部位に対
して、被分析流体試料に含まれる抗原物質と既知の量の
標識抗原とを競合させるものである。抗体と結合した標
識抗原の量は、試料に含まれる抗原の量に逆比例する。

免疫測定試験（immunometric tests）においては、標
識抗体が使用される。複合体に関係した標識抗体の量は
試料に含まれる抗原物質の量に正比例する。

同時に二つ以上の抗体と結合して複合体を形成するこ
とのできる抗原物質である多価抗原の検出に特に適した
免疫測定試験においては、被分析流体に不溶性である固
相の支持体と結合した非標識抗体と、放射性同位元素等
の指示物を含む可溶性の抗体とが使用される。この場合
には、固相にある非標識抗体と、抗原と、標識抗体とか
ら三元複合体が形成され、それが検出もしくは定量測定
される。それらの方法においては、まず、被分析試料が
固相と結合した抗体と接触させられることにより、試料
中の抗原と固相にある抗体とから二元複合体が形成さ
れ、試料から抗原が抽出される。一定時間のインキュベ
ーションの後で固相を洗い、反応しなかった抗原を含む
残留流体試料を除去し、さらに、既知の量の標識抗体を
含む溶液と接触させる。二回目のインキュベーションに
よって、標識抗体は、固相の指示体に非標識抗体を介し
て結合する抗原と結合し、三元複合体が形成される。さ
らに、固相の二回目の洗浄を行い反応しなかった標識抗
体を除き、その後、固相上で標識抗体の存在を検出し
（例えば指示物として放射性元素が使用された場合には
放射線を測定する）、さらに、適宜、標識抗体の定量測
定をも実施する。

上記の方法は、抗原がその表面の異なる二つの部位で
二つの抗体に結合するところから、サンドイッチ法また
は二部位（bi−site）法として知られている。それらの
方法は、ワイド（WIDE）の“放射免疫決定法（Radioimm
unoassay Methods）”［カークハム（Kirkham）とハン
タ（Hunter），発行E.アンドS.リビングストン，エジン
パラ,1970,p.199−206］に記載されている。それらの具
体的な適用例（肝炎ウィルスの結合抗原の検出試験）が
米国特許第3867517号に記載されており、また、それら
の変形法［“同時的（simultaneous）”もしくは“逆
（inverse）”変形法］がジェオング（Jeong）らの“RI
Aと、ヒト甲状腺刺激ホルモン（HTSH）の測定に適用さ
れた単回インキュベーション二部位免疫ラジオメトリッ
ク検定法（single−incubation two−site immunoradio
metric assay）（RIMA）との比較”［バイオ−ラドラボ
ラトリーズ（Bio−Rad Laboratories）,1979］に記載さ
れ、さらに、米国特許第4174384号［螢光発色基（フル
オレセイン）を有する抗体と、フルオレセインから発せ
られた光を吸収する発色基を有する抗体の二つの抗体を
標識する］と、米国特許第4098876号に記載されてい
る。それらの方法においては当初はポリクローナル抗体
が使用されていたが、この抗体は他の抗原との間で交差
反応（cross reaction）を示すところから感度において
充分とは言えなかった。ハイブリテック（HYBRITECH）
に付与されらフランス特許第8115030号（公開番号第248
7983号）には、それらの免疫測定試験において、ポリク
ローナル抗体の代わりにモノクローナル抗体を使用する
ことにより、測定の感度を実質的に改善することが提案
されている。

リオッタ（LIOTTA）に付与されたフランス特許第8216
973号（公開番号第2514511号）には、エリザ（ELISA）
法で必要な希釈および洗浄の操作を不要にしまたインキ
ュベーションの時間を短縮した、生物流体中の抗原の存
在を測定する装置および方法（エリザ法）が記載されて
いる。提案された装置には、ポリアクリルアミド，アガ
ロース，コラーゲン等の多孔性のゲルの中に置かれたニ
トロセルロースもしくはジアゾベンジルオキシメチル
（DBM）の紙片よりなるマトリックス、または、セルロ
ースもしくはプラスチックの繊維片よりなるマトリック
スが使用される。前者の場合には、抗原を、ゲルの孔の
中に捕捉するかまたはリガンドのアミン基とマトリクッ
スのカルボキシル基とによってゲルと架橋結合させるこ
とができる。後者の場合には、その繊維片の内部にリガ
ンドを含む粒子（particles）もしくはビーズ（beads）
が捕捉される。リオッタの特許による装置には第一ゾー
と第二ゾーンとが含まれる。第一ゾーンは抗原と、酵素
に結合させられた抗体とを担持し、その抗体はそれが被
試験試料に含まれる（非結合の）抗原と反応した場合に
は第一ゾーンを通過してそこから除去されるように、他
方、抗原が存在しない場合にはそのような除去がなされ
ないように、その第一ゾーン内に保持される。また、第
二ゾーンは酵素に結合させられた抗体と反応し得る物質
を担持し、それによりその抗体の存在を明らかにする発
色反応が生じさせられる。さらに詳述すれば、リオッタ
の特許に記載された免疫検定装置には、三相の多孔性マ
トリックスよりなる層構造体が使用される。第一層には
酵素と結合させられた特定の抗体が植え込まれ、第二多
孔層は固定された（結合させられた）基準抗原を担持
し、第三層は抗体と結合させられた酵素と反応する発色
基質を含む。被分析試料中に存在する被検定遊離抗原が
第一層と接触させられると、それは第二層へその後第三
層へと拡散する。試料中に存在する遊離抗原は、酵素結
合抗体との結合反応において、第二層に固定された結合
基準抗原と競合する。酵素結合抗体が遊離抗原と結合す
れば、それは自由に第三層へ拡散し、発色反応が生じさ
せられる。他方、被分析試料に抗原が含まれていなけれ
ば、すべての酵素結合抗体がいまだ結合していない結合
部位を有し従って第二層に存在する固定抗原と結合す
る。第二層の固定抗原と結合した酵素結合抗体は第三層
に拡散できず、発色反応は生じない。リオッタに付与さ
れたフランス特許第8708007号（公開番号第2599845号）
には、二層のみを含む上記装置の変形例が記載されてい
る。その上層は抗原と二種類の反応性抗体とを担持し、
下層には発色基質が含まれる。その二つのゾーン、つま
り、捕捉ゾーンと基質ゾーンとは並置されることも可能
である。酵素結合抗体と結合した試料中の抗原が拡散す
る多孔性層は、このように、酵素によって標識された抗
体と結合した抗原のみを通過させる選択フィルタとして
作用し、試料中に抗原が存在しないために抗体が抗原と
結合しない場合にはそのような機能は示さない。

ハイブリテックに付与された米国特許第4632901号
（およびそれに対応するPCT国際出願第85/05451号）に
は、長時間のインキュベーションやそれに関係した洗浄
操作が不要で、その簡易性によって医師が手術中に使用
でき、さらには患者が自宅で使用することもできる免疫
検定実施方法および装置が記載されている。この装置に
は第一多孔性要素と第二吸収性要素とが含まれる。前者
は、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体が
結合させられた膜もしくはフィルタによって構成され、
その抗体が同定されるべき抗原を識別する。後者は、そ
の上面および下面に垂直な毛細管通路を有し、本装置の
前記第一要素を構成する多孔性膜等と毛細管連通状態に
ある。第一要素の孔のサイズは、他の手段を使用しない
でもその中を液体が通過するように誘導することができ
る程度とされている。多孔性のフィルタ膜はNH₂基を有
するナイロンにより構成することができ、抗体はそのNH
₂基にグルタルアルデヒドの存在下でカップリングによ
り共有結合させられる。また、吸収性要素は、セルロー
スアセテート，ポリエテル，ポリオレフィン等の繊維な
どの繊維性フィルタ材料により構成することができる。
これら二つの要素は、抗体と非特異的には結合せず、標
識抗体を吸収性要素の上面に非特異的には結合させない
別の多孔性要素（例えばポリエチレンにより構成され
る）によって互いに分離させることができる。

同様に、アボットラボラトリーズ（ABBOTT LABORATOR
IES）のヨーロッパ特許出願第186100号には、被試験試
料中の物質の存在もしくは量を測定する装置が記載され
ている。この装置には、疏水性のポリマが植え込まれた
ガラス等の非吸収性多孔繊維性マトリックスが使用さ
れ、その疏水性のポリマがマトリックスの少なくとも一
部を被覆しそれに対して試料中の被同定物質と反応し得
る抗体もしくは抗原等の試薬が結合させられる。この装
置は、吸収性材料よりなる基底層および／または、前記
繊維性マトリックスを被覆して“前フィルタ”として作
用し得るグラスファイバもしくはセルロースフィルタ紙
等の繊維性材料の層と関係させることができる。

また、ミュレックスコーポレーション（MUREX CORPOR
ATION）のヨーロッパ特許出願第206561号には、少なく
とも一つの反応ゾーンとそれに関係させられた少なくと
も一つの周辺ゾーンとを有するフィルタ要素と、その第
一要素の周辺ゾーンにのみ関係させられた吸収性ゾーン
と、そのフィルタを適当な位置に保持する要素とを含む
診断装置が開示されている。その反応ゾーンで生じる
“反応”もまた等しく、免疫的カップリングとしての濾
過による分離であり得、その反応を読み取るための信号
がそのゾーン内に現れる。試験用液体試料は漏斗通過後
フィルタに到達するが、その漏斗の出口オリフィスの径
は、漏斗における液体の圧力との関係において、液体が
フィルタの上面に落下するには充分であるがそれを通過
してしまうことがないように計算される。さらに、流体
静力学的圧力が調節されて、その液体が重力下でフィル
タに浸透し、フィルタをそのまま垂直的に通過してしま
うことなく、毛細管作用によってその中を拡散するよう
にされている。

上記の全ての装置に共通する特徴は、試験用液体試料
が流通する多孔性フィルタ要素が使用されることと、そ
の液体流速を低下させる手段が適宜設けられることであ
る。しかしながら、この型のフィルタ要素では、それと
結合させられた試薬と液体試料中の被同定物質との間で
充分な接触時間を確保することができず、そのために、
試料に含まれる極めて低濃度の物質をも測定できるよう
な感度を示す反応を得ることができない。さらに、抗原
−抗体複合体等のリガンド−受容体複合体が適宜含まれ
た液体試料がフィルタ要素を流通することから読み取り
誤差が生じ易くなる。

従って本発明の目的は、流体中の反応性リガンドを定
性的ないし定量的に迅速測定する装置および方法であっ
て、従来の技術において同一の目的のために提案された
装置および方法よりも一層実際的なニーズをみたす装置
および方法を提供することである。本発明の装置におい
ては、生物流体等の流体中に存在する抗原等の非常に低
濃度のリガンドを検出できることから、その感度は従来
の装置に比較して極めて高い。本発明による検出可能な
濃度は例えば５ピコグラム程度の低さであるのに対し、
従来の方法ではそれほど低い濃度を検出することができ
ず、精々数マイクログラム（μｇ）に止まる。また、本
発明によれば被検出物質と試薬の間での２つの反応が各
々別の完全に独立した場所で行なわれ、それらの反応が
極めて特異的な反応であることから、交差反応の生じる
危険性も完全に回避され、競合法を用いないでも間違っ
た陰性もしくは陽性結果を示すことがない。さらに、複
数の型のモノクローナル抗体を同時に使用することがで
き、また、その結果を読み取る方法としては、比色法，
螢光分析法，化学発光法，放射能測定法等のあらゆる方
法を適用することができる。加えて、定量的検定を行な
うこともできる。

本発明は、流体中の反応性リガントを定性的ないし定
量的に迅速測定する装置であって、同定されるべき前記
リガンドと反応する標識された抗体もしくは抗原等の標
識された試薬を担持する（contain）反応ゾーンと、発
現（developement）ゾーンとを含む装置であって、 少なくとも一時的に不透過性である膜を含み、前記流
体の被検査試料を受け入れるようにされ、かつ、前記試
料中に存在するかも知れない前記被同定リガンドを識別
し得る少なくとも１つの適当に標識された試薬（reagen
t）と前記膜を透過性とする手段とに関係させられる第
一反応ゾーンと、 その第一反応ゾーンから独立であって前記膜によって
少なくとも一時的にその第一ゾーンから隔離され、前記
被同定リガンドを識別し得る非標識基準試薬を担持する
固相を含み、かつ、少なくとも一時的に不透過性である
第二膜によって前記第一膜と反対の側で少なくとも一時
的に閉鎖される第二反応ゾーンと、 前記第二膜によって少なくとも一時的に前記第二反応
ゾーンから隔離さるとともに、前記第一もしくは第二反
応ゾーンで生じたかも知れない反応を発現させる手段を
有する第三反応ゾーンと を含み、かつ、前記膜の少なくとも一方が、前記各反応
ゾーンにおいて前記反応が生じるのに充分な第一時間不
透過性である材料によって構成され、その材料がその第
一時間の経過後透過性とさせられることによって前記反
応の結果として生じる反応生成物が次の反応ゾーンに到
達し、前記各膜の一方もしくは両方を透過性とする手段
がその一方もしくは両方の膜を溶解させる物質（substa
nce）かもしくは分解させる物質（agent）であることを
特徴とする測定装置に関する。

本発明の装置のある実施例においては、前記各膜の一
方もしくは両方を透過性とする手段が、その膜から独立
している。

本発明の装置の他の有利な実施例においては、前記各
膜の一方もしくは両方を透過性とする手段が、その膜に
内包されている。

本発明の有利な構成例においては、前記一方もしくは
両方の膜を製造するために使用される少なくとも一時的
に不透過性である材料が、炭水化物，蛋白質，ゼラチ
ン，脂質，プラスチックスを含む群の中から選択され、
特に、ゼラチン，脂質，プラスチックスの中から選択さ
れる。

本発明の装置の他の有利な実施例においては、前記第
一反応ゾーンが、もし適当であれば前記各膜を分解する
前記分解物質との関係において、望ましくは前記第一膜
により支持されて、前記すくなくとも１つの適当な標識
試薬を担持する固相を収容するに適したものである。

本発明によれば、好ましくは、標識試薬としては、特
に酵素，放射性同位元素，螢光もしくは化学発光発色性
物質によって標識されたものが有利に使用され、また、
抗体もしくは抗原がそのような標識試薬として有利に使
用される。

また、本発明によれば、好ましくは、少なくとも前記
第一膜を構成する材料が、その第一膜が適当な時間の後
に前記被検査用試料の水性液相によって溶解されるもの
である。

本発明によれば、好ましくは、前記膜を透過性とする
物質がその膜を分解する適当な酵素等の作用物質からな
り、その物質が当該膜の中に内包させられるか、本装置
に導入されることによってその膜と関係させられるもの
であるか、あるいは前記試薬を含む固相に関係させられ
るものである。

本発明の装置の他の有利な実施例においては、前記第
二反応ゾーンに存在する前記非標識基準試薬を担持する
前記固相が、前記被同定リガンドに対応する非標識基準
試薬（特に抗体もしくは抗原等）が結合させられた不溶
性の支持体から成り、当該不溶性の支持体が、マイクロ
スフェア，マイクロプレートを含む群から選択される。

本発明の装置の他の有利な実施例においては、前記反
応が比色法によって測定される場合に、前記第三反応ゾ
ーンが発色基質（chromogenic substrate）を含む。

本発明の装置の他の有利な実施例においては、前記第
一反応ゾーンと第二反応ゾーンとの間に標識された試薬
を含む中間ゾーンを有し、その場合に、前記第一反応ゾ
ーンが非標識試薬を含む。

上記実施例の有利な態様においては、前記中間ゾーン
が、酵素等の適当な分解物質により適当な時間の後に放
出され得る少なくとも１つの試薬を内包する少なくとも
一重の多層小胞状構造体を含む。

上記実施例の他の有利な態様においては、前記中間ゾ
ーンが、前記第一膜と前記第二反応ゾーンとの間に設け
られた中間膜にて構成され、その中間膜が好適には前記
標識試薬と関係させられ、その場合に、前記第一膜が前
記中間膜と同一種類の試薬と関係させられる。

本発明の装置の３つの反応ゾーンを有する実施例にお
いては、生物流体中の抗原もしくは抗体など、流体中の
反応性リガンドの存在もしくは不存在の定性的な測定を
行なうことができる。さらにもう一つの反応ゾーンを有
する実施例においては、そのようなリガンドの半定量的
検定を行なうことができる。

本発明によれば、前記第三反応ゾーンが、RIA,分光光
度計等の既存の定量装置に関係させられることによっ
て、低量的検定を行なうことができる。

本発明の装置の他の有利な実施例においては、前記各
反応ゾーンを重ねることにより、前記第一反応ゾーンを
含む上段と、前記第二反応ゾーンを含む中段と、前記第
三反応ゾーンを含む下段とが形成され、適当であればそ
の上段と中段との間に前記中間反応ゾーンを含む中間段
が形成される。

本発明はまた、流体中の反応性リガンドを定性的ない
し定量的に迅速測定する方法であて、その第一工程にお
いて、前記流体の分析用試料が、本工程に続く各工程が
行われる各ゾーンから一時的に隔離されたゾーンにおい
て、標識された抗体もしくは抗原等の標識された試薬
と、リガンド−試薬反応が生ずるに充分な時間接触させ
られ、その後、その反応が生じた前記ゾーンの前記隔離
が破壊されることにより、第二工程において、後続ゾー
ンから一時的に隔離された第二ゾーンにおいて、前記反
応の結果として生じるいかなる反応生成物も、同定され
るべき前記リガンドに対応する非標識第二試薬との接触
を許容され、その後、その第二ゾーンの前記隔離が破壊
されることにより、第三工程において、前記第一もしく
は第二反応の生成物が、前記被検出リガンドの存在もし
くは不存在を明らかにする手段と接触させられることを
特徴とする測定方法に関する。

本発明の方法を実施するある実施例においては、前記
流体試料が、前記第一工程において、非標識試薬と接触
させられ、前記第二工程に先行して中間工程が行なわ
れ、その中間工程において、第一工程において形成され
たリガンド−非標識試薬複合体が、次の工程から一時的
に隔離されたゾーンにおいて、第一工程において使用さ
れた試薬と同一種類であって標識された試薬と接触させ
られる。

本発明の方法を実施する上記実施例の有利な態様にお
いては、前記第一工程において前記分析用流体試料と接
触させられる前記非標識試薬が、被検出リガンド等の既
知の量のリガンドに対応する所定量にて使用され、その
第一工程において前記試薬と結合しない過剰のリガンド
が、前記中間工程において、前記標識試薬と結合するこ
とによってそれに捕捉され、その結果、前記分析用流体
試料中における前記リガンドの存在の可能性を明らかに
する反応がその試料中のリガンドの量が前記所定量を上
回る場合にのみ陽性を示し、それにより前記流体中に存
在するリガンドが半定量的に測定される。

本発明の方法を実施する他の有利な実施例において
は、前記第一工程が吸収相であり、前記第二工程が放出
相であり、前記第三工程が吸収相である。

本発明の方法が前記第一工程と前記第二工程との間に
前記中間工程を含む場合において、当該中間工程が前記
第一工程と同様に吸収相である。

上記の諸態様に加えて、本発明は、以下の記載から明
らかとなるその他の態様をも含むものである。

本発明は以下の記載によってより明確に理解されるで
あろう。その記載中以下の図面が参照される。

第１図は、本発明の装置のある実施例の縦断面概略図
である。

第２図は、抗原の存在を定性的に測定する方法の各工
程を示す略図である。

第３図は、抗体の存在を定性的に測定する方法の各工
程を示す略図である。

第４図は、ヒトの血清中に存在するACEの定量的検定
のためのグラフである。

但し、それらの図面及びそれに対応する記載とは本発
明の内容を詳しく説明するためのものであって、何らの
限定も意図しないことが明確に理解されるべきである。

第１図に示されている本発明の装置は、下から順に、
支持部材７と、その支持部材７に支持された発色基質と
してのペレット６と、そのペレット６の上に設けられた
第一の膜３′を含む。第一の膜３′については後に詳述
する。第一の膜３′の上にはマイクロスフェア層５が設
けられている。この層５についても後に詳述するが、マ
イクロスフェア層５の両面は好ましくは、従って必ずそ
うでなければならないということではなく、織物等の適
当な材料からなる保護層によって保護される。マイクロ
スフェア層５の上には第二の膜３が設けられる。本装置
の枠組みは構造部材２と支持部材７と中間枠部材８とに
よって構成される。構造部材２の杯状凹部９には、本装
置によって検出されるべきリガンドを識別する試薬のペ
レット１が挿入される。ペレット１は好ましくは凍結乾
燥されたものが使用される。

本装置によって検出されるリガンドは、あらゆる種類
の化学物質および生物物質であり、特に抗原および抗体
である。本発明の方法および装置の適用範囲は極めて広
い。その中から具体例を挙げれば、ウィルス性および微
生物性愁訴の診断，酵素検定，自己免疫患者およびアル
ツハイマ病の診断，癌の早期発見，迅速な血液型判定，
血液中の薬物の検定，アレルゲンの検出およびアレルギ
ーの診断，膜受容体の検定，ホルモンの検定，エレクト
ロフェログラムにおける陰イオン，陽イオン等の化学成
分の検定等である。勿論これらは例示にすぎず、網羅的
なものでも限定的なものでもない。

被検出リガンドを識別する試薬としては特に抗体もし
くは抗原があり、これらは好ましくは凍結乾燥され、ペ
レット１の形態で使用される。

ペレット１に内包（contain）される抗体もしくは抗
原は、放射性同位元素，酵素，螢光物質，適当な物質と
の間で発色反応を呈する化学物質等の適当な標識で標識
された抗体ないしは抗原である。

本装置の上段を構成する第二の膜３は、一時的に不透
過性である材料から作られる。第二の膜３が不透過であ
る時間は、検査される流体試料の一滴がペレット１と接
触し、その流体が被検出リガンドを含んでいた場合には
それと反応してリガンド−標識抗体ないしは標識抗原複
合体を形成するに充分な時間である。第二の膜３はその
時間の経過後に不透過性を失い、流体はそれが前記複合
体を含むか否かに関わらずその膜３を通過して装置の中
段に達する。

第二の膜３の材料としては好ましくは、通常の状態で
は不透過性であるが、適当な酵素によって20秒〜１分以
内で分解させられるものが使用される。第二の膜３がゼ
ラチンからなる場合には、それを分解させる酵素として
コラゲナーゼの使用が適している。この場合に、ゼラチ
ンを分解する酵素は抗体もしくは抗原のペレット１に内
包させるのが好ましい。というのは、リガンドと、ペレ
ット１に内包された試薬（抗体もしくは抗原）との反応
に要する時間が、この分解酵素が第二の膜３を分解させ
るのに必要な時間と同じオーダだからである。また、好
ましくは、ゼラチンの膜３の中にグラスファイバの構造
体を埋め込みその強度を改善する。その場合には、ゼラ
チンの分解後もそのグラスファイバ構造体が第二の膜３
の骨格として残る。他にも本発明の枠内において使用さ
れる膜の例が以下の記載中に開示される。

本発明装置の中段に含まれるマイクロスフェア層５
は、金属もしくは合金，ポリアクリルアミド等の適当な
材料によって構成され、その径は例えば10〜250μｍの
範囲とされる。そのマイクロスフェアは被検出リガンド
と同一もしくは類似の試薬（抗原もしくは抗体）を担持
（carry）する。マイクロスフェア層５を設ける目的
は、上段において遊離のまま残された標識試薬をこれで
捕捉することである。

上記の条件下で、生物流体の一滴を用いてその中の抗
原について検査する場合において、陽性反応が示される
場合の一連の現象は以下の通りである。流体中に存在す
る抗原が、第二の膜３上においてペレット１に内包され
た抗体と結合し、第二の膜３はその結合反応が起きると
直ちに適当な酵素によって分解させられる。次いで、抗
原−抗体複合体を含む流体が、マイクロスフェア層５を
それで捕捉されることなく通過し、第一の膜３′に達す
る。第一の膜３′はその流体に含まれる前記酵素によっ
て分解され、それにより流体は発色基質６を担持する発
現ゾーンに到達する。発色基質６は被検査流体と接触す
ることにより発色する。

それに対して、陽性反応の場合、すなわち、被検査流
体に抗原が含まれていない場合には、上段の標識抗体が
中段のマイクロスフェア層５に結合させられた非標識抗
原によって捕捉され、そのために発色基質６は発色しな
い。

流体中の抗体を検出する場合にも、上記の方法を必要
な変更を加えた上で適用し得る。

半定量的測定を行なう場合には、上段の試薬を非標識
とし、上段の次に、多層小胞状構造体もしくはマイクロ
カプセルを含む中間段を設けてそこに標識試薬を内包
（incorporate）させる。第二の膜３に関係させられる
抗体等の試薬は、10ng/mlなどのxng/ml程度の所定の量
の抗原に対応する量で使用される。被検査流体がその所
定量を上回る量の抗原を含んでいる場合には、その過剰
量が中間段の小胞状構造体に内包された標識抗体と結合
し、そして直ちにその小胞状構造体が分解酵素の作用の
下で開放させられる。こうして得られる測定結果は、あ
る閾値に対する相対的なものであって、そこで本測定は
半定量的測定である。

第２図においては、陽性反応が得られる場合の抗原の
定性的検定が説明される。図において符号10は形成され
た抗体−抗原複合体を示す。複合体10はマイクロスフェ
ア層５に捕捉されずに中段11を通過し、下段16において
陽性反応を示す。詳述すると、ペレット１のすべての標
識抗体が血清中に存在する抗原によって約30秒で飽和さ
せられ、第二の膜（上の膜）３の分解とともにすなわち
当該30秒の時間の経過の後、その飽和複合体がマイクロ
スフェア層５に達する。マイクロスフェア層５には血清
中の被検出抗原と同一種類の抗原が結合させられている
が、マイクロスフェア層５は飽和複合体とは結合するこ
とができず、従って複合体は分解された第一の膜３′を
通過して発現ゾーンに到達する。

第２図に示された検定方法は例えば梅毒抗原の存在の
定性的検定に適用され得る。

上段13の試薬として使用される標識抗体は、正の制御
（positive control）血清（パスツールコード76751）
由来のヒトのIgGs（500ピコグラム）を用い、これをコ
ンカナバリンＡ上でペルオキシダーゼ［メルク（Merc
k）］で標識した［グエスドン（GUESDON）とアヴラメア
ス（AVRAMEAS）の方法,1980］ものである。試薬を内包
するペレット１はまた、膜3,3′を分解させる酵素をも
内包する。膜3,3′がゼラチンからなる場合には、この
酵素にはコラゲナーゼが使用され、その場合、ペレット
１には好ましくは５単位のコラゲナーゼ［カルバイオケ
ム（Calbiochem）のコラゲナーゼクロストリディウム
（Collagenase Clostridium）］を内包させる。第二の
膜３はまた、厚さ10μｍ、３μｍの多数の孔を有するポ
リカルボネート−DMF製の膜とされてよく、その孔はゼ
ラチンの熱（hot）３％エタノール溶液によってブロッ
クされ、孔をブロックするゼラチンは30秒でコラゲナー
ゼによって分解される。第二の膜３はグラスファイバの
構造体によって補強される。試薬として使用される標識
ポリクローナル抗体14は、その試薬14を含むペレット１
に血清の滴に含まれた血清抗原15が接触させられること
により、標識抗体−抗原複合体10を形成する。VDRL抗原
陽性の血液は50マイクロリットルの滴当たり約200ピコ
グラムのVDRL抗原を含むので、上段13に導入される標識
抗体としては500ピコグラムで充分に血清抗原15を捕捉
することができる。また、過剰の抗体は、Ag−Ab反応を
加速させる効果を有する。詳述すると、上段13の500ピ
コグラムの標識抗体14の中、200ピコグラムが血清抗原1
5と結合してAg−Ab複合体10を形成し、そのAg−Ab複合
体10は中段11のマイクロスフェア層５を構成する固相と
は結合しない。“マグノゲル（Magnogel）”（IBF）の
マイクロスフェア（５μ）は、プロテインＡ＋グルタ
ルアルデヒド（IBF試薬）およびVDRL［ダイアグ．（Dia
g.）パスツールコード52675］のVDRL−ラテックス抗原
（1ng/5μ）によるコーティングを含む。第二の膜３
のゼラチンが分解させられると直ぐに、遊離状態にある
300ピコグラムの標識抗体は中段11のマイクロビーズ５
に担持されたVDRL−ラテックス抗原と結合する。他方、
血清抗原15によって飽和させられた200ピコグラムの標
識抗体14（10）は、孔をブロックしているゼラチンが分
解させられるとともに、第一の膜（下の膜）３′（第二
の膜３と同じ材料よりなる）を通過して基質（Ｓ）８を
含む発現ゾーンとしての下段16に到達する。基質（Ｓ）
８は好ましくは、ホワットマン第１号紙（Whatman no.1
paper）等の適当な支持体上に担持された安定3,3′,5,
5′−テトラメチルベンジジン［ICN−マイルズラブ．
（MILES LAB.）］よりなる。複合体10は基質８と結合す
ることにより発色反応（12）を呈する。基質８が3,3′,
5,5′−TMBに加えてグルコースオキシダーゼ／β−Ｄ−
グルコース複合体を含む場合には、わずか20ピコグラム
で発色反応が生じ得る。グルコースオキシダーゼ／β−
Ｄ−グルコース複合体が血清に接すると過酸化水素が発
生し、それにより発色反応が強められるのである。

第３図においては、陽性反応が得られる場合の抗体の
定性的検定が説明される。約30秒ですべての標識抗原が
血清抗体によって飽和させられ、その後、第二の膜（上
の膜）３が分解させられ、それによりすべての抗体−標
識抗原複合体が中段11のマイクロスフェア層５に達す
る。そのマイクロスフェア層５には被検出抗体と同一種
類の抗体が結合させられているが、エピトープ（抗原部
位）はすでに血清抗体によって飽和させられているの
で、マイクロスフェア層５と結合した抗体によっては識
別されず、複合体は発現ゾーンに到達し、そこで基質８
と反応して発色する。

４ 第３図に示された検定方法は例えばトキソプラズマ
病の抗体の検出に適用される。

標識抗原として使用される試薬として、上段13は、好
ましくは凍結乾燥（250ピコグラム）されるとともにペ
ルオキシダーゼ（メルク）で標識されたトキソプラズマ
病抗原（ダイアグ.,パスツールコード52721）を担持す
る。抗原17を内包する凍結乾燥ペレットにはさらに、分
解酵素が内包させられる。膜3,3′が第２図との関係に
おいて記載したものである場合には、分解酵素としては
特にコラゲナーゼ（５単位）（カルバイオケムのコラゲ
ナーゼクロストリディウム）が使用される。試薬として
使用される標識抗原17は、当該試薬17を含むペレット１
に血清の滴に含まれた（ポリクローナル）血清抗原18が
接奥させられることにより、標識抗原−血清抗体複合体
19を形成する。抗トキソプラズマ表抗体陽性の血液は10
0〜150ピコグラムの抗トキサプラズマ病抗体を含むの
で、250ピコグラムの標識抗原で充分に血清抗体18を飽
和させることができ、血清抗体18が中段11のマイクロビ
ーズ（５μ）20と結合することはない。マイクロビー
ズ20としては、例えば、プロテインＡ＋グルタルアルデ
ヒド（IBF試薬，パスツール研究所抗体））の抗トキソ
プラズマ病抗体（1ng/5μ）によるコーティングを含
む“マグノゲル”（IBF）のマイクロビーズが使用され
る。非限定的具体例として記載したポリカーボネート膜
３が、その孔をブロックしているゼラチンの分解によっ
て透過性とさせられることにより、血清抗体18によって
飽和させられなかった標識抗原17がマイクロビーズ20に
よって支持された抗体と結合し、他方、標識抗原−抗体
複合体19は第一の膜（下の膜）３′をそれが透過性とさ
れる直ちに通過し、第２図との関係で記載したものと同
一であってよい基質（Ｓ）と結合して発色する。この発
色反応もまた、第２図との関係で記載した手段によっ
て、適宜、増幅され得る。

以上、本発明の装置を第１図〜第３図に示された実施
例について記述したが、これまでは計画された分解膜
（programmed lysis membranes）の具体例として概して
ゼラチンのみにてなるかもしくはゼラチンを含むものの
みを記載した。しかし、本発明においてはそのような計
画分解膜はその他の材料によっても構成され得ることは
明らかである。以下、本発明による非限定的具体例につ
いて記述するが、その目的は、本発明の枠内で使用され
得る他の計画分解膜の例について記載することと、本発
明の検定装置および方法を血清もしくは尿中に存在する
抗原もしくは抗体の検定に適用した例について記載する
こととである。

例１ 脂質膜の調製 脂質膜は、種々の両親媒性脂質ないしは脂質の混合物
から調製され得る。

不透過性膜の調製に最も適した脂質は燐脂質であり、
それはコレステロールと関係させられたものであっても
よい。それは細胞膜の基本構成要素である。

天然（非合成）の燐脂質は共通のラジカル（基）Ｒと
互いに異なる末端基（terminal group）とを以下のよう
に有する。

Ｒ−Ｈ ホスファチジン散 Ｒ−CH₂−CH₂−Ｎ−（CH₃）_３ ホスファチジルコリン Ｒ−CH₂−CH₂−NH₃ ホスファチジルエタノールアミン Ｒ−CH₂−CHOH−CH₂−OH ホスファチジルグリセロール Ｒ−CH₂−CHOH−CH₂−Ｏ−Ｒ′ カルジオライピン Ｒ−R₁複合体 スフィンゴミエリン 合成の燐脂質が存在し、それらは優れた抵抗性，特性
保持性等を示す。それを以下に示す。

DMPC ジミリストイルフォスファチジルコリン DPPC ジパルミトイルフォスファチジルコリン DSPC ジステアロイルフォスファチジルコリン 1.脂質溶液の調製 −燐脂質 10μmol −ベンゼン 1ml 溶液はヴォルテックス（Vortex）上で１分間撹拌され
る。

2.次いで40℃の水浴中で数分間加熱される。

3.12μが、ナイロン，ニトロセルロース，セルロース
紙，ポリエステルの各支持体の中の一つ［直径13mm、0.
45μ程度の孔度（porosity），厚さ100μ［上に適用さ
れる。

4.高真空（60mmHg）下でベンゼンが蒸発させられ、残留
物がそのまま真空下なしはアルゴン中に保持される。

5.この種の膜の分解は、適当な洗剤（detergent）およ
び／またはペルオキシダーゼによって行なわれる。

分解試験 10μの水がペレット上に適用された場合、その滴は
少なくとも１時間の間不動のままであった。

10μのトゥイーン（Tween）20もしくはトリトン（T
riton）Ｘ−100,0.02％および／またはペルオキシダー
ゼ1ng/μがペレット状に適用された場合、10μの滴
は45秒間不動であったがその後直ちに支持膜を通過し
た。

6.膜のキャリブレーション 膜の分解時間は、以下に示
される諸態様のように、燐脂質の濃度もしくは洗剤／ペ
ルオキシダーゼの濃度を変化させることにより変更する
ことができる。

6.1 ベンゼン1ml中に10μmolの燐脂質を含む溶液から
膜を調製した場合、トリトンＸ−100,0.02％の滴は90秒
後に通過する。

6.2 同じ濃度の燐脂質に対してトリトンＸ−100,0.01
％を適用した場合には、分解は５分後に生じる。

6.3 ベンゼン1ml中に５μmolの燐脂質を含む溶液から
膜を調製した場合、トリトンＸ−100,0.02％はその膜を
15秒で通過し、他方、トリトンＸ−100,0.01％を使用し
た場合は50秒必要である。

重要注記−非イオン性洗剤はある種の溶液（ペルオキ
シダーゼで標識された抗体等）を適当に保護するととも
に、当該ペルオキシダーゼと関係して膜を分解する。

例２ アクリレート共重合体膜の調製 1.以下の貯蔵溶液が調製される。

−プロパン−２−オール（イソプロパノール） 30％ −アクリル酸／アクリレート共重合体 40％ −ヒドロキシプロピルメチルセルロース 20％ −クエン酸アセチルトリエチル ５％ −塩酸アルミニウム（Alminum chlorhydrate） ５％ 溶液は40℃の水浴中で10分間加熱される。

さらにヴォルテックス上で１分間撹拌される。

そして密閉容器中に保持される。

2.前記の例で記載した支持体の中の一つに適用される前
に、貯蔵溶液は純粋エタノールを用いて、貯蔵溶液１体
積に対して純粋エタノール５体積の割合で希釈される。

3.10μが、直径13mmの支持体の上に適用される。

4.支持体が真空下で乾かされ、乾燥剤が存在させられた
真空下に保持される。

5.この種の膜は、pH7.2のPBSで分解される。

分解試験 pH7のPBS10μの滴が使用された場合、それはゆっく
りと（約１分で）膜を通過する。

pH7.2のPBS10μの滴が適用された場合、それは数秒
で支持体を通過する。

6.以下のものを変更することによってアクリルフィルム
の分解時間を短縮もしくは延長することができる。

−貯蔵溶液の組成（例えば，プロパン−２−オールの割
合の増減） −エタノールの割合，例えば10体積中９体積がエタノー
ルとされた場合、フィルムは極めて急速に通過し、５体
積中４体積がエタノールとされた場合、通過は遅くな
る。

7.クエン酸アセチルトリエチルの濃度を変えることによ
って分解のpHを変更することができる。

例３ タンパク質膜の調製 第１図〜第３図の装置に関連して記載されたゼラチン
の膜は、以下のようにして有利に調製される。

以下の組成を有する貯蔵溶液が調製される。

−寒天 5ml −脱塩された水 95ml 溶液は磁気撹拌（magnetic stirring）によって50℃
に加熱される。

10μが、例えば例１に記載されている支持体上に適
用される。

支持体は真空下で乾かされる。

次いで、乾燥剤が存在する真空下に保持される。

寒天はコラゲナーゼによって分解される。

分解試験 このようにして用意されたペレットの上に10μの水
が適用された場合、その水は一時間以上不動のままであ
る。

1IU/μを含むコラゲナーゼの溶液10μが適用され
た場合、その滴は45秒間で支持体を通過する。

タンパク質膜の流体による通過は、それを通過する溶
液にコラゲナーゼのほかに他のどのようなタンパク質分
解酵素を含ませることによっても調節することができ
る。ここでコラゲナーゼが選択される理由は、それが膜
の上もしくは下で生ずると予想される生物反応に適合的
であるのに対して、他のタンパク質分解酵素は抗体ない
し標識としてのタンパク質等に有害であるからである。

また、ゼラチンの濃度もしくはコラゲナーゼの濃度を
変えることによって膜の通過時間を変更することができ
る。すなわち、ゼラチンの量を減らすかコラゲナーゼの
量を増やせば時間は短縮され、ゼラチンの量を増やすか
コラゲナーゼの量を減らせば時間は延長される。

例４ 炭水化物膜の調製 以下の貯蔵溶液が調製される。

−Ｄ−グルコース 10グラム、 −脱塩された水 5ml、 が70℃に加熱される。ヴォルテックス上で撹拌されてい
る状態で、10gのＤ−グルコースが少量ずつ添加され
る。連続的な添加の間も撹拌は継続される。その結果、
シロップ様の粘度を持つ高濃度の溶液が得られる。

このシロップ様溶液１体積が99％純粋エタノールの１
体積で希釈され、その後、この溶液10μが例１に記載
されている支持体の上に適用される。支持体は真空下に
おいて37℃の温度で乾かされる。この種の膜は水の存在
下で分解される。

分解試験 10μの水が適用される。

１−Ｄ−グルコース不適用で同じ支持体の場合、直ぐ
に通過する。

２−Ｄ−グルコースが適用された支持体の場合、35秒
後に通過する。

とりわけ粗いＤ−グルコースは適している。というの
は、それがグルコースオキシダーゼと接触して過酸化物
が生じ、その結果として、ペルオキシダーゼを標識に使
用する検定では信号を増幅することになるからである。

例５ 血清中に存在するACEの検出 第４図はヒトの血清試料中に含まれるACEの検定のた
めのグラフである。

検査用試料の体積は50μである。各々同じ体積のヒ
ト血清試料10サンプルと、ACEを含まないヒト血清試料
１サンプルとが、各々以下の手順で処理される。

各試料は凍結乾燥されたペレット１の上に滴下され
る。ペレット１は第二の膜３によって支持されており、
マウスのIgG1を1250ピコグラム内包している。このIgG1
はACEのエピトープ328.Cに対応し、ペルオキシダーゼで
標識されている。

30秒で標識抗体はすべて血清抗原によって飽和させら
れる。ゼラチン等からなる（グラスファイバ網により補
強された）第二の膜３のコラゲナーゼによる分解は、当
該30秒の経過によって生じ、その結果、血清抗原によっ
て飽和させられた標識抗体を含む流体が第二反応ゾーン
に到達し、そこでマイクロビーズ層５と接触する。マイ
クロビーズ層５は同一の抗原でコーティングされている
が、飽和標識抗体はマイクロビーズ５をコーティングす
るこの抗原によって捕捉されない。というのは、抗体の
Fab部が既に血清抗原によって飽和させられているから
である。他方、第二反応ゾーンに流れ込んだ流体中に存
在する酵素は第一の膜３′を溶解させ、その結果、流体
は第三反応ゾーンに達する。このゾーンにおいては、血
清抗原と結合した標識抗体がすべて基質８のペレットと
接触する。このペレットは例えば3,3′5,5′−テトラメ
チルベンジジンである。そこで、ペルオキシダーゼの存
在の下に準瞬間的に発色が生ずる。本装置の下に小さな
ストリップ（片）を置き当該装置で濾過されたものを集
め、その反応信号を検出することにより、マイクロビー
ズ層５を通過した被標識物質の量を測定する。

被分析試料に含まれるACEの各濃度が第４図に示され
ている。血清（ml）中のACEの各濃度は、0.5,1,1.5,2,
2.5,5,10,15,20ng/ml,すなわち、被検定試料50μ中の
ACEは各々25,50,75,100,125,250,500,750,1000ピコグラ
ムである。

本発明の装置および方法における検出の閾値は極めて
低いので、本発明の枠内において、体積にしてわずか50
μという血液一滴を用いて、測定を行なうことが可能
である。

また、異なった診断標識を担持するマイクロスフェア
を使用することにより同時に複数種類の診断を行なうこ
ともできる。

本検定の感度は、使用されるモノクローナル抗体の感
度により５〜125ピコグラムのオーダとなる。そのた
め、超特異的なモノクローナル抗体を使用することが好
ましい。

前記のように、本発明の装置の連続する各段階は、水
に対して異なった親和性を示す複数の相を構成する。す
なわち、上段は吸収相であり、中段は放出相であり、下
段は吸収相である。この変化は、記載の例について言え
ば、例えばグルコースによる浸透圧勾配を形成すること
により達成される。その結果、液体はすべて下段の基質
に向かって吸収され、他方、陰性の場合には、被標識物
質のみがマイクロスフェア層５に捕捉される。

例６ 全血中の抗HIV抗体を検出する定性試験 6.1 全血中の抗HIV抗体を検出する装置 6.2 装置の操作 D122紙は以下の溶液によって処理される。

−スキムミルク 10％w/v −ゼラチン １％ −Exc.無菌蒸溜水 積層されたペレット上に全血の滴が適用されると、第
一のPLMの存在のために30秒間は不動のままである。

第一のPLMは30秒後に、標識抗原を適用するための溶
液（トゥイーン20,0.1％）に含まれた洗剤によって弁解
される。この洗剤は他に３つの極めて重要な機能をも
つ。すなわち、 −ペルオキシダーゼを抗原から保護すること、 −溶血反応を促進すること、 −遮断剤として作用して、長期に渡って保存する場合に
標識抗原がD122紙と結合することを防止すること、であ
る。

抗体はすべて、D122紙上に適用された溶液に含まれる
標識抗原と結合する。その溶液の組成は以下の通りであ
る。

−トゥイーン20,0.1％ −ゼラチン １％ −グルコースオキシダーゼで標識された抗原 10ng/μ
−Exc.PBS この溶液５μが適用される。

反応が陰性の場合は、標識抗原は30秒（第二のPLMの
分解時間）で固相の抗体と結合する。

反応が陽性の場合には、血清抗体／標識抗原複合体は
固相とは結合せず、抗原を標識するグルコースオキシダ
ーゼが発現ペレットのＤ−グルコースと接触して過酸化
水素を生じさせ、それが、ヘモグロビンのペルオキシダ
ーゼがTMBを発色させるための基質（H₂O₂）となる。

30秒後、第二のPLMは分解され、被検査抗体とグルコ
ースオキシダーゼで標識された抗原との複合体が発現ペ
レットに到達する。

例７ 全血中のACEを検定する半定量試験 第１図について記載したように、本発明の半定量試験
に使用される装置には、正常値に対応する所定の量の抗
原を予め捕捉する第一の固相が含まれ、その所謂正常値
を超える血液中の抗原が第二の固相によって捕捉され
る。

本試験において使用される装置を以下に示す。

装置の構成 固相 処理されたナイロン 結合抗ACE抗体が血液（m
l）中のACEを5ng/mlで捕捉 第一の脂質PLM処理されたD122紙 グルコースオキシダ
ーゼで標識された抗ACE抗体50ng/ngが過剰のACEと結合 第二の脂質PLM 第二の固相 結合抗原がACEで飽和されていない標識抗
体を捕捉 第三の脂質PLM ナイロンの支持体 TMB ３μ クエン酸干渉液1M 10μ Ｄ−グルコース 10μ 例８ 尿中のHCGを検出する定性試験（定性妊娠試験） 本装置は以下の構成を有する。

上記の８つの層は互いに積層され、直径２〜8mmのオ
リフィスが形成されたプレキシガラスのスライドととも
に押圧される。

ギルソン（Gilson）ピペットを使用して、新鮮な尿試
料90μが採取され、静かにそのオリフィス内に適用さ
れる。

尿の一部が直ぐに吸収され、適用された滴は20秒間は
不動のままであり、その後、急速かつ部分的に崩れる。
上方のペレットは湿った状態にある。20秒後、尿のレベ
ルが再び下がり、上方から観察すると装置は全く乾燥し
ているように見える。

以上の２つのステップは明らかに２つの膜，すなわち
標識抗体の下に置かれた膜と固相の下に置かれた膜との
各々の計画的分解を示す。

結果が陰性である場合には、生成される過酸化水素
は、ペルオキシダーゼで標識された抗体が存在しないこ
とから（光とTMB上のH₂O₂の結果として）１〜２分後に
サケ肉色を呈する。

反応が陽性の場合には、強いスカイブルーのスポット
が直ちに現れる。

呈色を保存するためには、それらを乾燥した場所であ
って特に暗所に保存することが必要である。その結果を
後で観察したい場合、実際には、試験装置をそのパッケ
ージに戻し、しっかり密封しておけばよい。発色はこの
状態で数日間消失しない。

例９ 尿中のLHのピークを検出する半定量試験 尿中のLHは全周期を通じて最小のレベルでは存在す
る。そして、排卵の前と排卵中に顕著なピークを示す。
従って本試験の要点は、LHのレベルが最小の時には発色
せず、LHのレベルがピークに達した時に発色信号を示す
ようにすることである。

これは標識抗体の上にさらに一段を設けることにより
達成される。当該段には以下のものが含まれる。

−最小レベルに対応する量のLHのみをそのレベルで捕捉
するように抗LH抗体を担持する固相と、 −固相の抗LH抗体が最小レベルのLHを捕捉するような時
間を許容する計画分解膜と、である。

本装置の残余の部分は定性試験装置の対応部分と同一
である。

変更例として、標識された抗LH抗体が第一SPのリポソ
ーム中に担持されるようにし、それにより、第一SPの抗
LH抗体が予め最小レベルのLHを捕捉するようにすること
もできる。

上記の記載から明らかなように、本発明は、明示的に
記載された実施の態様，実施例もしくは適用の態様に何
等限定されるものでなく、本発明の枠組もしくは範囲を
逸脱しない限り、当業者に自明のあらゆる変更を含むも
のである。

フロントページの続き (72)発明者 トレダーノ，ジャック フランス国 75020 パリ リュ・デ・ オルトー 55 (56)参考文献 特開 昭58−76763（ＪＰ，Ａ)

Claims (16)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】流体中の反応性リガンドを定性的ないし定
   量的に迅速測定する装置であって、同定されるべき前記
   リガンドと反応する標識された抗体もしくは抗原等の標
   識された試薬を担持する反応ゾーンと、発現ゾーンとを
   含む装置であって、 少なくとも一時的に不透過性である膜（３）を含むとと
   もに、前記流体の被検査試料を受け入れるようにされ、
   かつ、前記膜が、前記試料中に存在するかも知れない前
   記被同定リガンドを識別し得る少なくとも１つの適当に
   標識された試薬と当該膜を溶解させる物質かもしくは分
   解させる物質とに関係させられるようにされた第一反応
   ゾーン（13）と、 その第一反応ゾーンから独立であって前記膜（３）によ
   って少なくとも一時的にその第一反応ゾーンから隔離さ
   れ、前記被同定リガンドを識別し得る非標識基準試薬
   （５もしくは20）を担持する固相を含み、かつ、少なく
   とも一時的に不透過性である第二膜（３′）によって前
   記第一膜と反対の側で少なくとも一時的に閉鎖される第
   二反応ゾーン（11）と、 前記第二膜（３′）によって少なくとも一時的に前記第
   二反応ゾーンから隔離されるとともに、前記第一もしく
   は第二反応ゾーンで生じたかも知れない反応を発現させ
   る手段を有する第三反応ゾーン（16）とを含み、かつ、
   前記各膜（3,3′）が、前記各反応ゾーンにおいて前記
   反応が生じるのに充分な第一時間不透過性である材料に
   よって構成され、その材料がその第一時間の経過後前記
   溶解物質もしくは分解物質によって溶解もしくは分解さ
   せられることにより前記反応の結果として生じる反応生
   成物が次の反応ゾーンに到達し、その溶解もしくは分解
   が前記各反応ゾーンで生ずる前記反応と同時的に始まる
   ことを特徴とする測定装置。
2. 【請求項２】前記各膜の溶解物質もしくは分解物質が、
   その膜から独立している請求項１の測定装置。
3. 【請求項３】前記各膜の溶解物質もしくは分解物質が、
   その膜に内包されている請求項１もしくは請求項２の測
   定装置。
4. 【請求項４】前記第一反応ゾーン（13）が、もし適当で
   あれば前記各膜を分解する前記分解物質との関係におい
   て、望ましくは前記第一膜（３）により支持されて、前
   記少なくとも１つの適当な標識試薬を担持する固相
   （１）を収容するに適したものである請求項１ないし３
   の何れかの測定装置。
5. 【請求項５】前記第二反応ゾーン（11）に存在する前記
   非標識基準試薬を担持する前記固相が、前記被同定リガ
   ンドに対応する非標識基準試薬（特に抗体もしくは抗原
   等）が結合させられた不溶性の支持体（５もしくは20）
   から成る請求項１ないし４の何れかの測定装置。
6. 【請求項６】前記反応が比色法によって測定される場合
   に、前記第三反応ゾーン（16）が発色基質を含む請求項
   １ないし５の何れかの測定装置。
7. 【請求項７】前記第一反応ゾーンと第二反応ゾーンとの
   間に標識された試薬を含む中間ゾーンを有し、その場合
   に、前記第一反応ゾーンが非標識試薬を含む請求項１な
   いし６の何れかの測定装置。
8. 【請求項８】前記中間ゾーンが、酵素等の適当な分解物
   質により適当な時間の後に放出され得る少なくとも１つ
   の試薬を内包する少なくとも一重の多層小胞状構造体を
   含む請求項７の測定装置。
9. 【請求項９】前記中間ゾーンが、前記第一膜と前記第二
   反応ゾーンとの間に設けられた中間膜にて構成され、そ
   の中間膜が好適には前記標識試薬と関係させられ、その
   場合に、前記第一膜が前記中間膜と同一種類の試薬と関
   係させられる請求項８の測定装置。
10. 【請求項１０】前記第三反応ゾーンが、RIA,分光光度計
    等の既存の定量装置に関係させられる請求項１ないし９
    の何れかの測定装置。
11. 【請求項１１】前記各反応ゾーンを重ねることにより、
    前記第一反応ゾーンを含む上段と、前記第二反応ゾーン
    を含む中段と、前記第三反応ゾーンを含む下段とが形成
    され、適当であればその上段と中段との間に前記中間反
    応ゾーンを含む中間段が形成される請求項１ないし10の
    何れかの測定装置。
12. 【請求項１２】流体中の反応性リガンドを定性的ないし
    定量的に迅速測定する方法であって、その第一工程にお
    いて、前記流体の分析用試料が、本工程に続く各工程が
    行われる各ゾーンから一時的に隔離されたゾーンにおい
    て、標識された抗体もしくは抗原等の標識された試薬
    と、リガンド−試薬反応が生ずるに充分な時間接触させ
    られ、その後、その反応が生じた前記ゾーンの前記隔離
    が、前記ゾーンに存在しかつ前記流体と同時に一時的に
    不透過性である膜に到達してその膜との接触によりその
    膜を溶解させる物質かもしくは分解させる適当な分解物
    質によって破壊される−その隔離膜の漸進的で計画され
    た溶解もしくは分解は前記反応と同時に生ずる−ことに
    より、第二工程において、後続ゾーンから一時的に隔離
    された第二ゾーンにおいて、前記反応の結果として生じ
    るいかなる反応生成物も、同定されるべき前記リガンド
    に対応する非標識第二試薬との接触を許容され、その
    後、その第二ゾーンの前記隔離が前記溶解物質もしくは
    分解物質によって、漸進的で計画されかつ同時的な態様
    で破壊されることにより、第三工程において、前記第一
    もしくは第二反応の生成物が、前記被検出リガンドの存
    在もしくは不存在を明らかにする手段と接触させられる
    ことを特徴とする測定方法。
13. 【請求項１３】前記流体試料が、前記第一工程におい
    て、非標識試薬と接触させられ、前記第二工程に先行し
    て中間工程が行なわれ、その中間工程において、第一工
    程において形成されたリガンド−非標識試薬複合体が、
    次の工程から一時的に隔離されたゾーンにおいて、第一
    工程において使用された試薬と同一種類であって標識さ
    れた試薬と接触させられる請求項12の測定方法。
14. 【請求項１４】前記第一工程において前記分析用流体試
    料と接触させられる前記非標識試薬が、被検出リガンド
    等の既知の量のリガンドに対応する所定量にて使用さ
    れ、その第一工程において前記試薬と結合しない過剰の
    リガンドが、前記中間工程において、前記標識試薬と結
    合することによってそれに捕捉され、その結果、前記分
    析用流体試料中における前記リガンドの存在の可能性を
    明らかにする反応がその試料中のリガンドの量が前記所
    定量を上回る場合にのみ陽性を示し、それにより前記流
    体中に存在するリガンドが半定量的に測定される請求項
    13の測定方法。
15. 【請求項１５】前記第一工程が吸収相であり、前記第二
    工程が放出相であり、前記第三工程が吸収相である請求
    項12ないし14の何れかの測定方法。
16. 【請求項１６】前記第一工程と前記第二工程の間に前記
    中間工程が含まれる場合において、その中間工程が前記
    第一工程と同様に吸収相である請求項15の測定方法。