JP2001083152A - 乾式免疫分析方法及び乾式分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 被検物質（例えば抗原）と固定化被検物質と
標識特異結合物質（例えば、前記抗原に対する抗体）と
の競争的結合反応により、被検物質を簡便、迅速、高精
度に分析することができる乾式分析方法及び乾式分析要
素を提供する。 【構成】 固定化被検物質を含有する検出層の上に、標
識特異結合物質を予め含有させた標識物保持層を設け
る。検出層の下には吸水層を配置する。被検物質を含む
液体試料を点着するだけで、検出層内で被検物質と固定
化被検物質と標識特異結合物質との競争的結合反応を進
行させることができる。検出層の固定化被検物質と結合
しなかった標識特異結合物質は、分析要素内での液体の
拡散・移動に伴い吸水層に移動除去されるので、洗浄等
の操作を必要としない。検出層に形成された固定化被検
物質−標識特異結合物質の複合体の量は標識着色粒子の
吸収から容易に測定することができる。乾式分析要素に
よる分析であるので、小型測定機器への対応が容易とな
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は免疫学的反応を応用した
被検物質の簡便かつ迅速な乾式分析方法に関するもので
ある。詳しくは、被検物質（例えば抗原）を添加するこ
とにより、被検物質と固定化被検物質と着色粒子で標識
した特異結合物質（例えば、前記抗原に対する抗体）と
の間の競争的結合反応を、乾式分析要素の層構成の中で
行わせる乾式分析方法に関するものである。またこの分
析方法を可能にする乾式多層分析要素に関する。

【０００２】

【発明の背景】近年、医療分野において、各種疾患の診
断のために液体試料中の微量被検物質、特に抗原又は抗
体を迅速、簡便にしかも精度良く定量する必要性が高ま
ってきた。これらを検出する免疫測定法の多くは公知で
あり、サンドイッチ法、競合法などがある。

【０００３】特開昭60-192261にはいわゆるディップス
ティック法と呼ばれる固相免疫測定法が開示されてい
る。この測定法では、第１抗体を固定化した担体（試験
ストリップ片）を被検物質（抗原）を含む液体試料に浸
漬する。或いは、担体上の第１抗体固定化帯域に液体試
料を載置する。免疫反応を行わせた後、液体試料を洗浄
により担体上から除去し、次いで標識（例えば金コロイ
ド標識）第２抗体溶液を供給し、担体上でサンドイッチ
反応を行わせる。洗浄により未反応の標識第２抗体を除
去して、担体上に捕捉された被検物質（抗原）の在否を
標識物の着色スポットにより判定する。この方法は、特
別な機器を必要とせず比較的簡便な操作で、被検物質の
存在を定性的又は半定量的に判定することができ、少数
の検体を処理するのに適している。しかし、この方法は
標識物による着色の有無を目視判定するものであるた
め、定量的な分析には適していなかった。またアッセイ
には洗浄操作が必要であるため、大量の検体を分析する
場合には、操作が煩雑となる。

【０００４】特公平7-13640及び特開平10-73592には、
イムノクロマト法により被検物質の在否判定を行う固相
イムノアッセイ法が開示されている。この方法では、濾
紙などの毛管作用を有する長尺状媒体（ストリップ）の
一端（第１の帯域）に標識抗体を保持させる一方、別の
領域（第２の帯域）には第２抗体を捕捉用抗体として固
定化しておく。抗原を含有する液体試料を第１の帯域に
供給すると、被検抗原と標識抗体は毛管作用により、固
定化抗体のある第２の帯域まで拡散、移動し、この固定
化抗体により抗原と標識抗体とが捕捉される。捕捉用第
２抗体の帯域に現れる標識物の色調を検出することによ
り被検抗原の存在を確認するものであり、この方法はサ
ンドイッチ法を固相化したものと言える。

【０００５】また第１の帯域に標識抗体の代わりに標識
抗原を保持させた場合には、抗原を含有する液体試料を
第１帯域に供給すると、毛管作用により抗原と標識抗原
とが固定化抗体のある第２の帯域へ拡散移行し、ここで
固定化抗体との競合反応が起こることになる。このよう
な競合反応によっても被検抗原の存在を確認することが
できる。

【０００６】これらのイムノクロマト法は、試薬が乾式
化されているので、その保存安定性には優れている。し
かし、分析の定量性に欠けるという問題があった。ま
た、原理上、液体試料と標識体を水平方向に毛管作用に
より移動させなければならず、液体試料点着箇所と検出
箇所とが離れた位置となる。このような配置をとるため
には、当該部材をストリップ形状にする必要があり、必
然的に形状が大きくなる。このため、例えば機器による
光学測定を行う場合は不利になる。

【０００７】特開昭63-127160に開示された特異的蛋白
質の検出方法では、第２抗体をメンブレンフィルターに
固定化し、そこに被検物質と金コロイド抗体を順次添加
するキットを用いている。しかしながら、金コロイド抗
体はそれを含有する液体として外から供給されるため、
被検物質を含む液体試料の点着と金コロイド抗体含有溶
液の点着という２段階の操作が必要であり、操作の煩雑
さの問題は解決されていない。

【０００８】

【発明の目的】本発明は、被検物質の定量測定を簡便、
迅速、高精度で実施でき、さらに省スペース化を達成す
るための小型測定機器への対応が可能な形態の乾式免疫
分析方法を提供することを第１の目的とする。また本発
明は、このような乾式分析方法の実施に使用する乾式分
析要素を提供することを第２の目的とする。

【０００９】

【発明の構成】このような本発明の第１の目的は、以下
のステップを備える乾式分析方法により達成される。す
なわち、a) 被検物質を含有する液体試料を、この被検
物質に特異的に結合可能な特異結合物質を着色粒子で標
識した標識特異結合物質を含有する標識物保持層に点着
供給し；b) この標識物保持層の下に配置され固定化被
検物質を含有する検出層に、被検物質と標識特異結合物
質とを移行させ；c) 標識特異結合物質に対して被検物
質と固定化被検物質とを競合的反応させ、被検物質に結
合した標識特異結合物質を検出層の下に配置された吸水
層に移行させ；d) 検出層に形成された標識特異結合物
質−固定化被検物質の複合体の着色粒子、又は吸水層に
移行した標識特異結合物質−被検物質の複合体の着色粒
子の量を光学的に測定し、その結果に基づいて被検物質
の濃度を定量する。

【００１０】すなわち本発明の分析方法では、多層乾式
分析要素の層構成の中で、被検物質（例えば抗原）と標
識特異結合物質（例えば抗体）と固定化被検物質との競
争的結合反応を行い、形成された標識特異結合物質−固
定化被検物質の複合体の量或いは標識特異結合物質−被
検物質の複合体の量を分析要素外部から光学的測定によ
り検出するものである。標識特異結合物質−被検物質の
複合体は分析要素内での液体の拡散・移動に伴い吸水層
に移動除去されるので、従来法で必要とされた洗浄等の
操作を必要としない。

【００１１】これにより、被検物質（抗原）を含む液体
試料を点着するだけで、検出層に被検物質の量に応じて
形成される複合体の量を標識着色粒子の吸収から容易に
測定することができる。この複合体は、透過光又は反射
光の光学的変化として検出することが容易である。被検
物質の量が多くなるほど、検出層に形成される固定化被
検物質−標識特異結合物質の複合体の量は少なくなり、
また吸水層に移行する被検物質−標識特異結合物質の複
合体の量は多くなる。

【００１２】検出層を、少なくとも液体試料点着により
光透過性となる媒体で構成することにより、液体試料を
点着した検出層上面側から検出層に形成された固定化被
検物質−標識特異結合物質の複合体中の標識物（着色粒
子）を光学測定することができる。また吸水層を液体試
料点着により光透過性となる媒体（例えば親水性ポリマ
バインダなど）で構成すれば、吸水層側すなわち液体試
料点着面の裏面側から、吸水層に移行した被検物質−標
識特異結合物質の複合体中の標識物（着色粒子）量を光
学的に測定することができる。

【００１３】また本発明の第２の目的は、液体試料中の
被検物質に特異的に結合可能な特異結合物質を着色粒子
で標識した標識特異結合物質を含有する標識物保持層
と；この標識物保持層の下に配置され、固定化被検物質
を含有する検出層と；検出層の下に配置された吸水層；
とを備えることを特徴とする乾式分析要素により達成さ
れる。

【００１４】このような積層構成をとることにより、点
着された液体試料は標識物保持層から検出層を通り吸水
層に浸透する。その過程で、液体試料中の被検物（例え
ば抗原）は、標識物保持層に保持されていた標識特異結
合物質（例えば標識抗体）と共に、検出層に移行する。
検出層に予め含有されていた固定化被検物質と、被検物
質と標識特異結合物質との競争反応により、被検物質の
量に反比例した標識特異結合物質−固定化被検物質の複
合体が形成される。固定化被検物質に結合しなかった標
識特異結合物質は被検物質との複合体として試料溶液と
共に吸水層に移行し、検出層から除去される。

【００１５】このように液体試料は分析要素内で各層を
縦方向（膜横断方向）に拡散移動するので、固定化被検
物質−標識特異結合物質の複合体が液体試料点着部の直
下の検出層に形成されることになる。液体試料の点着部
と検出部とは、平面視同一部分となる。すなわち、本発
明の乾式分析要素は、検出部における標識物質に由来す
る発色等を液体試料の点着部を通して、或いは点着部の
裏側から検出可能な構造となっている。従って、乾式分
析要素の形態は非常に小さなチップ状に成り得る。この
ような、乾式分析要素の小型チップ化は本乾式分析要素
を定量測定するために必要な測定機器の小型化を可能に
し、このことは検査スペースの省スペース化を達成する
ために非常に有用である。

【００１６】

【発明の構成の詳細な説明】被検物質と特異結合物質 本発明で分析できる被検物質は、これに特異的に結合す
る特異結合物質が天然界に存在するもの、あるいは免疫
学的手段や化学的手段によりこれを用意できるものであ
ればよい。特異結合物質は、被検物質に対し特異的に結
合するものであり、かつ標識担体（着色粒子）に結合さ
せることのできる物質である。

【００１７】被検物質と特異結合物質との組み合わせ
は、例えば、抗原と抗体、ある種の糖類とレクチン、ビ
オチンとアビジン、プロテインＡとIgＧ、ホルモンとそ
のレセブター、酵素と基質、核酸とこれに少なくとも一
部が相補的な核酸などが例として挙げられる。この組合
せは、逆でもよい。

【００１８】最も一般的な例は、抗原を被検物質とし、
抗体を特異結合物質とするものである。被検物質として
の抗原には、例えば、被検物質と特異的に結合する抗体
を選択することによりヘモグロビン（糞便中）、トラン
スフェリン、卵胞刺激ホルモン、黄体刺激ホルモン、胎
盤性ゴナドトロピン、甲状腺ホルモン、リポタンパク、
アポリポタンパク、アルブミン、プロゲステロン、エス
トラジオール等があるが、これらに限定されるものでは
ない。

【００１９】特異結合物質としての抗体は、ポリクロー
ナル抗体でもよいが、親和性の均質性が確保できるモノ
クローナル抗体とするのが好ましい。本発明の分析方法
は、被検物質（抗原）と固定化被検物質と特異結合物質
（抗体）との間の競争的結合反応を利用するものである
から、この特異結合物質としての抗体は、抗原に対して
種々の親和性を持つ抗体の集団であるポリクローナル抗
体ではない方が望ましい。モノクローナル抗体を用いる
方が、より感度が上昇する。またこの抗体はＦabやＦa
b'やＦ(ab')₂等のフラグメントでもよい。

【００２０】標識着色粒子 特異結合物質を結合して標識する標識用着色粒子は、免
疫凝集反応に用いられている着色粒子を使用することが
できる。例えば、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン
共重合体のような有機高分子のラテックス着色粒子、金
属コロイドのような金属等を用いることができる。担体
粒子（又はコロイド）の平均粒径は、0.02〜10μmの範
囲が好ましい。色素を含有したリポゾームやマイクロカ
プセル等も着色粒子として使用することができる。

【００２１】従来公知の着色金属コロイドはいずれも標
識用着色粒子として使用することができる。例えば、金
コロイド、銀コロイド、白金コロイド、鉄コロイド、水
酸化アルミニウムコロイドなどが挙げられる。特に、金
コロイドと銀コロイドが適当な粒径において、金コロイ
ドは赤色、銀コロイドは黄色を示す点で好ましい。金属
コロイドの粒径としては、約１〜500nmが好ましく、特
に強い色調が得られる５〜100nmがさらに好ましい。

【００２２】金属コロイドと特異結合物質との結合は、
従来公知の方法（例えばThe Journal of Histochemistr
y and Cytochemistry, Vol.30,No.7,pp691-696,(198
2)）に従い、行うことができる。すなわち、金属コロイ
ドと特異結合物質（例えば抗体）を適当な緩衝液中で室
温下５分以上混合する。反応後、遠心分離により得た沈
殿を、ポリエチレングリコールや界面活性剤などの分散
剤を含む溶液中に分散させることにより、目的の金属コ
ロイド標識特異結合物質を得ることができる。

【００２３】金属コロイドとして金コロイド粒子を用い
る場合には、市販のものを用いてもよい。あるいは、常
法、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方
法（Nature Phys. Sci., vol.241, 20, (1973)等 ）に
より金コロイド粒子を調製することができる。

【００２４】固定化被検物質 検出層に固定化される被検物質は、分析対象である被検
物質そのものと全く同じ物質でなくてもよく、被検物質
の類似物質であってもよい。ここで類似物質とは、必ず
しもその構造が被検物質と類似であるという意味ではな
く、被検物質と特異結合物質との結合と同じように、特
異結合物質と結合する挙動が類似であるという意味であ
る。

【００２５】例えば、被検物質が抗原であり特異結合物
質がその抗体である場合には、抗原とエピトープを共通
にする物質を検出層に固定化して、本発明における固定
化被検物質とすることができる。被検物質の化学誘導体
などの化学構造上の類縁体のみならず、抗体（特異結合
物質）に対する免疫応答性において被検物質と類似の挙
動を示す化合物、物質であれば、これを検出層に固定化
することにより固定化被検物質とすることができる。

【００２６】分析要素の層構成 図１は、本発明の乾式分析要素の一実施態様を示す。図
１において、符号１０は支持体であり、その上には吸水
層１２、検出層１４，標識物保持層１６が順次積層され
ている。

【００２７】標識物保持層 標識物保持層１６は、水浸透性層で構成され、着色粒子
で標識した特異結合物質（例えば標識抗体）を含有す
る。液体試料が点着されたときにはこの標識第１特異結
合物質を移動可能にし、下層の検出層１４への移行を許
容する層である。

【００２８】標識物保持層１６は、標識特異結合物質を
湿潤によって移動可能にする親水性バインダーからなる
層とするのが好ましい。また、液体試料点着時に、検出
層で形成される固定化抗原−標識特異結合物質の複合体
中の着色粒子の吸収を点着面側から測定する場合には、
この光学的測定を妨げない程度の光透過性バインダーを
使用するのが好ましい。このような光透過性バインダー
としては、例えば、デンプンなどの多糖類、ポリビニル
ピロリドン、ポリメチルビニルエーテルなどが挙げられ
る。

【００２９】一方、吸水層１２へ移行した被検物質−標
識特異結合物質の量を、点着面の裏面側からすなわち支
持体１０側から測定する場合には、標識物保持層１６は
必ずしも光透過性である必要はない。むしろ白色背景と
なるような繊維性素材などの多孔性層で形成することが
できる。

【００３０】標識物保持層を多孔性層とする場合、その
多孔性層は繊維質であってもよいし、非繊維質であって
もよい。繊維質材料としては、例えば濾紙、不織布、織
物布地（例えばブロードやポプリンなどの平織布地）、
編物布地（例えばトリコット、ダブルトリコット、ミラ
ニーズ等の編物布地）、ガラス繊維濾紙等を用いること
ができる。非繊維質材料としては、特開昭49-53888等に
記載の酢酸セルロース等からなるメンブランフィルタ
ー；特開昭49-53888、特開昭55-90859（対応米国特許
4,258,001）、特開昭58-70163（対応米国特許 4,486,53
7）等に記載の無機物又は有機物微粒子からなる連続空
隙含有粒状構造物層；等のいずれでもよい。特開昭61-4
959(対応欧州公開 EP 0166365A）、特開昭62-116258 、
特開昭62-138756(対応欧州公開 EP 0226465A）、特開昭
62-138757(対応欧州公開 EP 0226465A）、特開昭62-138
758(対応欧州公開 EP 0226465A）等に記載の部分接着さ
れた複数の多孔性層の積層物でもよい。

【００３１】多孔性層は、供給される液体の量にほぼ比
例した面積に液体を層内に展開する、いわゆる計量作用
を有する展開層であってもよい。多孔性層に展開層とし
ての機能を持たせることにより、多孔性層に供給される
液体の展開が面積当たり均一になり、検出層１４での被
検物質の定量的分析の精度が向上する。

【００３２】多孔性層を展開層として機能させる場合に
は、これらのうち織物布地、編物布地などが好ましい。
織物布地などは特開昭57-66359号に記載されたようなグ
ロー放電処理をしてもよい。展開層には、展開面積、展
開速度等を調節するため、特開昭60-222770（対応: EP
0162301A）、特開昭63-219397（対応ドイツ特許公開 DE
37 17 913A）、特開昭63-112999（対応: DE 37 17 913
A）、特開昭62-182652（対応: DE 37 17 913A）に記載
したような親水性高分子あるいは界面活性剤を含有させ
てもよい。

【００３３】検出層 検出層１４は、被検物質（または特異結合物質に対する
結合の挙動が被検物質と類似である類似物質）を固定化
した層であり、標識物保持層１６から移行してくる被検
物質（例えば抗原）と標識特異結合物質（抗体）との間
で、競争反応を行う層である。検出層の担体は、被検物
質を高密度に固定化できるものであればよい。また検出
層１４内部に形成された固定化被検物質−標識特異結合
物質の複合体中の着色粒子を層外部から測定するために
は、検出層１４は、液体試料点着時に着色粒子の吸収の
光学的測定を妨げない程度の光透過性を有することが好
ましい。このような担体として、例えばニトロセルロー
ス、（電荷改良型）ナイロン、フッ化ビニリデン樹脂
（ＰＶＤＦ）などの多孔性膜が挙げられる。

【００３４】一方、吸水層１２へ移行した被検物質−標
識特異結合物質の複合体中の着色粒子の量を、点着面の
裏面側からすなわち支持体１０側から測定する場合に
は、検出層１４は必ずしも光透過性である必要はない。
むしろ白色背景となるような繊維性素材などの標識物保
持層の説明の中で挙げられた多孔性層で形成することが
できる。必要に応じて二酸化チタンや硫酸バリウムなど
の光反射性微粒子を含有させてもよい。このように検出
層１４を光遮蔽層としても機能させることにより、吸水
層１２内での呈色、色調の変化を透明支持体１０側から
反射測光する場合の白色背景とすることができる。但
し、検出層１４自体が色調変化の白色背景となる光学的
性能を有するものである場合には、光反射性微粒子を含
有させなくてもよい。

【００３５】多孔性膜への被検物質（例えば抗原）また
はその類似物質の固定化は化学反応による結合でもよい
が、物理吸着により固定化するものでもよい。被検物質
を固定化した後は、アッセイ時に標識特異結合物質（標
識抗体）が非特異的吸着するのを防止するため、ＢＳＡ
（牛血清アルブミン）やゼラチンなどで膜表面をブロッ
クしておくのが望ましい。これらは、従来公知の方法に
より行うことができる。

【００３６】吸水層 吸水層１２は、分析要素に点着される液体試料が標識物
保持層１６，検出層１４を縦方向（膜横断方向）に移行
するのを促進するために設ける。また、競争反応の結果
固定化被検物質とは結合せずに分析対象たる被検物質と
結合した酵素標識特異物質を、吸水層１２に吸収して検
出層１４から取り除くための層である。

【００３７】この吸水層１２には、例えばセルロース、
酢酸セルロース、レーヨン、木綿（コットン）、ガラス
繊維などの多孔性繊維性材料や、あるいはゼラチン、多
糖類、ピロリドン骨格を有するポリマー、ポリメチルビ
ニルエーテル又は高吸水性ポリマーなどの吸水性材料が
用いられる。この吸水層１２は、分析要素に点着される
試料液を効率よく吸水して標識物保持層１６及び検出層
１４を通過させるに足りる吸水容量があればよい。

【００３８】吸水層１２を、液体試料点着時に光透過性
となる媒体（例えばゼラチンや親水性ポリマバインダな
ど、或いは検出層１４で使用する光透過性の多孔性膜な
ど）で構成すれば、吸水層側すなわち液体試料点着面の
裏面側から、検出層１４内の固定化被検物質−標識特異
結合物質の複合体の形成量を光学的測定が可能である。
この場合、吸水層１２に移行した標識特異結合物質（被
検物質と結合したもの、未結合のもの。いずれも含む）
が、液体試料点着箇所直下に多く分布すると、検出層１
４に形成された複合体中の着色粒子の吸収測定のノイズ
となり得る。従って、固定化被検物質と結合しなかった
標識特異結合物質が液体試料点着部位の直下からできる
だけ水平方向に離散・拡散するように、吸水層１２を構
成することが望ましい。このためには、吸水層１２は、
検出層１４から受容する液体試料が、検出層１４内での
湿潤領域（この領域内で固定化被検物質−標識特異結合
物質の複合体が形成されている）よりも広く拡散する程
度の薄さに形成するのが望ましい。

【００３９】一方、検出層１４内の固定化被検物質−標
識特異結合物質複合体形成量を点着面側から、すなわち
標識物保持層側から測定する場合には、吸水層１２は光
透過性である必要はなく、むしろ白色背景となるような
繊維性素材などの多孔性層で形成することが望ましい。
必要に応じて二酸化チタンや硫酸バリウムなどの光反射
性微粒子を含有させてもよい。このように吸水層１２を
光遮蔽層としても機能させることにより、吸水層１２内
に移行した標識特異結合物質による着色粒子の存在は、
点着面側からの検出層の反射光学密度測定の際の妨げと
ならなくなる。また前記した点着裏面側から測定する場
合のように薄い吸水層とする必要はなく、十分な吸水力
を持たせるように構成することができる。

【００４０】また、検出層１４と吸水層１２の間に二酸
化チタンや硫酸バリウムなどの光反射性微粒子を含有さ
せた光遮蔽層を設ければ、吸水層１２内に移行した標識
特異結合物質による光学濃度を点着裏面側から測定する
こともできる。

【００４１】更に、検出層１４の素材や空隙の大きさ等
を選択することにより、固定化被検物質−標識特異結合
物質複合体を検出層１４の点着表面近傍に形成させるこ
とが可能となる。このようにすれば、固定化被検物質−
標識特異結合物質複合体の光学濃度を点着面側から測定
するのに有利である。この場合に、検出層１４に光不透
過性の素材を用いれば、上記光遮蔽層を設けなくても吸
水層１２内に移行した標識特異結合物質による光学濃度
を点着裏面側から測定することができる。

【００４２】なお、吸水層１２が多孔性繊維性材料など
の、それ自身自立可能でその上層の検出層１４を支持で
きる材質である場合には、後述の支持体１０を用いなく
てもよい。

【００４３】支持体 支持体１０としては光不透過性（不透明）、光半透過性
（半透明）、光透過性（透明）のいずれのものも用いる
ことができるが、一般的には光透過性で水不透過性の支
持体が好ましい。また吸水層１２が液体試料点着時に光
透過性になるものであって、かつ支持体１０が光透過性
である場合には、検出層１４で形成された固定化被検物
質−標識特異結合物質の複合体の着色粒子の吸収測定は
支持体側から行うことが可能になる。

【００４４】光透過性水不透過性支持体の材料として好
ましいのものはポリエチレンテレフタレート、ポリスチ
レンである。この上に積層される吸水層１２を強固に接
着するため、通常下塗り層を設けるか親水化処理を施
す。

【００４５】本発明の好ましい実施態様は、着色粒子に
金属コロイド、特に安定性が高く、赤色を示す金コロイ
ド、特異結合物質としては被検物質の抗体を使用する態
様である。このような態様では、被検物質（抗原）を含
む液体試料を点着するだけで、検出層上に被検物質の量
に反比例して金コロイド標識抗体−固定化抗原の複合体
を形成させることができ、洗浄等の操作を必要とせず
に、検出層に捕捉された金コロイド標識抗体の金コロイ
ドの吸収を液体試料を点着した面から光学的に測定する
ことにより被検物質の検出、定量が可能になる。

【００４６】乾式分析要素の製造方法 本発明の乾式分析要素は諸特許明細書に記載の方法を参
考にして調製することができる。本発明の分析要素は一
辺約15mmから約30mmの正方形またはほぼ同サイズの円形
等の小片に裁断し、特公昭57-28331（対応米国特許 4,1
69,751)、実開昭56-142454（対応米国特許 4,387,99
0)、特開昭57-63452、実開昭58-32350、特表昭58-50114
4（対応国際公開: WO 83/00391)等に記載のスライド枠
に収めて化学分析スライドとして用いることが、製造，
包装，輸送，保存，測定操作等の観点で好ましい。使用
目的によっては、長いテープ状でカセットまたはマガジ
ンに収めて用いたり、または小片を開口のあるカードに
貼付または収めて用いることなどもできる。

【００４７】乾式分析要素による分析方法 本発明の分析要素は前述の諸特許明細書等に記載の操作
と同様の操作により液体試料中の被検物質の定量分析が
できる。被検物質が抗原又は抗体である場合は、例えば
約５μL〜約30μL、好ましくは８〜15μLの範囲の血
漿、血清、尿、便懸濁液などの液体試料を、標識物保持
層１６、又はその上に展開層が積層されている場合には
展開層に点着する。点着した分析要素を約４℃〜約45℃
の範囲の一定温度で、好ましくは約20℃〜約40℃の範囲
内の一定温度で１〜10分間インキュベーションする。検
出層１４内の着色粒子の色を点着面側（標識物保持層
側）から、或いは吸水層１２に移行した着色粒子の色を
点着面の裏面（光透過性支持体側）から反射測光し、予
め作成した検量線を用いて比色測定法の原理により検体
中の被検物質の量を求めることができる。点着する液体
試料の量、インキュベーション時間及び温度を一定にす
ることにより定量分析を高精度に実施できる。

【００４８】測定操作は特開昭60-125543、同60-22086
2、同61-294367、同58-161867(対応米国特許 4,424,19
1）などに記載の化学分析装置により極めて容易な操作
で高精度の定量分析を実施できる。なお、目的や必要精
度によっては、目視により発色や色調変化の度合いを判
定して、半定量的な測定を行なってもよい。

【００４９】

【実施例１】金コロイド標識抗ヒトヘモグロビン抗体の
調製 粒径50nmの金コロイド溶液（BRITISH BIOCELL社）600μ
Lに、0.2M炭酸カリウム溶液11μLを添加してpH9.0とし
た。このpH調整金コロイド溶液611μLに、抗ヒトヘモグ
ロビン抗体溶液（2.5mg/mL、MEDIX BIOCHEMICA社製、0.
02Mリン酸緩衝液（pH6.4）、0.02％アジ化ナトリウム含
有）を蒸留水で0.1mg/mLに調整したものを60μL添加し
た。この混合物を振とう攪拌後、安定化剤として10mMリ
ン酸緩衝液（pH6.4、１％ＢＳＡ、0.05%アジ化ナトリウ
ム含有）600μLを添加した。高速遠心機にて14,500rpm
で60分間遠心し、上澄みを除去した。沈殿物を10mMリン
酸緩衝液（pH6.4、1％ＢＳＡ、0.05％アジ化ナトリウム
含有）100μLに再懸濁し、抗ヒトヘモグロビン抗体標識
金コロイド懸濁液を得た。

【００５０】

【実施例２】ヒトヘモグロビン固定化膜（検出層）の調
製 ヒトヘモグロビンＡ₀(EXOCELL.INC社製)を0.1mg/mLにな
るように10mMリン酸緩衝液(pH7.2)で希釈し、その6μL
を、1.5cm平方の大きさに切断したハイ−フロー・メン
ブレン（HI-FLOW MEMBRANE(SNHF)；MILLIPORE社）に点
着含浸した後、55℃で30分間減圧乾燥した。このメンブ
レンを１％ＢＳＡ添加10mMリン酸緩衝液（pH7.2）に室
温で4時間浸漬して、ブロッキングを行った。これを55
℃で30分間減圧乾燥した。

【００５１】

【実施例３】乾式免疫分析要素の調製 市販の化粧用コットンパフを圧縮した状態で接着テープ
で固定したものを吸水層とした。この吸水層の上に、孔
径200μmその中心間隔が700μmのシルクスクリーンを当
て、その上に事務用接着剤（澱粉糊）をスクイズ法によ
って塗った後、スクリーンをはがして接着剤の網点を吸
水層の上に形成した。接着剤網点形成後すぐに、その上
に実施例２で調製したヒトヘモグロビン固定化膜を接着
し、検出層として設けた。

【００５２】この検出層上に、下記の被覆量になるよう
に実施例１で調製した金コロイド標識抗ヒトヘモグロビ
ン抗体溶液を塗布、乾燥して標識物保持層を設けてヒト
ヘモグロビン分析用多層分析要素を調製した。 カルボキシメチル化澱粉 6.67 g/m² 金コロイド標識抗ヒトヘモグロビン抗体 0.044 g/m²

【００５３】次いでこの分析要素を15mm四方のチップに
裁断し、特開昭57-63452に記載のスライドの枠に収め
て、本実施例のヘモグロビン分析用乾式スライドとし
た。

【００５４】

【実施例４】ヒトヘモグロビン検出試験 ヒトヘモグロビンＡ₀(EXOCELL.INC社製)を0.2M塩化アン
モニウム(pH6.8)水溶液で希釈して0, 100, 500, 1000,
5000 ng/mLの希釈溶液系列を調製した。このヒトヘモグ
ロビン希釈溶液系列を、実施例３で作製した乾式スライ
ドに、それぞれ50μL点着した。点着液が完全に吸水層
に浸透した後、点着面側から中心波長540nmの可視光で
反射光学濃度を測定した。図２の検量線に示されるよう
に、本発明の乾式免疫分析要素により、ヒトヘモグロビ
ンの定量測定が行えることが示された。

【００５５】

【発明の効果】以上のように、本発明の分析方法は、多
層乾式分析要素の層構成の中で、被検物質と固定化被検
物質と標識特異結合物質の競争的結合反応を進行させ
る。被検物質の量に反比例して標識特異結合物質−固定
化被検物質の複合体が形成される。固定化被検物質に結
合しなかった標識特異結合物質は被検物質との複合体と
して、分析要素内での液体の拡散・移動に伴い吸水層に
移動除去されるので、従来法で必要とされた各工程ごと
の洗浄等の操作を必要としない。検出層に捕捉された標
識特異結合物質の量は標識着色粒子の吸収から容易に測
定することができる。或いは、吸水層に移動した標識特
異結合物質の量を標識着色粒子の吸収から測定してもよ
い。

【００５６】また乾式分析要素による免疫分析方法であ
るので、被検物質の定量測定を簡便、迅速、高精度で実
施できる。さらに省スペース化を達成するための小型測
定機器への対応が容易となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の乾式分析要素の一実施態様例の構成図
である。

【図２】実施例４の結果を示す図であり、乾式分析要素
の検量線を示す図である。

【符号の説明】

１０ 支持体 １２ 吸水層 １４ 検出層 １６ 標識物保持層

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 中村 健太郎 埼玉県朝霞市泉水３丁目11番46号 富士写 真フイルム株式会社内 (72)発明者 川崎 和也 埼玉県朝霞市泉水３丁目11番46号 富士写 真フイルム株式会社内 (72)発明者 篠木 浩 埼玉県朝霞市泉水３丁目11番46号 富士写 真フイルム株式会社内 (72)発明者 天野 芳和 埼玉県朝霞市泉水３丁目11番46号 富士写 真フイルム株式会社内 (72)発明者 永田 正人 東京都中央区銀座６丁目２番10号 合同酒 精株式会社内 (72)発明者 田中 徹 東京都中央区銀座６丁目２番10号 合同酒 精株式会社内

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下のステップを備える乾式分析方法：
   被検物質を含有する液体試料を、 この被検物質に特異的に結合可能な特異結合物質を着色
   粒子で標識した標識特異結合物質を含有する標識物保持
   層に点着供給し；この標識物保持層の下に配置され固定
   化被検物質を含有する検出層に、被検物質と標識特異結
   合物質とを移行させ；標識特異結合物質に対して被検物
   質と固定化被検物質とを競合的反応させ、被検物質に結
   合した標識特異結合物質を検出層の下に配置された吸水
   層に移行させ；検出層に形成された標識特異結合物質−
   固定化被検物質の複合体の着色粒子、又は吸水層に移行
   した標識特異結合物質−被検物質の複合体の着色粒子の
   量を光学的に測定し、その結果に基づいて被検物質の濃
   度を定量する。
2. 【請求項２】 前記被検物質が抗原であり、前記特異結
   合物質がその抗体である請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 前記着色粒子が金属コロイド又は着色ラ
   テックスである請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 前記金属コロイドが金コロイド又は銀コ
   ロイドである請求項４記載の方法。
5. 【請求項５】 液体試料点着後の被検物質量に応じて検
   出層に形成された標識特異的結合物質−固定化被検物質
   の複合体の着色粒子の量を点着面側から光学的に測定す
   る請求項１記載の方法。
6. 【請求項６】 液体試料点着後の被検物質量に応じて吸
   水層に移行した標識特異的結合物質の着色粒子の量を点
   着面の裏面側から光学的に測定する請求項１記載の方
   法。
7. 【請求項７】 液体試料中の被検物質に特異的に結合可
   能な特異結合物質を着色粒子で標識した標識特異結合物
   質を含有する標識物保持層と；この標識物保持層の下に
   配置され固定化被検物質を含有する検出層と；検出層の
   下に配置された吸水層；とを備えることを特徴とする乾
   式分析要素。
8. 【請求項８】 前記被検物質が抗原であり、前記特異結
   合物質がその抗体である請求項７記載の乾式分析要素。
9. 【請求項９】 前記着色粒子が金属コロイド又は着色ラ
   テックスである請求項７記載の乾式分析要素。
10. 【請求項１０】 前記金属コロイドが金コロイド又は銀
    コロイドである請求項９記載の乾式分析要素。
11. 【請求項１１】 前記標識物保持層が前記標識特異結合
    物質を湿潤によって移動可能にし、少なくとも液体試料
    点着後に光透過性である多糖類、ポリビニルピロリド
    ン、ポリメチルビニルエーテルからなる群から選択され
    るバインダを担体とする層である請求項７記載の乾式分
    析要素。
12. 【請求項１２】 前記検出層が液体試料点着後に光透過
    性である多孔性膜である請求項７記載の乾式分析要素。
13. 【請求項１３】 前記吸水層が、セルロース、酢酸セル
    ロース、レーヨン／木綿（コットン）、ガラス繊維、ゼ
    ラチン、多糖類、ピロリドン骨格を有するポリマー、ポ
    リメチルビニルエーテル又は高吸水性ポリマーからなる
    群から選択される少なくとも１つの素材からなる層であ
    る請求項７記載の乾式分析要素。