JP2001059845A

JP2001059845A - 乾式分析方法及び乾式分析要素

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Publication number: JP2001059845A
Application number: JP11236793A
Authority: JP
Inventors: Kentaro Nakamura; 中村　　健太郎; Kazuya Kawasaki; 和也川崎; Hiroshi Shinoki; 浩篠木; Yoshikazu Amano; 芳和天野; Masato Nagata; 正人永田; Toru Tanaka; 徹田中
Original assignee: Godo Shusei KK; Wako Pure Chemical Industries Ltd; Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp; Godo Shusei KK; Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1999-08-24
Filing date: 1999-08-24
Publication date: 2001-03-06

Abstract

(57)【要約】【目的】被検物質（例えば抗原）と、標識特異結合物
質（例えば抗体）と弱親和性物質（例えば前記抗原より
は弱い親和性で特異結合物質（抗体）に結合する物質）
との複合体との置換放出反応により、被検物質を簡便、
迅速、高精度に分析することができる乾式分析方法及び
乾式分析要素を提供する。【構成】検出層に弱親和性物質を固定化し、これに予
め標識特異結合物質を結合させて複合体を形成させてお
く。検出層の下には吸水層を設ける。被検物質を含む液
体試料を点着するだけで、検出層内で置換放出反応が進
行し、放出された標識特異結合物質は、分析要素内での
液体の拡散・移動に伴い吸水層に移動除去されるので、
洗浄等の操作を必要としない。被検物質の量に応じて検
出層に残存する標識特異結合物質の量は、標識着色粒子
の吸収から容易に測定することができる。吸水層に移行
した標識特異結合物質の量を検出することもできる。乾
式分析要素による分析であるので、小型測定機器への対
応が容易となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は免疫学的反応を応用した
被検物質の簡便かつ迅速な乾式分析方法に関するもので
ある。詳しくは、被検物質（例えば抗原）を添加するこ
とにより、着色粒子で標識した特異結合物質（例えば抗
体）と弱親和性物質（例えば前記抗原よりは弱い親和性
で特異結合物質（抗体）に結合する物質）との複合体か
ら、標識特異結合物質を複合体から放出させる置換放出
反応を、乾式分析要素の層構成の中で行わせる乾式分析
方法に関するものである。またこの分析方法を可能にす
る乾式多層分析要素に関する。

【０００２】

【発明の背景】近年、医療分野において、各種疾患の診
断のために液体試料中の微量被検物質、特に抗原又は抗
体を迅速、簡便にしかも精度良く定量する必要性が高ま
ってきた。これらを検出する免疫測定法の多くは公知で
あり、サンドイッチ法、競合法などがある。

【０００３】特開昭60-192261にはいわゆるディップス
ティック法と呼ばれる固相免疫測定法が開示されてい
る。この測定法では、第１抗体を固定化した担体（試験
ストリップ片）を被検物質（抗原）を含む液体試料に浸
漬する。或いは、担体上の第１抗体固定化帯域に液体試
料を載置する。免疫反応を行わせた後、過剰の被検物質
を洗浄により担体上から除去し、次いで標識（例えば金
コロイド標識）第２抗体溶液を供給し、担体上でサンド
イッチ反応を行わせる。洗浄により未反応の標識第２抗
体を除去して、担体上に捕捉された被検物質（抗原）の
在否を標識物の着色スポットにより判定する。この方法
は、特別な機器を必要とせず比較的簡便な操作で、被検
物質の存在を定性的又は半定量的に判定することがで
き、少数の検体を処理するのに適している。しかし、こ
の方法は標識物による着色の有無を目視判定するもので
あるため、定量的な分析には適していなかった。またア
ッセイには洗浄操作が必要であるため、大量の検体を分
析する場合には、操作が煩雑となる。

【０００４】特公平7-13640及び特開平10-73592には、
イムノクロマト法により被検物質の在否判定を行う固相
イムノアッセイ法が開示されている。この方法では、濾
紙などの毛細管作用を有する長尺状媒体（ストリップ）
の一端（第１の帯域）に標識抗体を保持させる一方、別
の領域（第２の帯域）には第２抗体を捕捉用抗体として
固定化しておく。抗原を含有する液体試料を第１の帯域
に供給すると、被検抗原と標識抗体は毛細管作用によ
り、固定化抗体のある第２の帯域まで拡散、移動し、こ
の固定化抗体により抗原と標識抗体とが捕捉される。捕
捉用第２抗体の帯域に現れる標識物の色調を検出するこ
とにより被検抗原の存在を確認するものであり、この方
法はサンドイッチ法を固相化したものと言える。

【０００５】また第１の帯域に標識抗体の代わりに標識
抗原を保持させた場合には、抗原を含有する液体試料を
第１帯域に供給すると、毛細管作用により抗原と標識抗
原とが固定化抗体のある第２の帯域へ拡散移行し、ここ
で固定化抗体との競合反応が起こることになる。このよ
うな競合反応によっても被検抗原の存在を確認すること
ができる。

【０００６】これらのイムノクロマト法は、試薬が乾式
化されているので、その保存安定性には優れている。し
かし、分析の定量性に欠けるという問題があった。ま
た、原理上、液体試料と標識体を水平方向に毛管現象に
より移動させなければならず、液体試料点着箇所と検出
箇所とが離れた位置となる。このような配置をとるため
には、当該部材をストリップ形状にする必要があり、必
然的に形状が大きくなる。このため、例えば機器による
光学測定を行う場合は不利になる。

【０００７】特開昭63-127160に開示された特異的蛋白
質の検出方法では、第２抗体をメンブレンフィルターに
固定化し、そこに被検物質と金コロイド抗体を順次添加
するキットを用いている。しかしながら、金コロイド抗
体は液として外から供給されるため、被検物質の点着と
金コロイド抗体の点着という２段階の操作が必要であ
り、操作の煩雑さの問題は解決されていない。

【０００８】

【発明の目的】本発明は、被検物質の定量測定を簡便、
迅速、高精度で実施でき、さらに省スペース化を達成す
るための小型測定機器への対応が可能な形態の乾式免疫
分析方法を提供することを第１の目的とする。また本発
明は、このような乾式分析方法の実施に使用する乾式分
析要素を提供することを第２の目的とする。

【０００９】

【発明の構成】このような本発明の第１の目的は、以下
のステップを備える乾式分析方法により達成される。す
なわち、 a) 被検物質に特異的に結合可能な特異結合物質を標識
着色粒子に結合した標識特異結合物質と、被検物質より
も弱い親和性で特異結合物質に結合可能な弱親和性物質
とを含有し、前記弱親和性物質は固定化され、前記標識
特異結合物質と前記固定化弱親和性物質とが複合体を形
成している検出層に、被検物質を含有する液体試料を点
着供給し； b) 検出層内で前記複合体と前記被検物質との置換放出
反応により、前記標識特異結合物質を遊離させて検出層
の下に配置された吸水層に移行させ； c) 検出層に残存する前記標識結合物質の着色粒子、又
は吸水層に移行した標識特異結合物質の着色粒子の光学
吸収を測定することにより被検物質の濃度を定量する。

【００１０】すなわち本発明の分析方法では、多層乾式
分析要素の層構成の中で、標識特異結合物質（例えば抗
体）と弱親和性物質（例えば被検物質である抗原よりは
弱い親和性でこれに対する特異結合物質（例えば抗体）
に結合する物質）との複合体に被検物質を接触させるこ
とにより当該複合体から標識特異結合物質（抗体）を放
出させ、これを被検物質（例えば抗原）との結合物と
し、この被検物質−標識特異結合物質の結合体を吸水層
に移行させる。被検物質の量が多くなるほど、吸水層に
移行する被検物質−標識特異結合物質の結合体の量は多
くなり、また検出層に残存する固定化弱親和性物質−標
識特異結合物質の複合体の量は少なくなる。こうして検
出層に残存する、又は吸水層に移行した標識物（着色粒
子）の量を、分析要素外部から光学的測定により検出す
ることにより被検物質の濃度を定量するものである。

【００１１】検出層を、少なくとも液体試料点着後は光
透過性を有する媒体で構成することにより、液体試料を
点着した検出層上面側から検出層に残存する固定化弱親
和性物質−標識特異結合物質の複合体の量を光学測定す
ることができる。また吸水層を液体試料点着により光透
過性となる媒体（例えば親水性ポリマバインダなど）で
構成すれば、吸水層側すなわち液体試料点着面の裏面側
から、吸水層に移行した被検物質−標識特異結合物質の
結合体量を光学測定することができる。

【００１２】また本発明の第２の目的は、液体試料中の
被検物質に特異的に結合可能な特異結合物質を標識着色
粒子に結合した標識特異結合物質を含有し、特異結合物
質に対して被検物質よりも弱い親和性で結合可能な弱親
和性物質が固定化されている検出層であって、前記標識
特異結合物質は前記固定化弱親和性物質と複合体を形成
している検出層と；この検出層の下に配置された吸水
層；とを備えることを特徴とする乾式分析要素により達
成される。

【００１３】このような層構成をとることにより、点着
された液体試料は検出層から吸収層に浸透する。その過
程で、液体試料中の被検物質（例えば抗原）は、固定化
弱親和性物質と複合体を形成していた標識特異結合物質
（例えば標識抗体）を引き抜いて、被検物質−標識特異
結合物質の結合体とする。この結合体は液体試料と共に
吸水層に移行して、検出層から除去される。

【００１４】このように液体試料が、分析要素層内を縦
方向（膜横断方向）に拡散移動する過程で、置換放出反
応が液体試料点着部の検出層で進行することになる。液
体試料の点着部と検出部とは、同一部分となる。従っ
て、乾式分析要素の形態は非常に小さなチップ状に成り
得る。このような、乾式分析要素の小型チップ化は本乾
式分析要素を定量測定するために必要な測定機器の小型
化を可能にし、このことは検査スペースの省スペース化
を達成するために非常に有用である。

【００１５】

【発明の構成の詳細な説明】被検物質と特異結合物質本発明で分析できる被検物質は、これに特異的に結合す
る特異結合物質が天然界に存在するもの、あるいは免疫
学的手段や化学的手段によりこれを用意できるものであ
ればよい。特異結合物質は、被検物質に対し特異的に結
合することが可能であり、かつ標識担体（着色粒子）に
結合させることのできる物質である。

【００１６】被検物質と特異結合物質との組み合わせ
は、例えば、抗原と抗体、ある種の糖類とレクチン、ビ
オチンとアビジン、プロテインＡとIgＧ、ホルモンとそ
のレセブター、酵素と基質、核酸とこれに少なくとも一
部が相補的な核酸などが例として挙げられる。この組合
せは、逆でもよい。

【００１７】最も一般的な例は、抗原を被検物質とし、
抗体を特異結合物質とするものである。被検物質として
の抗原には、例えば、被検物質と特異的に結合する抗体
を選択することによりヘモグロビン（糞便中）、トラン
スフェリン、卵胞刺激ホルモン、黄体刺激ホルモン、胎
盤性ゴナドトロピン、甲状腺ホルモン、リポタンパク、
アポリポタンパク、アルブミン、プロゲステロン、エス
トラジオール等があるが、これらに限定されるものでは
ない。

【００１８】特異結合物質としての抗体は、ポリクロー
ナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体とするのが好
ましい。本発明の分析方法は、被検物質（抗原）と弱親
和性物質の、特異結合物質（抗体）に対する結合性の差
を利用するものであるから、この特異結合物質としての
抗体は、抗原に対して種々の親和性を持つ抗体の集団で
あるポリクローナル抗体ではない方が望ましい。モノク
ローナル抗体を用いる方が、より感度が上昇する。また
この抗体はＦabやＦab'やＦ(ab')₂等のフラグメントで
もよい。

【００１９】標識着色粒子特異結合物質を結合して標識する標識用着色粒子は、免
疫凝集反応に用いられている着色粒子を使用することが
できる。例えば、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン
共重合体のような有機高分子のラテックス着色粒子、金
属コロイドのような金属等を用いることができる。担体
粒子（又はコロイド）の平均粒径は、0.02〜10μmの範
囲が好ましい。色素を含有したリポゾームやマイクロカ
プセル等も着色粒子として使用することができる。

【００２０】従来公知の着色金属コロイドはいずれも標
識用着色粒子として使用することができる。例えば、金
コロイド、銀コロイド、白金コロイド、鉄コロイド、水
酸化アルミニウムコロイドなどが挙げられる。特に、金
コロイドと銀コロイドが適当な粒径において、金コロイ
ドは赤色、銀コロイドは黄色を示す点で好ましい。金属
コロイドの粒径としては、約１〜500nmが好ましく、特
に強い色調が得られる５〜100nmがさらに好ましい。

【００２１】金属コロイドと特異結合物質との結合は、
従来公知の方法（例えばThe Journal of Histochemistr
y and Cytochemistry, Vol.30,No.7,pp691-696,(198
2)）に従い、行うことができる。すなわち、金属コロイ
ドと特異結合物質（例えば抗体）を適当な緩衝液中で室
温下５分以上混合する。反応後、遠心分離により得た沈
殿を、ポリエチレングリコールや界面活性剤等の分散剤
を含む溶液中に分散させることにより、目的の金属コロ
イド標識特異結合物質を得ることができる。

【００２２】金属コロイドとして金コロイド粒子を用い
る場合には、市販のものを用いてもよい。あるいは、常
法、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方
法（Nature Phys. Sci., vol.241, 20, (1973)等）に
より金コロイド粒子を調製することができる。

【００２３】弱親和性物質検出層に固定化されている弱親和性物質は、特異結合物
質に結合可能な物質であり、その親和性は被検物質のそ
れよりも低い物質である。すなわち本発明は、被検物質
よりも結合性（親和性）の低い物質を弱親和性物質とし
て予め特異結合物質と複合体を形成させておく。特異結
合物質に対する結合性（親和性）の差を利用して、当該
複合体に被検物質を接触させることにより特異結合物質
を固定化弱親和性物質から遊離させ被検物質と結合させ
る。被検物質−特異結合物質の複合体は、検出層から吸
水層に移行する。

【００２４】このような弱親和性物質としては、例えば
被検物質の類似物質が挙げられる。ここで類似物質と
は、必ずしもその構造が被検物質と類似であるという意
味ではなく、被検物質と特異結合物質との結合と同じよ
うに、特異結合物質と結合する挙動が類似であるという
意味である。

【００２５】例えば、被検物質が抗原であり、特異結合
物質がその抗体である場合には、抗原と共通するエピト
ープを有するが、抗体に対する親和性が低い異種動物由
来の抗原、抗原の化学的な誘導体、或いは抗原の変性物
を弱親和性物質とすることができる。抗原がタンパク質
の場合には、そのエピトープ構造を抗体との結合を確保
できる程度に変性した変性タンパク質を使用できる。こ
のようなタンパク質の変成は、熱、酸、アルカリなどの
処理により得ることができる。変性により、エピトープ
構造そのものが変化していなくても、分子全体の立体構
造が変化することにより抗体に対する結合性が低くなっ
たタンパク質抗原でもよい。

【００２６】特異結合物質に対する抗体を弱親和性物質
として使用してもよい。被検物質が抗体である場合に
は、特異結合物質としてこの抗体に対応する抗原を使用
する。この場合、弱親和性物質は、抗原（特異結合物
質）上の、被検物質である抗体が認識するエピトープを
認識する別の抗体（第２抗体）であって、被検物質であ
る抗体よりも抗原（特異結合物質）に対する親和性が低
いものであればよい。或いは、被検抗体と同じエピトー
プを認識しなくても、これに近接するエピトープを認識
するなどの理由により、被検物質（抗体）が接触（共
存）したときに弱親和性物質としての第２抗体から抗原
（特異結合物質）が遊離するような性質を存するのであ
れば、このような第２抗体は本発明の弱親和性物質とし
て使用できる。このような第２抗体は、特異結合物質を
抗原として作製したモノクローナル抗体から選ぶことが
できる。

【００２７】分析要素の層構成図１は、本発明の乾式分析要素の一実施態様を示す。図
１において、符号１０は支持体であり、その上には吸水
層１２、検出層１４が順次積層されている。

【００２８】検出層検出層１４は、弱親和性物質（例えば抗原類似物質）を
固定化し、この固定化弱親和性物質に特異結合物質（例
えば抗体）を結合させて複合体を形成させた層である。
検出層の担体は、弱親和性物質（例えば抗原類似物質）
を高密度な固定化できるものであればよい。また検出層
１４内部の標識物（着色粒子）を層外部から測定するた
めには、検出層１４は、液体試料点着後は着色粒子の吸
収の光学的測定を妨げない程度の光透過性を有すること
が好ましい。このような担体として、例えばニトロセル
ロース、（電荷改良型）ナイロン、フッ化ビニリデン樹
脂（ＰＶＤＦ）などの多孔性膜が挙げられる。

【００２９】多孔性膜への弱親和性物質（例えば抗原類
似物質）の固定化は化学反応による結合でもよいが、物
理吸着により固定化してもよい。弱親和性物質（例えば
抗原類似物質）を固定化した後は、これに特異結合物質
（抗体）を結合させる前に、特異結合物質（抗体）が非
特異的に吸着するのを防止するため、ＢＳＡ（牛血清ア
ルブミン）、カゼイン、ゼラチンなどで膜表面をブロッ
クしておくのが望ましい。これらは、従来公知の方法に
より行うことができる。

【００３０】弱親和性物質は、この弱親和性物質に対し
て特異的に結合する第２の特異結合物質を介して、多孔
性膜に結合させてもよい。例えば、弱親和性物質に対す
る抗体を予め多孔性膜に固定化した後、この固定化抗体
に弱親和性物質を結合させることにより、弱親和性物質
を検出層である多孔性膜に固定化することができる。

【００３１】被検物質が抗原であり、特異結合物質が抗
体である場合には、弱親和性物質は例えば抗原類似物質
となる。この抗原類似物質に対する抗体であって特異結
合物質として使用した抗体（第１抗体）とは異なる抗体
（第２抗体）を、第２の特異結合物質とすることができ
る。但し、このような第２抗体は、第１抗体よりも弱親
和性結合物質（抗原類似物質）に対する結合性（親和
性）が高く、第１抗体（特異結合物質）添加時に弱親和
性物質（抗原類似物質）が固定化第２抗体から遊離しな
いようなものである必要がある。この観点からは、弱親
和性物質（抗原類似物質）を抗原として免疫して得られ
るモノクローナル抗体から、被検物質（抗原）には結合
せず、弱親和性物質（抗原類似物質）とのみ結合する抗
体を、弱親和性物質固定化用の第２抗体として選択する
のが望ましい。弱親和性物質（抗原類似物質）に特異的
な第２抗体を用いれば、第１抗体（特異結合物質）添加
時に弱親和性物質（抗原類似物質）が固定化第２抗体か
ら遊離することがない。

【００３２】被検物質が抗体であり、特異結合物質が抗
原である場合には、弱親和性物質は抗体（第２抗体）と
なる。この弱親和性物質（第２抗体）は、これに対する
抗体（第３抗体）により多孔性膜に固定化することがで
きる、この第３抗体は、第２抗体の抗原結合部位に影響
を与えないものが好ましく、例えば、抗Ｆｃ抗体を使用
することができる。第３抗体の代わりに、Ｆｃ領域に特
異的に結合するプロテインＡやプロテインＧを用いても
よい。弱親和性物質としての第２抗体を直接多孔膜に物
理吸着により固定化する場合、この第２抗体のＦab部分
が多孔膜に結合してしまうと、特異結合物質としての抗
原との反応効率が落ちることが考えられる。この場合
に、抗Ｆｃ抗体やプロテインＡ、プロテインＧなどで弱
親和性物質としての第２抗体のＦｃ部分を固定化すれ
ば、第２抗体と抗原との反応効率が減少することを防止
できる。

【００３３】吸水層吸水層１２は、分析要素に点着される液体試料が検出層
１４を縦方向（膜横断方向）に移行するのを促進するた
めに設ける。また、検出層内での置換放出反応により固
定化複合体から遊離し、被検物質と結合した標識特異結
合物質を、吸水層１２に吸収して検出層１４から取り除
くための層である。

【００３４】この吸水層１２には、例えばセルロース、
酢酸セルロース、レーヨン、木綿（コットン）、ガラス
繊維などの多孔性繊維性材料や、あるいはゼラチン、多
糖類、ピロリドン骨格を有するポリマー、ポリメチルビ
ニルエーテル又は高吸水性ポリマーなどの吸水性材料が
用いられる。この吸水層１２は、分析要素に点着される
試料液を効率よく吸水して検出層１４を通過させるに足
りる吸水容量があればよい。

【００３５】吸水層１２は、液体試料点着後は光透過性
を有する媒体（例えばゼラチンや親水性ポリマバインダ
など、或いは検出層１４で使用する光透過性の多孔性膜
など）で構成すれば、吸水層側すなわち液体試料点着面
の裏面側から吸水層１２内に移行した標識着色粒子の量
を光学的測定が可能である。但し、吸水層１２に移行し
た拡散可能な結合体（被検物質−標識特異結合物質）
が、液体試料点着箇所直下に多く分布すると、検出層１
４に残存する複合体（固定化弱親和性物質−標識特異結
合物質）中の着色粒子の吸収測定のノイズとなり得る。
従って、拡散性結合体（被検物質−標識特異結合物質）
が液体試料点着部位の直下からできるだけ水平方向に離
散・拡散するように、吸水層１２を構成することが望ま
しい。このためには、吸水層１２は、検出層１４から受
容する液体試料が、検出層１４内での湿潤領域よりも広
く拡散する程度の薄さに形成するのが望ましい。

【００３６】一方、検出層１４内に残存する複合体（固
定化弱親和性物質−標識特異結合物質）の量を、点着面
側からすなわち検出層側から測定する場合には、吸水層
１２は光透過性である必要はなく、むしろ白色背景とな
るような繊維性素材などの多孔性層で形成することが望
ましい。必要に応じて二酸化チタンや硫酸バリウムなど
の光反射性微粒子を含有させてもよい。このように吸水
層１２を光遮蔽層としても機能させることにより、吸水
層１２内に移行した標識特異結合物質による着色粒子の
存在は、点着面側からの検出層の反射光学濃度測定の際
の妨げとならなくなる。また前記した点着裏面側から測
定する場合のように薄い吸水層とする必要はなく、十分
な吸水力を持たせるように構成することができる。

【００３７】なお、吸水層１２が多孔性繊維性材料など
の、それ自身自立可能でその上層の検出層１４を支持で
きる材質である場合には、後述の支持体１０を用いなく
てもよい。

【００３８】支持体支持体１０としては光不透過性（不透明）、光半透過性
（半透明）、光透過性（透明）のいずれのものも用いる
ことができるが、一般的には光透過性で水不透過性の支
持体が好ましい。また吸水層１２が液体試料点着時に光
透過性になるものであって、かつ支持体１０が光透過性
である場合には、吸水層１２に移行した遊離結合体（被
検物質−標識特異結合物質）の着色粒子の吸収測定は支
持体側から行うことが可能になる。

【００３９】光透過性水不透過性支持体の材料として好
ましいのものはポリエチレンテレフタレート、ポリスチ
レンである。この上に積層される吸水層１２を強固に接
着するため、通常下塗り層を設けるか親水化処理を施
す。

【００４０】本発明の好ましい実施態様は、着色粒子に
金属コロイド、特に安定性が高く、赤色を示す金コロイ
ド、特異結合物質としては被検物質の抗体、弱親和性物
質としては被検物質の類似物質（特に被検物質をある程
度変性させた物質）を使用する態様である。このような
態様では、被検物質（抗原）を含む液体試料を点着する
だけで、検出層内で複合体（固定化弱親和性物質−金コ
ロイド標識抗体）と被検物質（抗原）との間の置換放出
反応を進行させることができる。洗浄等の操作を必要と
せずに、被検物質の量に応じて検出層に残った標識特異
結合物質（金コロイド標識抗体）の吸収を液体試料を点
着した面から光学測定することにより被検物質の検出、
定量が可能になる。

【００４１】乾式分析要素の製造方法本発明の乾式分析要素は諸特許明細書に記載の方法を参
考にして調製することができる。本発明の分析要素は一
辺約15mmから約30mmの正方形またはほぼ同サイズの円形
等の小片に裁断し、特公昭57-28331（対応米国特許 4,1
69,751)、実開昭56-142454（対応米国特許 4,387,99
0)、特開昭57-63452、実開昭58-32350、特表昭58-50114
4（対応国際公開: WO 83/00391)等に記載のスライド枠
に収めて化学分析スライドとして用いることが、製造，
包装，輸送，保存，測定操作等の観点で好ましい。使用
目的によっては、長いテープ状でカセットまたはマガジ
ンに収めて用いたり、または小片を開口のあるカードに
貼付または収めて用いることなどもできる。

【００４２】乾式分析要素による分析方法本発明の分析要素は前述の諸特許明細書等に記載の操作
と同様の操作により液体試料中の被検物質の定量分析が
できる。被検物質が抗原又は抗体である場合は、例えば
約５μL〜約30μL、好ましくは８〜15μLの範囲の血
漿、血清、尿などの液体試料を、検出層１４、又はその
上に展開層が積層されている場合には展開層に点着す
る。点着した分析要素を約４℃〜約45℃の範囲の一定温
度で、好ましくは約20℃〜約40℃の範囲内の一定温度で
１〜10分間インキュベーションする。検出層１４内の着
色粒子の色を点着面側（検出層側）から或いは点着面の
裏面（光透過性支持体側）から反射測光し、予め作成し
た検量線を用いて比色測定法の原理により検体中の被検
物質の量を求めることができる。点着する液体試料の
量、インキュベーション時間及び温度を一定にすること
により定量分析を高精度に実施できる。

【００４３】測定操作は特開昭60-125543、同60-22086
2、同61-294367、同58-161867(対応米国特許 4,424,19
1）などに記載の化学分析装置により極めて容易な操作
で高精度の定量分析を実施できる。なお、目的や必要精
度によっては、目視により発色や色調変化の度合いを判
定して、半定量的な測定を行なってもよい。

【００４４】

【実施例１】金コロイド標識抗ヒトヘモグロビン抗体の
調製粒径50nmの金コロイド溶液（BRITISH BIOCELL社）600μ
Lに、0.2M炭酸カリウム溶液11μLを添加してpH9.0とし
た。このpH調整金コロイド溶液611μLに、抗ヒトヘモグ
ロビン抗体溶液（2.5mg/mL、MEDIX BIOCHEMICA社製、0.
02Mリン酸緩衝液（pH6.4）、0.02％アジ化ナトリウム含
有）を蒸留水で0.1mg/mLに調整したものを60μL添加し
た。この混合物を振とう攪拌後、安定化剤として10mMリ
ン酸緩衝液（pH6.4、1％牛血清アルブミン、0.05%アジ
化ナトリウムを含む）600μLを添加した。高速遠心機に
て14,500rpmで60分間遠心し、上澄みを除去した。沈殿
物を10mMリン酸緩衝液（pH6.4、1％ＢＳＡ、0.05％アジ
化ナトリウムを含む）100μLに再懸濁し、抗ヒトヘモグ
ロビン抗体標識金コロイド懸濁液を得た。

【００４５】

【実施例２】変性ヒトヘモグロビン固定化膜の調製ヒトヘモグロビンＡ₀(EXOCELL.INC社製)を0.5mg/mLにな
るように10mMリン酸緩衝液(pH7.2)で希釈し、このヒト
ヘモグロビン溶液を55℃で６時間加熱処理して、変性ヒ
トヘモグロビン溶液を得た。その6μLを、1.5cm平方の
大きさに切断したハイ−フロー・メンブレン（HI-FLOW
MEMBRANE(SNHF)；MILLIPORE社）に点着含浸した後、55
℃で30分間減圧乾燥した。このメンブレンを１％ＢＳＡ
添加の10mMリン酸緩衝液（pH7.2）に室温で４時間浸漬
して、ブロッキングを行った。これを55℃で30分間減圧
乾燥した。

【００４６】

【実施例３】金コロイド標識抗ヒトヘモグロビン抗体結
合変性ヘモグロビン固定化膜（検出層）の調製上記変性ヒトヘモグロビン固定化膜を、0.4mg/mLになる
ように50mMクエン酸緩衝液(pH6.0)で溶解した金コロイ
ド標識抗ヒトヘモグロビン抗体溶液に室温で30分間浸漬
し、さらに50mMクエン酸緩衝液(pH6.0)に室温で30分間
浸漬した。洗浄後、これを55℃で30分間減圧乾燥した。

【００４７】

【実施例４】乾式免疫分析要素の調製市販の化粧用コットンパフを圧縮した状態で接着テープ
で固定したものを、吸水層とした。この吸水層の上に、
孔径200μmその中心間隔が700μmのシルクスクリーンを
当て、その上に事務用接着剤（澱粉糊）をスクイズ法に
よって塗った後、スクリーンをはがして接着剤の網点を
吸水層の上に形成した。接着剤網点形成後すぐに、その
上に実施例３で調製した金コロイド標識抗ヒトヘモグロ
ビン抗体結合変性ヘモグロビン固定化膜を接着し、検出
層として設けた。

【００４８】次いでこの分析要素を15mm四方のチップに
裁断し、特開昭57-63452に記載のスライドの枠に収め
て、本実施例のヘモグロビン分析用乾式スライドとし
た。

【００４９】

【実施例５】ヒトヘモグロビン検出試験ヒトヘモグロビンＡ₀(EXOCELL.INC社製)を0.2M塩化アン
モニウム(pH6.8)水溶液で希釈して0, 100, 500, 1000,
5000 ng/mLの希釈溶液系列を調製した。このヒトヘモグ
ロビン希釈溶液系列を、実施例４で作製した乾式スライ
ドに、それぞれ50μL点着した。点着液が完全に吸水層
に浸透した後、点着面側から中心波長540nmの可視光で
反射光学濃度を測定した。図２の検量線に示されるよう
に、本発明の乾式免疫分析要素により、ヒトヘモグロビ
ンの定量測定が行えることが示された。

【００５０】

【発明の効果】以上のように、本発明の分析方法は、多
層乾式分析要素の層構成の中で、複合体（固定化弱親和
性物質−標識特異結合物質）と被検物質との間の置換放
出反応を進行させる点に特徴がある。置換放出反応で追
い出された標識特異結合物質は、被検物質と結合して分
析要素内での液体の拡散・移動に伴い吸水層に移動除去
されるので、従来法で必要とされた各工程ごとの洗浄等
の操作を必要としない。検出層に残存する標識特異結合
物質の量は標識着色粒子の吸収から容易に測定すること
ができる。或いは、吸水層に移動した、標識特異結合物
質の量を測定してもよい。

【００５１】また乾式分析要素による免疫分析方法であ
るので、被検物質の定量測定を簡便、迅速、高精度で実
施できる。さらに省スペース化を達成するための小型測
定機器への対応が容易となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の乾式分析要素の一実施態様例の構成図
である。

【図２】実施例５の結果を示す図であり、乾式分析要素
の検量線を示す図である。

【符号の説明】

１０支持体１２吸水層１４検出層

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者中村健太郎埼玉県朝霞市泉水３丁目11番46号富士写真フイルム株式会社内 (72)発明者川崎和也埼玉県朝霞市泉水３丁目11番46号富士写真フイルム株式会社内 (72)発明者篠木浩埼玉県朝霞市泉水３丁目11番46号富士写真フイルム株式会社内 (72)発明者天野芳和埼玉県朝霞市泉水３丁目11番46号富士写真フイルム株式会社内 (72)発明者永田正人東京都中央区銀座６丁目２番10号合同酒精株式会社内 (72)発明者田中徹東京都中央区銀座６丁目２番10号合同酒精株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下のステップを備える乾式分析方法：
被検物質に特異的に結合可能な特異結合物質を標識着色
粒子に結合した標識特異結合物質と、被検物質よりも弱
い親和性で特異結合物質に結合可能な弱親和性物質とを
含有し、前記弱親和性物質は固定化され、前記標識特異
結合物質と前記固定化弱親和性物質とが複合体を形成し
ている検出層に、被検物質を含有する液体試料を点着供
給し；検出層内で前記複合体と前記被検物質との置換放
出反応により、前記標識特異結合物質を遊離させて検出
層の下に配置された吸水層に移行させ；検出層に残存す
る前記標識結合物質の着色粒子、又は吸水層に移行した
標識特異結合物質の着色粒子の光学吸収を測定すること
により被検物質の濃度を定量する。
【請求項２】前記被検物質が抗原であり、前記特異結
合物質がその抗体である請求項１記載の乾式分析方法。
【請求項３】前記弱親和性物質が被検物質の類似物質
である請求項１，２記載の乾式分析方法。
【請求項４】前記着色粒子が金属コロイド又は着色ラ
テックスである請求項１記載の乾式分析方法。
【請求項５】前記金属コロイドが金コロイド又は銀コ
ロイドである請求項４記載の乾式分析方法。
【請求項６】検出層内に残存する着色粒子の量を検出
層側から光学的に測定する請求項１記載の乾式分析方
法。
【請求項７】吸水層に移行した着色粒子の量を吸水層
側から光学的に測定する請求項１記載の乾式分析方法。
【請求項８】液体試料中の被検物質に特異的に結合可
能な特異結合物質を標識着色粒子に結合した標識特異結
合物質と、被検物質よりも弱い親和性で特異結合物質に
結合可能な弱親和性物質とを含有し、前記弱親和性物質
は固定化されて、前記標識特異結合物質は前記固定化弱
親和性物質と複合体を形成している検出層と；この検出
層の下に配置された吸水層；とを備えることを特徴とす
る乾式分析要素。
【請求項９】前記被検物質が抗原であり、前記特異結
合物質がその抗体である請求項８記載の乾式分析要素。
【請求項１０】前記弱親和性物質が被検物質の類似物
質である請求項８記載の乾式分析要素。
【請求項１１】前記弱親和性物質が前記特異結合物質
に対する抗体である請求項８記載の乾式分析要素。
【請求項１２】前記弱親和性物質は、これに対する第
２の特異結合物質を介して前記検出層に固定化されてい
る請求項８記載の乾式分析要素。
【請求項１３】前記第２の特異結合物質は、前記特異
結合物質よりも高い親和性で前記弱親和性物質に結合す
る抗体である請求項１２記載の乾式分析要素。
【請求項１４】前記着色粒子が金属コロイド又は着色
ラテックスである請求項８記載の乾式分析要素。
【請求項１５】前記金属コロイドが金コロイド又は銀
コロイドである請求項１５記載の乾式分析要素。
【請求項１６】前記検出層が液体試料点着後に光透過
性の多孔性膜である請求項８記載の乾式分析要素。
【請求項１７】前記吸水層が、セルロース、酢酸セル
ロース、レーヨン、木綿繊維、ガラス繊維、ゼラチン、
多糖類、ピロリドン骨格を有するポリマー、ポリメチル
ビニルエーテル又は高吸水性ポリマーからなる群から選
択される少なくとも１つの素材からなる層である請求項
８記載の乾式分析要素。