JPH01123149A - 金属ゾル捕捉イムノアッセイ法、それの使用のためのキットおよび捕捉される金属含有複合材料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、水性試料中の免疫学的に反応性の分析対象、
例えばリガントまたはりガントレセプターの測定および
検出のための方法に関する。より詳しくは、本発明は、
免疫学的に反応性のリガントおよびそれと特異的に免疫
学的に反応性である、部ち結合可能である、抗リガント
またはりガントレセプターから成る、特異的結合対の利
用を含む。

本発明はさらに、本発明の方法を実施する上での使用材
料のキットおよび、末法に従って製造される視覚的に測
定可能または検出可能の収集された固相の金属含有複合
材料に関する。

〔先行技術の記載〕

物質を高い感度および特異性をもって測定する必要は以
前からあった。特に、臨床医学、法医学、環境品質試験
、食品品質保証、薬物試験および他の関連領域といった
分野では、試験試料中の極微量物質の存否および／また
は量がしばしば非常に重大となる。そのような領域にお
いては、１００万分の１またはそれより小さいオーダー
でのごく低濃度の測定が時々必要である。さらに、その
ような試験または測定は、類似しているが異なる構造を
もつ他の分子を感知することのない、特定分子の同定を
しばしば必要とする。

高感度で且つ特異的な試験の必要性は、抗原とそのよう
な抗原に対して向けられる抗体との間の高い特異性およ
び感受性の相互作用に基づく多数のイムノアッセイ法の
開発により、従来対応されている。抗原および抗体は、
初めに動物の免疫過程に関与するものとして認識された
。即ち、動物が外来物質、即ち抗原（または抗体生産体
、ＡＮＴＩｂｏｄｙ　ＧＥＮｅｒａｔｏｒ）を注入され
ると、その動物は、侵入抗原を認識しそしてぴったりと
結合しそれにより抗原の除去または破壊を促進するよう
なタンパク質分子である抗体を生産することにより、直
ちに応答する。その免疫過程は非常に特異的であり、そ
して特定物質の同定のためにイムノアッセイ法を利用す
ることは大きな成果を伴って活用されている。そのよう
な方法は、いわゆるモノクローナル抗体を調製する方法
に関する、Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−４９７．１
９７５において報告されたＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＫｏ
ｈｌｅｒの重大発見によりさらに容、易になった。

この研究の詳細はよく知られており、ここで同じことを
繰り返す必要はないが、ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＫｏｈ
ｌｅｒの研究の結果として、高い感受性および特異性の
試薬の開発が容易になった。

ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法と称する既知の従来
の分析方法においては、抗体または抗原のどちらかが■
ｔＳのような放射性同位体でラベル化される。これらの
既知の方法に従えば、免疫複合体中の放射性同位体の量
を測定してもよく、そしてそれは試料溶液中の分析対象
の存否または量の関数である。当業界において公知のよ
うに、ラジオイムノアッセイは、競合的方式または免疫
サンドイッチ方式を使って、有名であるが数少ない様々
なやり方において構成されてもよい、　　ＲＩＡ法は、
巨大分子のような大きい分析対象およびテオフィリンの
ような小さい分子から成るより小さい物質の両方の検出
のために構成されている。現時点では、抗原性であるか
または適当な担体との結合により抗原性となることがで
きるあらゆる物質を−ＲＩ　Ａ法により検出することが
可能であり、そしてそのような方法は、それによって達
成することのできる高い感度および特異性の結果として
、広範囲に、特に臨床診断室において受入れられている
。

他方、ＲＩＡ法は、あるタイプの試験についておよびあ
る環境において、それの使用を非実用的にするような幾
つかの欠点を有する。即ち、Ｒ１＾法は、精巧な装置、
例えばγカウンターまたはシンチレーションカウンター
を使って、放射性同位体を検出する必要がある。さらに
、放射性同位体は、本質的に不安定でありそして限られ
た保存寿命を有する。また、放射性同位体は危険であり
、それの使用は特に訓練された専門家並びに危険廃棄物
処理の手段および設備を備えた研究室に限定される。

ＲＩＡ法における本来の欠点は、非放射性のラベルまた
はマーカー、例えば酵素の色形成体、蛍光物質、化学発
光マーカー等の利用により克服することができる。酵素
をラベルとして使用する時、その分析法はエンザイムイ
ムノアッセイ（ＥＩＡ）またはエンザイムリンクドイム
ノアンセイ（ＥＬＩＳ＾）（これは固相のイムノソルベ
ントを使用する）として知られるようになった。普通、
西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）のペルオキシダ
ーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダー
ゼおよびウレアーゼのような酵素が、ラベルとして使用
されている。これらの酵素は、特定の基質と反応して検
出可能のシグナルを生成しく通常、色の生成）、そのシ
グナルは、ＲＩＡ法に必要とされるものに比べていくら
か単純な装置、例えば比色計を使って定量できる。さら
に酵素の使用は、放射性同位体に比べて、はとんどまた
は全く危険がない。

ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ法に関する最も有用な酵素系は
、比較的安定であり、そして冷凍条件下で１年位の間し
ばしば保存され得るものである。結果として、酵素マー
カーを利用する分析法は、様々な研究室装置において、
そしである場合には医院においておよび使用者の家にお
いてさえも、今日広く使用されている。蛍光分析および
化学発光分析のような他の方法も同様に、ＲＴＡの安定
性および危険性の欠点を克服する。しかしながら、これ
らの方法は、一般に精巧な装置を必要とし、そのためそ
れの使用が主としてよく設備された研究室に限定される
。イムノア７セイ法において有用な多数の酵素、蛍光お
よび化学発光ラベルは、米国特許証第４．２３３，４０
２号において開示されている。

−船釣に言えば、酵素ラベル化イムノアッセイ法は、離
れた場所で行われる高感度および高特異性のイムノアッ
セイに対する要求および希望を満足させるために利用さ
れている。そのような試験が望ましく行われるような離
れた場所は、前述したように、医院および使用者の家を
包含する。医院においては、診断が遅れることなく完了
しそして１回の来院の間に処置が始められるように、患
者がまだ医院にいる間に迅速で単純な分析を行うことが
しばしば有効である。そのような分析でなくとも、１回
の来院の間に医師が患者から試料を採取することはしば
しば必要であり、そしてそのよ、うな試料は分析のため
に診断室に送られ、結果は後にその診断室により医者に
戻って報告される。

その合間に患者は家へ帰り、そしＬ適切な処置および／
または投薬を受けるために２回目の来院のために医院に
戻らなければならない。そのような遅れは、非能率的で
且つ不適当であり、そしである場合には、人命にさえか
かわるかもしれない。

自宅試験は、消費者自身の家の中における消費者による
試験を容易にすることが好ましい。試験の結果は、医師
への訪問の必要性の有無を示すものであってもよい。“
自宅での”需要に有用な試験の例は、妊娠、排卵、スト
レプトコンカス感染、および尿、唾液または他の適当な
試料の分析により検出されるだろう他の感染についての
試験である。

離れた場所の試験については、適当な感度および特異性
が達成されると仮定して、実用的な分析法のためにさら
に少なくとも３つの必要条件がある。それらの望ましい
要素の第一は、分析が許容できる短時間内で（短ければ
短いほどよい）行われなければならないという点で速さ
である。分析の成分は、冷凍または特定の管理なしに長
い時間安定であるべきであり、そして最初Ｑ試験が行わ
れた数日後であっても解釈が正確であるように、分析結
果または読取りは十分に安定であるべきである、という
点で安定性もまた望ましい主要点で之 ある、最後に、商業的観点から、試験はできる限り単純
で最低限の器具のみを必要とするかまたは全く必要とせ
ず、そして不正確な解釈となるような誤りまたは乏しい
性能を排除するものである。

酵素マーカーを使用するイムノア７セイキソトは、妊娠
および排卵を検知するものについて今日商業的に入手可
能である。そのようなキットに通常含まれる技術的構成
要素は、（１）固定化抗体を有する固相、（２）酵素ラ
ベル化された抗体、（３）洗浄液（ある場合には、これ
は使用者の水道水でもよい）、および（４）酵素のため
の基質、である。

典型的な手順は、試料を固相と混合しそしてインキュベ
ートシ（次に洗浄段階を伴ってまたは伴ねないで）次い
で試料を捨てることである０次いで、固相を酵素ラベル
化抗体と接触させそしてインキュベートし、その後固相
を洗浄し、そして基質と接触させる。約５分後、固相の
色を観察、する。１つのそのようなアッセイは、米国特
許証第４．６３２．９０１において記載されている。

酵素ラベル化イムノアフセイは、例外ではなく、幾つか
の酵素系の不安定性、キット成分の数および操作の煩雑
さに起因するそれ自体の欠点がある。

結果として、イムノアッセイ法、特に離れた場所で行わ
れる方法を単純化し、迅速化しそしてその成分および生
成物に安定性を与えるための努力において研究が続いて
いる。そのような研究の１つの結果は、イムノアッセイ
法におけるマーカーとしての金属ゾル粒子の認識であっ
た。そのような方法は、米国特許証第４．３１３．７３
４において開示されている。この特許の開示においては
、タンパク質でコートされた金属ゾル粒子がタンパク質
でコートされた固相と反応して光学的特性の変化を引き
起こし、そして液相における比色測定を提供する。その
免疫反応は、分散した物質の凝集または凝塊形成をもた
らし、液相の光吸収および反射の特性に変化をもたらす
。そのような変化は、分光光度計のような装置を使って
測定される。ある場合においては、液相中の色の変化は
対照の液体の色と試料中の色との比較により、そしてお
そらく赤〜紫〜無色への色の変化のような融合体中の微
妙な色の変化を観察することにより、視覚的に評価され
るかもしれない。凝集試験における反応の経路は時間依
存性であり、そして目視検査は時間内のある特定な時点
で行われなければならない。

さらに、視覚評価が行われた後でも反応は続行するので
、試験結果は一般に安定性を欠く。

免疫反応性試薬の反応に起因しそしてラベルとして金を
利用する凝集反応は、ＨｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒおよびＲ
ｏｓｓｅｔによるマンナンの検出にも利用された。

彼らの研究は“コロイド状の金、透過および走査電子顕
微鏡検査のための有用なマーカー”と題した彼らの論文
（Ｊ、旧ｓｔｏｃｈｅｍ、ｃ　ｔｏｃｈｅｍ、　２５＋
１９７Ｌｐｐ、２９５−３０５）中に記載されている。

この研究において、凝集過程が使用されそして免疫反応
の進行の後で流体における光の吸収が分光光度的に読み
取られた。この研究は、前記特許゛７３４に記載された
研究の序論を提供した。

タンパク質でコートされた粒子を利用した他の従来方法
は、米国特許証第４．１１５．５３５に記載されている
。前記特許°５３５に記載された方法は、同一のタンパ
ク質でコートされた２つの異なる種類の粒子の凝集が生
じる免疫過程を含む、その粒子のうちの１つは、磁石を
使って液体から凝集塊が分離できるように、磁性を有す
る。もう１つの種類の粒子は、蛍光および／または示差
的に色のついた小ポリマー粒子から成ると記載されてい
る。各粒子のサイズは、１ミクロンかまたはそれより小
さいものであると指定されている。金属粒子が磁気粒子
として使用されているけれども、この開示においては、
比色結果を与えるような金属粒子の利用について全く示
唆していない。凝集反応は、米国特許証第４，４８６．
５３０に開示された方法の中にもまた含まれている。　
　　　゛ 注目すべき先行技術の方法は、Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　ｏ
ｆｔｈｅ　Ａｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎ　　１９８６　
ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ−ｎａｌ　Ｃｏｎ
　ｒｅｓｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　　の第３６３頁
（ＡｂｓｔｒａｃｔＣ−２１３）に開示されている。こ
の方法は、ニトロセルロース膜上に固定された抗体の利
用を包含する。その抗体は、その膜を通した検体の免疫
濾過の間に抗原を捕捉するために利用されている。その
後、抗体と結合したコロイド状の金でその膜を染色した
。赤いスポットが陽性反応を表すと言われた。この方法
は、２つの注入段階が必要でありそしてその方法は前調
製および特定の抗体が結合する膜の利用を必要とすると
いう点で、前述したエンザイムイムノアッセイと同じ種
類の欠点に悩む。

〔発明の概要〕

本発明は、前述の先行技術の方法の欠点からの敦済を提
供する。このために、本発明は、安定な成分を利用しそ
して安定な試験結果を与える、単純化された、感受性の
および特異的な試験方法を提供する０本発明に従って、
水性試料中の免疫学的に反応性の分析対象の測定および
検出のための方法が提供される。その方法は、免疫学的
に反応性の物質とラベル化された成分の通常安定な単分
散の懸濁液の維持を容易にするようなサイズおよび性質
の金属含有粒子との結合生成物を含んで成るラベル化さ
れた成分の準備を包含する。また、免疫学的に反応性の
物質と固相成分の通常安定な懸濁液の維持を容易にする
ようなサイズおよび性質の固相粒子との結合生成物を含
んで成る固相成分を準備する。前記固相成分と前記ラベ
ル化された成分を一緒に混合し、そして分析することに
なっている試料と接触させて、両成分と分析対象につい
て分析することになっている試料とを含む単一の水性混
合懸濁液を形成せしめる。前記粒子に結合した免疫学的
に反応性の両物質は、分析対象の存在の作用として直接
的または間接的に結合することができ、それにより分散
性の、収集可能な、固相の、金属含有複合材料を形成す
る。本性は、前記複合材料を収集し、そして収集された
固相複合材料における金属の存在を直接目視検査を通し
て評価することにより、試料中の分析対象を測定または
検出する、最終段階を包含する。

特にリガントまたは抗リガント（後者は、時々リガント
レセプターと称される）である分析対象の測定および検
出において有用である。そして本発明のより特定の観点
においては、金属含有粒子は、好ましくは約５０人〜１
０００人の範囲、より好ましくは約１３５人〜約５００
人の範囲の粒度を有する金属ゾル粒子である。本発明の
特に好ましい形態においては、本性は金のゾル粒子の使
用を包含する。

本発明の方法において有用なラベル化された成分は、免
疫学的に反応性の物質を前記粒子に直接結合させること
により調製されてもよい。また、ラベル化された成分は
、ビオチン／アビジン結合を使って前記粒子と前記物質
とを結合させることにより調製されてもよい。この後者
に関しては、前記物質をビオチニル化してもよく、そし
て金属含有粒子はアジピン化合物でコーティングしても
よい。次いで該物質上のビオチンを該粒子上のアジピン
化合物・ヒ反応させて、該物質と該粒子とを−ｒに結合
してもよい。本発明の別の代わりの形態においては、牛
血清アルブミン（ＢＳＡＪを使って該粒子と該物質とを
結合することにより、ラベル化成分を調製してもよい。

本発明に従って、対応する物質を固相粒子と直接結合さ
せることにより、固相成分を調製してもよい。代わりに
、ＢＳＡ結合を使って該物質と該粒子とを結合すること
により、固相成分を調製してもよい。また、別の代わり
の形態においては、ゼラチンを使って該物質と該粒子と
を結合することにより、固相成分を調製してもよい。

本発明のある好ましい形式に従えば、免疫学的に反応性
の両物質は、共に分析対象と結合してサンドイッチを形
成することができるものであってもよい。これについて
、前記両物質は各々、抗原の分析対象と免疫学的に結合
することのできる抗体であってもよい。好ましくは、そ
のような両抗体は、抗原上の異なる部位とそれぞれ結合
する。

本発明の他の好ましい形式においては、免疫学的に反応
性の両物質は互いと結合してもよい。すなわち、両物質
のうちの１つが抗体でありそしてもう１つが抗原であっ
てもよい。好ましくは、ラベル化された成分の免疫学的
に反応性の物質が抗体であろう。本発明のこの形式にお
いて、分析方法は競合的阻害（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ
　１ｎｈｉｖｉｔｉｏｎ）法に頼ってもよい。

本発明のある好ましい観点においては、収集段階は、濾
液の通過は許すが複合材料の通過を妨げるような多孔質
の濾過要素上に複合材料を捕捉することを含んで成って
もよい。本発明のこの観点においては、濾液は遠心力ま
たは毛管力によりあるいは沈下により該要素を通して引
き抜かれてもよい。本発明の他の観点においては、収集
段階は、複合材料を沈降により限定体積の空間の中へ沈
下させて、それにより濃縮されたペレットを形成せしめ
ることから成ってもよい。本発明の別の観点においては
、収集段階は、水性懸濁液を遠心して複合材料を限定体
積の空間の中へ押し込め、そしてそれにより複合材料を
濃厚なペレットに詰めこむことを含んで成ってもよい。

別の重要な観点において、本発明は、水性試料中の免疫
学的に反応性の分析対象の測定および検出において使用
するための材料のキットを提供する。そのキットは、例
えば、免疫学的に反応性の物質とラベル化された成分の
通常安定な単分散の懸濁液の維持を容易にするようなサ
イズおよび性質の金属含有粒子との結合生成物を含んで
成る、ラベル化された成分；免疫学的に反応性の物質と
固相成分の通常安定な懸濁液の維持を容易にするような
サイズおよび性質の固相粒子との結合生成物を含んで成
る、固相成分（前記両成分は、前記両成分の水性混合懸
濁液の形成を可能にするために操作可能および同時操作
可能であり、そして分析対象について分析することにな
っている試料を含み、前記ラベル化された成分の物質お
よび前記固相成分の物質は、試料中の分析対象の存在の
作用として間接的にまたは直接的に結合し、それにより
分散性の、収集可能な、固相の、金属含有複合材料を形
成することができる）；および、固相複合材料における
金属の存在を評価する目的で該複合材料を収集しそして
直接目視検査を可能にし、それにより試料中の分析対象
の最初の存在を検出または測定するための、コレクター
要素；を包含するであろう。

さらに別の観点においては、本発明は、水性試料中の分
析対象の最初の存否または量を指示するために直接視覚
的に観察することのできる、固相の金属含有複合材料の
安定な収集塊を提供する。

その複合材料は、免疫学的に反応性の物質とラベル化さ
れた成分の通常安定な単分散の懸濁液の維持を最初に容
易にするようなサイズおよび性質の金属含有粒子との結
合生成物である、ラベル化された成分；免疫学的に反応
性の物質と固相成分の通常安定な懸濁液の維持を最初に
容易にするようなサイズおよび性質の固相粒子との結合
生成物を含んで成る、面相成分；を含んで成り、前記両
物質は、前記複合材料を与えるために直接的または間接
的に互いに結合する。本発明のこの観点においては、前
記塊状物は、多孔質フィルター要素上または試験管の底
に収集される。そのような形で収集された複合材料は、
比較的安定な色調でありそして復時の結果の確認のため
に保存されてもよい。

〔具体的な記載〕

本発明の概念および理論に従えば、′約５０〜約１００
人の範囲の粒度を有する金属ゾル粒子を抗体でコーティ
ングしてもよい。そのような金属粒子、および特にその
表面上を抗体でコートされた金ゾル粒子は、既にＭ、）
ｌｏｒｔｓｂｅｒｇｅｒらにより、ｈ以圧釦μ佳株、３
１．第１１４７−１１４９頁、１０月１５日、１９７５
において記載されている。抗体または抗原でコートされ
たそのような金粒子は、粒度に依存して、赤、オレンジ
または紫のいずれかに強く着色している。

本発明に従えば、そして全く思いがけないことに、色形
成体として酵素を通常使用する多くのイムノアッセイに
おいて、感度の有意な低下なしに、金ラベル化免疫反応
体が酵素ラベル化免疫反応体の代わりに直接置き換えら
れてもよいということが見出された。このことは最も重
要な知見である。

なぜなら、金うベル化沃体は、下記の条件下で肉眼で直
接置ることができるが、一方酵素ラベル化抗体は、その
酵素のための基質の添加を必要とするからである。それ
故、金属ゾル分析、特に金ゾル分析は、１つ少ない段階
および１つ少ない試薬を必要とする。加えて、コロイド
状の金粒子は、一般にどのような酵素ラベル化抗体より
もかなり安定である。

本発明の方法に従えば、免疫試薬でコートされた金粒子
を、ラテックス、スラニー状ガラス、セファロース、リ
アクトゲルまたはイソチオシアネート活性化ガラスのよ
うな固相粒子と混合する。

この固相粒子もまた免疫試薬でコートされている。

そのような混合懸濁液を、金ゾル相および懸濁された固
相と結合した２つの免疫試薬のうちの両方または片方と
結合可能であるような分析、対象を含む試料と接触させ
る。そうして、金粒子は固相と免疫特異的に結合する（
サンドイッチ形式）か、または期待される結合を妨害す
る（競合的阻害形式）。この概念の種々の態様は、下記
に記載される。

本明細書中に記載する態様および例の各々において、懸
濁された固相は、沈降、遠心、または多孔質捕捉マトリ
ックスの上および内部へのトラップにより、収集または
捕獲される。分析結果は、捕捉された固相の直接目視検
査により得られる。

金ゾル粒子を、使用するなら、ば、捕捉された固相は、
分析対象の存否に依存して、そして金ゾル粒子の不在下
では固相それ自体が無色であると仮定すれば、強烈な赤
、ピンクまたは本質的に無色のいずれかであろう。

本発明に従って使用される金属ゾル粒子は、既知の方法
論により調製されてもよい。例えば、金ゾル粒子の調製
は、Ｇ、Ｆｒｅｎｓ、Ｎａｔｕｒｅ、　２４１．２０　
２２（１９７３）の文献中に発表されている。また、金
属ゾル粒子は、金属または金属化合物あるいは金属また
は金属化合物でコートされたポリマー核であってもよく
、すべて前記の特許９７３４中に記載されている。この
ことについては、金属ゾル粒子は、白金、金、銀または
銅あるいは特徴ある色を示す多数の金属化合物であって
もよい。

固相粒子は、多数の既知の水分散性粒子のうちのいずれ
か１つ、例えば米国特許証第３．０８８，８７５号に開
示されたポリスチレンラテックス粒子を含んで成っても
よい。そのような固相材料は、水不溶性の小さい粒子か
ら成ってもよく、そこにタンパク質、例えば本発明の免
疫学的に反応性の物質が結合することができる。適当な
固相粒子は、例えば米国特許証第４．１８４．８４９号
；第４．４８６．５３０号；および第４．６３６．４７
９号において開示されている。

本発明に関する有用な固相粒子は、例えば、ラテックス
粒子または他の支持材料の粒子、例えばシリカ、アガロ
ース、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリメチルメタク
リレート、カルボキシレート改質ラテックスおよびセフ
ァロース粒子、を含んで成ってもよい。好ましくは、そ
の粒子は約０．２−〜約１０．１１１１の範囲のサイズ
において異なるであろう。特に、有用な商業的に入手可
能な材料は、０．９９μのカルボキシレート改質ラテッ
クス（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）　、臭化シアン活性
化セファロースビーズ（Ｓｉｇｉ＋ａ）　、融解シリカ
粒子（Ｃｉｂａ　Ｃｏｒｎｉｎｇ。

ロット＃６）、イソチオシアネートガラス（Ｓｉｇｍａ
）。

リアクトゲル２５０Ｆ　（Ｐｉｅｒｃｅ）およびポリビ
ーズ−カルボキシレート単分散微小球（Ｐｏｌｙｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ）を包含する。本発明に従って、当業界にお
いて既知のやり方でそのような粒子を免疫学的に反応性
の物質の層でコートして、固相成分を与えてもよい。

本発明に従えば、特定の抗原を検出または測定するため
に、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のど
ちらかを使用してもよい。有用なモノクローナル抗体は
、上記に引用したＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＫｏｈ　ｌｅ
ｒの発明に従って調製されてもよい。

本発明に係る特に望ましいモノクローナル抗体は、Ｓｏ
ｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第３巻、第
２号、１９７７、第２３１−２３６頁において報告され
た、Ｇｅｆ　ｔｅｒ、　Ｍａｒｇｕ−１ｉｅｓおよび５
ｃｈａｒｆｆのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で促
進されるハイブリダイゼーション法を使って調製されて
もよい。ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）およびヒ
ト黄体形成ホルモン（ｈＬＨ）’ｄ＊出するのに有用で
ある適当な抗体は、種々の既知の免疫処置スケジュール
のうちのいずれか１つ、抗原投与および抗原授与の方法
を利用して、ｈＬＨまたはｈｃｃでのマウスＡ株（Ｊａ
ｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＋Ｂａｒ　Ｈａ
ｒｂｏｒ、　Ｍａｉｎｅ）の免疫処置を含む、わずかに
変えｒ；Ｇｅｆｔｅｒの方法を使って調製されてもよい
。

そのような方法は、ハイブリドーマ細胞系を良好に産生
ずることのできる抗原反応性血清抗体の産生を誘導する
。特に、ハイブリドーマは、Ｇｅｆ　ｔｅｒらのポリエ
チレングリコールで触媒される細胞融合法により、免疫
マウスからのＳｐ６マウスリンパ球とＳＰ　２　／　Ｏ
−Ａｇ１４細胞との融合により調製されるＣＭ、Ｊ、Ｓ
ｃｈｕｌｍａｎおよびＧ、Ｋｏｈｌｅｒ、　Ｎａｔｕｒ
ｅ＋第２７４巻、第９１７−９１９頁（１９７８）　）
。ハイブリドーマ組織培養物の上清は、Ｋｌｉｎｍａｎ
らの方法に従って、固相の抗体の結合イムノアッセイに
より初めて分析された（Ｋｌ　ｉｎｍａｎ＋　Ｎ、　Ｒ
，、Ｐｉｃｋａｒｄ、　Ａ、Ｒ，、Ｓｉｇａｌ、　Ｎ、
Ｈ，。

Ｇｅａｒｈａｒｔ、Ｐ、Ｊ、　、Ｍｅｔｃａｌｆ、Ｅ、
Ｓ、およびＰｉｅｒｃｅ、Ｓ、に、ｔＡｎｎ、Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、（ｌ口ｓｔ　Ｐａ５ｔｅｕｒ　、　１２７Ｃ巻
、第４８９−５０２頁（１９７６）　）。

典型的な方法を使った分析およびスクリーニングの後、
適切な結合能力および特異性を有する抗体を産生ずるた
めのハイブリドーマ細胞系を同定した。そのようなハイ
ブリドーマ細胞系を使って産生される抗体を、便宜上、
ｈｃｃ特異的抗体については２Ｂ２、ｈＬＩ＋特異的抗
体についてはＬＩ！２６、そしてｈＬＨおよびｈｃｃの
両方と特異的に反応する抗体についてはＨＣＧ／ＫＬＨ
／２Ｇ９の用語を使って同定する。

２Ｂ２抗体はｈＣＧ抗原分子上の１つの個別的な結合部
位に選択的に結合し、一方、ＨＣＧ／ＫＬ１１／２Ｇ９
抗体は、ｈＣＧ分子上の独立した個別的な結合部位に選
択的に結合する。同様に、ＬＨ２６およびＩＩＣＧ／Ｋ
ＬＩＩ／２Ｇ９抗体は、ｉ＋ＬＨ分子上の独立した、別
々の、個別的な結合部位に選択的に結合する。

本発明に従っておそらく検出または測定されるかもしれ
ない標的リガントまたは抗リガントのリストは、本明細
書に包含するには長すぎる。しかしながら、ＩｇＥ＋　
ｈＣＧ、ｈＬＨ１プレグナンジオール−３−グルクロニ
ド（Ｐ３Ｇ）のようなリガントおよび抗原並びに動物の
体液中に見つかる他の抗原およびリガント、またバクテ
リア、寄生虫、真菌類またはウィルスに関する抗体、例
えばストレプトコツカス、クラミジアまたは淋病に関す
る抗体を、例えば本発明の方法により検出または測定し
てもよい、とだけ言っておこう。さらに、例えばテオフ
ィリンのような小さい分子を有する療法薬および調節物
質を、本発明を利用して検出または測定してもよい。

本発明は下記の例によりさらに詳細に説明される。

〔実施例〕

例１−７４ムリ唄１ （ａ）金ゾル粒子を上記に引用したＦｒｅｎｓ　（１９
７３）の方法に従って調製する。一般に、０．２ｇのク
ロ口金酸（ＨＡｕＣｌ４）　（八ＥＳＡＲ，５ｅａｂｒ
ｏｏｋ＋Ｎｅｗ　Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ）を１９メガオー
ムの脱イオン化蒸留水２１に溶かし、そして３０分以内
に沸騰させる。１％クエン酸三ナトリウムの新鮮な溶液
４８Ｍ１を撹拌しながら素早く添加する。５分間以内に
、ブリリアントオレンジ色のゾル分散液が形成される。

生成した物質の光学スキャンは、５２０ナノメートル（
ｒ＋ｍ）に最大吸収を示した。得られた粒子の直径を電
子走査顕微鏡での目視により測定すると、約１３５オン
グストローム（人）であることがわかった。

（ｂ）直径５００人を有する金ゾル粒子は、クエン酸三
ナトリウム溶液を４８−ではなり１５ｍｆｆ１添加する
こと以外は例１　（ａ）の手順を使って調製した。

例■−會Ａ對ジ１１１ タンパク質を金ゾル粒子上にコーティングする最適条件
は、タンパク質ごとに、および金ゾル粒子のバッチごと
に異なる。そして、そのような条件は、一般に経験的に
決定されるに違いない。最適条件を決定するために、最
初に、金ゾル粒子に吸着されるタンパク質を、ｐＨ８，
０を有する２ミリモル（ｍＭ）ホウ酸塩−１０ｍＭアジ
ド溶液に対して室温で徹底的に透析する。コーティング
の前に、透析した調製物を０．２ミクロン（−）のＭｉ
ｌｌｅｘ　ＧシフイルターＣＭｉｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄ
ｆｏｒｄ、ＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔＬｓ）を通して濾過
した。タンパク質濃度は、１．４の吸光係数を使って分
光光度的に測定した。金ゾル粒子の最適コーティングに
必要なタンパク質の量を決定するために、ｐｉｔおよび
タンパク質濃度の変数の等温式が作成される。Ｇｏｏｄ
ｍａｎ＋Ｈｏｄｇｅｓ、Ｔｒｅｊｄｏｓｉ−ｅｗｉｃｚ
およｉｕＬｉｖｉｎｇｓｔｏｎ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
旧Ｃｒ０３ＣＯ１Ｖｏ１．１２３．Ｐｔ、２．１９８１
年８月、第２０１−２１３頁の方法が後に示されるよう
な幾つかの変形を伴って利用される。金粒子上のタンパ
ク質の吸着におけるｐＨの効果は、２．３〜１１．０の
範囲のｐＨを有する１１の異なる緩衝液のシリーズにお
いて調べられる。使用する緩衝液は、ｐＨの増加する順
に、トリス、リン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエ
ン酸、ホウ酸、バルビツール、ピペラジン、モルホリン
、乳酸、サリシル酸ナトリウムおよびフタル酸である。

分光光度分析用には、２７０μｌの金ゾル粒子を、１０
ｍ？Ｌ？ｆｆｉ度のアジドを含む７０ｍＭの緩衝液の３
０μ！アリコートに添加する。その溶液を渦動撹拌し、
そして室温で１５分間放置する。１−当たり５０μｇの
タンパク質溶液６０１１！を、渦動撹拌しながら添加す
る。周囲温度で１時間放置した後、１０％塩化ナトリウ
ム溶液６０μ！を加える。無蛍光ゾルに対して最大吸光
度（５２５ｎｍ）を測定する。該ゾルは最初オレンジ／
赤でありそして凝集するとその色が青／グレーに変化す
るので、反応を視覚的に記録する。コロイド状金のこの
特性を活用して、Ｇｏｏｄｍａｎらの方法に従って最適
な緩衝液を選択する。タンパク質濃度の等温式は、ｌｌ
１１ｒ／−〜３．９■／Ｗ１の範囲の濃度を使って同様
にして決定されてもよい。このようにして、最適な緩衝
液および吸着タンパク質濃度が、タンパク質材料および
金ゾルのバッチの各組合わせについて選択されてもよい
。タンパク質の過剰吸着の影響は、最適コーティングの
レベルの上下のタンパク質濃度のプローブ調製物を使っ
て調査されてもよい。最適にコーティングした金ゾル粒
子は、前述の方法論に従って調製され、そして次の例に
おいて利用される。

（ａ）ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）またはヒト
黄体形成ホルモン（ｈＬＨ）のどちらか一方と特異的に
反応することのできるモノクローナル抗体でコートされ
た金プローブ、および抗体ＨＣＧ／ＫＬＨ／２Ｇ９とし
て同定されたものでコートされた金プローブは、４１の
ビーカ゛−中で７０ｍＭ炭酸塩−Ｌ　ＯｍＭチアジド衝
液２００−と例１　（ａ）に記載の金ゾル分散調製物１
８００１Ｒ１とを迅速に混合することにより調製される
。生成するｐＨは９．９である。混合しながら、ｐＨ８
，０を有する２ｇＭホウ酸塩−１０ｍＭアジド緩衝液中
の１５０ｎ／ａｄの抗体溶液４００−を加え、そして１
５分間反応させる。次いで、５−のＡｃｒｏ−ｄｉｃ（
ＧｅｌＩＩａｎ、Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ）を通して前濾過
しである５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２０Ｍ
　（Ｓｉｇｍａ。

Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ）１８０ｍを混合しながら加え、そし
テソノ混合物を周囲温度で１５分間反応させる。そして
そのプローブを、１シリーズの２２０ｄ　Ｎａ１ｇｅｎ
ｅポリカーボネート容器の中にアリコートに分け、そし
て５ｏｒｖａｌｌ　ＧＳＡＳ−ローター中れ、そして５
ｏｒ−ｖａｌｌ　ＲＣ５Ｂ遠心機において４℃で４５分
間１０，０００ｒｐｍで遠心する。上清を捨て、そして
暗赤色のペレットを等量の緩衝液Ｘ（ｐＨ７，３を有し
、そして０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｍｉｌ
ｅｓ）、０．１ｇ　／１チメロサール（Ｍａｒｃｈｅｓ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　＋　０．３　ｇ　／　ｌ塩化ナ
トリーウムおよび０．２ｇ／ＩＩ　　ＰＥＧ　２０Ｍ（
Ｓｉｇｍａ）から成る〕中に再懸濁する。遠心操作を繰
り返し、そして生じたペレットを最小体積の緩衝液Ｘ中
に再懸濁し、０．２　ｎ　Ｍｉｌｌｅｘ　ＧＶユニー−
ット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過しそして再び
緩衝液Ｘを使って体積を５０−に合わせる。調製された
プローブを琥珀色のガラス容器中に入れ、そして使用ま
で４℃で保存する。脱イオン水において１：２０で希釈
されたアリコート部分は、５２５ｎｍの吸光度最大を現
し、そしてオレンジ／赤の色を有する。

（ｂ）プレグナンジオール−３−グルクロニドのための
プローブは、例１　（ａ）の金ゾル分散液５９８．５−
と９１１８．５を有する７０ｍＭホウ酸塩−１Ｏｎ＋Ｍ
アジド緩衝液６６．５−とを素早く混合することにより
調製される。’１５ｎｌｙｄｔＷｉ度のプレグナンジオ
ールに対する抗体およびｐ）１８．０を有する２ａ＋Ｍ
ホウ酸塩１０ｍＭアジド緩衝液を含む溶液１３３Ｎｉを
、混合しながら、緩衝化された金ゾル混合物に加える。

生じた混合物を１５分間反応させる。その材料を遠心し
そして例ＩＩ　（ａ）において前述したように操作する
。

（ｃ）　ｈＣＧとｈＬＨの両方のための別の多目的プロ
ーブは、最初にストレブタビジン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ、
Ｌｏｕｉｓ）で金ゾル粒子をコーティングすることによ
り調製される。この場合、例Ｉ　（ａ）の金ゾル分散液
６７．５−およびｐＨ８，３の炭酸塩緩衝液をビーカー
に入れ、そして迅速に混合する。迅速な混合の間に、ホ
ウ酸塩緩衝液中に７５ｘ／ｊｄの濃度でストレプタビジ
ンを含む溶液１５−を加える。その溶液を周囲温度で１
５分間混合し、そして濾過済のＰＩ！Ｇ　２０Ｍ６．１
５ｄを添加する。遠心および洗浄の後、このプローブも
同様に上記の例ｎ　（ａ）において指定されたように操
作する。

ｈＣＧとｈＬＩＩの両方と特異的に反応するＩＩｃＧ／
ＫＬＨ／２Ｇ９抗体をビオチニル化してストレプタビジ
ン金プローブへの付着を容易にする。このために、ビオ
チン−ε−アミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステル（ビオチン−ｘ　−ＮＨ３＋Ｃａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　　１　ｌｅｇを口ＭＳＯ（Ａｌｄ
ｒｉｃｈ）　　１−に溶かす。

ｐＨを８．２で維持するために０．１Ｍ炭酸水素ナトリ
ウム緩衝液を使って、１■／−の濃度で抗体を含む溶液
を調製する。そのビオチン−Ｘ−ＮＩＩＳＷＩ液の６０
　、１２０および２４０Ｉの部分を、それぞれ１−アリ
コートの抗体溶液に添加し、そして周囲温度で２．４時
間反応する。インキュベーションの後、ｐＨ７，２のリ
ン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）−アジド溶液に対して１６時間
透析を行う。４００Ｊｔｌアリコートの各試料を、アジ
ピンでコートされた金プローブ１５６Ｊ１１と反応せし
める。各試料を室温で１５分間反応させ、次いでその試
料を緩衝液Ｘで希釈し、そして５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ５
Ｂ遠心機において４℃で３０分間１０、　ＯＯＯｒｐｍ
で遠心する。その試料を０．２１１　ＭｉｌｌｅｘＧＶ
フィルターに通して濾過し、そして４℃で保存する。

（ｄ）テオフィリンのためのプローブは、水９ピリジン
１で含む混合物３−中にテオフィリンブチル酸（ＴＢＡ
−Ｃａ１．Ｂｉｏｃｈｅ＋ｓ、５８１１１６）　　２０
ｏ＋ｇおよび牛血清アルブミン（ＢＳＡ）　１１０■を
溶解することにより、ＢＳＡとＴＢＡとを最初゛に接合
させることにより調製される。この溶液に、Ｎ−エチル
、Ｎ〜ジメチルアミノカルボジイミド塩酸塩２９■を加
える。室温で一晩インキユベーションした後、その混合
物をＰＢＳに対して徹底的に透析し、そしてＰＢＳ　ｄ
　ｄ中に保存する。

ＴＢＡ　−ＢＳＡ接合体を次のようにコロイド状金上に
コーティングする。例１　（ａ）に従って調製した０、
００１Ｍ　トリス緩衝液中の金ゾル分散液８−をｐＨ７
，０の０．０７Ｍ　）リス緩衝液ＩＮ１に添加する。生
じたＴＢＡ　−ＢＳＡ接合体溶液２００ＩをＰＢＳ　３
−で希釈し、そして生じた混合物を、緩衝化されたコロ
イド状金の溶液へ（後者を渦動撹拌しながら）満月する
。次いでＰＢＳ　３０ｄを加え、そしてその混合物を２
７．０００Ｇで２０分間遠心する。そのペレットを再懸
濁し、そして同様に遠心により６回洗浄する。テオフィ
リンでコートされた金ゾルを、最後に０．１％ＢＳＡを
含むＰＢＳ約３ｄ中に再懸濁する。

（ｅ）　ｈＣＧまたはｈＬＩ＋のどちらか一方と特異的
に反応することΦできるモノクローナル抗体でコートさ
れた金プローブは、例Ｕ　（ａ）の方法を使って調製さ
れる。ただしこの場合には、例１　（ｂ）に従って金ゾ
ル分散液を調製し、そして抗体溶液は３００賄／−の抗
体濃度を有する。調製した５００人の金プローブ粒子を
、例ＩＩ　（ａ）において前述したように濾過し、洗浄
し、操作しそして保存する。

例ｍ−ｕ側む■１１ （ａ）　０．９９μカルボキシレート変質ラテツクス（
Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）　１．０　ｙｄおよび０．
１５Ｍ　ＮａＣｊｔ溶液２０Ｍ１を遠心管に入れる。１
００■／ｌ１１１Ｗ１度の１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の水溶液０
．７５−をその遠心管に加え、そしてその混合物を２０
分間攪拌する。

その後、０．１５Ｍ　ＮａＣｆ溶液ｌｉｄを添加し、そ
してこの混合物を３８．０００　Ｇで１０分間沈降させ
た。

その上清を捨てそしてペレット化したラテックス粒子を
０．１５Ｍ　ＮａＣｊ！溶液２〇−中に再懸濁する。

その懸濁液を上記のように再遠心し、そしてそのペレッ
トを最終的に０．１５Ｍ　ＮａＣ１溶液４ｎｔｌ中に再
懸濁する。このラテックス懸濁液２−、　０．１５ＭＮ
ａＣ１溶液１．５１１１１および１．６７８ｍ＋ｒ／−
の濃度でｈＬＨ特異的抗原（称号ＬＨ２６により上記に
同定されたもの）を含む溶液１．５−を、１５−のプラ
スチック製試験管中で混合する。その試験管のふたをし
て、そして混合物をＬａｂｑｕａｋｅ回転子上で転倒撹
拌しながら２２℃で１６時間インキエベートする。その
後、ＰＨ７，５を有する１Ｍリジン溶液１．０　Ｍｌを
加え、そしてその混合物をさらに３０分間撹拌する。抗
体でコートされたラテックスを、前述のようにペレット
化を繰り返しながら、０．１５ＦＩ　Ｎａ（Ｊ溶液３０
−で４回洗浄する。最後のペレットを、１■／−のＢＳ
Ａを含む０．１５Ｍ　ＮａＣ１溶液２−中に再懸濁する
。

（ｂ）ウサギの抗テオフィリン抗血清はＫａｌｌｅｓｔ
ａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＋Ｃｈａｓｋａ、旧ｎｎ
ｅｓｏｔａ（カタログ番号３３４、ロフト番号Ｘ　３５
３１）から得られる。血清のγ−グロブリン分画は、最
終濃度４０％への硫酸アンモニウムの添加、遠心分離、
ＰＢＳ中への再溶解およびＰＢＳに対する透析により得
られる。タンパク質濃度２３■／−のこの調製物０．２
−を、０．１５ＭＮａＣ４、０，０５９Ｍ　ＮａＨＣＯ
ｓの溶液２１１１中に懸濁した臭化シアン活性化セファ
ロースビーズ（Ｓ　ｉ　ｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ
、）　０．５　ｇｌｌと反応せしめる。室温で２時間混
合した後、ｐＨ８，４を有する０、２７Ｍリジン溶液２
＋ｄの添加により反応を止める。そしてポリクローナル
抗体でコートされたビーズをガラス濾過器上に集め、０
．１５Ｍ　ＮａＣ１で洗い、そして等張食塩水中に保存
する。

（Ｃ）臭化シアンセファロース／ｈＣＧに対する抗体の
調製物を以下のように調製した。臭化シアンセファロー
ス４Ｂビーズ（Ｓｉｇｍａ）　１．０　ｇをガラス濾過
器上で０．０００１Ｍ　１（ＣＪ　２００＋ｄで洗う。

洗浄した白−ズを、称号２Ｂ２により上記に同定された
ｈｃｃ特異的抗体９．０　＊を含むＰＢＳ　３　ｄの入
った試験管に加える。その試験管のフタをし、そして混
合物を室温で一晩転倒回転させる。ｐＨ８，１での水２
−中１００■のリジンの添加により、反応は停止する。

手動振とうにより混合をさらに３０分間続け、次いでそ
の懸濁液をガラス濾過器上で濾過し、そして０．１５Ｍ
　ＮａＣ１溶液で繰り返し洗う。ｈＣＧ抗体でコートさ
れたビーズを等張食塩水４　ｍｌ中に再懸濁する。

（ｄ）　　ｈＣＧに対する抗体でコートされたイソチオ
シアネートガラスの固相調製物は、イソチオシアネート
ガラスピーズ（Ｓｉｇｍａ）０．１２７ｇｍをタンパク
質濃度２．８８６■／−の２Ｂ２抗体の溶液３−と混合
することにより調製される。その抗体溶液をホウ酸塩緩
衝液でｐＨ９，０に緩衝化し、そしてその混合物を室温
で一晩転倒混合させる。リジン濃度４０■／１およびｐ
Ｈ８，１を有するリジン：　ＨＣｌ１溶液１　ｄの添加
により、反応を止める。混合の１時間後、懸濁液を焼ガ
ラス上で濾過し、そして０．１５Ｍ　ＮａＣ１溶液で洗
う。そして、２Ｂ２抗体でコートされたガラスピーズを
０，１５Ｍ　ＮａＣ１３−中に保存する。

（ｅ）例ＩＩＩ　（ｄ）においてイソチオシアネートガ
ラスについて前に概説したものと同じ手順をそのまま使
って、リアクトゲル２５０Ｆ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ）０．１５ｇを２Ｂ２抗体と縮合させることに
より、リアクトゲル−ｈＣＧに対する抗体の調製物を調
製する。

（ｆ）　　ｈＣＧに対する融解シリカガラス抗体を次の
ように調製する。融解シリカ粒子（Ｃｉｂａ　Ｃｏｒｎ
ｉｎｇ。

ロット＃６）を、水４０−中にシリカ粒子１０ｇｍを懸
濁しそして３−アミノプロピルトリエトキシシラン（Ｅ
ａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏｍｐａｎｙ＋　カタロ
グ番号８７４６　、ロフト番号Ｃ１４Ｄ）　　１０−を
添加することにより、シラン化処理する。その混合物を
封管中室部で４時間転倒回転させる。次いでシラン化粒
子を１回当たり水５０−で６回洗い、そして１．５００
０で１０分間遠心する。アミノアルキルシリル化粒子１
００■を、２．５％グルタルアルデヒドを含む水溶液２
Ｍｌ中に懸濁する。この混合物を封管中室部で４時間転
倒回転させる０次いでその粒子を１　、５００　Ｇでの
１０分間の遠心により収穫する。生じたペレットを、ｈ
ＣＧ特異的抗体２Ｂ２をタンパク質濃度３．５■／１１
１で含む溶液２−中に再懸濁する。

この懸濁液を４時間転倒回転する。次いで前記のような
遠心によりその粒子を収穫し、そしてＰＢＳ中１０曜／
ｄのＢＳＡを含む溶液２−中に再懸濁する。この溶液も
また、１時間転倒回転させ、収穫し、そしてｌｌ１１ｒ
／ｗ１１のＢＳＡを含むＰＢＳ　２−中にその粒子を再
懸濁する。

（ｇ）　Ｅｒｌａｎｇｅｒら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、　２２８．７１３　７２７（１９５７）により詳細に
記載された混合酸無水物法により、遊離酸型のプレグナ
ンジオール−３−グルクロニド（Ｐ３Ｇ）　（Ｓｉｇｍ
ａ）をゼラチン（Ｓｉｇ＋ｅａ）と共有結合的に縮合せ
しめる。ポリビーズ−カルボキシレート単分散微小球（
Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）　１　ｄをＰＢＳ　１０−
と混合し、そして１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（Ｓｉ−ｇｍａ）　
１１■をその混合物に添加する。封管中２２℃で転倒回
転しながらのインキュベーション１０分後、ＳＳ　−３
４０−ターを装備した５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ５Ｂ遠心機
において１０．００Ｏｒｐｍでラテックス懸濁液を遠心
分離し、そしてその上清を捨てる。８．９■のゼラチン
Ｐ３Ｇを含むＰＢＳ　１０１ｄ中にペレットを再懸濁す
る。この混合物を転倒回転しながら２２℃で１２時間イ
ンキュベートする。未反応の結合部位をブロックするた
めに、１０■／−濃度のリジン塩酸塩水溶液１１Ｒ１を
添加し、そして１０分後、抗体でコートされた粒子を前
述のような遠心により収穫する。このようにしてペレッ
トを２回洗浄した後、抗体でコートされたラテックス粒
子を最終的にＰＢＳ　５−中に再懸濁する。

（ｈ）例ｍ　（ａ）において詳細に示された正確な手順
を使って、ただしこの場合には、１．６７８■／ｄの濃
度でｈＣＧ特異的抗体２Ｂ２を含む溶液１．５−をｈＬ
Ｈ特異的抗体の溶液の代わりに使用して、ｈｃｃ特異的
抗体でコートされたラテックス粒子から成る固相成分を
調製する。

例■−立立方１ 人ａ）ビオチニル化）１ｃＧ／ＫＬ１１／２Ｇ９抗体と
結合した吸着アビジンを含みそして種々のビオチン対抗
　、体の比を有する金のプローブを、すべて上記の例［
［（ｃ）に従って調製し、分析手順において評価する。

この手順においては、ＮａＣ１Ｏ，ＳＭｔａ度、ｐａ１
７．２のＩＩＥＰＥｓ緩衝液０．１Ｍ？ｍ度および１％
ＰＶＰ　（分子量３６０　、０００）から成る緩衝液０
．５　ｄを含む、６本の分析用試験管を準備する。その
試験管のうちの３本は、１−当たり２００ｓｌＵのＬｌ
＋をさらに含み、−方残りの分析試験管はＬＨを全く含
まない。その後、例ｍ　（ａ）に従って調製したＬＨ特
異的抗体と共有結合的に付着させてコートされた分散性
ラテックス粒子を含むラテックス懸濁液０．０２０ｍｊ
！および、例ＩＩ　（ｃ）に従って調製した金プローブ
０．１５０〜０．１７５−を、各試験管に加える。生じ
た混合物は、抗体でコートされたラテックス粒子を含ん
で成る分散固相成分および抗体でコートされたゴールド
プローブ粒子を含んで成るラベル化された成分を各々。

含み、オレンジ／赤の色を有する。その試料を室温で１
０分間インキュベートし、その間は試験管中の色は変化
せず、次いで各試料を５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄ　５
ｃｈｕｅｌｌのＳＲＣ−９６マニホールド中に収容され
た１μのＲＣ６０５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃ
ｈｕｅｌｌ　フィルターを使って減圧濾過する。試料の
濾過の後、１％ＳＯＳを含む１％Ｉｇｅｐａｌ　ＣＡ−
７２０（ＧＡＦ）　０．５　ｙｄで各々を洗浄する。フ
ィルターを風乾し、そしてその１μのフィルターに残っ
たトラップされた粒子の色の強度を視覚的におよび反射
分光光度計（Ｍａｃｂ−ｅｔｈ、Ｋｏｌｌｍｏｒｇｅｎ
　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の両方で定量する。

結果を下記の表Ｉに示す。

１−」−一表 ６０　　躍：■　　　　　　　　ＯＯ，４５＋１２００
　　　　　　３．５９　　　　＋３１２０　ｎ　：■　
　　　　　　ＯＯ，８５＋１２００　　　　　　３．９
９　　　　　＋３２４０　趨：■　　　　　　　　ＯＯ
，５１＋１２００　　　　　　２．４８　　　　　＋２
上表から理解されるように、試料中のＬＨの存在は、直
接目視検査を通して、収集された固相複合材料における
金属の存在を評価することにより、測定および検出され
る。金属はフィルター上で着色し、それは視覚的に確認
できる。そしてそのような色は金属がそこにあるという
ことを示す。前記の分析操作の別の結果として、抗体に
対するビオチンのより小さい比率を使って、より優れた
観察結果が得られる。この結果は、直接的におよび反射
分光計の使用によるものと両方で測定される。

（ｂ）テオフィリンについての競合沈降試験を次のよう
にして行う。上記の例ＩＩＩ　（ｂ）に従って調製した
抗体でコートされたセファロースの懸濁液を、前に使用
したのとほぼ同じ振とうにより再懸濁し、その４（ｌｄ
を１シリーズのプラスチック製コニカル試験管（Ｆａｌ
ｃｏｎ　２０９７）ど入れる。種々の濃度でテオフィリ
ンを含む溶液をその試験管に入れ、そして撹拌および室
温での２分間のインキュベーションの後、上記の例ＩＩ
　（ｄ）に従って調製したテオフィリン−ＢＳＡの金ゾ
ル分散液２５０１ｚ１を各試験管に加え、そしてその内
容物を４分間振とうにより混合する。次いで、そのビー
ズを約３０分間鎮静させ、そして各試験管中の上清を視
覚的に評価する。

約０．１Ｒより多くのテオフィリンを含む試験管におい
ては、ビーズは本質的に白色であり、そして上清は明ら
かにピンクである。しかしながら、０、１　ｔｒｇより
少ないテオフィリンを含む試験管においては、テオフィ
リン濃度が減少するにつれてビーズのピンク色が増す。

同時に上清は透明度を増す。その結果は、上清の吸光度
を測定することによっても評価され、次のような結果で
ある。

蚤−１−表 、０００１躍　　　　　　　　０．０４６．００１　ｔ
ｎｒ　　　　　　　　　Ｏ，０４９，０１ｎ　　　　　
　　　　０．０６４．１　　躍　　　　　　　　０．１
０４１．０　　趨　　　　　　　　０．１０９１０　　
　躍　　　　　　　　０．１０９１００　　ｐｇ　　　
　　　　　　０．１０９理解され得るように、その結果
は、一般に分析試料中にテオフィリンのレベルが増すと
固相中のラベル化テオフィリンの存在の減少が生じると
ｐｓうことにおいて、競合的測定法と矛盾しない。即ち
、試料中のテオフィリンがラベル化テオフィリンの固相
への結合を阻害する。従って、直接目視検査により確認
されたように、試料中のテオフィリンの濃度が増加する
と、収集される固相中の色が薄くなりそして上清中の色
が濃くなる。

（Ｃ）　　ｈＣＧについての重力分離分析は次のように
行う。この操作においては、例ｍ　（ｃ）に従って調製
したｈＣＧ特異的抗体でコートされたセファロース粒子
５０１１１．例ＩＩ　（ａ）に従って調製した抗体でコ
ートされた金ゾル粒子３００ｍ　、異なる量（１゜ｌＯ
または１０１００ｎのｈＣＧを含む幾つかの標準液のう
ち（７）　ｌ　”）１００１！ｌおよびＰＢＳ　−ＢＳ
ＡＩＩ街液３００ｍを、ニジリーズのプラスチック製コ
ニカル試験管の各々に入れる。回転混合３０〜３５分間
の後、ビーズを試験管の底に沈降させる。沈降の後、ビ
ーズの色を直接外観検査により観察する。固相の色は、
ｈｃｃＯ量が１ナノグラム（ｎｇ）である試験管におい
ては本質的に白色である。しかしながら、ｈｃＧの量が
１０ｎｇである試験管においては、ビーズの色は淡いピ
ンク色であり、そして初めに１１００ｎのｈＣＧを含む
試験管においては、ビーズは濃いピンク色を有する。従
って、試料中のｈＣＧの存否およびそれの量は、直接目
視検査を通して評価することにより測定および検出され
、その色は収集された固相複合材料中に結合した金属に
起因する。もちろん、淡いピンクおよび濃いピンクの色
は、この分析操作の間に各試験管の底に沈降して収集さ
れた固相の金属含有複合材料中の金の存在に起因する。

（ｄ）例ＩＩＩ　（ｄ）に従って調製した抗体でコート
されたイソチオシアネートガラス粒子Ｌｏｏｍを、１シ
リーズのプラスチック製コニカル試験管の各試験管に入
れる。例Ｕ　（ａ）に従って調製した抗体でコートされ
た金粒子２０１１１、ＰＢＳ　−ＢＳＡ緩衝液４００ｐ
ｉおよび、１０００　、１００　、１０　、１またはＯ
ｎｇ／−のいずれか１つのｈＣＧを含む溶液１００Ｉを
、各試験管に加える。試験管はフタをしてそして室温で
１時間転倒回転により混合する。その後、鎮静の後、ビ
ーズの色を直接外観検査により観察する。例■（ｅ）に
従って調製した抗体でコートされたりアクトゲル２５０
Ｆ粒子を使ってその操作を繰り返す。試験管中のｈＣＧ
の１０ｎｇレベルについての分析の感度を、イソシアネ
ートガラス粒子並びにリアクトゲル粒子の場合について
注目すると、上記の例■（Ｃ）に関する臭化シアンセフ
ァロースビーズについて認められたものと全（同じであ
る。また、抗体でコートされた金粒子および抗体でコー
トされた固相粒子を抗原と反応させて、分散性の、収集
可能な、固相の、金属含有複合体を生成させてそれを沈
下により収集する。最初の試料中のｈＣＧの存在および
量は、収集された固相複合材料中の金属の存在により生
じる色の直接目視検査により評価される。各場合におい
て、試験管中のｈＣＧの最初のレベルが１０ｎｇまたは
それより多い時に、その複合材料における金属の存在が
ピンク色の着色を引き起こす。

（ｅ）　　ｈＣＧの存在は、複合材料を収集するために
遠心力を利用する方法においても、検出または測定され
る。ＰＢｓ　−ＢＳＡ緩衝液２００１１１．２５　、２
．５またはＯｎｇのｈＣＧを含むそれぞれの溶液２５１
１１．例■（ａ）に従って調製した抗体でコートさ−れ
た金ゾル粒子２０ｍ、および例１［［（ｆ）に従って調
製した抗体でコートされた融解シリカ粒子１０Ｉ！１を
、９６ウエルのミクロ滴定プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ
、　Ｉｍｍｕｎｌｏｎ）のウェルに入れる。５分間のイ
ンキュベーションの後、２７６０−ターを装備したＩＥ
ＣＰＲ２遠心機において２．００Ｏｒｐｍ＋でそのプレ
ートを遠心する。上清を捨てそしてペレットをＰＢＳ　
２００ｍで洗う。白色のバックグラウンドに対してプレ
ートを置くことにより、最後のペレットを直接目視検査
により調べる。最初の試料中にｈＣＧを欠くものにおい
て、本質的に白いペレットが認められ、一方２．５また
は２５ｎｇのいずれかのｈＣＧを最初に含んでいたウェ
ルにおいては、明白なピンクまたは赤のペレットが生じ
る。

（ｆ）　　ｈＣＧについての多孔質マトリックス捕捉試
験は次のように行われる。この方法においては、２本の
分析試験管を用意し、それぞれは、例■（ｈ）に従って
調製したｈＣＧ特異的抗体でコートされたラテックス粒
子５０１１！、例ｆｆ　（ａ）に従って調製した抗体で
コートされた金ゾル粒子３００　ｄおよびＰＢＳ　−Ｂ
ＳＡ緩衝液３００　ｄの混合物を含む。その試験管のう
ちの１本は、１−当たり５０ｍ１ＵのｈＣＧを含む標準
溶液１００ｍをさらに含み、もう１本はｈＣＧを全く含
まない標準溶液１００Ｉｌｌをさらに含む。生じた混合
物は、それぞれ、抗体でコートされたラテックス粒子を
含んで成る分散性固相成分、および抗体でコートされた
金プローブ粒子を含んで成るラベル化された成分を含み
、オレンジ／赤の色を有する。試験管中の混合物を室温
で１０分間インキュベートするが、その間は試験管中の
色は変化しない。前述したような自蔵流出装置中に設置
されたグラスファイバーフィルター（質ｈａｔａ＋ａｎ
　ＧＦ／Ａ）マトリックス上に試料を注ぐ。ｈＣＧを含
む溶液と接触した時点で、明らかなピンク色の視覚的に
明確なスポットがマトリックス上に現れる。マトリック
スがｈＣＧを全く含まない溶液と接触した場合には、そ
のようなスポットは現れない、スポットされたマトリッ
クスを４日間日光から透光すると、ピンク色のスポット
はその最初の強度のままである。同様なスポットがノー
ト中に６〜１２ケ月間残っており、そしてまだ十分に確
認できる。

（ｇ）　　ｈＣＧについての別の多孔質マトリックス捕
捉試験は、例Ｕ　（ａ）の金プローブよりもむしろ例■
（ｆ）の金プローブを使用すること以外は、例■（ｆ）
のそれと同じ手順を使って行う。この場合には、溶液は
最初暗紫色を有し、そしてｈＣＧを含む溶液が捕捉マト
リックスと接触した時点で現れる色のスポットは、紫が
かったピンク色を有する。

その他の結果は、例ＩＶ　（ｆ）において得られるもの
と同様である。

（ｈ）　　Ｐ３Ｇについての沈降のコンペティティプア
ッセイは、例ｆｆ　（ｂ）の金プローブ、例ｍ　（ｇ）
の固相および例ＩＶ　（ｂ）の手順を使って行った。観
察された結果は、例ｆｔ／　（ｂ）におけるものと本質
的に同じであり、Ｐ３Ｇの濃度が減少するにつれてビー
ズはピンク色を増しそして上滑は透明さを増す。

上記の例ＩＶ　（ｆ）において例示および記載したもの
と同様なマトリックス捕捉方式は、本発明のための最も
重要な市販型となるかもしれない。多孔質マトリックス
捕捉においては、分散性の、収集可能な、固相の、金属
含有複合材料が、それを含む固相成分に関係なく、多孔
質マトリックスの表面上並びに隙間および気孔中に捕捉
される。実験室においてマトリックス捕捉を容易にする
ために、捕捉マトリックスが吸光計と隙間なく接続して
保持されるように自蔵流出装置が組み立てられており、
そのために捕捉マトリックスを通る液体の流れは自発的
であり、真空または外圧の力を必要としない。実験室で
最も有用であると思われる吸光゛媒体は、セルロースプ
ラグから成るＴｒａｎｓｏｒｂ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｆ
ｉｌｔｒｏｎａ）ユニットである。

分離体（ｓｅｐａｒａｔｏｒ）をマトリックスと吸光体
との間に置くと、吸光される液相と多孔質マトリックス
上に捕捉されそして収集される固相との間の完全分離が
確実である、ということがわかっている。

多数の分離層が評価されており、グラスファイバー層（
Ｗｈａｔｎ＋ａｎ）　、ブロック−祇（Ｇｉｌｌｍａｎ
）または多孔質プラスチックＮ（ＰｏｒｅｘまたはＰｅ
１ｌｏｎ）から成る同様なものが、本質的に同じ結果を
有するであろうことがわかっている。同様に相当数の捕
捉マトリックスが評価され、そして適当であると示され
ている。グラスファイバーフィルター（Ｗｈａ−ｔｍａ
ｎ　ＧＦ／Ａ）、再生セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒ
ｅ　ＭＦシリーズ、それぞれ０．４５．３　、５および
８ミクロンのポアサイズを有するＨＡＷＰ　、　５ＳＷ
Ｐ　、　ＳＭＷＰおよびＳＣＣ腹膜は全て、固相、いわ
ゆる本発明に係る金属含有複合材料を捕捉および収集す
るために有効的に利用される。これらの捕捉マトリック
スが商業的適用において最良であるということはまだ決
定されておらず、そしであるマトリックスがある状態に
ついては優れており、他のマトリックスが他の状態につ
いて優れている、ということが決定できただけである。

しかしながら、実験室においては、グラスファイバーフ
ィルターが特に有用であることは知られている。

適当な捕捉マトリックスの選択においては、２つの要素
、即ち多孔度および非特異的結合特性を考慮しなければ
ならない。より大きなポアサイズまたは多孔度はより速
い流れを与えるであろうし、それ故に特に外圧または減
圧を適用できない場合において好ましいであろう。しか
しながら、捕捉マトリックスがあまりに多孔でまたは空
隙であると、固相、即ち金属含有複合体がマトリックス
を通過してしまいそしてそのため目視できない。ある捕
捉マトリックスは、非特異的に、即ち免疫反応なしで、
そしておそらく固相捕捉粒子なしでさえも、抗体でコー
トされた金属粒子と結合するであろうということが観察
されている。そのような非特異的結合は当業者において
よく知られており、ポリビニルピロリドン、仔牛血清、
牛血清アルブミンそして／または関連技術において広く
知られている種々の他の物質およびポリマーといった非
特異的結合遮断剤で、捕捉マトリックスを前処理するこ
とにより防げるだろう。本発明に従って有効的に使用さ
れるに違いない１つの方式は、米国特許証第４．６３２
．９０１号において開示されており、その原理の相違は
、本発明に従って利用されるべき膜がそこでは免疫試薬
の結合であるということである。むしろ、本発明のため
の膜は、単に機械的フィルターとして利用される。本発
明の目的に適合するであろう他の先行技術の装置は、米
国特許証第４．２４６．３３９号および第４．４０７．
９４３号において開示されている。また、これらの先行
技術の装置は膜への反応性結合を有し、一方本発明にお
いては膜に結合するべき反応体を全く必要としない。

むしろ、本複合材料は濾過タイプの操作により簡単に収
集される。

本発明に従って、抗体でコートされた固相粒子および抗
体でコートされた金属粒子は、各粒子が多数の抗体を担
持しているのでそれぞれ多価であるけれども、分析の結
果として生成した最後の分散性の、収集可能な、固相の
、金属台を複合材料は、単に、それに結合した金粒子で
コートされた固相粒子を含んで成る０本発明の免疫反応
の結果として固相粒子に付着してコートされた金粒子は
、各金粒子がその表面上に未反応の抗体を担持している
のにもかかわらず、別の抗体でコートされた固相粒子と
は結合しないように思われる。この理由は十分に理解さ
れていないが、しかし、そのような結合が起こらずそし
て本発明が米国特許証第４．３１３．７３４に従って開
発されたような凝集反応または凝塊形成現象を包含しな
いことは確認されている。

本発明の利用を通して、特にラテックス、ガラスピーズ
等のような水に懸濁可能な粒子および抗体でコートされ
た金ゾル粒子の利用を通して、ｈＣＧについての分析は
、本発明に従って３７．５ｍＩＵと同じ位少量のｈＣＧ
を検出することが可能であり、そして感度の最終レベル
はまだ確定されていない。

本発明の結果として得られる改良された結果は、限定体
積においてかなり大きい表面積および粒子の捕捉力を与
えそれにより人間の目により認識される色を数倍に増や
すような、懸濁可能な粒子の・　利用から生じると思わ
れる。

凝集反応の原理を使った先行技術の分析は、色が液相中
で一般に赤から青紫色へ変化し、これが反応の経過を測
定するために利用されるということに注目するべきであ
る。それ故、抗体でコートされた金ゾルと抗体でコート
されたビ゛−ズとを混合すると、それらが同時凝集して
液相中で赤〜紫〜青への色の遷移がおこると予想するで
あろう。

あいにく本発明の場合には、そのような色の遷移は液相
または固相のどちらにおいても起こらず、そして固相は
、収集した時に、そして特にマーカーとして金が使用さ
れた時に、人間の目で容易に可視できるような明確な赤
色を有する。

本発明は、人間の尿中の分析対象の検出または測定に限
定されないけれども、商業的適用において、特に妊娠お
よび排卵試験が必要とされる場合、試験溶液は一般に朝
の最初の尿の試料を含むであろう。尿は多くの非特異的
な、分散性の、粒状の汚染物または不純物を含み、それ
が誤った陽性の結果を与えるかもしれないし、そうでな
ければ本発明の試験を妨害するかもしれないとわかって
いる。従って、尿試料を使って本発明の試験を行う場合
、試験の操作に入る前に、尿試料を濾過してそのような
汚染物を除去することが望ましいと思われる。粒状の汚
染物を除去することのできるいかなる種類のフィルター
を利用してもよい。しかしながら、分離体（ｓｅｐａｒ
ａｔｏｒ）としての利用について前記した種類の高密度
多孔質ポリエチレンポーレックスプラグは、そのような
濾過目的に非常に有効であることがわかっている。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、水性試料中の免疫学的に反応性の分析対象の測定お
   よび検出のための方法であって、次の段階： （ａ）免疫学的に反応性の物質とラベル化された成分の
   通常安定な単分散の懸濁液の維持を容易にするような大
   きさおよび性質の金属含有粒子との結合生成物を含んで
   成る、ラベル化された成分を準備し； （ｂ）免疫学的に反応性の物質と固相成分の通常安定な
   懸濁液の維持を容易にするような大きさおよび性質の固
   相粒子との結合生成物を含んで成る、固相成分を準備し
   ； （ｃ）前記の両成分の水性混合懸濁液を形成せしめ、こ
   れは分析対象について分析することになっている試料を
   含み、前記の両物質は、前記分析対象の存在の作用とし
   て直接的または間接的に結合することができ、それによ
   り収集可能な固相の金属含有複合材料を形成し； （ｄ）前記複合材料を収集し；そして （ｅ）収集された固相複合材料中の金属の存在を直接目
   視検査を通して評価することにより、試料中の分析対象
   を測定または検出する； を含んで成る方法。 ２、前記分析対象がリガントおよび抗リガントから成る
   群から選択される生物学的に活性な物質である、請求項
   １に記載の方法。 ３、前記金属含有粒子が金属ゾル粒子である、請求項１
   に記載の方法。 ４、前記金属ゾル粒子が約５０Åから約１０００Åの範
   囲の粒度を有する、請求項３に記載の方法。 ５、前記金属ゾル粒子が約１３５Åから約５００Åの範
   囲の粒度を有する、請求項４に記載の方法。 ６、前記粒子が金ゾル粒子である、請求項３に記載の方
   法。 ７、前記粒子が金ゾル粒子である、請求項４に記載の方
   法。 ８、前記粒子が金ゾル粒子である、請求項５に記載の方
   法。 ９、前記ラベル化された成分が、前記物質と前記金属含
   有粒子とを直接結合することにより調製される、請求項
   １に記載の方法。 １０、前記ラベル化された成分が、ビオチン−アビジン
   結合を使って前記物質と前記粒子とを結合することによ
   り調製される、請求項１に記載の方法。 １１、前記ラベル化された成分が、前記物質をビオチニ
   ル化し、前記金属含有粒子をアビジンでコーティングし
   そして該物質上のビオチンと該粒子上のアビジン化合物
   とを反応せしめることにより調製される、請求項１０に
   記載の方法。 １２、前記ラベル化された成分が、牛血清アルブミンを
   使って前記物質と前記粒子とを結合することにより調製
   される、請求項１に記載の方法。 １３、前記固相成分が、前記物質と前記固相粒子とを直
   接結合することにより調製される、請求項１に記載の方
   法。 １４、前記固相成分が、牛血清アルブミン結合を使って
   前記物質と前記粒子とを結合することにより調製される
   、請求項１に記載の方法。 １５、前記固相成分が、ゼラチンを使って前記物質と前
   記粒子とを結合することにより調製される、請求項１に
   記載の方法。 １６、前記ラベル化された成分が、アビジンでコートさ
   れた金属含有粒子を混合水性懸濁液のその他の成分を全
   て一緒に混合した後の水性懸濁液に添加することにより
   形成される、請求項１１に記載の方法。 １７、前記両物質が共に分析対象と結合してサンドイッ
   チ型を形成することができる、請求項１に記載の方法。 １８、前記両物質がそれぞれ抗体でありそして前記分析
   対象が抗原である、請求項１７に記載の方法。 １９、前記両抗体が前記抗原上の異なる部位と結合する
   、請求項１８に記載の方法。 ２０、前記両物質が互いに結合する、請求項１に記載の
   方法。 ２１、前記両物質のうちの一方が抗体でありそして他方
   が抗原である、請求項２０に記載の方法。 ２２、前記ラベル化された成分の物質が抗体である、請
   求項２０に記載の方法。 ２３、前記収集が、濾液の通過を許すが前記複合材料の
   通過を妨げるような多孔質濾過要素の表面上に前記複合
   材料を捕捉することを含んで成る、請求項１に記載の方
   法。 ２４、前記収集が、沈降により限定体積空間へ前記複合
   材料を沈下させそれにより濃縮されたペレットを形成せ
   しめることを含んで成る、請求項１に記載の方法。 ２５、前記収集が、前記複合材料を限定体積空間へ押し
   込めるために前記水性懸濁液を遠心しそれにより濃厚に
   詰まったペレットをそこから形成せしめることを含んで
   成る、請求項１に記載の方法。 ２６、前記濾液が遠心力による要素を通して引き抜かれ
   る、請求項２３に記載の方法。 ２７、前記濾液が毛管力による要素を通して引き抜かれ
   る、請求項２３に記載の方法。 ２８、水性試料中の免疫学的に反応性の分析対象の測定
   および検出において使用するための材料のキットであっ
   て、 免疫学的に反応性の物質とラベル化された成分の通常安
   定な単分散の懸濁液の維持を容易にするようなサイズお
   よび性質の金属含有粒子との結合生成物を含んで成る、
   ラベル化成分； 免疫学的に反応性の物質と固相成分の通常安定な懸濁液
   の維持を容易にするようなサイズおよび性質の固相粒子
   との縮合生成物を含んで成る、固相成分 （前記両成分は、前記両成分の混合水性懸濁液の形成を
   可能にするように操作可能および同時操作可能であり、
   分析対象について分析することになっている試料を含み
   、前記ラベル化された成分の物質および前記固相成分の
   物質は、前記分析対象の存在の作用として間接的または
   直接的に結合することができ、それにより分散性の、収
   集可能な、固相の金属含有複合材料を形成する）；およ
   び 前記複合材料を収集しそして直接視覚的に検査して収集
   された固相複合材料に結合した金属の存在を評価しそし
   てそれにより前記試料中の分析対象の存在を検出または
   測定するためのコレクター；を含んで成るキット。 ２９、前記両物質が共に前記分析対象と結合してサンド
   イッチ型を形成することができる、請求項２８に記載の
   キット。 ３０、前記両物質がそれぞれ抗体であり、そして前記分
   析対象が抗原である、請求項２９に記載のキット。 ３１、前記両抗体が前記抗原上の異なる部位に結合する
   、請求項３０に記載のキット。 ３２、前記両物質が互いに結合する、請求項２８に記載
   のキット。 ３３、前記金属含有粒子が金属ゾル粒子である、請求項
   ２８に記載のキット。 ３４、前記金属ゾル粒子が約５０Åから約１０００Åの
   範囲の粒度を有する、請求項３３に記載のキット。 ３５、前記金属ゾル粒子が約１３５Åから約５００Åの
   範囲の粒度を有する、請求項３４に記載のキット。 ３６、前記粒子が金ゾル粒子である、請求項３３に記載
   のキット。 ３７、前記粒子が金ゾル粒子である、請求項３４に記載
   のキット。 ３８、前記粒子が金ゾル粒子である、請求項３５に記載
   のキット。 ３９、水性試料中の分析対象の最初の存否または量を指
   示するために直接視覚的に観察することのできる固相の
   金属含有複合材料の安定な収集された塊状物であって、
   前記複合材料が、 免疫学的に反応性の物質とラベル化された成分の通常安
   定な単分散の懸濁液の維持を初めに容易にするようなサ
   イズおよび性質の金属含有粒子との結合生成物を含んで
   成る、ラベル化された成分；並びに 免疫学的に反応性の物質と固相成分の通常安定な懸濁液
   の維持を初めに容易にするようなサイズおよび性質の固
   相粒子との結合生成物を含んで成る、固相成分 （ここで前記両成分は前記複合材料を与えるように直接
   的または間接的に互いと結合できる）；を含んで成る、
   前記塊状物。 ４０、前記複合材料が、分析対象および該分析対象と結
   合してサンドイッチ型を形成するような前記両物質を含
   む、請求項３９に記載の塊状物。 ４１、前記塊状物が多孔質フィルター要素上に収集され
   る、請求項４０に記載の塊状物。４２、前記塊状物が試
   験管の底に収集される、請求項４０に記載の塊状物。 ４３、前記両物質が直接互いと結合する、請求項３９に
   記載の塊状物。