DE60128458T2

DE60128458T2 - Anorganische teilchenkonjugate

Info

Publication number: DE60128458T2
Application number: DE60128458T
Authority: DE
Inventors: Hedi Alexandria MATTOUSSI; George P. Lanham ANDERSON; J. Matthew Silver Spring MAURO; Moungi G. Boston BAWENDI; Vikram C. Stoneham Sundar
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology; US Naval Research Laboratory NRL
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology; US Naval Research Laboratory NRL
Priority date: 2000-03-20
Filing date: 2001-03-20
Publication date: 2008-01-10
Anticipated expiration: 2021-03-21
Also published as: US7470379B2; JP2003528321A; US20060057637A1; DE60128458D1; ATE362615T1; JP2011085590A; JP4951184B2; US6921496B2; EP1266223B1; EP1266223A2; WO2001071354A3; US8034259B2; US20100308275A1; CA2403620C; CA2403620A1; US20020182632A1; AU2001250882A1; US8192646B2; US20110319601A1; WO2001071354A2

Description

Diese Erfindung betrifft ionische Konjugate, umfassend anorganische Teilchen und Makromoleküle, und spezieller ein elektrostatisches Konjugat, welches beim Detektieren des Vorliegens oder Nicht-Vorliegens spezifischer Spezies, wie z.B. zum Detektieren eines biologischen Ziels, von Nutzen ist.
Das Markieren biologischer Moleküle unter Verwendung fluoreszenter Markierungen ist auf dem Gebiet der Biologie eine übliche und nützliche Praxis. Fluoreszente Kleinmoleküle (konventionelle organische Farbstoffe) werden sowohl in einzelnen als auch mehreren gleichzeitigen Detektionsansätzen verwendet. Das biologische Markieren unter Verwendung organischer Fluorophore unterliegt signifikanten Beschränkungen. Fluoreszente Moleküle haben tendenziell schmale Absorptionsspektren, und ihre Emissionsspektren sind üblicherweise breit und zeigen rotes Tailing, was die gleichzeitige quantitative Beurteilung relativer Mengen verschiedener Sonden, die in derselben Probe vorliegen, aufgrund von spektralem Cross-Talk zwischen verschiedenen Detektionskanälen erschwert. Weiterhin erfordern jegliche gewünschte Variationen der Absorptions- und/oder Emissionsspektren markierter Biokonjugate die Verwendung unterschiedlicher molekularer Markierungen mit entsprechenden Herausforderungen an Synthese und Biokonjugation. Nichtsdestotrotz hat die Verwendung mehrerer Markierungen einen beträchtlichen Grad der Raffinesse erreicht, wie durch kürzlich durchgeführte Durchflußzytometrie-Arbeiten, die ein Drei-Laser-System und ein achtfarbiges Markierungsschema umfassen, um gleichzeitig insgesamt 10 Parameter auf zellulären Antigenen zu messen, demonstriert wird.
Ein ionisches Konjugat bildet sich durch Selbstorganisation, wobei sich anorganische Teilchen elektrostatisch an wenigstens ein Makromolekül anheften und mit diesem verknüpfen. Ein Typ der Verknüpfung ist die Selbstorganisation. Die Selbstorganisation ist eine koordinierte Wirkung unabhängiger Einheiten unter verteilter (d.h. nicht-zentraler) Kontrolle, wodurch eine größere Struktur erzeugt oder eine gewünschte Gruppenwirkung erzielt wird. Beispiele der Selbstorganisation kommen in der Biologie, z.B. Embryologie und Morphogenese, und in der Chemie, z.B. Bildung lockerer gebundener supramolekularer Strukturen aus Gruppen von Molekülen, vor. Die Selbstorganisation ionischer Konjugate wird durch nicht-kovalente Bindung, wie elektrostatische Wechselwirkungen zwischen geladenen, ionisierbaren oder ladbaren Verknüpfungsgruppen der anorganischen Teilchen und komplementären Gruppen des Makromoleküls, angetrieben.
Jedes der Makromoleküle kann auch einen Rest umfassen, der mit einer vorbestimmten chemischen Spezies oder einem biologischen Ziel reagiert oder eine Affinität dafür zeigt. Das Makromolekül kann beispielsweise einen Antikörper, ein Polynukleotid oder eine Zellmembran mit einer geladenen, ionisierbaren oder ladbareri Verknüpfungsgruppe beinhalten. Alternativ kann ein Makromolekül, welches nicht mit einer vorbestimmten chemischen Spezies oder einem biolo gischen Ziel reagiert oder eine Affinität dafür zeigt, an einen biologischen Rest mit solchen Eigenschaften angehängt werden. In diesem Fall organisiert sich der Makromolekülabschnitt selbst mit dem anorganischen Teilchen, und der biologische Rest wechselwirkt mit einer vorbestimmten chemischen Spezies oder einem biologischen Ziel. Im Ergebnis können die Makromoleküle, die die selbstorganisierten supramolekularen Strukturen bilden, so vorausgewählt sein, daß das ionische Konjugat ein Makromolekül umfaßt, welches direkt oder indirekt mit einer spezifischen Spezies reagiert oder eine Affinität dafür zeigt.
Anorganische Teilchen, wie Halbleiter-Nanokristalle, liefern eine Lösung für viele der Probleme, auf die man mit organischen Kleinmolekülen in Fluoreszenzmarkierungsanwendungen trifft, indem sie Vorteile bieten, wie beispielsweise einen hohen Photobleichung-Schwellwert, eine ausgezeichnete chemische Stabilität und leicht einstellbare spektrale Eigenschaften. Das Kombinieren der größenabhängigen Lumineszenzemissionseigenschaften der Nanokristalle, ihres breiten Bereichs an nützlichen Anregungs- und Emissionswellenlängen, der Beständigkeit gegen Photobleichung und eine große mengenmäßige Ausbeute in wäßrigen Lösungen (hohe Empfindlichkeit) macht diese Materialien für das Markieren biologischer Ziele unter Verwendung eines selbstorganisierten Nanokristall-Makromoleküls, wobei das Makromolekül einen Rest enthält, der Affinität für ein spezifisches biologisches Ziel besitzt, sehr attraktiv.
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend ein anorganisches Teilchen, eine Verknüpfungsgruppe mit einem distalen Ende und einem proximalen Ende, wobei das distale Ende an eine äußere Oberfläche des anorganischen Teilchens gebunden ist und das proximale Ende einen ersten geladenen oder ionisierbaren Rest umfaßt, wobei der erste und der zweite geladene oder ionisierbare Rest das anorganische Teilchen unter Bildung eines ionischen Konjugats elektrostatisch mit dem Makromolekül verknüpft. Das Makromolekül kann ein Fusionsprotein mit einem zweiten geladenen oder ionisierbaren Rest sein, wobei der erste und der zweite geladene oder ionisierbare Rest das anorganische Teilchen unter Bildung eines ionischen Konjugats elektrostatisch mit dem Fusionsprotein verknüpft.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bildung eines ionischen Konjugats durch Bereitstellen eines anorganischen Teilchens, umfassend eine Verknüpfungsgruppe mit einem distalen Ende und einem proximalen Ende, wobei das distale Ende an eine äußere Oberfläche des anorganischen Teilchens gebunden ist und das proximale Ende einen ersten geladenen oder ionisierbaren Rest umfaßt, und Inkontaktbringen eines Makromoleküls mit einem zweiten geladenen oder ionisierbaren Rest mit dem anorganischen Teilchen, wobei der erste und der zweite geladene oder ionisierbare Rest das anorganische Teilchen unter Bildung eines ionischen Konjugats elektrostatisch mit dem Makromolekül verknüpfen. Das Verfahren kann weiterhin das Inkontaktbringen einer Mehrzahl von Makromolekülen, wobei jedes der Makromoleküle einen geladenen oder ionisierbaren Rest umfaßt, mit dem anorganischen Teilchen umfassen, um die Mehrzahl von Makromolekülen über eine Mehrzahl von Verknüpfungsgruppen der anorganischen Teilchen elektrostatisch mit dem anorganischen Teilchen zu verknüpfen. Das Makromolekül kann durch rekombinante oder synthetische Verfahren gebildet oder aus einer natürlichen Quelle isoliert werden. Jedes aus der Mehrzahl von Makromolekülen kann derselben oder verschiedenen Spezies angehören.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Detektieren des Vorliegens einer vorbestimmten Spezies in einer Lösung. Das Verfahren umfaßt das Inkontaktbringen einer Lösung mit einem ionischen Konjugat, wobei das ionische Konjugat ein anorganisches Teilchen umfaßt, welches elektrostatisch mit einem Makromolekül verknüpft ist, wobei das Makromolekül spezifisch an die vorbestimmte Spezies binden kann. Das Verfahren umfaßt weiterhin das Bilden eines ionischen Konjugats durch Zugeben eines anorganischen Teilchens und eines Makromoleküls zu der Lösung. Das anorganische Teilchen umfaßt eine Verknüpfungsgruppe mit einem distalen Ende und einem proximalen Ende, wobei das distale Ende an eine äußere Oberfläche des anorganischen Teilchens gebunden ist und das proximale Ende einen ersten geladenen oder ionisierbaren Rest umfaßt. Das Makromolekül umfaßt einen zweiten geladenen oder ionisierbaren Rest. Der erste und der zweite geladene oder ionisierbare Rest verbinden sich elektrostatisch unter Bildung des ionischen Konjugats.
Ausführungsformen der Erfindung können eines oder mehrere der folgenden umfassen. Das anorganische Teilchen kann ein halbleitender Nanokristall (QD) sein. Der halbleitende Nanokristall kann ein erstes Halbleitermaterial, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Gruppe II-VI-Verbindung, einer Gruppe II-V-Verbindung, einer Gruppe III-VI-Verbindung, einer Gruppe III-V-Verbindung, einer Gruppe IV-VI-Verbindung, einer Gruppe I-III-VI-Verbindung, einer Gruppe II-IV-VI-Verbindung und einer Gruppe II-IV-V-Verbindung, umfassen. Das erste Halbleitermaterial kann aus der Gruppe ausgewählt sein, bestehend aus ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, HgS, HgSe, HgTe, AlN, AlP, AlAs, AlSb, GaN, GaP, GaAs, GaSb, GaSe, InN, InP, InAs, InSb, TlN, TlP, TlAs, TlSb, PbS, PbSe, PbTe und Gemischen davon. Das erste Halbleitermaterial kann CdSe sein. Das erste Halbleitermaterial kann mit einem zweiten Halbleitermaterial umhüllt sein. Das zweite Halbleitermaterial kann ZnS, ZnO, ZnSe, ZnTe, CdS, CdO, CdSe, CdTe, MgS, MgSe, HgO, HgS, HgSe, HgTe, AlN, AlP, AlAs, AlSb, GaN, GaP, GaAs, GaSb, GaSe, InN, InP, InAs, InSb, TlN, TlP, TlAs, TlSb, PbS, PbSe, PbTe, SiO₂ oder Gemische davon sein.
Das anorganische Teilchen kann eine Mehrzahl von Verknüpfungsgruppen umfassen, die jeweils unabhängig voneinander einen geladenen oder ionisierbaren Rest umfassen. Das ionische Konjugat kann eine Mehrzahl von Makromolekülen umfassen, wobei jedes der Makromoleküle einen geladenen oder ionisierbaren Rest umfaßt. Die Mehrzahl von Makromolekülen kann sich durch elektrostatische Wechselwirkung mit der Mehrzahl von Verknüpfungsgruppen für anorganische Teilchen mit dem anorganischen Teilchen verknüpfen. Das anorganische Teilchen kann Ag, Au oder einen Phosphor umfassen. Die erste und die zweite geladene oder ionisierbare Gruppe können Hydroxid, Alkoxid, Carboxylat, Sulfonat, Phosphat, Phosphonat oder quaternäres Ammonium umfassen. Der zweite geladene oder ionisierbare Rest kann ein Leucin-Zipper sein. Der zweite geladene oder ionisierbare Rest kann Polyaspartat sein. Das Makromolekül kann ein Polypeptid oder Polynukleotid, wie ein Maltose-Bindungsprotein oder ein Immunglobulin G-Bindungsprotein, umfassen.
Die Verknüpfungsgruppe kann die folgende Formel haben: (R₁)_a-R₂-[(R₃)_b(R₄)_c]_d wobei
R₁ aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus C1-C100-Heteroalkyl, C2-C100-Heteroalkenyl, Heteroalkinyl, -OR, -SH, -NHR, -NR'R'', -N(O)HR, -N(O)R'R'', -PHR, -PR'R'', -P(NR'R'')NR'R'', -P(O)R'R'', -P(O)(NR'R'')NR'R'', -P(O)(OR')OR'', -P(O)OR, -P(O)NR'R'', -P(S)(OR')OR'' und -P(S)OR, wobei R, R', R" unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus H, einem verzweigten oder unverzweigten C1-C100-Alkyl, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Alkenyl, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Alkinyl, einem verzweigten oder unverzweigten C1-C100-Heteroalkyl, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Heteroalkenyl, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Heteroalkinyl, mit der Maßgabe, daß, wenn a größer als 1 ist, die R₁-Gruppen an den gleichen oder verschiedenen Atomen innerhalb der R₂- oder R₃-Gruppen an diese angehängt sein können, die R₁-Gruppen gleich oder verschieden sein können oder die R₁-Gruppen ein sechs-, sieben-, acht-, neun- oder zehngliedriges Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Heterozyklus, Aryl, Heteroaryl oder einen sechs- bis dreißiggliedrigen Kronenether oder Heterokronenether bilden können,
R₂ ausgewählt ist unter einer Bindung, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Alkylen, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Alkenylen, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Heteroalkenylen, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Cycloalkinyl, Heterozyklus, Aryl und Heteroaryl,
R₃ ausgewählt ist unter einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Alkylen, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Alkenylen, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Heteroalkenylen, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Cycloalkinyl, Heterozyklus, Aryl und Heteroaryl,
R₄ aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Wasserstoff, einem Carboxylat, einem Thiocarboxylat, einem Amid, einem Hydrazin, einem Sulfonat, einem Sulfoxid, einem Sulfon, einem Sulfit, einem Phosphat, einem Phosphonat, einem Phosphoniumion, einem Alkohol, einem Thiol, einem Amin, einem Ammonium, einem Alkylammonium, einem Nitrat, und
a 1 bis 40 ist, b 0 bis 3 ist, c 1 bis 30 ist, d 1 bis 3 ist, und wenn d 2 oder 3 ist, die R₃-Gruppen gleich oder verschieden sein können oder unter Bildung eines fünf- bis zehngliedrigen Cycloalkyls, Cycloalkenyls, Heterozyklus, Aryls oder Heteroaryls miteinander verknüpft sein können. Die Verknüpfungsgruppe kann die Formel HS-C₂H₄-CH(SH)-(C₄H₈)-COOH haben.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bildung eines ionischen Konjugats aus einem modifizierten anorganischen Teilchen und einem Makromolekül. Sowohl das Teilchen als auch das Molekül umfassen geladene oder ionisierbare Verknüpfungsgruppen, die zusammen komplementäre ionische Paare zum elektrostatischen Anhängen wenigstens eines Makromoleküls an das Teilchen bilden können. Das anorganische Teilchen kann durch Ver binden einer geladenen oder ionisierbaren Verknüpfungsgruppe mit der Teilchenoberfläche modifiziert werden. Das Makromolekül kann ein modifiziertes Protein, z.B. modifiziert durch ein rekombinantes Proteinverfahren, sein, um ein Ende einer geladenen oder ionisierbaren Verknüpfungsgruppe, wie ein ladbares Polypeptid, auf der Oberfläche des Proteins aufzunehmen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein rekombinantes Protein, welches elektrostatisch an ein halbleitendes Nanoteilchen gemäß Anspruch 1 angehängt ist. Das rekombinante Protein kann ein Fusionsprotein sein, umfassend jedes Protein, welches biologische Aktivität vermittelt und welches beispielsweise so modifiziert wurde, daß es einen basischen Leucin-Zipper umfaßt. Der Leucin-Zipper ist ein ladbares Polypeptid, dessen eines Ende an das Protein gebunden ist und dessen anderes Ende nicht-gebunden ist und von der Oberfläche des Proteins weg vorspringt. Der Zipper umfaßt auch eine Thiolgruppe, die eine kovalente Bindung mit der Thiolgruppe eines Leucin-Zippers eines weiteren Fusionsproteins bilden kann, wodurch ein Dimer von Fusionsproteinen entsteht. Das halbleitende Nanoteilchen kann Dihydroliponsäuregruppen umfassen, die elektrostatisch mit dem nicht-gebundenen Ende des basischen Leucin-Zippers wechselwirken, wodurch das ionische Konjugat gebildet wird.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Nanoteilchen mit einem Kern und einer Umhüllung. Während der routinemäßigen Herstellung wird ein anorganischer Kern des Nanokristalls mit einer organischen Hülle, wie einem Gemisch aus Trioctylphosphin und Trioctylphosphinoxid (TOP/TOPO), überdeckt, die weiter modifiziert werden kann, und dadurch wird eine nach der Synthese erfolgende Manipulation und eine Anpassung der Löslichkeit von Teilchen in verschiedenen Lösungsmitteln gestattet. Die Umhüllung des CdSe-Kerns beispielsweise mit einem halbleitenden Material mit größerer Bandlücke, z.B. ZnS oder CdS, ein Verfahren, welches auf den Konzepten der Bandlückenherstellung basiert, die in der Elektronik verwendet werden, erlaubt die Passivierung von Kernoberflächenzuständen und reduziert das Austreten von Excitonen außerhalb des Kerns. Diese Umhüllung verbessert die photochemische Stabilität dieser Materialien und verbessert die Lumineszenz-Quantenausbeute im wesentlichen ohne Beeinflussung der Wellenlänge und der spektralen Breite der Emission, d.h. CdSe-ZnS-Nanoteilchen haben eine FWHM ~ 40–60 nm. Zusätzlich kann die Umhüllung die Beständigkeit gegen Photobleichung verbessern. Die obigen Eigenschaften verbessern die Empfindlichkeit von Detektionsansätzen, die diese Nanoteilchen für die Signalerzeugung verwenden. Es werden beträchtliche PL-Intensitäten mit guten Signal-zu-Rauschen-Verhältnissen zusammen mit gut aufgelösten Spektren für Dispersionen mit Konzentrationen, die weitaus kleiner als 1 Nanomol an Nanoteilchen pro Liter sind, gemessen. Ein Ersetzen der TOP/TOPO-Kappe durch Gruppen mit polarem Ende erlaubt die Verteilung dieser Nanoteilchen mit Kernumhüllung in wäßrigen Lösungen, wobei eine hohe Photolumineszenz-Quantenausbeute beibehalten wird. Das Vorliegen einer Dihydroliponsäure lieferte stabile Wasserdispersionen von CdSe-ZnS-Nanoteilchen mit Quantenausbeuten von 15–20%. Die Hydroliponsäuregruppen auf der Oberfläche der Nanoteilchen sind geladene oder ioni sierbare Gruppen, die sich elektrostatisch an komplementäre geladene oder ionisierbare Gruppen eines Makromoleküls anhängen.
Die ionischen Konjugate dieser Erfindung zeigen biologische Aktivität, sind chemisch stabil und zeigen eine verbesserte Quantenausbeute im Vergleich zu anorganischen Teilchen, denen es an einem elektrostatisch gebundenen Protein fehlt. Die Konjugate zeigen auch eine unerwartete reduzierte Aggregation relativ zu biologischen Konjugaten, bei denen ein biologischer Rest kovalent direkt an das organische Teilchen gebunden ist. Ein weiterer Vorteil des Verfahrens zur Herstellung ionischer Konjugate gemäß dieser Erfindung ist seine Einfachheit und Vielseitigkeit. Beispielsweise hängt sich das gewünschte Protein nahezu sofort an die Oberfläche des anorganischen Teilchens an.
Ionische Konjugate, die CdSe-Nanokristalle, überzogen mit ZnS, und Dithiolgruppen umfassen und mit Makromolekülen selbstorganisiert sind, bieten verschiedene Vorteile: 1) da jedes Dithiol-Kappenmolekül sich an zwei Oberflächenatome anhängen kann, kann mit der gleichen oder sogar einer geringeren Dichte von Kappengruppen pro Flächeneinheit beispielsweise im Vergleich zu Monothiol-Kappenmolekülen eine größere Oberflächenpassivierung erzielt werden. 2) Die Carbonsäuregruppen, die die Dispersion der Nanokristalle in Wasserlösungen bei basischem pH-Wert erlauben, liefern auch eine Oberflächenladungsverteilung, die für eine direkte Selbstorganisation (oder Reaktion) mit anderen Makromolekülen mit einer positiven Nettoladung verwendet werden kann. 3) Die ZnS-Umhüllung liefert eine bessere Abschirmung des CdSe-Kerns gegenüber der polaren Umgebung und eine effizientere Begrenzung der Excitonen (Elektronenlochpaare), was zu stabilen und hochgradig lumineszenten Nanokristalldispersionen in Wasser führt. Dispersionen von Nanokristallen mit Kernumhüllung in Wasser, die über einen Zangen Zeitraum (mehrere Monate) stabil sind und eine Photolumineszenz-Quantenausbeute von 20% haben, lassen sich unter Verwendung des obigen Ansatzes leicht herstellen. 4) Der Syntheseansatz läßt sich leicht auf eine Reihe verschiedener Nanokristalle mit Kernumhüllung anwenden und auf andere Kombinationen von halbleitenden Materialien, II-VI und III-V, ausdehnen, was eine Gruppe von fluoreszenten Sonden erzeugen kann, die spektral abgestimmt werden können. Dies steht im Gegensatz zu dem Bedarf nach der Entwicklung spezifischer chemischer Wege für jeden organischen Fluoreszenzfarbstoff von Fall zu Fall. 5) Die Synthese eines Makromoleküls, wie eines Fusionsproteins, basierend auf der Konstruktionsvektorstrategie liefert ein allgemeines und konsistentes Schema zur Herstellung einer breiten Auswahl biologischer Makromoleküle, die spezifische Funktionen ausüben und sich mit den Nanokristallen selbstorganisieren können. 6) Der Ansatz mit rekombinantem Protein erlaubt das Vornehmen von Änderungen an dem geladenen oder ionisierbaren Teil des Makromoleküls, z.B. der Ladung, der Größe, der A^H-Stabilität und Temperatur, und gestattet dadurch das Variieren und Kontrollieren der Selbstorganisation des Makromoleküls, so daß Monomere, Dimere und Tetramere von Makromolekülen gebildet werden, die sich auf dem anorganischen Teilchen selbstorganisieren können. Jedes der Makromoleküle kann Reste umfassen, die Affinitäten für das gleiche oder verschiede ne biologische Mittel besitzen. 7) Das Kontrollieren der Eigenschaften des Peptidschwanzes erlaubt eine nicht-kovalente Wechselwirkung dieser Proteine mit einer Vielzahl von Materialien (z.B. anorganischen kolloidalen Teilchen und sogar Oberflächen), die eine Ladung haben, die zu derjenigen auf dem Verknüpfungsende der Proteine entgegengesetzt ist.
Die Einzelheiten zu einer oder mehreren Ausführungsformen der Erfindung sind in den begleitenden Zeichnungen und der nachstehenden Beschreibung aufgeführt. Weitere Merkmale, Ziele und Vorteile der Erfindung werden aus der Beschreibung und den Zeichnungen sowie aus den Ansprüchen offensichtlich.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Ansicht eines ionischen Konjugats dieser Erfindung.
2A–2B sind schematische Querschnittsansichten von anorganischen Teilchen der ionischen Konjugate aus 1.
3A ist eine schematische Ansicht eines rekombinanten Proteins, eines Fusionsproteins, der ionischen Konjugate aus 1.
3B ist eine diagrammatische Ansicht einer ionisierbaren Verknüpfungsgruppe, die von der Oberfläche des rekombinanten Proteins aus 3A vorspringt.
3C ist eine schematische Ansicht eines weiteren rekombinanten Proteins des ionischen Konjugats aus 1.
4A–4B sind detaillierte Ansichten des in 1 gezeigten ionischen Konjugats.
5 umfaßt Absorptions- und Photolumineszenzspektren von Lösungen, die halbleitende CdSe-ZnS-Teilchen und mit MBP-Zipper umhüllte halbleitende CdSe-ZnS-Teilchen enthalten.
6A–6B zeigen Querschnittsansichten (jeweils ~ 15 mm dick) von Dünnfilmlösungen von CdSe-ZnS-Nanoteilchen, umhüllt mit rekombinanten Proteinen von MBP-Leucin-Zipper (a), nicht-umhüllten CdSe-ZnS-Nanoteilchen (b), CdSe-ZnS-Nanoteilchen, umhüllt mit IgG unter Verwendung eines kovalenten Vernetzungsmittels, EDAC (c).
7A ist ein Diagramm der Photolumineszenz als eine Funktion der Anzahl von elektrostatisch gebundenen Proteinen.
7B ist ein Diagramm der Photolumineszenz als eine Funktion des pH-Werts.
Es sei angemerkt, daß gleiche Bezugssymbole in den verschiedenen Zeichnungen gleiche Elemente bezeichnen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Die ionischen Konjugate umfassen ein anorganisches Teilchen, welches elektrostatisch mit einem Makromolekül verknüpft ist. Das Makromolekül kann so ausgewählt werden, daß es mit einer vorbestimmten Spezies wechselwirkt. Im Ergebnis können die ionischen Konjugate in Tests zum Detektieren des Vorliegens oder zum Quantifizieren der Mengen spezifischer Verbin dungen, zum Detektieren spezifischer Wechselwirkungen biologischer Systeme, zum Detektieren spezifischer biologischer Verfahren, zum Detektieren von Veränderungen in spezifischen biologischen Verfahren oder zum Detektieren von Veränderungen in der Struktur spezifischer Verbindungen verwendet werden.
In 1, auf die nun Bezug genommen wird, umfaßt ein ionisches Konjugat 10 ein anorganisches Teilchen 20 und ein Makromolekül 40, die jeweils eine Verknüpfungsgruppe 30 bzw. 50 umfassen, um das Teilchen 20 an den Enden 31 und 51 assoziativ an das Makromolekül 40 zu binden. Die Enden 31 und 51 sind geladen oder ionisierbar, d.h. die Enden können lokalisierte Mengen positiver oder negativer Ladung enthalten, und bilden komplementäre ionische oder elektrostatische Paare, wie eine teilweise negative Ladung am Ende 31 und eine teilweise positive Ladung am Ende 51 oder umgekehrt. Im allgemeinen umfaßt das Makromolekül 40 eine Verknüpfungsgruppe an irgendeiner Stelle in oder auf dem Makromolekül, die zugänglich ist, um elektrostatisch mit der Verknüpfungsgruppe 30 zu Wechselwirken, um das Makromolekül an das anorganische Teilchen 20 anzuhängen. Typischerweise erstreckt sich der geladene oder ionisierbare Teil der Verknüpfungsgruppe 50 von dem Makromolekül 40 weg (springt von diesem vor).
Im allgemeinen kann das anorganische Teilchen jedes anorganische Material sein, welches eine eindeutige physikalische Eigenschaft hat, die verwendet werden kann, um das Material zu identifizieren. Die physikalischen Eigenschaften können ohne Beschränkung hierauf magnetische Eigenschaften oder optische Eigenschaften sein. Optische Eigenschaften umfassen ohne Beschränkung hierauf Emission, wie Photolumineszenz, Absorption, Streuung und Plasmonresonanzen. Beispielsweise kann das anorganische Teilchen mit einer Lichtquelle bei einer Absorptionswellenlänge bestrahlt werden, um eine Emission bei einer Emissionswellenlänge zu bewirken, die verwendet werden kann, um das emittierende Material von anderen Materialien zu unterscheiden.
Beispiele anorganischer Teilchen umfassen ohne Beschränkung hierauf anorganische Kolloide und halbleitende Nanoteilchen. Die Teilchen können metallische oder magnetische Teilchen sein. Die Teilchen können auch kristalline Teilchen sein. Beispiele anorganischer Kolloide umfassen Ag, Au oder einen Phosphor. Der Phosphor kann ein anorganischer Phosphor, wie ein Seltenerdoxid, sein. Die anorganischen Kolloide können in Abhängigkeit von der Größe der Teilchen in dem Kolloid deutliche Reflektivitäts- und Streuungseigenschaften, Plasmonresonanzen, zu Strahlung zeigen. Beispiele halbleitender Nanoteilchen umfassen ohne Beschränkung hierauf Elemente der Gruppen II-VI, III-V und IV des Periodensystems. Elemente aus diesen Gruppen umfassen ohne Beschränkung hierauf CdS, CdSe, CdTe, ZnS, ZnSe, ZnTe, MgTe, GaAs, GaP, GaSb, GaN, HgS, HgSe, HgTe, InAs, InP, InSb, InN, AlAs, AlP, AlSb, AlS, PbS, PbSe, Ge, Si oder eine Legierung oder ein Gemisch davon, einschließlich ternärer und quaternärer Gemische. Die halbleitenden Nanoteilchen können halbleitende Nanokristalle sein. Die Nanokristalle können mit einer Lichtquelle bei einer Absorptionswellenlänge bestrahlt werden, die eine Emission bei einer Emissionswellenlänge bewirkt. Die Emission hat eine Frequenz, die der Bandlücke des quantenbegrenzten Halbleitermaterials entspricht. Die Bandlücke ist eine Funktion der Größe des Nanokristalls. Nanokristalle mit kleinen Durchmessern können Eigenschaften haben, die zwischen molekularen und Masseformen von Materie liegen. Beispielsweise können Nanokristalle auf Basis von Halbleitermaterialien mit kleinen Durchmessern in allen drei Dimensionen eine Quantenbegrenzung sowohl des Elektrons als auch des Lochs zeigen, was zu einer Zunahme der effektiven Bandlücke des Materials bei abnehmender Kristallitgröße führt. Folglich verlagern sich sowohl die optische Absorption als auch die Emission von Nanokristallen in den blauen Bereich (d.h. zu höheren Energien), wenn die Größe der Kristallite abnimmt.
Die Emission des Nanokristalls kann ein schmales Gauß-Emissionsband sein, welches durch den kompletten Wellenlängenbereich der ultravioletten, sichtbaren oder infraroten Regionen des Spektrums hindurch eingestellt werden kann, indem man die Größe des Nanokristalls, die Zusammensetzung des Nanokristalls oder beides variiert. Beispielsweise kann CdSe im sichtbaren Bereich eingestellt werden, und InAs kann im infraroten Bereich eingestellt werden. Die enge Größenverteilung einer Population von Nanokristallen kann zu einer Emission von Licht in einem engen Spektralbereich führen. Die Population kann monodispers sein und eine Abweichung von weniger als 15% RMS, vorzugsweise von weniger als 10%, bevorzugter von weniger als 5%, im Durchmesser der Nanokristalle zeigen. Spektralemissionen in einem engen Bereich von nicht größer als etwa 75 nm, bevorzugt 60 nm, bevorzugter 40 nm und am meisten bevorzugt 30 nm voller Breite bei halbem Maximum (FWHM) können beobachtet werden. Die Breite der Emission nimmt ab, wenn die Polydispersität der Nanokristalldurchmesser abnimmt. Halbleitende Nanokristalle können hohe Emissionsquanteneffizienzen haben, wie beispielsweise größer als 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% oder 80%.
Der die Nanokristalle bildende Halbleiter kann Gruppe II-VI-Verbindungen, Gruppe II-V-Verbindungen, Gruppe II-VI-Verbindungen, Gruppe III-V-Verbindungen, Gruppe IV-VI-Verbindungen, Gruppe I-III-VI-Verbindungen, Gruppe II-IV-VI-Verbindungen und Gruppe II-IV-V-Verbindungen umfassen, wie beispielsweise ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, HgS, HgSe, HgTe, AlN, AlP, AlAs, AlSb, GaN, GaP, GaAs, GaSb, GaSe, InN, InP, InAs, InSb, TlN, TlP, TlAs, TlSb, PbS, PbSe, PbTe oder Gemische davon.
Verfahren zur Herstellung monodisperser halbleitender Nanokristalle umfassen die Pyrolyse von organometallischen Reagenzien, wie Dimethylcadmium, die in ein heißes koordinierendes Lösungsmittel injiziert werden. Dies erlaubt eine diskrete Kernbildung und resultiert im kontrollierten Wachstum makroskopischer Mengen von Nanokristallen. Die Herstellung und die Manipulation von Nanokristallen werden beispielsweise in dem US-Patent Nr. 6,322,901 beschrieben. Das Verfahren zur Herstellung eines Nanokristalls ist ein kolloidaler Wachstumsprozeß. Kolloidales Wachstum erfolgt durch rasches Injizieren eines M-Donors und eines X-Donors in ein heißes koordinierendes Lösungsmittel. Die Injektion erzeugt einen Kern, der auf kontrollierte Weise gezüchtet werden kann, um einen Nanokristall zu bilden. Das Reaktionsgemisch kann leicht erhitzt werden, um den Nanokristall zu züchten und zu annealen. Sowohl die Durchschnittsgröße als auch die Größenverteilung der Nanokristalle in einer Probe sind von der Wachstumstemperatur abhängig. Die Wachstumstemperatur, die erforderlich ist, um ein konstantes Wachstum aufrechtzuerhalten, steigt mit zunehmender durchschnittlicher Kristallgröße an. Der Nanokristall ist ein Teil einer Population von Nanokristallen. Als Ergebnis der diskreten Kernbildung und des kontrollierten Wachstums hat die erhaltene Population von Nanokristallen eine enge monodisperse Verteilung von Durchmessern. Die monodisperse Verteilung von Durchmessern kann auch als eine Größe bezeichnet werden. Der Vorgang des kontrollierten Wachstums und Annealens der Nanokristalle in dem koordinierenden Lösungsmittel, der auf die Kernbildung folgt, kann auch in einer einheitlichen Oberflächenderivatisierung und regelmäßigen Kernstrukturen resultieren. Durch Hinzufügen von mehr M-Donor oder X-Donor kann die Wachstumsperiode verkürzt werden.
Der M-Donor kann eine anorganische Verbindung, eine organometallische Verbindung oder elementares Metall sein. M ist Cadmium, Zink, Magnesium, Quecksilber, Aluminium, Gallium, Indium oder Thallium. Der X-Donor ist eine Verbindung, die mit dem M-Donor unter Bildung eines Materials mit der allgemeinen Formel MX reagieren kann. Typischerweise ist der X-Donor ein Chalkogeniddonor oder ein Pnictiddonor, wie ein Phosphinchalkogenid, ein Bis-(silyl)-chalkogenid, Disauerstoff, ein Ammoniumsalz oder ein Tris-(silyl)-pnictid. Geeignete X-Donoren umfassen Disauerstoff, Bis-(trimethylsilyl)-selenid ((TMS)₂Se), Trialkylphosphinselenide, wie (Tri-n-octylphosphin)-selenid (TOPSe) oder (Tri-n-butylphosphin)-selenid (TBPSe), Trialkylphosphintelluride, wie (Tri-n-octylphosphin)-tellurid (TOPTe) oder Hexapropylphosphortriamidtellurid (HPPTTe), Bis-(trimethylsilyl)-tellurid ((TMS)₂Te), Bis-(trimethylsilyl)-sulfid ((TMS)₂S), ein Trialkylphosphinsulfid, wie (Tri-n-octylphosphin)-sulfid (TOPS), ein Ammoniumsalz, wie ein Ammoniumhalogenid (z.B. NH₄Cl), Tris-(trimethylsilyl)-phosphid ((TMS)₃P), Tris-(trimethylsilyl)-arsenid ((TMS)₃As) oder Tris-(trimethylsilyl)-antimonid ((TMS)₃Sb). In bestimmten Ausführungsformen können der M-Donor und der X-Donor Reste innerhalb desselben Moleküls sein.
Ein koordinierendes Lösungsmittel kann dazu beitragen, das Wachstum des Nanokristalls zu kontrollieren. Das koordinierende Lösungsmittel ist eine Verbindung mit einem freien Donorpaar, dem beispielsweise ein freies Elektronenpaar zum Koordinieren mit einer Oberfläche des wachsenden Nanokristalls zur Verfügung steht. Lösungsmittelkoordination kann den wachsenden Nanokristall stabilisieren. Typische koordinierende Lösungsmittel umfassen Alkylphosphine, Alkylphosphinoxide, Alkylphosphonsäuren oder Alkylphosphinsäuren, jedoch können auch andere koordinierende Lösungsmittel, wie Pyridine, Furane und Amine, für die Nanokristallherstellung geeignet sein. Beispiele geeigneter koordinierender Lösungsmittel umfassen Pyridin, Tri-n-octylphosphin (TOP) und Tri-n-octylphosphinoxid (TOPO). TOPO mit technischer Qualität kann verwendet werden.
Die Größenverteilung während des Wachstumsstadiums der Reaktion kann durch Überwachen der Absorptionslinienbreite der Teilchen abgeschätzt werden. Eine Modifikation der Reaktionstemperatur in Reaktion auf Veränderungen im Absorptionsspektrum oder im Emissionsspektrum der Teilchen erlaubt die Aufrechterhaltung einer genauen Teilchengrößenverteilung während des Wachstums. Recktanten können während des Kristallwachstums zu der Kernbildungslösung zugegeben werden, um größere Kristalle zu züchten. Indem das Wachstum bei einem bestimmten mittleren Durchmesser der Nanokristalle gestoppt und die geeignete Zusammensetzung des halbleitenden Materials ausgewählt wird, können die Emissionsspektren der Nanokristalle kontinuierlich über den Wellenlängenbereich von 400 nm bis 800 nm eingestellt werden. Der Nanokristall hat einen Durchmesser von weniger als 150 Å. Eine Population von Nanokristallen hat mittlere Durchmesser im Bereich von 15 Å bis 125 Å.
Der Nanokristall kann ein Teil einer Population von Nanokristallen mit enger Größenver teilung sein. Der Nanokristall kann ein Kügelchen, ein Stab oder eine Scheibe sein oder eine andere Form haben. Der Nanokristall kann einen Kern aus einem Halbleitermaterial haben. Der Nanokristall kann einen Kern umfassen, welcher die Formel MX hat, wobei M Cadmium, Zink, Magnesium, Quecksilber, Aluminium, Gallium, Indium, Thallium oder Gemische davon ist und X Sauerstoff, Schwefel, Selen, Tellur, Stickstoff, Phosphor, Arsen, Antimon oder Gemische davon ist.
Der Kern kann eine Umhüllung auf einer Oberfläche des Kerns aufweisen. Die Umhüllung kann ein Halbleitermaterial sein, welches eine Zusammensetzung hat, die sich von der Zusammensetzung des Kerns unterscheidet. Die Umhüllung aus einem Halbleitermaterial auf einer Oberfläche des Nanokristalls kann Gruppe II-VI-Verbindungen, Gruppe II-V-Verbindungen, Gruppe III-VI-Verbindungen, Gruppe III-V-Verbindungen, Gruppe IV-VI-Verbindungen, Gruppe I-III-VI-Verbindungen, Gruppe II-IV-VI-Verbindungen und Gruppe II-IV-V-Verbindungen umfassen, wie beispielsweise ZnS, ZnO, ZnSe, ZnTe, CdS, CdO, CdSe, CdTe, MgS, MgSe, HgO, HgS, HgSe, HgTe, AlN, AlP, AlAs, AlSb, GaN, GaP, GaAs, GaSb, GaSe, InN, InP, InAs, InSb, TlN, TlP, TlAs, TlSb, PbS, PbSe, PbTe, SiO₂ oder Gemische davon. Beispielsweise können ZnS-, ZnSe- oder CdS-Umhüllungen auf CdSe- oder CdTe-Nanokristallen gezüchtet werden. Ein Umhüllungsverfahren ist beispielsweise in der US-Patentanmeldung Nr. 08/969,302 beschrieben, die durch Bezugnahme vollständig hierin aufgenommen ist. Durch Einstellen der Temperatur des Reaktionsgemischs während des Umhüllens und Überwachen des Absorptionsspektrums oder des Absorptionsspektrums des Kerns können umhüllte Materialien mit hohen Emissionsquantenausbeuten und engen Größenverteilungen erhalten werden.
Die Teilchengrößenverteilung kann durch größenselektive Präzipitation mit einem für die Nanokristalle schlechten Lösungsmittel, wie Methanol/Butanol, weiter verfeinert werden, wie es in dem US-Patent Nr. 6,322,901 beschrieben ist. Beispielsweise können Nanokristalle in einer Lösung von 10% Butanol in Hexan dispergiert werden. Methanol kann tropfenweise zu dieser gerührten Lösung zugegeben werden, bis die Opaleszenz beständig ist. Eine Abtrennung von Über- Überstand und flockigem Niederschlag mittels Zentrifugation erzeugt ein Präzipitat, angereichert mit den größten Kristalliten in der Probe. Dieses Verfahren kann wiederholt werden, bis keine weitere Schärfung des optischen Absorptionsspektrums mehr zu beobachten ist. Die größenselektive Präzipitation kann in einer Vielzahl von Lösungsmittel/Nicht-Lösungsmittel-Paaren, einschließlich Pyridin/Hexan und Chloroform/Methanol, durchgeführt werden. Die nach Größe selektierte Nanokristallpopulation kann eine Abweichung von nicht mehr als 15% RMS vom mittleren Durchmesser, bevorzugt eine Abweichung von 10% RMS oder weniger und bevorzugter eine Abweichung von 5% RMS oder weniger haben.
Die äußere Oberfläche des Nanokristalls kann eine Schicht aus Verbindungen umfassen, die von dem während des Wachstumsprozesses verwendeten koordinierenden Lösungsmittel abgeleitet sind. Die Oberfläche kann durch wiederholtes Aussetzen an einen Überschuß einer konkurrierenden koordinierenden Gruppe unter Bildung eines Überzugs modifiziert werden. Beispielsweise kann eine Dispersion des mit Kappe versehenen Nanokristalls mit einer koordinierenden organischen Verbindung, wie Pyridin, behandelt werden, um Kristallite zu erzeugen, die sich in Pyridin, Methanol und Aromaten leicht dispergieren lassen, die sich jedoch in aliphatischen Lösungsmitteln nicht mehr dispergieren lassen. Ein solcher Oberflächenaustauschvorgang kann mit jeder Verbindung durchgeführt werden, die sich mit der äußeren Oberfläche des Nanokristalls koordinieren oder verbinden kann, einschließlich beispielsweise Phosphinen, Thiolen, Aminen und Phosphaten. Der Nanokristall kann kurzkettigen Polymeren ausgesetzt werden, die eine Affinität für die Oberfläche zeigen, und die in einem Rest mit Affinität für ein Suspensions- oder Dispersionsmedium enden. Eine solche Affinität verbessert die Stabilität der Suspension und wirkt einer Ausflockung des Nanokristalls entgegen.
Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) oder Röntgenkleinwinkelstreuung (SAXS) kann Informationen zur Größe, Form und Verteilung der Nanokristallpopulation liefern. Pulverröntgenbeugungs-(XRD-) Muster können die vollständigsten Informationen zum Typ und zur Qualität der Kristallstruktur der Nanokristalle liefern. Schätzungen der Größe sind ebenfalls möglich, da der Teilchendurchmesser über die Röntgen-Kohärenzlänge umgekehrt proportional zur Peakbreite ist. Beispielsweise kann der Durchmesser des Nanokristalls durch Transmissionselektronenmikroskopie direkt gemessen werden oder beispielsweise unter Verwendung der Scherrer-Gleichung aus Röntgenbeugungsdaten abgeschätzt werden. Er kann auch aus dem UV/Vis-Absorptionsspektrum abgeschätzt werden.
Ein Makromolekül kann jede organische oder anorganische Spezies, einschließlich einer geladenen, ladbaren oder ionisierbaren Gruppe, sein. Die geladene, ladbare oder ionisierbare Gruppe kann ohne Beschränkung hierauf ein Carboxylat, ein Thiocarboxylat, ein Amid, ein Hydrazin, ein Sulfonat, ein Sulfoxid, ein Sulfon, ein Sulfit, ein Phosphat, ein Phosphonat, ein Phosphoniumion, ein Alkohol, ein Thiol, ein Amin, ein Ammonium, ein quaternäres Ammonium, ein Alkylammonium oder ein Nitrat sein. Beispielsweise kann die ionisierbare Gruppe eine saure oder basische Seitenkette einer Aminosäure, wie beispielsweise Lysin, Arginin, Histidin, Aspartat oder Glutamat, sein. Das Makromolekül kann eine Mehrzahl ionisierbarer Gruppen umfassen, wie Polylysin, Poly(acrylsäure) (PAA), Poly(allylaminhydrochlorid) (PAH), sulfoniertes Polystyren (SPS) und Polydiallyldimethylammoniumchlorid (PDADMAC). Das Makromolekül kann ein Polypeptid oder ein Polynukleotid sein.
Das Makromolekül kann eine spezifische Wechselwirkung mit einem separaten Molekül oder einem biologischen Ziel zeigen. Beispielsweise kann das Makromolekül ein Protein, einen Antikörper, eine DNA, eine RNA oder eine Zellmembran umfassen, welche(s/r) an eine spezifische Verbindung bindet, mit dieser wechselwirkt oder einen Komplex bildet. Alternativ kann ein Makromolekül, welches keine gewünschte Affinität für eine vorbestimmte Spezies zeigt, an einen chemischen oder biologischen Rest, wie ein Protein, einen Antikörper, eine DNA, eine RNA oder eine Zellmembran angehängt sein, welche(s/r) die gewünschte Wechselwirkung zeigt. Beispielsweise kann das Makromolekül durch biologische Verfahren, z.B. aus Kulturen rekombinanter Organismen (Bakterien-, Hefe-, Insekten- oder Säugerzellen), oder alternativ durch vollständig synthetische oder halbsynthetische Verfahren an den chemischen oder biologischen Rest angehängt sein. Der biologische Rest, ganz gleich, ob es sich dabei um RNA, cDNA, genomische DNA, Vektoren, Viren oder Hybride davon handelt, kann aus einer Vielzahl von Quellen isoliert, genetisch manipuliert, vervielfältigt und/oder rekombinant exprimiert werden. Jedes rekombinante Expressionssystem kann verwendet werden, einschließlich – zusätzlich zu Bakterienzellen – beispielsweise Säuger-, Hefe-, Insekten- oder Pflanzenzell-Expressionssystemen. Beispiele biologischer Reste umfassen Maltose-Bindungsprotein (MBP) und Immunglobulin G-Bindungsprotein (Protein G).
Alternativ können Nukleinsäuren unter Verwendung gut bekannter chemischer Synthesetechniken in vitro hergestellt werden, wie sie beispielsweise beschrieben sind in Carruthers (1982) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411–418; Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440–3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373–380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886–7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859; US-Patent Nr. 4,458,066 . Doppelstrangige DNA-Fragmente können dann entweder durch Synthetisieren des Komplementärstrangs und Annealen der Strange unter geeigneten Bedingungen oder durch Hinzufügen des Komplementärstrangs unter Verwendung von DNA-Polymerase mit einer geeigneten Primersequenz erhalten werden.
Techniken zur Manipulation von Nukleinsäuren, wie beispielsweise die Erzeugung von Mutationen in Sequenzen, Subklonieren, Markieren von Sonden, Sequenzieren, Hybridisieren und dergleichen, sind in der wissenschaftlichen Literatur und in der Patentliteratur gut beschrieben; siehe beispielsweise Sambrook, Hsg., Molecular Cloning: a Laboratory Manual (2. Aufl.), Bände 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, Hsg. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, Hsg. Elsevier, N.Y. (1993). Techniken zum Einbringen eines geladenen oder ionisierbaren Makromoleküls, wie eines Leucin-Zippers, werden auch diskutiert in "Peptide "Velcro': Design of a Heterodimeric Coiled Coil", Current Biology 3(10), 658–667 (1993), von O'Shea et al. und in "Fiber-Optic Fluorometric Sensing of Polymerase Chain Reaction-Amplified DNA Using an Immobilized DNA Capture Protein", Analyt. Biochemistry 235, 61–72 (1996), von Mauro et al.
Rekombinante (Fusions-) Proteine können in einem konstruierten Plasmid (doppel-strangige DNA) unter Verwendung geeigneter Klonierungsstrategien, einer Technik, die auf dem Gebiet der biotechnischen Manipulation von Molekülen bekannt ist, hergestellt werden. Die Stufen der Klonierung und der Proteinexpression können in Escherichia coli (E. coli) durchgeführt werden, was auch als Wachstumsumgebung dient. Geeignete und spezifische Enzyme (Restriktionsendonukleasen) können eingebracht werden, um das Plasmid an der korrekten Polylinker-Klonierungsstelle abzuschneiden, wo das Gen mit der spezifischen Funktion eingebracht wird. Eine Verknüpfungsgruppe, wie ein Peptidschwanz, kann dann an das carboxyterminale Ende der codierenden Region der biologischen Reste mit einer gewünschten Funktion kloniert werden. Biologische Reste umfassen das Maltose-Bindungsprotein (MBP), welches mit hoher Affinität an den Zucker Maltose bindet, und das Protein G, von dem bekannt ist, daß es durch seine b-Untereinheit spezifisch an die Fc-Region von Immunglobulin G (IgG) bindet. Die biologischen Reste können auch weiter mutiert sein, so daß die Reste eine gewünschte Funktion ausüben, wie z.B. Bindung an ein spezifisches biologisches Ziel. Beispielsweise kann Protein G sowohl so modifiziert werden, daß es mit einem spezifischen Molekül wechselwirkt, als auch so, daß eine Funktionalität als Leucin-Zipper darin aufgenommen wird. Protein G kann dann elektrostatisch an das anorganische Teilchen angehängt und verwendet werden, um Wechselwirkungen mit dem spezifizierten biologischen Ziel zu detektieren.
Ein synthetisches Verfahren zum Anhängen des Makromoleküls an einen biologischen Rest kann durch die bekannte Festphasen-Peptidkopplungstechnik durchgeführt werden. Beispielsweise kann das Makromolekül aus einer einzelnen kovalent verknüpften Polypeptidkette gebildet sein, die einen geladenen oder ionisierbaren Teil und einen Teil, der biologische Spezifität zeigt, umfaßt. Synthetische Verfahren zur Herstellung des Makromoleküls können Verfahren umfassen, bei denen alle oder ein Teil einer oder beider Polypeptidkomponenten, d.h. der geladene oder ionisierbare Teil und der Teil mit biologischer Spezifität, die das Makromolekül bilden, unter Verwendung von in vitro-Synthese hergestellt werden. Alternativ können alle oder ein Teil entweder einer oder beider Polypeptidkettenkomponenten unter Verwendung des (der) obigen rekombinanten Organismus (Organismen) hergestellt werden. Beispielsweise kann der geladene oder ionisierbare Teil eines Polypeptids synthetisch hergestellt werden und der Teil mit biologischer Spezifität kann durch rekombinante oder synthetische Verfahren erhalten werden. Wenn der geladene/ionisierbare Teil und der Teil mit biologischer Spezifität unabhängig voneinander erhalten werden, können sie durch a) ein chemisches Mittel nach dem chemischen Aktivieren der Peptidtermini, wie z.B. mit EDC (1-Ethyl-3,3-dimethylaminopropylcarbiimid)-Kopplung, b) enzymatisch unterstützte Katalyse von aktivierten oder nicht-aktivierten Polypeptiden, c) Bildung von Disulfid-(S-S-) Bindungen, gefördert durch Oxidation unter Verwendung von O₂ oder durch zusätzliche chemische oder enzymatische Mittel, oder d) unter Verwendung nicht-kovalenter elektrostatischer oder hydrophober Wechselwirkungen, die von den Selbstorganisations-Wechselwirkungen getrennt sind, die verwendet werden, um ein Makromolekül elektrostatisch an ein Teilchen anzuhängen, angehängt werden. Die synthetischen Verfahren umfassen auch das Anhängen geladener oder ionisierbarer Teile durch irgendeines der obigen Verfahren an Polynukleinsäureaptamere (DNA oder RNA), Peptidnukleinsäure-(PNA-) Oligomere, Oligosaccharide, Lipopolysaccharide, Polydextrine, zyklische Polydextrine, Kronenether oder ähnliche Derivate und andere natürliche oder synthetische "Rezeptor"-Spezies.
In einem alternativen synthetischen Ansatz kann ein selbstorganisierter Komplex mittels einer elektrostatischen Konjugation eines positiv geladenen Polyelektrolyten, wie Polydiallyldimethylammoniumchlorid, mit einem negativ geladenen Phosphin-Carbonsäure-Komplex, wie Tris-2-carboxyethylphosphin, gebildet werden. Der resultierende Komplex kann mit den Teilchen gekoppelt werden, wobei die Phosphingruppen ein Haltemittel bereitstellen, um an die Teilchenoberfläche zu binden, während das positiv geladene Polymer die Löslichkeit der Teilchen in Wasser vereinfacht. Die geladenen Polymere können terminale Amin- oder Hydroxylgruppen umfassen, oder sie können mit einem Amino- oder Hydroxylgruppen enthaltenden Monomer, wie Allylamin und Hydroxymethacrylat, copolymerisiert werden. Standardmäßige Kopplungschemien des EDC-Typs können verwendet werden, um eine Verknüpfung, wie z.B. über eine Peptidbindung, zwischen den Amino- oder Hydroxylgruppen und einem biologischen Rest zu bewirken, wodurch ein selbstorganisiertes ionisches Konjugat gebildet wird, welches eine spezifische biologische Affinität zeigt.
Bezugnehmend auf 2A ist das anorganische Teilchen in einigen Ausführungsformen ein halbleitender Nanokristall 100, der einen Halbleiterkern 110 und eine den Kern einkapselnde Umhüllung 120 umfaßt. Der Halbleiterkern 110 und die Umhüllung 120 sind aus den oben beschriebenen halbleitenden Elementen hergestellt. Eine Mehrzahl von Verknüpfungsgruppen 130 bindet an eine Oberfläche der Umhüllung 120 über eine interaktive Oberflächengruppe 132, die sich mit den Materialien der Umhüllung oder des Nanokristalls verknüpft. Typischerweise ist die Bandlückenenergie des Umhüllungsmaterials größer als die Bandlückenenergie des Kerns. Jede Verknüpfungsgruppe 130 enthält auch eine geladene oder ionisierbare Gruppe 136, die durch einen Spacer 134 an die interaktive Oberflächengruppe 132 angebunden ist. Im allgemeinen ist der Spacer 134 lang genug, um eine Übertragung von Elektronenladung zwischen den Gruppen 132 oder 120 und 136 zu verhindern.
Bezugnehmend auf 2B ist in anderen Ausführungsformen ein anorganisches Teilchen 200 dieser Erfindung ein anorganisches Kolloidteilchen 210 mit einer Mehrzahl von Verknüpfungsgruppen 220, die über eine interaktive Oberflächengruppe 222 an eine Oberfläche des Teilchens 210 angehängt sind. Die Verknüpfungsgruppe 220 ist der oben beschriebenen Verknüpfungsgruppe 130 ähnlich und umfaßt eine geladene oder ionisierbare Gruppe 226 und einen Spacer 224.
Im allgemeinen haben die anorganischen Teilchen dieser Erfindung einen Durchmesser von zwischen etwa 10 Å und etwa 1000 Å, bevorzugt zwischen etwa 10 Å und etwa 500 Å und am meisten bevorzugt zwischen etwa 10 Å und etwa 250 Å. Die Größenverteilung um eine mittlere Größe der anorganischen Teilchen beträgt typischerweise weniger als etwa 20%, bevorzugter weniger als etwa 15%, noch bevorzugter weniger als etwa 10% und am meisten bevorzugt weniger als etwa 5%. Im allgemeinen fallen mehr als etwa 40%, bevorzugt mehr als etwa 50% und am meisten bevorzugt mehr als etwa 60% der Teilchen in einen spezifizierten Teilchengrößenbereich.
Die interaktive Oberflächengruppe kann jeder chemische Rest sein, der Elemente oder chemische Gruppen aufweist, die darin enthalten sind und die an die Oberfläche des anorganischen Teilchens binden können. Beispielsweise kann die Oberflächengruppe S-, N-, P-, O- oder O=P-Gruppen umfassen. Die geladenen oder ionisierbaren Gruppen 136 und 226 können jede ionisierbare chemische Gruppe oder jede chemische Gruppe mit einer ursprünglichen Ladung, wie eine quaternäre Ammoniumgruppe, umfassen. Beispiele von geladenen oder ionisierbaren chemischen Gruppen umfassen ohne Beschränkung hierauf Hydroxide, Alkoxide, Carboxylat, Sulfonat, Phosphat, Phosphonat, quaternäres Ammonium und dergleichen.
Die Verknüpfungsgruppen 30, 130, 220 tragen auch dazu bei, eine wasserlösliche Schicht um die Teilchen herum auszubilden. In bestimmten Ausführungsformen umfaßt die Oberfläche des anorganischen Teilchens eine Mehrzahl von Verknüpfungsgruppen, von denen einige dazu beitragen, das Teilchen in Wasser löslich zu machen, und sich nicht elektrostatisch mit Makromolekülen verknüpfen, und andere, die dies tun. Die Verknüpfungsgruppen können die Teilchen auch stabiler machen (d.h. die Teilchen können in verdünnten Konzentrationen verwendet werden). Beispielsweise kann eine einzähnige Verknüpfungsgruppe auf die Oberfläche des Teilchens aufgebracht werden, und dann kann durch Selbstorganisation eine Monoschicht aus einem Oligomer um das Teilchen herumgewickelt werden, um die funktionellen Gruppen auf der Oberfläche des Teilchens effektiv zu vernetzen. Die Selbstorganisation erlaubt eine Kontrolle der Zusammensetzung der ionischen Konjugate im Nanometermaßstab und ähnelt der Technik der schichtweisen Selbstorganisation (oder der sequentiellen Adsorption), die verwendet wird, um große synthetische und biologische Polymere zusammenzusetzen. Siehe beispielsweise "Molecular-Level processing of Conjugated Polymers. 1. Layer-by-Layer Manipulation of Conjugated Polyions", Macromolecules 28, 7107 (1995), von M. Ferreira und M.F. Rubner; "New Nanocomposite Films for Biosensors: Layer-by-Layer Adsorbed Films of Polyelectrolytes, Proteins or DNA", Biosensors & Bioelectronics 9, 677–684 (1994), von Decher et al. und "Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites", Science 277: 1232–1237 (1997) von G. Decher.
In bevorzugten Ausführungsformen haben die Verknüpfungsgruppen 30, 130 und 220 die Formel: (R₁)_a-R₂((R₃)_b(R₄)_c]_d wobei (R₁)_a eine oder mehrere interaktive Oberflächengruppe ist, R₂ der Spacer ist und [(R₃)_b(R₄)_c]_d die geladene oder ionisierbare Gruppe ist,
R₁ aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus C1-C100-Heteroalkyl, C2-C100-Heteroalkenyl, Heteroalkinyl, -OR, -SH, -NHR, -NR'R'', -N(O)HR, -N(O)R'R'', -PHR, -PR'R'', -P(NR'R'')NR'R'', -P(O)R'R'', -P(O)(NR'R'')NR'R'', -P(O)(OR')OR'', -P(O)OR, -P(O)NR'R'', -P(S)(OR')OR'' und -P(S)OR, wobei R, R', R'' unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus H, einem verzweigten oder unverzweigten C1-C100-Alkyl, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Alkenyl, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Alkinyl, einem verzweigten oder unverzweigten C1-C100-Heteroaikyl, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Heteroalkenyl, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Heteroalkinyl, mit der Maßgabe, daß, wenn a größer als 1 ist, die R₁-Gruppen an den gleichen oder verschiedenen Atomen innerhalb der R₂- oder R₃-Gruppen an diese angehängt sein können, die R₁-Gruppen gleich oder verschieden sein können oder die R₁-Gruppen ein sechs-, sieben-, acht-, neun- oder zehngliedriges Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Thereozyklus, Aryl, Heteroaryl oder einen sechs- bis dreißiggliedrigen Kronenether oder Heterokronenether bilden können,
R₂ ausgewählt ist unter einer Bindung (d.h. R₂ fehlt; in diesem Fall hängt sich R₁ an R₃ an), einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Alkylen, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Alkenylen, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Heteroalkenylen, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Cycloalkinyl, Heterozyklus, Aryl und Heteroaryl,
R₃ ausgewählt ist unter einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Alkylen, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Alkenylen, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Heteroalkenylen, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Cycloalkinyl, Heterozyklus, Aryl und Heteroaryl,
R₄ aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Wasserstoff, einem Carboxylat, einem Thiocarboxylat, einem Amid, einem Amin, einem Hydrazin, einem Sulfonat, einem Sulfoxid, einem Sulfon, einem Sulfit, einem Phosphat, einem Phosphonat, einem Phosphoniumion, einem Alkohol, einem Thiol, einem Amin, einem Ammonium, einem Alkylammonium, einem Nitrat, und
a 1 bis 40 ist, b 0 bis 3 ist, c 1 bis 30 ist, d 1 bis 3 ist, und wenn d 2 oder 3 ist, die R₃-Gruppen gleich oder verschieden sein können oder unter Bildung eines fünf- bis zehngliedrigen Cycloalkyls, Cycloalkenyls, Heterozyklus, Aryls oder Heteroaryls miteinander verknüpft sein können.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hat die Verknüpfungsgruppe 130 die Formel: HS-C₂H₄-CH(SH)-(C₄H₈)-COOH.
Verfahren zur Herstellung anorganischer Teilchen, wie halbleitender CdSe-Nanoteilchen mit einem oder ohne ein Umhüllungsmaterial werden beispielsweise diskutiert in "Semiconductor Nanocrystal Colloids: Manganese Doped Cadmium Selenide, (Core)Shell Composites for Biological Labeling, and Highly Fluorescent Cadmium Telluride", MIT-Doktorarbeit, Sept. 1999, von F.V. Mikulec, in "(CdSe)ZnS core-shell nanocrystals: Synthesis and characterization of a size series of highly luminescent nanocrystallites", J. Phys. Chem. B 101, 9463–9475 (1997), von Dabbousi et al. und in "Semiconductor Nanocrystals as Fluorescent Biological Labels", Science 281, 2013–2016 (1998) von Bruchez, Jr. et al.
Bezugnehmend auf die 3A–3B umfaßt ein biologischer Rest 300, z.B. ein rekombinantes Protein mit einer spezifischen biologischen Funktion, das Protein 310 und eine Verknüpfungsgruppe 320, die von der Oberfläche des Proteins 310 vorspringt. Die Verknüpfungsgruppe 320 umfaßt ein Kopplungssegment 326, wie einen Poly-Asn-Linker, eine brückenbildende Gruppe 322, wie Schwefel, und einen Schwanz 324. In bestimmten Ausführungsformen ist der Schwanz 324 ein Polypeptid, welches ungefähr 30 Aminosäurereste umfaßt. Beispielsweise kann der Schwanz jedes Polypeptid sein, das geladen oder ionisierbar ist, d.h. lokalisierte Mengen an positiver oder negativer Ladung enthält. 3B zeigt einen positiv geladenen Schwanz 324, welcher im allgemeinen als Leucin-Zipper bezeichnet wird. Weitere mögliche Schwänze umfassen ohne Beschränkung hierauf Polypeptide, einschließlich Arginin- oder Aspartatgruppen. Typischerweise bilden Proteine mit einem Leucin-Zipper tendenziell Dimere, um hydrophobe Wechselwirkungen zu minimieren (3C). Die resultierenden Dimere sind ein Zustand hoher Wahrscheinlichkeit für Proteine, die mit Leucin codiert sind. Das in 3C gezeigte Dimer 380 umfaßt zwei separate Proteine 310 und 312, die gleich (ein Homodimer) oder verschieden (ein Heterodimer) sein können und über zwei brückenbildende Gruppen 322, z.B. Thiolgruppen, verknüpft sind. Die Schwänze 324 sind durch die Kopplungsgruppe 326, die ein Atom oder ein Molekül, wie ein Polypeptid, sein kann, an die Oberfläche jedes Proteins angehängt. Die brückenbildenden Gruppen und die Kopplungsgruppen können jeweils gleich oder verschieden sein.
Bezugnehmend auf 4A umfaßt ein ionisches Konjugat 500 ein anorganisches Teilchen 510, das über die Verknüpfungsgruppen 520 und 530 elektrostatisch an die Proteine 540 angehängt ist. Im allgemeinen können die biologischen Reste sich entweder als Dimere oder als Monomere elektrostatisch an das anorganische Teilchen anhängen. Das Dimer kann ein Homodimer oder ein Heterodimer sein. Zusätzlich kann das Teilchen 510 elektrostatisch mit mehreren Proteinen verknüpft sein, die identisch oder verschieden sein können. Ein Teilchen, welches verschiedene Proteine umfaßt, kann verwendet werden, um gleichzeitig mehrere interessierende biologische Ziele zu detektieren. Natürlich hängt die exakte Zahl an Proteinen, die an das Teilchen angehängt sind, von dem Durchmesser des Teilchens, der Gesamtlänge der Verknüpfungsgruppen und der Größe des Proteins ab. Wie in 4B zu sehen ist, ist die Anzahl an Proteinen, N, durch folgendes Verhältnis gegeben: N ∝ (4π/3)(r2 3 – r1 3)/V(Protein) wobei r₂ und r₁ in 4B gezeigt sind, (r₂ ³ – r₁ ³) das zum Verpacken des Proteins zur Verfügung stehende Raumvolumen ist und V das mittlere Volumen der an das Teilchen angehängten Proteine ist. Alternativ kann N aus der folgenden Gleichung abgeleitet werden: N = 0,65 ((r2 3 – r1 3)/rp 3)wobei r_p der Radius des Proteins ist. Typischerweise umfaßt das ionische Konjugat zwischen etwa 1 und etwa 25, bevorzugt etwa 5 bis etwa 15 und am meisten bevorzugt etwa 5 bis etwa 10 Proteine, die elektrostatisch an ein organisches Teilchen mit einem Durchmesser von etwa 19 Å angehängt sind.
In anderen Ausführungsformen kann das anorganische Teilchen eine äußere Hülle umfassen, die entweder aus a) einer organischen Hülle, b) einer dünnen Silicalage oder c) einer Kombination aus a und b besteht. Die organische Hülle kann relativ zu der Oberfläche der anorganischen Teilchen einzähnig oder mehrzähnig sein. Die organische Hülle kann auch um das Teilchen herum polymerisiert werden.
Die äußere Hülle kann mit Gruppen funktionalisiert werden, die sich zu biologischen Resten seibstorganisieren, die entweder an den biologischen Rest angehängt wurden, sich zu dem Rest selbst seibstorganisieren oder die sich zu einem synthetischen Molekül seibstorganisieren, welches dann spezifisch an einen biologischen Rest bindet. Der Vorgang der Selbstorganisation kann eine elektrostatische Wechselwirkung mit der Oberflächengruppe sein. Die Selbstorganisation kann durch Wasserstoffbindung oder durch hydrophobe Wechselwirkungen erfolgen.
Ohne weitere ausführliche Darstellung wird angenommen, daß ein Fachmann auf dem Gebiet auf Basis der hier gegebenen Beschreibung die vorliegende Erfindung vollumfänglich nutzen kann. Die nachfolgenden spezifischen Beispiele, die die Synthese, die Durchmusterung und das biologische Testen verschiedener Verbindungen dieser Erfindung beschreiben, sollen daher lediglich als veranschaulichend betrachtet werden und den Rest der Offenbarung in keinster Weise beschränken.
Synthese von CdSe-ZnS-Liponsäure-Nanoteilchen:
Verknüpfungsgruppen, die verwendet werden, um halbleitende Nanoteilchen wasserlöslich zu machen, werden durch Austauschen von Trioctylphosphin-(TOP-)/Trioctylphosphinoxid(TOPO-)Gruppen auf der Oberfläche der Teilchen gegen die gewünschte Verknüpfungsgruppe an die Oberfläche des halbleitenden Teilchens angehängt. Eine Dihydroliponsäure-Verknüpfungsgruppe wurde durch Reduzieren von kommerziell erhältlicher Liponsäure (auch als Thioctansäure bezeichnet), erworben von Aldrich als ein Pulver, mit Natriumborhydrid (NaBH₄) hergestellt. Siehe das Verfahren in A.F. Wagner, J. Organic Chemistry, 1956, 5079-81. Die Dihydroliponsäure-Verknüpfungsgruppe erhöht die Stabilität des Teilchens so, daß modifizierte Teilchen in weitaus starker verdünnten Konzentrationen verwendet werden können. Das Verfahren zum Austauschen der Oberflächengruppen der Teilchen ist unten beschrieben.
Ein Volumen von halbleitenden Nanoteilchen (CdSe-ZnS), hergestellt unter Verwendung des Synthesewegs basierend auf Züchten und Annealen organometallischer Verbindungen bei hoher Temperatur (siehe Dabbousi et al.), wurde aus der Wachstumslösung entnommen und durch Zugabe von Methanol präzipitiert. Die Nanoteilchen umfaßten eine ZnS-Umhüllung (5–7 Monoschichten). Das isolierte Präzipitat wurde dann in einem minimalen Volumen einer ungefähr 1:10-Lösung von Butanol:Hexan erneut dispergiert. Wieder werden die halbleitenden Nanoteilchen durch Zugabe von Methanol ausgefällt. Das Verfahren des Präzipitierens, erneuten Dispergierens und Präzipitierens wurde 2- bis 3-mal wiederholt, bis die meisten der TOP/TOPT-Gruppen auf der Oberfläche des Teilchens entfernt worden waren. Ein zehn- bis zwanzigfacher Überschuß (bezogen auf das Gewicht) der gewünschten Verknüpfungsgruppe wurde zu dem feuchten Präzipitat zugegeben. Das Gemisch wurde in ein Ölbad (ungefähr 60–80°C) gegeben und für ungefähr 3–12 Stunden gerührt. Der Gruppenaustauschvorgang wurde durch Entfernen des Gemischs aus dem Ölbad gestoppt. Das Gemisch wurde durch Zugeben einer kleinen Menge DMF (für ungefähr 200 mg der gewünschten Verknüpfungsgruppe sind 100–200 μl DMF ausreichend) verdünnt. Getrennt hiervon wird eine weitere Lösung mit einem leichten molaren Überschuß (1,5:1) von Kalium-t-butoxid in einem 1:10-Volumen von DMF:H₂O hergestellt und zu der oben hergestellten Lösung aus halbleitendem Teilchen/DMF zugegeben, um die Liponsäuregruppen zu protonieren. Es resultierte ein weißliches Präzipitat, welches mittels Zentrifugation vom Rest der Lösung abgetrennt wurde. Das Präzipitat ließ sich leicht in Wasser dispergieren. Die Nanokristalldispersion wurde durch Konzentrieren aus verdünnten Lösungen unter Verwendung einer ultra-free-Zentrifugenfiltervorrichtung (von Millipore mit einem Cut-Off-Wert bei 50.000 Dalton) und erneutes Dispergieren in Wasser gereinigt (aus überschüssigem Kalium-t-butoxid und DMF). Ein 3- bis 4-maliges Wiederholen des Vorgangs liefert reine (mit einer Reinheit von ~ 95% oder mehr) und stabile Dispersionen in Wasser, die Emissionscharakteristika der Nanokristalle und eine PL-Ausbeute von ~ 15–20% haben.
In anderen Syntheseschemata kann die Base, Tetramethylammoniumhydroxid, gegen Kalium-t-butoxid in DMF substituiert werden. Die erstgenannte Base kann jedoch in Luft gelagert werden, während die letztgenannte in einer inerten Atmosphäre gehalten werden muß. Die Dihydroliponsäure wirkt am besten, wenn sie völlig rein ist. Wenn die reduzierende Liponsäure zur Herstellung von Dihydroliponsäure nicht komplett ist, tritt eine Gelbfärbung der Lösung auf. Die gelbe Lösung kann destilliert werden (bei 140°C unter Vakuum), wodurch eine klare Lösung von Dihydroliponsäure erhalten wird.
Klonierung und Herstellung von Proteinen aus MBP-basischem Zipper
Literaturstellen zum Hintergrund:

1) Für die Expression von MBP-Dimeren in Bakterien: "Engineering the quaternary structure of an exported Protein with a leucine zipper", Blondel, A. und Bedouelle, H. (1991) Protein Eng. 4(4): 457-61.
2) Für die Heterodimerbildung mittels exprimierter rekombinanter Proteine: "A general method of facilitating heterodimeric pairing between Proteins: application to expression of alpha and beta T-cell receptor extracellular segments", Chang, H.C., Bao, Z., Yao, Y., Tse, AG., Goyarts, E.C., Madsen, M., Kawasaki, E., Brauer, P.P., Sachettini, J.C., Nathenson, S.G. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(24): 11408–11412.
3) Für die Ausgestaltung und grundlegende Charakterisierung der in dieser Arbeit verwendeten Leucin-Zipper: "Peptide Velcro: design of a heterodimeric coiled coil", O'Shea, E.K., Lumb, K. und Kim, P.S. (1993) Current Biology 3(10) 658–667.
4) Für eine Beschreibung von Biokonjugaten: "Bioconjugation of Highly Luminescent Colloidal CdSe-ZnS Quantum Dots with an Engineered Two-Domain Recombinant Protein", H. Mattoussi et al. (2001) Phys. Stat. Sol. (b), 224(1): 277–283.
5) Für eine Beschreibung von Biokonjugaten: "Self-Assembly of CdSe-ZnS Quantum Dot Bioconjugates Using an Engineered Recombinant Protein", H. Mattoussi et al. (2001) J. Am. Chem. Soc., 122: 12142–12150.

Herstellung des basischen (positiv geladenen) Leucin-Zipper-Gens
Zwei DNA-Oligonukleotidprimer wurden synthetisiert, um an die 5'- und 3'-Enden des basischen Leucin-Zippers in dem PCRIIBasen-Plasmid, geliefert von Chang et al., zu annealen.

Primer 1: 5'-TGCGGTGGCTCAGCTCAGTTG-3'
Primer 2: 5'-GCTCTAGATTAATCCCCACCCTGGGCGAGTTTC-3'

Unter Verwendung von PCR wurde der basische Zipper unter Verwendung der Primer 1 und 2 und pfu-Polymerase vervielfältigt, wodurch ein DNA-Fragment mit einer Länge von ungefähr 120 bp erzeugt wurde, welches den basischen Zipper codiert und welches Termini hat, die für eine Verarbeitung vor der Einbringung 3' zu dem MalE-Gen geeignet sind, und ein Stopcodon und einen einzigartigen Cysteinrest 5' zu der Zippersequenz codiert, für die abschließende Bildung kovalenter Dimere in dem exprimierten Fusionsprotein. Die Verarbeitung des vervielfältigten Zipper-codierenden Fragments wurde durch Verdau eines Teils der DNA mit Restriktionsendonuklease XbaI erzielt, was einen in geeigneter Weise überlappenden 3'-Terminus für die anschließende Klonierungsstufe lieferte. Das 5'-Ende des PCR-Fragments wurde stumpfendig ausgestaltet, so daß keine weitere Verarbeitung vor der nächsten Stufe erforderlich war.
Klonieren des Leucin-Zipper-Gens an die C-terminale codierende Sequenz für MBP
Das hergestellte DNA-Fragment wurde dann enzymatisch in den kommerziell erhältlichen Vektor pMal-c2 (New England Biolabs) ligiert, der mit den Restriktionsendonukleasen XmnI und XbaI verarbeitet worden war; diese Enzymspaltungsstellen in dem DNA-Vektor lieferten die stumpfen 5'- und die überlappenden 3'-Sequenzen, die für eine erfolgreiche Ligierung des hergestellten Fragments, welches den basischen Leucin-Zipper enthielt, wie beschrieben, erforderlich waren. Nach der Transformation von E. coli DH5'' mit Ligationsprodukt und Erhalten von Ampicillin-resistenten Bakterienkolonien wurden mehrere Kolonien mittels Kolonie-PCR unter Verwendung von DNA-Oligonukleotidprimern, die die Vektorklonierungsstellen flankieren, auf das Vorliegen der gewünschten eingebrachten basischen Leucin-Zipper-DNA getestet. Mehrere positive Kolonien wurden für eine Vervielfältigung durch Wachstum über Nacht in kleinem Maßstab, gefolgt von der Herstellung kleiner Mengen an pMal-basischer Zipper-DNA ausgewählt.
Expression des Proteins aus MBP-basischem Zipper in Bakterien
Mehrere Kandidatenplasmide aus dem obigen Klonierungsverfahren wurden auf die Fähigkeit getestet, das gewünschte Fusionsprotein in dem DH5''-Wirtsbakterienstamm zu exprimieren, gemessen durch Zellkultur in kleinem Maßstab (10 ml) und SDS-Gelelektroforese des IPTGinduzierten Expressionsprodukts. Von mehreren erfolgreichen Klonen wurde einer ausgewählt, um die DNA-Sequenzierung durchzuführen und so die Exaktheit der DNA-Sequenz für weitere Expressionsstudien und schließlich für Expressionsarbeiten in größerem Maßstab zu verifizieren. Die korrekte erwartete DNA-Sequenz für den ausgewählten Klon wurde durch die MGIF-Sequenzierungseinrichtung an der Universität Georgia verifiziert.
Zusätzliche Expressionsstudien in kleinem Maßstab in verschiedenen Bakterienstämmen wurden anschließend durchgeführt, um die Herstellung des Fusionsproteins, E. coli BL21, einem Stamm, dem freie Protease fehlt, und von dem bewiesen wurde, daß er für die Expression des Proteins geeignet ist, zu optimieren.
Anhängen eines (His)6-(Hexahistidin)-Peptids an den C-Terminus des Fusionsproteins
Um zusätzliche Flexibilität bei der Herstellung und Reinigung dieses und weiterer ähnlicher Fusionsproteine bereitzustellen, wurde DNA, die eine Hexahistidin-Peptidsequenz codiert, an das 3'-Ende der pMal-basischen Zipper-Sequenz angehängt. Die Herstellung dieses Konstrukts erforderte die Synthese eines neuen 3'-Primers, der zusammen mit Primer 1 (oben) verwendet wurde, um eine Vervielfältigung eines basischen Zipper-DNA-Fragments, dem das Codon für die Termination der Translation fehlt, welches in das oben beschriebene anfängliche Konstrukt implantiert wurde, zu erlauben:

Primer 3: 5'-GCTCTAGATGAATCCCCACCCTGGGCGAGTTTC-3'

Unter Befolgung exakt des gleichen Verfahrens wie oben beschrieben wurde ein Zwischenkonstrukt hergestellt, welches zu dem pMal-basischen Zipper identisch war, mit der Ausnahme, daß ein Stopcodon 3' von dem Leucin-Zipper fehlte. DNA, die dieses Zwischenkonstrukt codierte, wurde mit den Restriktionsendonukleasen XbaI und PstI gespalten, und die folgende synthetisch hergestellte Duplex-DNA wurde enzymatisch an diese Stellen ligiert:
5'-CTAGCGGTCACCACCACCACCACCACTGACTGCA-3'
3'-GCCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGACTG-5'
Nach Transformation von E. coli DH5'' mit Ligationsprodukten des Vektors und des angegebenen DNA-Inserts wurde noch einmal eine PCR-Analyse der Kolonie durchgeführt, um Klone zu finden, die MBP codieren, nacheinander gefolgt von der basischen Leucin-Zipper-Sequenz, der Hexahistidinsequenz und einem Translations-Stopcodon. Erneut wurde herausgefunden, daß die Expression in E. coli 8121 zufriedenstellende Mengen und eine Proteinqualität für Arbeiten in größerem Maßstab lieferte.
Zellkultur entweder von MBP-basischem Zipper oder MBP-basischem Zipper-(His)6-Protein
Eine einzelne Kolonie frisch transformierter E. coli 8121 wurde in 10 ml Luria-Nährlösung (L8) überführt, die 100 μg/ml Carbenicillin enthielt, und die Kultur wurde über Nacht (für ungefähr 15 h) bei 37°C geschüttelt. 2,0 ml dieser Übernacht-Kultur wurden in 1 Liter LB überführt, die 50 μg/ml Carbenicillin und 2 Gramm Glucose enthielt. Nach Züchten auf eine optische Dichte von 0,6 bei 37°C wurde der die Zellkultur enthaltende Kolben zu Schütteln bei 30°C für 15 Min. überführt, ehe IPTG (Isopropylthiogalactopyranosid) bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben wurde. Nach 2 h Schütteln bei dieser Temperatur wurden die Zellen bei 4°C mittels Zentrifugation sedimentiert. Das resultierende Zellpellet wurde in pulverförmigem Trockeneis schnellgefroren und bis zum Auftauen zur Reinigung bei –80°C gelagert.
Reinigung von MBP-basischem Zipper-(His)6 aus 1 Liter Zellkultur
Lysepuffer (35 ml 50 mM HEPES, 0,3 M NaCl, 5 mM Imidazol, pH 7,9, enthaltend eine Tablette Boehringer EDTA-freien Proteaseinhibitorcocktail) wurde zu dem Röhrchen, welches das gerade aus der Lagerung bei –80°C entfernte auftauende Pellet enthielt, zugegeben. Nach vollständigem Resuspendieren auf Eis wurden die Zellen mittels Ultraschallbehandlung für 5 × 1 Minute in Eiswasser lysiert. Die lysierten Zellen wurden bei 16.000 U.p.M. bei 4°C für 30 Min. zentrifugiert. Nachdem der rohe Überstand durch einen zweistufigen Spritzenultrafilter mit 0,8/0,2 Mikrometern hindurchgeleitet worden war, wurden 15 ml einer 50%-igen Suspension von NiNta-Metall-chelierendem Harz (Qiagen), äquilibriert mit Lysepuffer, zugegeben, und das Röhrchen wurde bei 4°C für 1 h zentrifugiert. Das Harz und das gebundene Protein wurden kurz zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen; dann wurde das Harz 2× mit 40 ml Lysepuffer gewaschen. Das gewaschene Harz wurde in eine Glaschromatographiesäule mit 1,5 cm Durchmesser bei 4°C gegossen, und 50 ml Lysepuffer (ohne Proteaseinhibitoren) wurden bei 0,8 ml/Min. durch die Säule geleitet, gefolgt von 90 ml Waschpuffer (50 mM HEPES, 0,3 M NaCl, 20 mM Imidazol, pH 7,9). Das Produkt wird mit Elutionspuffer (50 mM HEPES, 0,3 M NaCl, 250 mM Imidazol, pH 7,4) aus der gewaschenen Säule eluiert. Gepoolte Fraktionen, die Protein enthielten, wurden dann auf eine Festbettsäule von 25 ml (2 cm Durchmesser) aus immobilisierter Amylose (4°C), zuvor äquilibriert mit 50 mM HEPES, 0,1 M NaCl, pH 7,4, bei etwa 1 ml/Min. aufgebracht. Die Säule wurde mit 100 ml des obigen Puffers gewaschen, dann wurde das Protein mit diesem Puffer, enthaltend 10 mM Maltose, eluiert. Gesammelte Fraktionen, die gereinigtes Protein enthielten, wurden gepoolt und durch einen sterilen Spritzenfilter mit 0,45 Mikrometern geleitet und bei 4°C gelagert. Gereinigtes Protein wurde mittels SDS-Gelelektroforese +/– Dithiothreitol als Reduktionsmittel (15 mg/ml in gekochten Proben) analysiert, um den Grad der Dimerbildung zu beurteilen.
Ionisches Konjugat mit Maltose-Bindungsprotein
Das MBP-Leucin-Zipper-Fusionsprotein wurde elektrostatisch an die CdSe(Kern)-ZnS (Umhüllung)-Dihydroliponsäure-modifizierten halbleitenden Teilchen angehängt, indem das Fusionsprotein und die anorganischen Teilchen in boratgepufferten Lösungen bei einem pH-Wert von 8–9 gemischt wurden. Ein pH-Wert größer als 7 eignet sich am besten für die Proteinmanipulation durch Konservieren der Löslichkeit des Nanokristalls und Bereitstellen einer negativ geladenen Oberflächenumhüllung. Die einfache Zugabe des MBP-Leucin-Zipper-Fusionsproteins zu einer Lösung, die eine feste Menge an Nanokristallen in gepufferter Lösung enthielt, lieferte ionische Biokonjugate, die frei von Aggregaten waren, unabhängig von dem Molverhältnis von anorganischen Teilchen zu Proteinen. Typischerweise liegt das Verhältnis der anorganischen Teilchen zu Proteinen zwischen 1 und 10. Die anorganischen Teilchen hatten einen mittleren Durchmesser von ungefähr 19 Å.
Der Vorteil einer Oberflächenmodifikation unter Verwendung des vorliegenden Verfahrens besteht in seiner Einfachheit und Vielseitigkeit. Es ist lediglich erforderlich, das Fusionsprotein zu den zu umhüllenden Teilchen zuzugeben, und das gewünschte Protein hängt sich nahezu sofort an die Oberfläche an. Weiterhin führt in einigen Fällen die Umhüllung der anorganischen Teilchen mit den biologischen Resten zu einer Verbesserung der Photolumineszenzausbeute. 5 zeigt, daß Teilchen, die mit dem MBP-Zipper-Protein umhüllt sind, eine ungefähr dreifache Steigerung der Lumineszenzintensität im Vergleich zu Teilchen zeigen, die nicht elektrostatisch mit einem biologischen Rest verknüpft sind.
Die mit dem MBP-Zipper umhüllten Nanokristalle (und Teilchen), die mittels nicht-kovalenter Vernetzung hergestellt wurden, wurden auch unter Verwendung von konfokaler Fluoreszenzmikroskopie-Abbildung untersucht. Die 6A–6C zeigen Querschnittsabbildungen unter Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops von Lösungen von MBP-Zipper, der an Nanokristalle (Kernumhüllung mit Kernradius von 19 Å) gebunden ist, zusammen mit einer Abbildung einer Probe der gleichen Teilchen, die kovalent mit Ovalbumin vernetzt sind, und zwar beispielsweise durch 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid (EDAC oder EDC). Verfahren zur kovalenten Vernetzung werden diskutiert in "Semiconductor Nanocrystals as Fluorescent Biological Labels", Science 281, 2013–2016 (1998), von Bruchez, Jr. et al.; "Quantum Dot Bioconjugates for Ultrasensitive Nonisotopic Detection", Science 281, 2016–2018, von W.C.W. Chan und S. Nie, und dort zitierten Literaturstellen. Signifikante Aggregate (die sich in dem Erscheinen konstellationsartiger Merkmale manifestieren) bildeten sich, wenn das kovalente Verfahren verwendet wurde (6C), wohingegen ionische Konjugate von anorganischen Teilchen, die mit dem MBP-Zipper umhüllt waren, zu nichtumhülltem Material identisch zu sein schienen (siehe 6A und 6B). Die in den 6A und 6B aufgezeichnete Emission resultiert aus einzelnen Teilchen und ist charakteristisch für stabile und aggregationsfreie Lösungen. Zusätzlich steigerte sich die Photolumineszenz der anorganischen Teilchen, die mit dem MBP-Zipper umhüllt waren (6A) relativ zu nicht-umhüllten anorganischen Teilchen (6B) für dünne Filme, die vergleichbare Konzentrationen der Teilchen enthielten. Für jede Abbildung wurde die Lösung ionischer Biokonjugate bei 488 nm angeregt, d.h. unterhalb der Position des ersten Absorptionspeaks der Nanoteilchen. Geeignete Filter wurden verwendet, um das Anregungssignal zu blockieren. Abbildungen von Nanoteilchen, die unter Verwendung des Ansatzes mit kovalenter Bindung (EDAC) mit Ovalbumin umhüllt wurden, wurden zusammen mit Abbildungen reiner Nanoteilchen (proteinfrei) und zu Fusionsproteinen komplexierter Nanoteilchen ebenfalls aufgezeichnet. Jede Abbildung repräsentiert sehr dünne Scheiben (jeweils mit einer Dicke von – 15 Mikrometern und einer Fläche von 150 × 100 Mikrometern²) entlang des Laserpfades (Anregungssignal verläuft vertikal). Die letzten Abbildungen im unteren Teil der Figur repräsentieren den Schnitt benachbart zu der Trägeroberfläche (Boden der optischen Schale). Die hellen grünen Punkte auf den Abbildungen repräsentieren die Lumineszenzemission von einzelnen Nanoteilchen, die in dem Lösungsfilm dispergiert sind. Die oben beschriebenen Ergebnisse deuten darauf hin, daß der vorliegende Umhüllungsansatz wirkungsvoll ist, um aggregationsfreie (selbst in sehr kleinem Maßstab) Nanokristall-Protein-Biokonjugate bereitzustellen. Die Proben sind über einen langen Zeitraum (Monate) stabil. Die Aggregate (6C) präzipitieren durch die Schwerkraft an den Boden, und nicht-umgesetzte Teilchen bleiben in der Lösung schwebend zurück, was den falschen Eindruck vermitteln könnte, daß kovalent umhüllte Teilchen stabil sind und keine Aggregation in großem Maßstab eingehen. Die Aggregation war in Lösungen, in denen IgG mittels EDAC an Nanokristalle angehängt wurde, sogar noch ausgeprägter (Daten nicht gezeigt).
Bezugnehmend auf die 7A und 7B wurden die Auswirkungen des pH-Werts und der Anzahl von Proteinen auf das Nanoteilchen getestet. Bei einem pH-Wert von etwa 9 nimmt die Photolumineszenz zu, wenn die Anzahl an Fusionsproteinen, die elektrostatisch an das Nanoteilchen angehängt sind, zunimmt. Bei einer konstanten Anzahl an Proteinen, die an die Nanoteilchen komplexiert sind, nahm die Photolumineszenz mit steigendem pH-Wert zu.
In einem nachfolgenden Experiment wurde die biologische Aktivität der ionischen Konjugate, einschließlich MBP, getestet, indem die ionischen Konjugate durch eine Säule von Amylose-funktionalisierten Harzen geleitet wurden. Die ionischen Konjugate banden an das Harz, als MBP mit Amylose wechselwirkte. So behielten die ionischen Konjugate ihre biologische Aktivität bei. Ionische Konjugate, die an die Amylose-funktionalisierten Harze banden, wurden durch Waschen der Säule mit einer Maltoselösung freigesetzt.
Klonierung und Herstellung von G-basischen Zipper-Proteinen
Die codierende Sequenz für die IgG-Bindungs-b2-Subdomäne von Streptokokkenprotein G (PG) wurde in den E. coli-Klonierungsvektor pBad/HisB (einen induzierbaren Expressionsvektor von Invitrogen) kloniert und exprimiert. Der Linker und der Schwanz des Leucin-Zippers wurden abstromig an der Stelle 3' von dem PG eingebracht. Zusätzlich wurde eine kurze Polyhistidinkette (Hexahistidin) an das Ende des Leucinschwanzes angehängt, um die Reinigung des Endprodukts zu erleichtern. Diese aufeinanderfolgenden Genmanipulationen lieferten ein Streptokokken-Fusionsprotein G, welches eine IgG-b2-Bindungssubdomäne und einen mit Leucin-Zipper beladenen Schwanz hat, was in dem vorliegenden Umhüllungsschema eine wichtige Rolle spielt.
Ionische Konjugate, einschließlich halbleitender Nanoteilchen (CdSe-ZnS), umhüllt mit Protein G-Zipper, wurden unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens synthetisiert. Das Verhältnis von anorganischen Teilchen zu Biomolekülen ist jedoch typischerweise kleiner als das Verhältnis von MBP-Proteinen zu anorganischen Teilchen.
Die resultierenden ionischen Biokonjugate wurden durch eine Säule geleitet, welche Harze enthielt, die mit IgG funktionalisiert waren, und für ungefähr 15 Minuten umgesetzt. Das Waschen der Säule mit reiner Pufferlösung führte zur Freisetzung vernachlässigbarer Mengen an ionischen Biokonjugaten. In der funktionalisierten Säule verblieben etwa 95–98% der ionischen Biokonjugate. Der Prozentsatz an ionischen Konjugaten, die in der Säule enthalten waren, wurde durch Überwachen des Eluats aus der Säule hinsichtlich Lumineszenz, die die halbleitenden Teilchen anzeigte, bestimmt. Diese Ergebnisse implizieren, daß Protein G-Zipper-Moleküle an die anorganischen Teilchen binden.

Claims

Zusammensetzung, welche folgendes umfaßt: ein anorganisches Teilchen, eine Verknüpfungsgruppe, die ein distales Ende und ein proximales Ende hat, wobei das distale Ende an eine äußere Oberfläche des anorganischen Teilchens gebunden ist und das proximale Ende einen ersten geladenen oder ionisierbaren Rest enthält, und ein Makromolekül, welches einen zweiten geladenen oder ionisierbaren Rest enthält, wobei der erste und der zweite geladene oder ionisierbare Rest das anorganische Teilchen elektrostatisch mit dem Makromolekül verknüpfen, wodurch ein ionisches Konjugat gebildet wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, welche folgendes umfaßt: ein anorganisches Teilchen, eine Verknüpfungsgruppe, die ein distales Ende und ein proximales Ende hat, wobei das distale Ende an eine äußere Oberfläche des anorganischen Teilchens gebunden ist und das proximale Ende einen ersten geladenen oder ionisierbaren Rest enthält, und ein Fusionsprotein, welches einen zweiten geladenen oder ionisierbaren Rest enthält, wobei der erste und der zweite geladene oder ionisierbare Rest das anorganische Teilchen elektrostatisch mit dem Fusionsprotein verknüpfen, wodurch ein ionisches Konjugat gebildet wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das anorganische Teilchen ein halbleitender Nanokristall ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei der halbleitende Nanokristall ein erstes Halbleitermaterial, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Gruppe II-VI-Verbindung, einer Gruppe II-V-Verbindung, einer Gruppe III-VI-Verbindung, einer Gruppe III-V-Verbindung, einer Gruppe IV-VI-Verbindung, einer Gruppe I-III-VI-Verbindung, einer Gruppe II-IV-VI-Verbindung und einer Gruppe II-IV-V-Verbindung, enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei das erste Halbleitermaterial aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, HgS, HgSe, HgTe, AlN, AlP, AlAs, AlSb, GaN, GaP, GaAs, GaSb, GaSe, InN, InP, InAs, InSb, TlN, TlP, TlAs, TlSb, PbS, PbSe, PbTe und Gemischen davon.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das erste Halbleitermaterial CdSe ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei das erste Halbleitermaterial mit einem zweiten Halbleitermaterial überzogen ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das zweite Halbleitermaterial ZnS, ZnO, ZnSe, ZnTe, CdS, CdO, CdSe, CdTe, MgS, MgSe, HgO, HgS, HgSe, HgTe, AlN, AlP, AlAs, AlSb, GaN, GaP, GaAs, GaSb, GaSe, InN, InP, InAs, InSb, TlN, TlP, TlAs, TlSb, PbS, PbSe, PbTe, SiO₂ oder Gemische davon ist bzw. sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das anorganische Teilchen weiterhin eine Mehrzahl von Verknüpfungsgruppen umfaßt, die jeweils unabhängig voneinander einen dritten geladenen oder ionisierbaren Rest enthalten.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, welche weiterhin eine Mehrzahl von Makromolekülen umfaßt, wobei jedes der Makromoleküle einen vierten geladenen oder ionisierbaren Rest enthält, wobei die Mehrzahl von Makromolekülen über elektrostatische Wechselwirkung mit der Mehrzahl von Verknüpfungsgruppen des anorganischen Teilchens mit dem anorganischen Teilchen verknüpft sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das anorganische Teilchen Ag, Au oder einen Phosphor umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die erste geladene oder ionisierbare Gruppe ein Hydroxid, Alkoxid, Carboxylat, Sulfonat, Phosphat, Phosphonat oder quaternäres Ammonium umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die zweite geladene oder ionisierbare Gruppe ein Hydroxid, Alkoxid, Carboxylat, Sulfonat, Phosphat, Phosphonat oder quaternäres Ammonium umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Verknüpfungsgruppe die Formel (R1)a-R2-((R3)b(R4)c]d hat, wobei R₁ aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus C1-C100-Heteroalkyl, C2-C100-Heteroalkenyl, Heteroalkinyl, -OR, -SH, -NHR, -NR'R'', -N(O)HR, -N(O)R'R'', -PHR, -PR'R'', -P(NR'R'')NR'R'', -P(O)R'R'', -P(O)(NR'R'')NR'R'', -P(O)(OR')OR'', -P(O)OR, -P(O)NR'R'', -P(S)(OR')OR'' und -P(S)OR, wobei R, R', R'' unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus H, einem verzweigten oder unverzweigten C1-C100-Alkyl, einem ver zweigten oder unverzweigten C2-C100-Alkenyl, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Alkinyl, einem verzweigten oder unverzweigten C1-C100-Heteroalkyl, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Heteroalkenyl, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Heteroalkinyl, mit der Maßgabe, daß, wenn a größer als 1 ist, die R₁-Gruppen an den gleichen oder verschiedenen Atomen innerhalb der R₂- oder R₃-Gruppen an diese angehängt sein können, die R₁-Gruppen gleich oder verschieden sein können oder die R₁-Gruppen ein sechs-, sieben-, acht-, neun- oder zehngliedriges Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Thereozyklus, Aryl, Heteroaryl oder einen sechs- bis dreißiggliedrigen Kronenether oder Heterokronenether bilden können, R₂ ausgewählt ist unter einer Bindung, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Alkylen, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Alkenylen, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Heteroalkenylen, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Cycloalkinyl, Heterozyklus, Aryl und Heteroaryl, R₃ ausgewählt ist unter einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Alkylen, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Alkenylen, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Heteroalkenylen, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Cycloalkinyl, Heterozyklus, Aryl und Heteroaryl, R₄ aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Wasserstoff, einem Carboxylat, einem Thiocarboxylat, einem Amid, einem Hydrazin, einem Sulfonat, einem Sulfoxid, einem Sulfon, einem Sulfit, einem Phosphat, einem Phosphonat, einem Phosphoniumion, einem Alkohol, einem Thiol, einem Amin, einem Ammonium, einem Alkylammonium, einem Nitrat, und a 1 bis 40 ist, b 0 bis 3 ist, c 1 bis 30 ist, d 1 bis 3 ist, und wenn d 2 oder 3 ist, die R₃-Gruppen gleich oder verschieden sein können oder unter Bildung eines fünf- bis zehngliedrigen Cycloalkyls, Cycloalkenyls, Heterozyklus, Aryls oder Heteroaryls miteinander verknüpft sein können.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Verknüpfungsgruppe die Formel HS-C₂H₄-CH(SH)-(C₄H₈)-COOH hat.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Makromolekül ein Polypeptid oder Polynukleotid enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei das Makromolekül ein Polypeptid enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 17, wobei der zweite geladene oder ionisierbare Rest ein Leucin-Zipper ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 17, wobei der zweite geladene oder ionisierbare Rest Polyaspartat ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 17, wobei das Polypeptid ein Maltosebindungsprotein enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 17, wobei das Polypeptid ein Immunglobulin G-Bindungsprotein enthält.
Verfahren zur Bildung eines ionischen Konjugats, welches folgendes umfaßt: Bereitstellen eines anorganischen Teilchens, welches eine Verknüpfungsgruppe mit einem distalen Ende und einem proximalen Ende enthält, wobei das distale Ende an eine äußere Oberfläche des anorganischen Teilchens gebunden ist und das proximale Ende einen ersten geladenen oder ionisierbaren Rest enthält, und Inkontaktbringen eines Makromoleküls, welches einen zweiten geladenen oder ionisierbaren Rest enthält, mit dem anorganischen Teilchen, wobei der erste und der zweite geladene oder ionisierbare Rest das anorganische Teilchen elektrostatisch mit dem Makromolekül verknüpfen, wodurch ein ionisches Konjugat gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das anorganische Teilchen ein halbleitender Nanokristall ist.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei der halbleitende Nanokristall ein erstes Halbleitermaterial, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Gruppe II-VI-Verbindung, einer Gruppe II-V-Verbindung, einer Gruppe III-VI-Verbindung, einer Gruppe III-V-Verbindung, einer Gruppe IV-VI-Verbindung, einer Gruppe-I-III-VI-Verbindung, einer Gruppe II-IV-VI-Verbindung und einer Gruppe II-IV-V-Verbindung, enthält.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei das erste Halbleitermaterial aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, HgS, HgSe, HgTe, AlN, AlP, AlAs, AlSb, GaN, GaP, GaAs, GaSb, GaSe, InN, InP, InAs, InSb, TlN, TlP, TlAs, TlSb, PbS, PbSe, PbTe und Gemischen davon.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei das erste Halbleitermaterial CdSe ist.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei das erste Halbleitermaterial mit einem zweiten Halbleitermaterial überzogen ist.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das zweite Halbleitermaterial ZnS, ZnO, ZnSe, ZnTe, CdS, CdO, CdSe, CdTe, MgS, MgSe, HgO, HgS, HgSe, HgTe, AlN, AlP, AlAs, AlSb, GaN, GaP, GaAs, GaSb, GaSe, InN, InP, InAs, InSb, TlN, TlP, TlAs, TlSb, PbS, PbSe, PbTe, SiO₂ oder Gemische davon ist bzw. sind.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das anorganische Teilchen weiterhin eine Mehrzahl von Verknüpfungsgruppen umfaßt, die jeweils unabhängig voneinander einen dritten geladenen oder ionisierbaren Rest enthalten.
Verfahren nach Anspruch 22, welches weiterhin eine Mehrzahl von Makromolekülen umfaßt, wobei jedes der Makromoleküle einen vierten geladenen oder ionisierbaren Rest enthält, wobei die Mehrzahl von Makromolekülen über elektrostatische Wechselwirkung mit der Mehrzahl von Verknüpfungsgruppen des anorganischen Teilchens mit dem anorganischen Teilchen verknüpft ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das anorganische Teilchen Ag, Au oder einen Phosphor umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die erste geladene oder ionisierbare Gruppe ein Hydroxid, Alkoxid, Carboxylat, Sulfonat, Phosphat, Phosphonat oder quaternäres Ammonium enthält.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die zweite geladene oder ionisierbare Gruppe ein Hydroxid, Alkoxid, Carboxylat, Sulfonat, Phosphat, Phosphonat oder quaternäres Ammonium enthält.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Verknüpfungsgruppe die Formel (R₁)_a-R₂-[(R₃)_b(R₄)_c]_d hat, wobei R₁ aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus C1-C100-Heteroalkyl, C2-C100-Heteroalkenyl, Heteroalkinyl, -OR, -SH, -NHR, -NR'R'', -N(O)HR, -N(O)R'R'', -PHR, -PR'R'', -P(NR'R'')NR'R'', -P(O)R'R'', -P(O)(NR'R'')NR'R'', -P(O)(OR')OR'', -P(O)OR, -P(O)NR'R'', -P(S)(OR')OR'' und -P(S)OR, wobei R, R', R'' unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus H, einem verzweigten oder unverzweigten C1-C100-Alkyl, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Alkenyl, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Alkinyl, einem verzweigten oder unverzweigten C1-C100-Heteroalkyl, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Heteroalkenyl, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Heteroalkinyl, mit der Maßgabe, daß, wenn a größer als 1 ist, die R₁-Gruppen an den gleichen oder verschiedenen Atomen innerhalb der R₂- oder R₃-Gruppen an diese angehängt sein können, die R₁-Gruppen gleich oder verschieden sein können oder die R₁-Gruppen ein sechs-, sie ben-, acht-, neun- oder zehngliedriges Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Thereozyklus, Aryl, Heteroaryl oder einen sechs- bis dreißiggliedrigen Kronenether oder Heterokronenether bilden können, R₂ ausgewählt ist unter einer Bindung (d.h. R₂ ist nicht vorhanden; in diesem Fall bindet R₁ an R₃), einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Alkylen, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Alkenylen, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Heteroalkenylen, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Cycloalkinyl, Heterozyklus, Aryl und Heteroaryl, R₃ ausgewählt ist unter einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Alkylen, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Alkenylen, einem verzweigten oder unverzweigten C2-C100-Heteroalkenylen, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Cycloalkinyl, Heterozyklus, Aryl und Heteroaryl, R₄ aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Wasserstoff, einem Carboxylat, einem Thiocarboxylat, einem Amid, einem Hydrazin, einem Sulfonat, einem Sulfoxid, einem Sulfon, einem Sulfit, einem Phosphat, einem Phosphonat, einem Phosphoniumion, einem Alkohol, einem Thiol, einem Amin, einem Ammonium, einem Alkylammonium, einem Nitrat, und a 1 bis 4 ist, b 0 bis 3 ist, c 1 bis 3 ist, d 1 bis 3 ist, und wenn d 2 oder 3 ist, die R₃-Gruppen gleich oder verschieden sein können oder unter Bildung eines fünf- bis zehngliedrigen Cycloalkyls, Cycloalkenyls, Heterozyklus, Aryls oder Heteroaryls miteinander verknüpft sein können.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Verknüpfungsgruppe die Formel HS-C₂H₄-CH(SH)-(C₄H₈)-COOH hat.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Makromolekül ein Polypeptid oder ein Polynukleotid enthält.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei das Makromolekül ein Polypeptid enthält.
Verfahren nach Anspruch 37, wobei der zweite geladene oder ionisierbare Rest ein Leucin-Zipper ist.
Verfahren nach Anspruch 37, wobei der zweite geladene oder ionisierbare Rest Polyaspartat ist.
Verfahren nach Anspruch 37, wobei das Polypeptid ein Maltosebindungsprotein enthält.
Verfahren nach Anspruch 37, wobei das Polypeptid ein Immunglobulin G-Bindungsprotein enthält.
Verfahren nach Anspruch 22, welches weiterhin die Bildung des Makromoleküls durch rekombinante Verfahren umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 22, welches weiterhin die Bildung des Makromoleküls durch Syntheseverfahren umfaßt.
Verfahren zum Detektieren des Vorliegens einer vorbestimmten Spezies in einer Lösung, welches folgendes umfaßt: Inkontaktbringen einer Lösung mit einem ionischen Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21.