JPH07120470A - 不透明な可塑支持体の使用に基づいたリガンド検出用の視覚的イムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 不透明な白色のプラスチック支持体を用い
て、流体中のリガンドを検出するための、高感度で高特
異性であり、かつ試薬が廉価な、手動操作によるイムノ
アッセイ法を提供する。 【構成】 リガンド結合パートナーをコーティングした
境界を定めた反応領域を有する不透明な白色プラスチッ
ク支持体を使用して、検体をインキュベートすると、プ
ラスチック支持体にコーティングされた特異的結合パー
トナーが検体に含まれるリガンドと反応する。このよう
な反応の標識は、単分散金コロイド粒子と検体中のリガ
ンドの特異的結合パートナーの抱合体を使用して行い、
最終段階において金コロイドの沈着によって生じた信号
が銀イオンを基剤とする物理的現像薬により増幅され
る。この増幅により、白色のプラスチック支持体と対照
的な金属的な薄黒い色が生じる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】ヒト、動物および植物の伝染性、
急性および慢性の疾患は、免疫学に基づくアッセイによ
り診断または検出することができる。このような方法に
ついては様々なものが知られており、いわゆる「サンド
イッチ」イムノアッセイや、競合結合アッセイなど、流
動性または非流動性検体中での目的とする分子の有無を
決定するために用いることができる方法が挙げられる。
イムノアッセイの一般的特徴は、それらが抗原−抗体反
応の特異性に基づくという点にある。この特異的反応
は、免疫複合体と命名されるものを生じる。この抗体
（免疫グロブリンとしても知られる）は、ポリクローナ
ルまたはモノクローナルなものから得ることができ、１
つまたは多数の抗原決定基の部位を有する特定の抗原の
特異的結合のパートナーとして作用する。非免疫グロブ
リン分子ばかりでなく、第２の抗体も所定の状況で抗原
になることができる。イムノアッセイは、ある抗原−抗
体反応を同定するある種の標識過程の存在によっても特
徴づけられる。標識は、この抗原−抗体反応の一部、ま
たはアッセイにおける追加段階を構成することができ
る。後者の場合、標識は、マーカー物質を持っている追
加の分子により、免疫複合体における抗原または抗体の
いずれかを追加的に特異的に認識する。多種多様なマー
カーが、現在イムノアッセイにおいて用いられている
（放射性アイソトープ、膠着できる金属および非金属の
微粒子、活性化により発光する、または着色した可溶性
または不溶性反応を生じることができる物質など）。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決すべき課題】Ｈｏｒｉｓ
ｂｅｒｇｅｒおよびＲｏｓｓｅｔ（Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈ
ｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２５：２９５−３０５，１９
７７）は、標識として金コロイドを用いた凝集分析法を
報告している。この分析法は簡単で経済的ではあるが、
分析時間が長く、取り分け反応の終点を決定する際の主
要な本来的な要素が色の評価によるものである、という
短所がある。Ｌｅｕｖｅｒｉｎｇ（米国特許第４，３１
３，７３４号明細書）では、新規のイムノアッセイ過程
は、コロイド状の金属物質の使用を含む新規なイムノア
ッセイ法を報告している。このようなコロイドは、免疫
抱合体における標識として用いられるが、この方法は、
コロイド状金属を免疫反応の部位から化学的に抽出した
後、その存在を分光光度計を使用することによって同定
を行うのである。従って、この分析方法では、厄介な予
備抽出の過程および高価な補助器具の使用に頼っている
割には、相対的に鈍感な結果を得るのである。

【０００３】Ｊａｎｓｓｅｎに譲渡された欧州特許出願
第ＥＰ１５８，７４６号明細書では、膜マトリックス表
面上の試薬の拡散に基づいたイムノアッセイ法（イムノ
ブロット法）が記載されている。この方法は、Ｌｅｕｖ
ｅｒｉｎｇのものよりも優れた選択肢を提供してはいる
が、やはり予備調製および膜のブロッキングを含む過剰
な実行時間および段階に煩わされている。

【０００４】欧州特許出願第ＥＰ２９，３９７号明細書
において、Ｊａｎｓｓｅｎは銀イオンの還元に基づく物
理的現像薬を用いて組織における不溶性金属の視覚化を
行うこと（Ｄａｎｓｃｈｅｒ，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ７１：ｌ−１６，１９８１）及び組織染色にお
ける金コロイド粒子抱合体であって、後で同様な現像薬
で増幅されるもの（Ｈｏｌｇａｔｅら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏ
ｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３１、９３８−９４４、
１９８３）の使用に関する既存の知見を考慮し、金コロ
イド抱合体を用いる最初の免疫染色法より高感度を得る
方法を提供している。前記の特許明細書においてＪａｎ
ｓｓｅｎは、その方法において、光に対して感受性がな
く且つ２種類の別個な溶液に適合した物理的現像薬を追
加的に用い、膜マトリックスに基づいた分析法の感度お
よび視覚的特徴を改良する方法として記載している。Ｃ
ｈｕｎらは１９８６年度アメリカ微生物学者学会の抄録
において（Ｃ−２１３、３６３頁、およびＣ−４０９、
３９６頁）、Ｊａｎｓｓｅｎが見付けたものと極めて類
似した形式を用いて、金コロイドの分析法におけるマー
カーとしての使用について報告した。しかしながら、こ
のＣｈｕｎらの分析法では、２から３時間程度のかなり
のインキュベーション時間を費やしてはじめて許容可能
な水準の感度を得ることができた。

【０００５】Ｏｒｔｈｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．に譲渡された欧州特許出願第ＥＰ
２５０，１３７号明細書および第ＥＰ２５８，９６３号
明細書では、新規なイムノアッセイ過程として、マーカ
ー試薬として金コロイドを用いる新規な免疫学的手法
と、免疫学的に活性な成分を固定した膜マトリックスを
有する特殊な装置を記載している。この手法の主要な特
許請求の範囲は、流体検体および試薬を膜を透過させた
場合に達成される感度および分析速度に集中している
が、この方法には幾つかの短所がある。この膜マトリッ
クスには、調製およびブロッキングの前段階、および前
記の膜から成る各検体についての特別な別々の装置の使
用、吸収材材料、および適合したプラスチック体が必要
であり、経費が上昇し、制酸技術が複雑になる。非特異
的なバックグラウンドの干渉により、視覚的に結果を読
み取る間に予期しない困難が起こる場合もあるが、これ
は質に影響したり、最終ユーザーによる反応の解釈にお
いて主観的要素を増加したりする場合があり、特に反応
性の低い検体の場合、および／または特異的な生物学的
な体液、例えば全血、血清、血漿等を使用する場合がこ
れにあたる。最後に、そして特に関連性のあることとし
て、この様な方法の個々の形式では未知の検体を試験す
る際の同じ装置において、真の陰性および陽性の検体コ
ントロールを現像させることはできない。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、免疫測定方法
に関しており、詳細には流体検体中の活性分子を免疫学
的に検出する新規の免疫測定法に関する。このような分
子は、単独のまたは単一エピトープを有する抗原または
抗体であることができる。抗原と抗体の間における特異
的な認識は、不明瞭なリガンド−リガンド結合のパート
ナー対を造り出すので、後者の用語は以後本文中で不明
瞭なまま使用される。これらの用語は、標識した物質と
免疫複合体の間の反応を説明するためにも使用する。

【０００７】詳細には本発明の目的は新規な分析手法で
あり、これはリガンド結合パートナーをコーティングし
た境界を定めた反応領域を有する不透明な白色プラスチ
ック支持体を使用するものである。検体をそのような領
域でインキュベートすると、免疫反応が起こり、プラス
チック支持体にコーティングされた特異的結合パートナ
ーが検体に含まれるリガンドと反応する。このような反
応の標識は、単分散金コロイド粒子と検体中のリガンド
の特異的結合パートナーの抱合体を使用することにより
可能になる。金コロイド粒子の好ましい直径は、１から
１８ナノメーターであり、５２０から５４０ナノメータ
ーの波長で測定する場合、このコンジュゲートの吸光度
は０．５から１．１５の間であった。この反応の視覚化
は、最終段階において金コロイドの沈着によって生じた
信号が銀イオンを基剤とする物理的現像薬により増幅さ
れた後に行われる。この増幅により、白色のプラスチッ
ク支持体と対照的な金属的な薄黒い色が生じる。

【０００８】新規なイムノアッセイ系は下記のものを包
含している：リガンド結合パートナーをコーティングし
た磨かれた境界の定まった反応表面を有するプラスチッ
ク製の不透明な白色支持体。このリガンド結合パートナ
ーは、これ以後分子均質性または分子の異種混合物のい
ずれかとして解釈される。境界の定まった反応表面を、
プラスチック表面にコーティングされた結合パートナー
に特異的なリガンドを含む検体に接触させる。このリガ
ンドは、これ以後分子均質性または分子の異種混合物の
いずれかとして解釈される。同時にまたは連続して、金
コロイドと検体に含まれるリガンドに特異的な結合パー
トナーとの直接または間接的抱合体を加え、前記の境界
の定まった反応表面を、金コロイドの微粒子が産生する
信号を増幅することのできる銀イオンを含む物理的顕色
剤のもとである液体試薬の混合物と接触させ、境界の定
められた反応表面を、銀イオンを含む物理現像薬を生成
し且つ金コロイド粒子によって生じた信号を増幅するこ
とができる液体試薬混合物と接触させ、境界の定まった
反応表面を、検体における所望のリガンドの有無を示す
金属的な薄黒い色のついた沈殿の存在について観察す
る。全体として、この免疫測定法は、調製および実行が
容易で、試薬が経済的で、高感度および高い特異性の水
準を示し、各実験における真の陰性および陽性の検体コ
ントロールの包含を確保する形状として適合させること
ができる。この手法は「サンドイッチ」、競合結合や他
の種類の分析法に適合させ、流動性の検体中の抗原や抗
体を検出することができる。このようなイムノアッセイ
は経済的に行い、バッチ生産に必要な品質要件を満たす
ことができる。本発明により提供される手法のもう一つ
のの利点は、それが視覚的に十分解釈できる免疫測定法
をもたらし、追加の機器の必要性がないことである。

【０００９】本発明の他の態様は、支持体の性質を様々
なポリマー構造を有するいくつかのプラスチック物質、
例えばポリスチレン、ポリアミド、ポリカーボネイト、
ポリ塩化ビニルおよびその他に拡張することが可能なこ
とであり、これは原材料の段階において十分な割合でチ
タン、亜鉛および他の化学的化合物と混合して、最終段
階で様々な形状に成形することができる不透明な支持体
が得られる。表面処理の別の応用としては、従来マイク
ロタイターのウェルプレートおよび酵素結合イムノソー
ベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）の細片の生産に従来使用
していたものと類似したものが挙げられ、これは、吸着
や共有結合によりプラスチック表面のコーティングを様
々なリガンドに最適にすることが可能である。

【００１０】本発明の特徴に関し、この新規なイムノア
ッセイの手法は流動性検体、例えば全血、血清、血漿、
尿、唾液などにおける多種多様なリガンドの検出に有用
である。ウイルス性の実体（ヒト免疫不全ウイルス、肝
炎ＣおよびＢウィルス、サイトメガロウイルス、ロタウ
イルス等）、バクテリアおよび寄生虫（Ｎｅｉｓｓｅｒ
ｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｅｐｉｏｓｐｉｒ
ａｅ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｅｐ
ｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ等）の特異的な抗原また
はこれらに特異的な抗体を検出することができる。前記
のものと異なる性質のリガンド、すなわち他の生物学的
および非生物学的な分子を、本発明の原理に基づき構築
されたイムノアッセイを用いて検出することもできるの
である。

【００１１】前記に簡潔に述べたように、本測定法はリ
ガンド結合パートナーをコーティングした境界が定めら
れた光沢のある円形の反応領域を有する不透明な白いポ
リスチレン支持体を使用する。この手法の詳細は、測定
法の種類、つまりそれが直接的、競合的またはサンドイ
ッチ型のいずれの測定法であるかによって変化する。通
常、支持体を、プラスチック表面にコーティングした結
合パートナーに特異的なリガンドを含む検体と共にイン
キュベートすると、免疫反応が起きる。金コロイドとリ
ガンドの結合パートナーの抱合体による連続的インキュ
ベーション（サンドイッチ型）を続いて行う。競合結合
型のアッセイでは、検体はコーティングしたプラスチッ
ク表面、並びに金コロイドのコンジュゲートおよび目的
のリガンドと共にインキュベートするため、この段階は
不要となる。この方法の最終段階は、プラスチック表面
と、銀イオンを含み、金コロイド粒子の最終的な検出を
増幅することができる物理現像薬を生じるも液体試薬の
混合物とのインキュベーションを包含している。各イン
キュベーション後の洗浄段階により、検体中の過剰なリ
ガンドおよび非特異的な分子、未結合の抱合体、および
物理現像薬を確実に除去する。

【００１２】驚くべきことに、生成した銀の金属粒子は
金粒子を取り巻いてポリスチレン表面結合した金粒子の
回りで成核したままになっていることが観察されたが、
これはリガンド−リガンド結合パートナー抱合体反応が
存在するためである。この結果、反応領域上は、金属的
な薄黒い色になり、これは白色のプラスチック支持体と
の対比において容易に視覚化することができる。「サン
ドイッチ」型の測定では、色の強度は検体に存在するリ
ガンの量に依存する。競合結合測定法では、検体中のリ
ガンドの量は、退色に比例する。特異的な免疫反応が表
面で起こらない場合、銀の金属的還元および成核は起こ
らず、表面は無色のままである。本発明の結果として、
膜マトリックスに基づく方法、または従来のＥＬＩＳＡ
と比較してプラスチック反応表面のコーティングに要す
るリガンド結合パートナーの量は極めて少量でよい。他
の液体試薬の容積を削減することもできる。このイムノ
アッセイの手法はまた、１試験当たりの検体量がＥＬＩ
ＳＡおよび多くの膜を基材とした技術において一般に用
いられるよりも少量で足りる。

【００１３】本発明は、不透明な白色の光沢のあるプラ
スチック表面および金コロイドコンジュゲートの使用の
後に物理的顕色剤による処理を組み合わせると、極めて
簡素化してはいるが感受性が高く、操作速度が許容可能
（総測定法時間約６０）で結果を視覚的に読み取ること
のできる免疫測定法となることを示している。このよう
な結果は、従来可能なものではなかった。例えばＯｒｔ
ｈｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ社に譲渡
された欧州特許出願ＥＰ第２５０，１３７号および第２
５８，９６３号明細書では、プラスチック製の透明な表
面で金コロイドコンジュゲートを独占的に用いた測定
は、免疫反応の視覚的検出には不十分であったと記して
いる。また驚くべきことに、重合材料および二酸化チタ
ンなどの物質の混合物から得た不透明な白色のプラスチ
ック支持体、小さな直径（１〜１８ナノメートル）の金
コロイド微粒子に基づくコンジュゲート、および物理現
像剤との組合せにより、「その場」での極めて適切な視
覚化が、リガンドおよびリガンド結合パートナーの間の
多くの免疫性反応について行われるであろう。バラ色の
信号は、金コロイドにより反応表面に産出され、これは
銀イオンに基づく物理的顕色剤と共に短時間のインキュ
ベーションを追加して増幅される。この信号の増幅は、
非常に対比的な金属的な薄黒い色の形成によるもので、
これは金微粒子が詳細には免疫反応により特異的にプラ
スチックと連結した時に表面化し、銀イオンの相当金属
への還元を誘導し、金微粒子の周辺に比例的および制御
された様式で沈殿する。この増幅により反応の視覚化が
可能性になるのは、検体中のリガンド濃度が極めて低い
場合である。従って前記の過程から得た感度および特異
性の程度は、従来の酵素免疫技術（ＥＬＩＳＡ）の件で
報告したものと同様である。

【００１４】一般に、免疫測定法で液体検体中の既知の
病原体に対する（血清学的診断）抗体（前記のリガン
ド）の検出を意図したものは、本発明で説明する原理を
用いて現像することのできるいくつかの手法である。例
えばエンベロープｇｐ１２０およびｇｐ４１抗原を代表
する組換え蛋白の混合物、およびヒト免疫不全ウイルス
（ＨＩＶ‐１）のコアｇａｇ２４というキューバ国ハバ
ナのＧｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙセンターの産出したもの
を使用し、著者らは血清学的に要請な対象の検体におけ
るＨＩＶ‐１に対するＩｇＧ抗体の血清学的検出を可能
にする「サンドイッチ」形式を開発した。前記の組換え
蛋白の調製は既知の技術であるため本明細書には説明し
ない。前記の組換え蛋白の最小量を、滑り台の形状をし
たポリスチレンの不透明な白色の支持体の、境界の定ま
った円い光沢のある領域にコーティングすることは可能
である。この前記のプラスチック支持体は、先に述べた
様に調製して乳白光色および白色を得、ガンマ放射線照
射を用いて等質的に活性化し、異なる大きさおよび構造
の様々な分子をコーティングする効率を上げることがで
きる。重合プラスチック構造のガンマ放射線照射の過程
による活性化も、既知の技術であり、詳細な説明を必要
としないものである。これらの型の新規な血清学的免疫
測定法は、その他の伝染性の薬剤、例えばＴｏｘｏｐｌ
ａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉに対するＩｇＧ、ＩｇＡ、およ
びＩｇＭ、風疹に対するＩｇＧおよびＩｇＭ、サイトメ
ガロウィルスに対するＩｇＧおよびＩｇＭ、Ｌｅｐｔｏ
ｓｐｉｒａに対するＩｇＧおよびＩｇＭ、Ｃ型肝炎ウィ
ルスに対するＩｇＧ、Ｂ型肝炎ウィルスに対するＩｇ
Ｇ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍに対するＩ
ｇＧおよびＩｇＭ等を調製することもできる。

【００１５】前記の全ての場合、金コロイドの粒子の直
接的なまたは間接的なコンジュゲートおよび前記の免疫
グロブリンの特異的結合パートナーは、免疫反応の標識
に使用する。このような結合パートナーは、ＩｇＧ、Ｉ
ｇＡまたはＩｇＭ、蛋白Ａ、蛋白Ｇ、または他のあらゆ
る免疫グロブリン−特異性の結合パートナーに特異性の
モノクローナルまたはポリクローナルの抗体であること
ができる。本発明をＨＩＶ−１に対するＩｇＧ抗体の血
清学的検出に応用する詳細な例において、用いた抱合体
は、金コロイドの粒子および組換え蛋白Ａを連結して構
築した。組換え蛋白Ａは、キューバ国ハバナのＧｅｎｅ
ｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙセンターが産生し、その調製法は既知
のものである。従って詳細な説明は不必要であると考え
られた。この試薬はリガンドの中で、いくつかの免疫グ
ロブリンのＦｃ領域を特異的に認識し、結合することの
できるもののうち、ヒトＩｇＧ（Ｒｏｍａｎｏら著Ｉｍ
ｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １４：７１１，１９７７
年）である。血清学的免疫測定法として言及した例とは
無関係に、別の「サンドイッチ」型の測定法を準備をす
ることが可能であるが、その場合抗原の代りにモノクロ
ーナルおよびポリクローナル抗体が前記のプラスチック
反応表面にコーティングされる。この方法では様々な特
異的な多エピトープ抗原（前記のリガンド）を液体検体
において検出することができる（例えばＨＢｓ抗原、サ
イトメガロウイルス、ロタウイルス、単純ヘルペスＩお
よびII、クラミジア、血液リポ蛋白等）。このような場
合、金コロイド粒子は他のモノクローナルおよびポリク
ローナル抗体で、抗原の異なるまたは類似のエピトープ
を同定するものと抱合体し、この抗原は、プラスチック
表面をコーティングするリガンド結合パートナーによっ
て「獲得」されていたものである。この測定法の最終段
階、例えば物理現像薬による信号の増幅は、前記に説明
したものと同様である。

【００１６】先行する方法に優る本発明の別の利点は、
測定法に使用しなければならない検体の量が非常に少な
いことである。プラスチック支持体における円い境界の
定まった反応領域の大きさは、これを直径僅か２０〜３
０マイクロメートルの希釈した血液、血漿、血清、尿そ
の他を、必要な使用量とすることができる。本発明者
は、直径せいぜい７ｍｍの境界の定まった領域でさえも
反応が容易に視覚化でき、「サンドイッチ」型の測定に
おいて必要な感度レベルに達していることを発見した。
本発明では金コロイドを使用しているが、驚くべきこと
に金コロイドの直径１から１８ナノメートルの間のもの
から調製した抱合体を用い、これを最適の吸光度値であ
る波長５２０〜５４０ｎｍにおける１に希釈し、（２０
〜３０マイクロリットル）に当たる少量の検体を採取
し、および室温で検体（５〜３０分）、抱合体（５〜３
０分）の短時間のインキュベーションを行うと、物理現
像薬（５〜１５分）により十分な高感度レベルを得た。
理想的には、最良の物理現像薬は軽度に鈍感な型の１つ
としてＪａｎｓｓｅｎに譲渡された欧州特許出願ＥＰ第
２９，３９７号明細書に説明のあるものである。前記に
述べた例において、この測定の終了は、反応領域に透明
な溶液中で安定させた銀イオンを含む試薬Ａ、および同
様に透明な溶液中においてそれ自身に顕色剤を含む試薬
Ｂの等部混合物を塗布することによった。プラスチック
表面に金の金属粒子が存在しない時は、試薬ＡおよびＢ
の混合物は長時間におよんで環境光の下でその透明度を
保持する。したがって反応領域で発色は起こらないであ
ろう。

【００１７】本発明で説明する過程は、多数のエピトー
プが存在しない（例えば薬剤、ホルモン、化合物等によ
る）ために「サンドイッチ」型の形状を開発することが
できない場合に適合させることができる。そのような状
況では競合測定法を開発することができ、即ちこれはプ
ラスチック支持体を特異的リガンド結合パートナー（例
えばモノクローナルまたはポリクローナル抗体等）でコ
ーティングし、リガンドを含んでいるであろう検体を、
反応領域、および同時にこのようなリガンドおよび金コ
ロイドの抱合体と接触するように位置させるというもの
である。 本発明の対象である過程により、予めコーテ
ィングした不透明な白色のプラスチック支持体、金コロ
イドの抱合体の入ったバイアル、物理現像薬の調製用の
溶液の入ったバイアル、必要な希釈剤および洗浄用緩衝
液の入ったフラスコ、真の陽性および陰性コントロール
の入ったバイアル、指示書および付属材料（スペアーの
バイアル、使い捨てピペット等）を含む診断／検出用キ
ットとして包装できる免疫測定法を生み出すことができ
る。このプラスチック支持体の形状は、様々な要求、例
えば多重検定（いくつかの反応領域のある滑り台状の支
持体）、または単回−検定測定法などに適合させること
ができる。これに加え本発明は、十分な器具の使用との
組み合わせにより濃度計による読み取り、または前記の
金属物質に特異的な検出器の使用に基づく定量的測定法
の開発に応用することができる。

【００１８】例 下記の例は、本発明を例示する方法として理解すべきで
あり、その適用上の立案および範囲を何ら制限するもの
ではないと解釈されるべきである。 例１：金コロイド溶液の調製 金コロイド溶液と接触する全てのガラス表面、またはそ
の調製用の成分を、クロロホルム（Ｆｌｕｋａ）中に２
％ジメチルクロロシラン（Ｍｅｒｃｋ）を含む溶液中に
２０分間液浸したのち無水エタノールおよび蒸留水で繰
り返し洗浄することによりシラン化しておかなければな
らない。ミリ−Ｑ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＩｎｃ．）水で
最終容積が１リットルとなるように調製した１％塩化金
（Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液を、１０００℃で１０分間加熱
する。クエン酸３ナトリウム物および１％タンニン酸の
混合物４０ｍｌを、還元剤として反応物に添加する。約
５〜１０分の沸騰後、金コロイド溶液の形成が起こり、
これは色彩が連続的に変化することによって示される。
その後反応物を室温でゆっくりと冷却する。このような
条件下で産生した金コロイド粒子の平均直径は１０〜１
５ナノメートルの間で変動し、単分散性および均質性を
Ｆｏｒｍｖａｒ炭素膜と共に親水性メッシュを用いる透
過型電子顕微鏡（１００ｋＶ、５０，０００×）を使っ
て検討した。コロイド状溶液のｐＨは、０．１Ｍ Ｋ₂
ＣＯ₃ の添加によって調節する。組換えプロテインＡ
（キューバのハバナの遺伝子操作およびバイオテクノロ
ジーセンターによって製造）との接着のためには、ｐＨ
値を６．０〜６．５の範囲に調節する。ポリクローナル
抗体を結合する場合はｐＨ範囲は７．０〜７．５としな
ければならない。モノクローナル抗体、抗原、またはそ
の他の型のリガンドの場合には、特有の分子それぞれの
等電点を考慮するべきである。一般的には、コロイド状
懸濁液の光学密度は５２０〜５４０ナノメートルの波長
で測定する。

【００１９】例２：金コロイドに対するリガンドの結合 手順１− 組換えプロテインＡの吸着による結合 無塩の組換えプロテインＡをＮａＣｌの０．００５Ｍ溶
液で希釈し、１ｍｇ／ｍｌの濃度にした。「金の数」す
なわちコロイド１００ｍｌを安定させるために必要なプ
ロテインＡの量を、一定容積のコロイド状懸濁液中で蛋
白を順次希釈することによって検討した。組換えプロテ
インＡの最適濃度は、１リットルの金コロイドを安定さ
せるのに必要な最小濃度に１０％の超過を加えたものと
して計算した。安定化した金コロイド各１リットルにＰ
ＥＧ２０，０００（Ｆｌｕｋａ）を最終１％となるよう
に添加し、５％グリセロール（Ｆｌｕｋａ）勾配中で、
３５，０００×Ｇで４５分間、４℃で遠心分離した。上
清を除去し、沈澱を５％グリセロール勾配中で２度洗浄
し、出発時の金コロイド濃度に対し１：１０の比で懸濁
し、０．４５ｍ膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でろ過した。
結合物の最終濃度を、ＯＤが１となるように（５４０ナ
ノメートルの波長）、１％ＲＩＡグレードのウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ；ＢＤＩＩ）および０．０５Ｍアジ化
ナトリウム（Ｍｅｒｃｋ）を含有する０．１Ｍリン酸緩
衝液ｐＨ７．４を用いて調節した。懸濁液を２〜８０℃
で保存した。同様な吸着による結合の工程を、モノクロ
ーナル抗体やウイルスの抗原等のような等電点が既知で
ある他のリガンドについて開発した。 手順２―ポリクローナル抗体の共有結合 例１に記載の条件に従って生成したｐＨ６．０の金コロ
イド溶液１リットルに、蒸留水１０ｍｌに予め希釈した
ＲＩＡグレードのＢＳＡ１ｇを添加した。室温で２時間
撹拌後、溶液を０．２ｍ膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用
いてろ過し、４℃で４５分間、３５，０００×Ｇで遠心
分離した。上清を除去し、沈澱を、遠心分離と同様の条
件を用いて蒸留水で洗浄した。Ｏ．Ｄ．を１に調節した
（５２０〜５４０ナノメートルの波長）。ＢＳＡと金コ
ロイドとの結合物の各１００ｍｌに、グルタルアルデヒ
ドを最終１％（ｗ／ｖ）となるように添加し、室温で２
時間混合した。活性化した粒子を、精製したポリクロー
ナル抗体１ｍｇを含有するリン酸緩衝液ｐＨ７．４で、
２〜５０℃で一晩インキュベートし、共有結合をホウ酸
ナトリウム水和物（Ａｌｄｒｉｃｈ）１ｍｇで安定し
た。３０分間撹拌することによりインキュベートした
後、ＢＳＡ−ｇｌｙｃｉｎｅ含有緩衝溶液５ｍｌｐＨ
８．０を添加し、混合物を５，０００×Ｇで４５分間遠
心分離した後、０．１Ｍ リン酸緩衝液（ＰＢＳ）ｐＨ
８．０で２回洗浄した。最終沈殿物を、０．０５Ｍ ト
リエタノールアミン、０．２％ＢＳＡ、および０．１％
アジ化ナトリウムを含むＰＢＳに懸濁しＯ．Ｄ．を５に
調節し（５４０ナノメートルの波長）、２〜４０℃の間
で保存した。

【００２０】例３：物理現像薬の調製 手順１−環境光に対し感受性を有する物理現像薬の調製 Ｄａｎｓｃｈｅｒによって記載されたもの（Ｈｉｓｔｏ
ｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３１、９３８〜９４４、
１９８３年）と同様の原理に従う。溶液Ａを、脱イオン
水ｌ００ｍｌの容積中に、次の成分を添加することによ
り調製する。 −クエン酸３ナトリウム ２．５５ｇ −クエン酸 ２．３５ｇ −ヒドロキノン ０．８５ｇ 溶液Ｂを、乳酸銀０．１１ｇを添加することによって、
使用直前に、注意深く光から保護して、脱イオン蒸留水
ｌ００ｍｌの容積に調製する。物理現像薬は、環境光か
ら保護した条件で溶液ＡおよびＢ双方の全量を混合する
ことによって調製する。リガンド‐リガンド結合パート
ナー免疫反応の存在により表面に結合した金コロイド粒
子を含有する、試験（例を参照のこと）に使用する全て
の不透明プラスチック製白色スライドを、物理現像薬へ
１０分間浸した。小さい金属粒子の存在下に、顕色溶液
の銀イオンは相当する金属へと還元され、暗黒色の金属
沈殿物が生成する。この信号の増幅効果はコントラスト
をかなり強め、それ故この方法の検出感度が増強する。 手順２−環境光に対し感受性を有さない物理現像薬系の
調製 Ｊａｎｓｓｅｎ（ＥＰ２９，３９７）に記載のものと同
様な原理に従う。溶液Ａを、下記の成分を用い、脱イオ
ン蒸留水１００ｍｌの容積中に調製する。 −イミダゾール（ＢＤＨ） ６ｇ −蟻酸ナトリウム（ＢＤＨ） ０．８５ｇ −硝酸銀（Ｍｅｒｃｋ） ０．１８ｇ 溶液の最終ｐＨは８．０としなければならない。溶液Ｂ
を、下記の成分を用い、脱イオン蒸留水１００ｍｌの容
積中に調製する。 −イミダゾール（ＢＤＨ） ２ｇ −ヒドロキノン（ＢＤＨ） １．５ｇ −亜硫酸ナトリウム（ＢＤＨ）１ｇ −蟻酸（ＢＤＨ） ２．５ｍｌ 溶液の最終ｐＨは５．０としなければならない。双方の
溶液を、２〜４℃の間で別々に保存し、１２ケ月までの
間それらの透明度および環境光に対する安定性を維持す
る。物理現像薬の調製は、その使用直前に行う。等量の
ＡおよびＢを、室光および室温の条件の下に、前記の例
のプラスチック製支持体の円上の境界を有する反応領域
を覆うのに十分な最終容積となるように混合し、室温で
１０分間インキュベートした。小さい金属粒子の存在下
に、顕色溶液の銀イオンは相当する金属へと還元され、
周囲の金粒子を核として暗黒色の金属沈殿物が生成す
る。この信号の増幅効果は非特異的なバックグラウンド
効果を示すことなくコントラストをかなり強め、それ故
高いレベルの感度を有する方法となる。 例４：スライド様プラスチック製支持体の調製 手順１―不透明な白色ポリスチレン支持体 顆粒状のポリスチレン（ＢＡＳＦ社１５８Ｋ、低密度、
結晶グレード）

【００２１】例４：スライド様プラスチック製支持体の
調製 手順１―不透明な白色ポリスチレン支持体 顆粒状のポリスチレン（ＢＡＳＦ社１５８Ｋ、低密度、
結晶グレード）約２５ｋｇを、二酸化チタン１０〜１０
０ｇおよびステアリン酸亜鉛１〜２０ｇと混合しホモジ
ナイズする。鋳造工程を経て、顕微鏡用スライドと同様
の形態を有し、多数の（８〜１２）円形の境界で区切っ
た（直径７〜９ｍｍ）浅い、表面を研磨したウェル（反
応領域）を有する、不透明で白色の使い捨てプラスチッ
ク製支持体を得る（図１および図２参照のこと）。前記
の支持体を、合計０．１〜１．０メガＲＡＤの線量のガ
ンマ放射線照射によって活性化し、室温で、５０〜７０
％の相対湿度下に、反応領域を損傷から十分に保護して
保存する 手順２．−不透明な白色ポリアミド支持体 顆粒状のポリアミド（ＮＹＬＯＮ−６６）約２５ｋｇ
を、二酸化チタン１０〜１００ｇと混合し機械的にホモ
ジナイズする。鋳造工程を経て、バイアルのねじぶたに
接着させた細片の形態の、不透明で白色の使い捨てプラ
スチック製支持体を得る。前記の支持体を、合計０．１
〜１．０メガＲＡＤの線量のガンマ放射線照射によって
活性化し、室温で、５０〜７０％の相対湿度下に、反応
領域を損傷から十分に保護して保存する

【００２２】例５． ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩ
Ｖ−１）に対する抗体の検出用の測定法 手順１―不動化したリガンド結合パートナーを有するプ
ラスチック製支持体の調製 例４の手順１に記載した支持体を用い（円形の境界で区
切った反応領域１２個を有するスライド様の支持体：図
１参照）、浅いウェルを、ＨＩＶ−１のエンベロープｇ
ｐ１２０およびｇｐ４１蛋白、およびコアｇａｇ２４蛋
白の抗原性領域を表す組換え蛋白の混合物によって感作
する（組換え蛋白は、キューバのハバナの遺伝子操作お
よびバイオテクノロジーセンターで、Ｅ．ｃｏｌｉ内で
産生する）。この組換え蛋白を、炭酸塩−重炭酸塩緩衝
液ｐＨ８．０で希釈する。各ウェルを、１〜２０ｇ／ｍ
ｌの範囲の濃度の混合物５０ｌで、３７℃で３時間コー
トする。この支持体をＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０および０．１％アジ化ナトリウムで洗浄し、過剰の非
吸着蛋白を除去し、乾燥し、乾燥剤で湿度から保護して
２〜４℃の間で保存する。 手順２―検体の調製 ５４５検体を試験したが、その内訳は下記の通りであ
る。 − 酵素免疫測定法（ＵＭＥＬＩＳＡ、ＴｅｃｎｏＳＵ
ＭＡ、ハバナ、キューバ、および、ＥＬＩＳＡ ＲＥＣ
ＶＩＨ、Ｈｅｂｅｒ Ｂｉｏｔｅｃ Ｓ．Ａ．、ハバ
ナ、キューバ）および確認試験（ウェスタンブロット、
Ｄｕｐｏｎｔ ｄｅＮｅｍｏｕｒｓ、ＤＡＶＩＨ）によ
りすでに特性を分析してある、ＨＩＶ‐１陽性者の１５
０検体の総血液検体。 − 前記の酵素免疫的なスクリーニング法によって、Ｈ
ＩＶ−１の抗体に対し１９８検体が陰性、２検体が陽性
とすでに分類されている、献血者からの２００検体の血
清検体。この２陽性検体は、ウェスタンブロットによっ
て後に偽陽性であることを確認した。 − 病院の臨床検査室を訪れた患者の１９５検体の血清
検体。これらのうち、前記の酵素免疫的なスクリーニン
グ法によって、１９３検体は陰性、２検体は陽性と分類
された。この２陽性検体は、ウェスタンブロットによっ
て後に偽陽性であることを確認した。 各検体を、０．１Ｍ ＰＢＳ、０．０５％Ｍ Ｔｗｅｅ
ｎ２０、０．１％アジ化ナトリウム、および０．５％ジ
エタノールアミンを含有する希釈用緩衝液で１：１０に
希釈した。 手順３―測定の実施（図４参照） １）各希釈した検体を、例４の手順１に記載のように調
製した１２ウェルのポリスチレンプラスチック製スライ
ドの反応領域に、２０ｌ容積を添加し、室温で２０分間
インキュベーションした。 ２）スライドを蒸留水で簡単に洗浄した後、ＰＢＳ−Ｔ
ｗｅｅｎ２０で１分間洗浄し、最終的に過剰の液体をろ
過紙を使って除去した。 ３）各反応領域を、例２の手順１に詳述のように調製し
た組換えプロテインＡと単分散性の金コロイド（１５ｎ
ｍ）との接合物２０ｌで覆い、室温で２０分間インキュ
ベーションした。 ４）過剰の試薬を、２）に記載したように洗浄すること
によって除去した。 ５）測定法の次の段階では、反応領域を、例３の手順２
に記載した方法に従い使用直前に調製した物理現像薬２
０１と１０分間インキュベーションした。 ６）プラスチック製スライドを、蒸留水で簡単に洗浄
し、乾燥し、結果の読みとりを単純な視覚検査により実
施した。陽性反応の場合、円形領域は金属的な暗黒色に
変化し、信号強度は検体中に存在する特異的抗ＨＩＶ‐
１抗体の濃度に従って変化した。陰性の場合、反応領域
は白色ままであった。 手順４．−感度および特異性試験 ＨＩＶ−１に対するＩｇＧ抗体についての、総血液検体および血清検体のスクリ ーニング 由来 ｎ 血清陽性 血清陰性 感受性 特異性 Sanatorio S.V.* 150 150 0 100 ％ − 血液銀行** 200 2(FP) 198 − 99 ％C.Garcia 病院*** 195 2(FP) 193 − 98 ％ * キューバのハバナの、血清陽性者（第IIおよび第III
群）およびＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ関連合併症患者（第
IV群）の検体。 ** キューバのハバナのＭａｒｉａｎａｏ血液銀行から
の、血清陰性である献血者の検体。 *** キューバのハバナのＣｉｒａ Ｇａｒｃｉａ病院の
臨床検査室において評価した未分類の検体。 （ＦＰ）：本発明の目的の免疫測定法、および従来のス
クリーニング法（ＵＭＥＬＩＳＡおよびＲＥＣＶＩＨ）
によって偽陽性と検出された検体。ウェスタンブロット
によってこれらの検体を偽陽性と確認した。

【００２３】例６．Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉ
ｉに対するＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡ抗体の同時検
出のための測定法 手順１．−不動化したリガンド結合パートナーを有する
プラスチック製支持体の調製 支持体を例４の手順１に従って使用した（３ウェルを有
する細片状の形態；図２参照）。ＲＨ株を接種したＢＡ
ＬＢ／ｃマウスの腹水から得たＴｏｘｏｐｌａｓｍａ
ｇｏｎｄｉｉの栄養型の膜および細胞質蛋白を含有する
溶解物を抗原として使用する以外は、支持体を例５の手
順１に記載したものと同様の条件で感作した。 手順２．−検体の調製 証明する目的で、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ
に対して特異的なＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡ抗体の
存在を、既に特性を分析したヒト血清検体について参照
血清学的方法（間接的な免疫蛍光、ＩＩＦ）により試験
した。この検体は、ＩＩＦ法に必要な条件と同じ条件 − ＩｇＧ抗体用には１：３２の初期希釈 − ＩｇＭ抗体用には１：８の初期希釈 − ＩｇＡ抗体用には１：４の初期希釈 でＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で既に希釈してあった。後者
の２つの場合においては、この検体を適切な量の乾燥し
たプロテインＡ−セファロースゲルに前吸着することに
より、特異的ＩｇＧ抗体の競合効果を排除した。 手順３．−測定の実施 測定は基本的に例５の手順３に記載した段階に従って実
施するが、例外として、（ａ）手順２に記載したよう
に、１つの同じ希釈検体を連続して３回希釈し、境界で
区切った３つの円形領域を有するプラスチック製支持体
の別々のウェル中でインキュベーションした（図２参
照）。 （ｂ）免疫グロブリンの特異的な型それぞれを示すため
に、異なる接合物 金コロイド（１５ｎｍ）−抗ヒトＩｇＧ（ヒツジ） 金コロイド（１５ｎｍ）−抗ヒトＩｇＭ（ヒツジ） 金コロイド（１５ｎｍ）−抗ヒトＩｇＡ（ヒツジ） を用いた。ヒツジ抗体は、親和性クロマトグラフィーに
よって精製したものであり、キューバのハバナの遺伝子
操作およびバイオテクノロジーセンターから入手し、カ
ップリング方法は共有結合について述べた例２に記載の
方法であった。という事実があった。 手順４．−結果の分析 適切に希釈した分析した検体が、境界で区切った反応領
域中で金属的な暗黒色を発した場合、これらの結果は所
定の抗体型に関して陽性であると考えた。境界で区切っ
た反応領域が白色のままであった場合、またはそれぞれ
の免疫グロブリンの型について希釈した陽性対照とイン
キュベーションした比較用の細片よりも明らかに染色が
弱かった場合、結果は陰性であると考えた。 １．血清検体の免疫グロブリン力価（Ｇ，Ｍ、およびＡ）の測定臨床症状* ｎ ＩｇＧ ＩｇＭ ＩｇＡ 解釈 妊娠 3 1:32 - 1:16 感染再発 1:32 1:8 - 亜急性の初期感染 1:256 1:32 1:16 急性の初期感染 流産 3 - 1:8 1:8 急性の初期感染 1:32 1:16 - 亜急性の初期感染 1:256 1:16 1:16 急性の初期感染 目の障害 1:32 1:8 1:8 急性の初期感染 1:32 1:8 1:8 急性の初期感染 1:128 - 1:16 再発または再感染 1:128 1:8 1:64 急性の初期感染 1:256 1:16 - 亜急性の初期感染 ＊Ｖａｎ ＫｎａｐｅｎおよびＰａｎｇｇａｂｅａｎに
よる解釈の判定基準（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．６：５４５〜５４７、１９７７）。 ２．臨床像に従って分類した個体の血清のスクリーニング結果臨床群 ｎ 陽性（％） 陰性（％） 眼の障害 5 4(80 ％) 1(20％) 全般的な障害 8 8(100％) -(-) Genicol./obst.障害 42 28(66.6 ％) 14(33.4％) 症状なし 79 50(63.3 ％) 29(36.7％) 合計 134 90(67.1 ％) 44(32.9％) ３. 従来の参照ＩＩＦ法に関する感受性および特異性の
値 感受性（Ｓ）−−−−−−−−−９４．２％ 特異性（ＳＰ）−−−−−−−−１００％ 陽性予測値（ＰＰＶ）−−−−−１００％ Ｓ＝Ａ×１００／Ａ＋Ｂ ＳＰ＝Ｄ×１００／Ｃ＋Ｄ ＰＰＶ＝Ａ×１００／Ａ＋Ｃ に従って実施した。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係るイムノアッセイ法に用いる及び同
法に用いるキット用白色不透明なプラスチック支持体の
模式図である。

【図２】本発明に係る白色不透明なプラスチック支持体
の別の態様を示す模式図である。

【図３】本発明に係るキットに用いられる液体試薬を有
する容器である。

【図４】本発明に係るイムノアッセイ法の手順を模式的
に示したものである。

フロントページの続き (72)発明者 リセット デ ラ シー．レスカイレ ブ イトラゴ キューバ国ハバナ シティー，プラヤ，ス トリート 184，3112，アパートメント 14

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （複数の）リガンドを検出するための視
   覚的イムノアッセイ法であって、 ａ． 磨かれて境界を定められた反応表面を（複数の）
   リガンド結合パートナーでコーティングしたものを有す
   るプラスチック性の不透明な白色支持体を提供し、 ｂ． 前記の境界を定められた反応表面を（複数の）リ
   ガンドを有する検体と接触させ、且つ同時にまたは連続
   的に金コロイドとリガンド若しくはリガンド結合パート
   ナーの直接的または間接的抱合体と接触させ、 ｃ． 免疫反応が起きたプラスチック表面を、銀イオン
   を含む物理的現像薬を生成し、金コロイド粒子の最終的
   な検出を増幅することができる液体試薬混合物と接触さ
   せ、 ｄ． 前記の境界を定めた反応表面を観察して、検体中
   に金コロイドとリガンドが含まれていることを示す着色
   沈殿の有無を検査する、工程を含んで成る、視覚的イム
   ノアッセイ法。
2. 【請求項２】 工程（ａ）のリガンド結合パートナーが
   １個の抗原または複数の抗原であり、 工程（ｂ）の検
   体中のリガンドがプラスチック支持体にコーティングし
   た（複数の）抗原に特異的な１個の抗体または抗体混合
   物であり、 工程（ｂ）の抱合体が金コロイドで直接または間接的に
   標識された抗体または抗体混合物である、請求項１に記
   載のイムノアッセイ法。
3. 【請求項３】 工程（ａ）のリガンド結合パートナーが
   １個の抗体または抗体混合物であり、 工程（ｂ）の検
   体中のリガンドが、プラスチック支持体にコーティング
   された抗体または抗体混合物によって特異的に認識され
   る単一または複合エピトープ部位を有する１個の抗原ま
   たは複数の抗原であり、 工程（ｂ）の抱合体が金コロイドで直接または間接的に
   標識された抗原に特異的な１個の抗体または抗体混合物
   であり、 工程（ｂ）の抗体が（ａ）の抗体と同じまたは異なるエ
   ピトープ部位を認識する、請求項１に記載のイムノアッ
   セイ法。
4. 【請求項４】 工程（ａ）のリガンド結合パートナーが
   抗原であり、 工程（ｂ）の検体中のリガンドが、プラスチック支持体
   にコーティングされた抗原に特異的な抗体または抗体混
   合物であり、 工程（ｂ）の抱合体が金コロイドで直接または間接的に
   標識された抗体または抗体混合物であり、これが検体中
   の抗体または抗体混合物と競合し且つこれが検体と同時
   に適用される、請求項１に記載のイムノアッセイ法。
5. 【請求項５】 工程（ａ）のリガンド結合パートナーが
   抗体または抗体混合物であり、 工程（ｂ）の検体中のリガンドがプラスチック支持体に
   コーティングされた抗体または抗体混合物によって特異
   的に認識される抗原または複数の抗原であり、 工程（ｂ）の抱合体が金コロイドで直接または間接的に
   標識された１個の抗原または複数の抗原であり、これが
   検体中の抗原と競合し且つこれが検体と同時に適用され
   る、請求項１に記載のイムノアッセイ法。
6. 【請求項６】 用いられる金コロイド懸濁液の５２０〜
   ５４０ｎｍで測定した吸光度が０．５〜１．１５であ
   る、請求項１に記載のイムノアッセイ法。
7. 【請求項７】 金コロイド粒子の直径が１〜１８ｎｍの
   範囲である、請求項１に記載のイムノアッセイ法。
8. 【請求項８】 白色不透明なプラスチック支持体を、ポ
   リ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ
   アミド、および他の類似の硬質表面の現像に従来から用
   いられている材料のような様々なポリマー性物質の混合
   物を基剤として調製し、コーティング特性に影響を与え
   る各種の物理的および化学的修飾手続きを施すまたは施
   さない、請求項１に記載のイムノアッセイ法。
9. 【請求項９】 請求項１に記載の流動性検体のリガンド
   を検出するための視覚的イムノアッセイ法に用いられる
   キットであって、 １個のリガンド結合パートナーまたは複数のパートナー
   をコーティングした白色不透明なプラスチック支持体で
   あって、このコーティングしたプラスチック支持体に検
   体を接触させるとき、検体中の１個のリガンドまたは複
   数のリガンドと特異的に反応するものと、 アッセイの種類によって同時にまたは連続的に適用され
   る金コロイドと直接または間接的に抱合した１個のリガ
   ンドまたはリガンド結合パートナーを有し且つ免疫反応
   を標識する容器と、 混合によって銀イオンを含む物理的現像薬を生じ、免疫
   反応の視覚的信号を増幅することができる液体試薬を有
   する容器と、を含んで成る、キット。