JP2601616B2 - 試験キツト - Google Patents

試験キツト

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JP2601616B2 JP5081149A JP8114993A JP2601616B2 JP 2601616 B2 JP2601616 B2 JP 2601616B2 JP 5081149 A JP5081149 A JP 5081149A JP 8114993 A JP8114993 A JP 8114993A JP 2601616 B2 JP2601616 B2 JP 2601616B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、結合剤及び対応する受体基質に
よつて生成した凝集物の、ブロツト・オーバレイ分析
（blot overlay assays）による検知及び／又は定量法
に関する。受体基質は普通水性試験試料中に含まれ、分
析の後の段階において固定化マトリツクスに吸着され及
び／又は共有的に結合せしめられる。固定化マトリツク
スの例は、ニトロセルロース（ＮＣ）フイルム（公知の
孔性の硝酸エステル化セルロースの薄い層）、ジアゾベ
ンジルオキシメチル（ＤＢＭ）−及びジアゾフエニルチ
オエーテル（ＤＰＴ）改変のセルロース紙、シアノーゲ
ンブロマイドで活性化された紙又は酢酸セルロース、及
びナイロンに基づく膜例えば Gene Screen及び Zetabin
d である。この後者は、製造中に多くの３級アミノ基を
導入することによつて改変したナイロンマトリツクス
（ナイロン６６として言及されるポリヘキサメチレンア
ジペート）である。該固定化マトリツクスは通常ブロツ
テイング媒体（blotting media）として言及される。
（参照、例えば J．M．Gershoni及び G．E．Pallade，A
nalytical Biochemistry，１３１，１〜１５（１９８
３））。
【０００２】ブロツト・オーバレイ分析は一般に２つの
異なる技術に分類できる： Ａ．サンドウイツチ式オーバレイ分析では、Ｂ（下記参
照）による固定化マトリツクスに、精製した又は富んだ
特異的結合剤を好ましくは小さいスポツトとして付け、
受体基質をこれに結合させてマトリツクスに固定化し、
続いてこれを検知する。これは特異的結合剤の特異性の
ために受体基質を複雑な試験試料例えば尿、血漿、血
清、他の体液、細胞を含まない翻訳系、細胞及び組織溶
解物などから分離することに、またこの手法を半定量及
び／又は定性（診断）分析、即ち所謂サンドウイツチ式
ブロツト・オーバレイ分析（ＳＢＯＡ）に使用すること
を可能にする。現在まで、比較的複雑な検知法だけが今
日使用されているから、ＳＢＯＡの実際的な価値は無視
されてきた。しかし本発明の具体例によれば、その検知
法は非常に単純化され、ＳＢＯＡの診断に対する興味は
増大する可能性がある。
【０００３】Ｂ．直接的なブロツト・オーバレイ分析に
おいては、「転移（transfer）」又は「ブロツテイング
（blotting）」として公知の方法により受体基質をブロ
ツテイング媒体に直接付ける。これを行なう文献から良
く知られた他の方法も存在する。例えば１μｌ程度（他
の量でもよい）の公知の又は未知の量の受体基質（精製
したもの又はしないもの）を含有する小滴を、ブロツテ
イング媒体上に点として適用して、受体基質をブロツテ
イング媒体に付着させる。そのような点状のブロツト
（blot）は種々の体液中の固定化された受体基質に対す
る特異的結合剤の存在の診断上の検知に潜在的に用いる
ことができる。受体基質が複雑な混合物の一部である場
合には、受体基質の同定を容易にするために、後者を種
々のクロマトグラフイー法例えば薄層クロマトグラフイ
ー法又は電気泳動法例えばポリアクリルアミドゲル中で
の方法、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）電気
泳動法、等電フオーカス法（isoelectric focusing）、
２−Ｄゲル電気泳動法、グラジエント・ゲル及び酸−尿
素ゲル電気泳動法、及び無変性ゲル電気泳動法で分離す
ることができる。核酸に対するようないくつかの場合に
は、寒天ゲルも使用できる。次いで電気泳動法で分割し
た成分（例えば蛋白質、ペプチド及び核酸）をキヤピラ
リー、真空又は電気的転移（或いはブロツテイング）に
よつて固定化マトリツクスに転移させる。続いて元の電
気泳動パターンを殆んど保持させながら、成分をブロツ
テイング媒体上に固定化させる。この完全なパターンは
公知の染色法例えばアミド・ブラツク及びクーマシー
（coomassie）青を用いて肉眼で見えるようにでき、問
題としている成分（受体基質）を検知する（更に見る）
ことができる。この時その位置は全電気泳動パターンと
関係づけられる。
【０００４】今まで使用された特異的結合剤のほとんど
は、受体基質の十分はつきりした領域へ結合する蛋白質
であつた。糖蛋白を検知するにはレクチンが使用され
る。ポリクローナル及びモノクローナル抗体は、その対
応する抗原又はハプテンを検知するために使用される
（例えばビオチン又はビオチニル化（biotynylated）Ｄ
ＮＡは、抗ＤＮＰを有するジニトロフエニル化蛋白上に
おいて抗ビオチン、ＤＮＰで検査される）。ブロツト・
オーバレイ分析は、抗体の特異性を試験するために及び
モノクローナル抗体の選別においてすでに広く使用され
ている。これら広く使用されている系のほかに、成分の
１つが固定化されている場合多くの他の蛋白−蛋白（例
えばカルモジユリン（calmodulin）又はアクチン（acti
n）結合蛋白）、或いは蛋白−配位体（例えばアビジン
（avidin）−ビオチン）相互作用も分析することができ
る。これらはＤＮＡ−蛋白及びＲＮＡ−蛋白相互作用、
受体−配位体相互作用、及び一般にいずれか他の、十分
に特異的な及び親和性の巨大分子−巨大分子相互作用を
含む。
【０００５】ブロツト・オーバレイ分析の本質的な部分
は、固定化された受体基質を見えるようにするために使
用される方法である。直接的及び間接的方法が存在す
る。検知の本質はマーカー、即ち放射性同位元素
（3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ又は125Ｉ）を利用し、続いて
自動放射線写真現像剤；不溶性の着色生成物又は蛍光色
素を形成することのできる酵素を用いるものである。直
接的な方法においては、マーカーが特異的結合剤に結合
する。間接的な方法では、それは第１の特異的結合剤に
対して特異的に結合することのできる巨大分子に結合す
る。後者が抗体である場合、巨大分子は蛋白質Ａ又は２
次抗体を有していてよい。アビジン・ビオチニル化西洋
ワサビペルオキシダーゼの複合体（ＡＢＣ）及び標識さ
れてないペルオキシダーゼの抗ペルオキシダーゼ（ＰＡ
Ｐ）を用いる方法のような工程の多い技術も抗体に対し
て使用できる。
【０００６】本発明の本質的な観点は、金属又は金属化
合物或いは金属又は金属化合物でコーテイングした核の
分散液を、ブロツト・オーバレイ法における視覚及び／
又は検知手段として利用する。本明細書で用いる如き
「コロイド状金属粒子」とは、粒子の分散液、随時金
属、金属化合物或いは金属又は金属化合物でコーテイン
グした核からなるゾルを包含する。
【０００７】コロイド状金属粒子は、次の技術的に公知
の方法、例えばコロイド状の金、銀又は鉄酸化物などの
製造法に従つて製造することができる。コロイド状金属
粒子は、技術的に公知の方法に従い、特異的に結合する
蛋白又は受体基質に或いは第１の特異的に結合する試剤
に対して特異的に結合する巨大分子例えば蛋白質Ａ、２
次抗体（１次抗体の場合）、又はストレプタビジン（st
reptavidin）及びアビジン（成分の１つをビオチニル化
する場合）に、元の結合活性のほとんどを保持したまま
で直接又は間接的に付着させることができる。ここにこ
の付着（attaching）とは、化学的又は物理的結合、例
えば共有結合、水素橋、極性引力及び吸着による結合と
して理解される。
【０００８】今回、受体基質が間接的に（Ａ参照）又は
直接に（Ｂ参照）付着せしめられたブロツテイング媒体
を、コロイド状金属粒子で標識された特異的結合剤の適
当な濃度と共に（直接的検知法）或いは最初に標識され
てない特異的結合剤と、次いで第１の特異的結合剤に特
異的に結合することのできるコロイド状金属粒子で標識
された巨大分子と共に（間接的検知法）保温する場合、
コロイド状金属粒子が特異的結合部位に蓄積し、驚くこ
とに用いたコロイド状金属粒子に特徴的な色として見え
るようになることが発見された。例えば金のような金属
を用いると桃色ないし暗赤色が、銀を用いると黄色ない
し褐／黒色が得られる。この色は裸眼で定性的に読むこ
とのできる或いは随時技術的に公知の分光学的方法例え
ば濃度計を用いて測定することのできる信号を生成す
る。
【０００９】コロイド状金属粒子の粒径は、好ましくは
３〜１００ｎｍ、更に好ましくは５〜５０ｎｍである。
【００１０】特異的結合剤に付着せしめうるコロイド状
金属粒子の例としては、金属、白金、金、銀及び銅、及
び金属化合物、ヨウ化銀、臭化銀、水和酸化銅、酸化
鉄、水酸化鉄又は水和酸化鉄、水酸化アルミニウム又は
水和酸化アルミニウム、水酸化クロム又は水和酸化クロ
ム、酸化バナジウム、硫化砒素、水酸化マンガン、硫化
鉛、硫化水銀、硫酸バリウム、及び二酸化チタンが記述
されている。上述の金属又金属化合物で被覆された核か
らなるコロイドが使用できることも公知である。これら
の粒子は金属又は金属化合物コロイドとして類似の性質
を有するが、寸法、密度及び金属含量は随時組合せるこ
とができる。一般に、特異的結合剤にその結合活性を破
壊することなしに結合することができ且つ裸眼で見るの
に十分なブロツト・オーバレイ分析での色強度を与える
すべてのコロイド状金属又は金属化合物は使用しうる。
好ましくはこれらの感度は金または銀で得られるものに
等しいか、それよりも優れているものがよい。
【００１１】今や特異的結合剤例えば抗体、レクチン、
蛋白Ａ、アビジン、及びその他、或いは更に受体蛋白例
えば抗原で表面が被覆されるコロイド金属粒子、特に金
ゾルのそれを用いることは、透過型及び掃引型電子顕微
鏡による多くの細胞化学的着色技術において良く確立さ
れている。金属で被覆された重合体からなるコロイド状
金属粒子を用いる例は、抗体に付着した時に透過型電子
顕微鏡に対して非常に有用なマーカーを与える鉄で被覆
されたデキストランである。しかしながらこれらの使用
は、このマーカーの典型的な電子不透明性（透過型電子
顕微鏡）或いは２次電子又は後方散乱１次電子を放射す
るその能力（掃査型電子顕微鏡）を利用する。
【００１２】コロイド金属粒子、特に金及び銀からなる
ものは、試料を見るために光学顕微鏡を用いる場合に、
そのようなコロイド状金属粒子の、組織スライドにおけ
る結合部位又は細胞表面における蓄積が見られるという
ことが示されて以来、光学顕微鏡による細胞化学的着色
技術に対するマーカーとしても使用されてきた。
【００１３】コロイド状金属粒子は、免疫学的成分、例
えば水性媒体中ハプテン、抗原及び抗体のある試験管内
での定量及び定性試験にも使用される。これらの技術
は、ゾル粒子免疫分析及び受動的金接合法（passive go
ld agglutination）（Geoghegan）と呼ばれている。
【００１４】受動的金接合技術は、金で標識された抗原
（金粒子１８〜２０ｎｍ）の、標識されてない抗体への
接合に基づき、そして接合してない金が赤色の流れをな
して壁面を流下するという標準的なミクロン力価セツト
を用いることを含む。この技術は、古典的な受動的接合
に同様であり、同じく敏感であり、金で標識された抗体
である逆接合（reverse agglutination）に対して能力
を有すると言われた。
【００１５】ゾル粒子免疫分析は２つの範ちゆうに分類
される。この第１は均一ゾル粒子分析と呼ばれ、抗体で
標識されたコロイド粒子の、免疫化学的２価又は多価抗
原による或いは担体蛋白に結合したハプテンによる接合
に基づく。この接合は空試験として緩衝剤を用いる比色
法によつて測定される如く色を減少させる。コロイド状
金属粒子の接合は試料からの遊離のハプテン分子によつ
て禁止されてよい。そのような方法はヨーロツパ特許第
０００７６５４号に記述されている。
【００１６】第２の種類のゾル粒子免疫分析は、放射線
免疫分析及び酵素免疫分析に類似の結合した／遊離のコ
ロイド状金属粒子共役体分離法に基づく。そのような方
法はヨーロツパ特許第０００７６５４号に記述されてい
る。１つのそのような方法は、サンドウイツチ式ゾル粒
子免疫分析（Sandwich Sol Particle Immunoassay（Ｓ
ＳＰＬＡ）と呼ばれ、サンドウイツチ式ＥＬＩＳＡ又は
固相サンドウイツチ式放射線免疫分析に同様である。Ｓ
ＳＰＬＡにおいて、典型的には決定すべき抗原に対する
抗体をミクロ滴定板（例えばポリスチレン製）の表面上
に吸着させる。適当な緩衝系に溶解した試料（抗原標準
物又は空試料）を抗体で被覆された井戸にピペツトで入
れ、適当に保温する。金で標識された抗体を添加し、反
応混合物を更に保温する。井戸を吸引し、洗浄して結合
してない共役体を除去する。最後に、結合した免疫錯体
を、均一にしたコロイド状金属粒子と一緒に離脱させ
る。得られる分散液の色の強度を視覚的に検査し或いは
金属濃度を比色計によつて測定する。視覚による検査法
（例えば分散された金の色）はより高い抗原濃度におい
てだけ使用することができる。
【００１７】ゾル粒子分析は、非免疫学的分析に対し
て、一般に「反応成分の相互に対する公知の結合親和性
を適用することにより、水性試験試料中の特異的結合蛋
白及び対応する結合しうる基質間の反応の１つ又はそれ
以上の成分を検知及び／又は定量する、すなわち該反応
の所望の成分を、粒子径が少くとも５ｍｍの金属、金属
化合物或いは金属又は金属化合物で被覆された重合体核
の水性分散液の粒子に直接又は間接的に結合させること
によつて得られる１つ又はそれ以上の標識された成分を
用い、これによつて反応中に又は適当な反応時間後、随
時結合した及び遊離の標識された成分の分離後に、技術
的に公知の方法に従つて金属及び／又は生成した金属含
有の集塊の物理的性質及び／又は性質を試験試料又は誘
導された画分の１つにおいて決定し、検知及び／又は定
量すべき成分を定性及び／又は定量する」分析に対して
有用であると記述されていることも特記すべきである。
【００１８】本発明は、ブロツト・オーバレイ分析法に
おけるマーカーとしてコロイド状金属粒子を用いること
に関する。この使用は全く新規であり、驚くことに使用
可能であることがわかつた。
【００１９】コロイド状金属粒子とは、金属、金属化合
物、或いは金属又は金属化合物で被覆された核の分散液
を含む。
【００２０】コロイド状金属粒子の、マーカーとしての
使用は、ブロツト・オーバレイ分析のすべての形態に当
てはまり、ブロツテイング媒体の表面において結合部位
に蓄積するコロイド金属粒子が、少くとも現存する技術
の非常に高感度のもの、例えば酵素に基づくブロツト・
オーバレイ分析と対比しうる感度を有して裸眼で直接見
えるようになるという利点をもたらす。本発明は、上述
の点が含まれないならば実際上の価値がないということ
が強調される。分析値が２次的酵素反応の必要なしに、
蛍光染料に対する自動放射線計法又は視覚系で、或いは
サンドウイツチ式ゾル粒子免疫分析における如く結合し
たコロイド状金属粒子の離脱、続く裸眼（低感度）、比
色計又はＣＲＡＡＳ（高感度）での測定で読みとること
ができるということは重要な利点である。また本発明の
最大の利点は、反応中に色が発現するから簡単であると
いうことである。これは所望の信号が生じた時に反応を
停止する、或いは予じめ決められた結果を固定された時
間限界内で得るために系を補正することを可能にする。
【００２１】金で標識された抗体の使用は、非常に感度
のよいと言われる免疫ペルオキシダーゼ法よりも非常に
簡単であり、それと同程度の感度を与える。本発明のこ
の簡単な分析法は、ブロツテイング媒体に結合した受体
基質に対する特異的結合剤、及び第１の特異的結合剤に
対するコロイド状金属粒子で標識された特異的結合剤の
存在を間接的に検知するための試験キツトに使用でき
る。特異的結合剤が抗体である場合、これはコロイド状
金属粒子で標識された２次抗体又は蛋白Ａであつてよ
い。これは非常に簡単な浸漬棒（dip stick）試験とし
て、例えば血清のような水性試験試料中の選んだ抗原に
対する抗体の存在を迅速に選別するためのスポツト・ブ
ロツト・オーバレイ免疫分析として使用できた。
【００２２】本方法は、 ｉ．受体基質の、ブロツテイング媒体として公知の固定
化マトリツクスへの次の方法のいずれかによる固定化、 ｉ.ｉ．随時電気泳動分離法を適用し且つ電気泳動媒体
からブロツテイング媒体への転移又はブロツテイング法
を適用し、そして続いてＢＳＡ、ゼラチン、ＰＥＧ又は
Ｔｗｅｅｎ２０の使用のような技術的に公知の方法に従
い、残存する蛋白結合部位を消去させた後、一般にブロ
ツテイングと呼ばれる直接的な結合及び／又は共有結合
をさせること、或いは ｉ.ii．ブロツテイング媒体を受体基質を含む水溶液と
接触させることによりブロツテイング媒体に固定化させ
るようになつた特異的結合剤によつて受体基質を結合せ
しめること。
【００２３】ii．ｉ）のブロツテイング媒体を、洗浄及
び空気乾燥後にある期間次のいずれかと接触させるこ
と、 ii.ｉ．適当な濃度のコロイド状金属粒子で標識された
特異的結合剤、或いは ii.ii．先ず適当な濃度の標識されてない特異的結合
剤、次いで標識されてない特異的結合剤に特異的なコロ
イド状金属で標識された蛋白。
【００２４】iii．ブロツテイング表面において結合し
たコロイド状金属粒子によつて生ずる着色信号及び特性
を裸眼で或いは濃度計のような技術的に公知の分光学的
技術を用いて読むこと、の連続的工程を含んでなる。
【００２５】また本発明は、反応の成分又はこの反応を
間接的に検知するために使用できる成分を、上述の如き
コロイド状金属粒子に結合させることによって得られた
コロイド状金属粒子で標識された成分及び他の試剤を含
有するブロツト・オーバレイ分析において、特異的結合
剤及び対応する受体基質間の反応の１つで直接的に又は
間接的に決定するのに用いるための試験キツトに関す
る。反応が免疫学的反応の場合には、サンドウイツチ式
ブロツト・オーバレイ分析（参照、実施例ＩＩＩ）に対
して、また選んだ抗原に対する血清中の抗体の存在の決
定（参照、実施例Ｉ）に対して試験キツトが使用でき
る。本発明の試験キツトは、特異的結合剤と対応する受
体基質との間の反応により形成される集塊の成分の１つ
を直接的又は間接的に検出するためのブロツト・オーバ
レイ分析の一般的方法に従って使用するための試験キツ
トであって、 （ａ） コロイド状金属粒子で標識された集塊の成分、
又は該集塊を検出するために使用されるコロイド状金属
粒子で標識された成分、 （ｂ） 物理的現像剤、及び （ｃ） 場合により他の試薬よりなる。 さらに、本発明
によれば、特異的結合剤と対応する受体基質との間の反
応により形成される集塊が、ブロツテイング媒体の表面
における反応部位に局在化した着色信号として可視化さ
れたブロツト・オーバレイ分析媒体であって、該集塊の
成分の１つ又は該集塊のための特異的結合剤が、これら
をコロイド状金属粒子に結合することにより得られる標
識された成分であることを特徴とするブロツト・オーバ
レイ分析媒体が提供される。
【００２６】本発明の随意の特徴は、ブロツト・オーバ
レイ分析の特徴として、ブロツテイング媒体の表面に結
合したコロイド状金属粒子の検知が、対応する金属に還
元できる物理的現像剤を適用することによつて間接的に
見る及び／又は高めることができるという事実を利用す
る。適当な物理的現像剤は例えば乳酸銀、硝酸銀などで
ある。例えば銀を物理的現像剤として用いる場合、反応
は最初に還元を接触する金属粒子の表面で起こり、続い
てこれを種にして自動触媒となる。この結果金属銀の蓄
積によつて黒い、非常にコントラストのきいた信号が生
成する。これは感度のかなりの増加をもたらす。光に鈍
感な銀沈殿物を得るためには、顕微鏡写真のプリントに
対して使用される安定化液でブロツトを定着しなければ
ならないということも発見された。
【００２７】物理的現像剤は、組織中の水に不溶な金
属、特に硫化金属を見るために多年に亘つて使用されて
きた（参照、Danscher，Histochemistry ７１，１〜１
６、１９８１）。硫化金属及び金属銀は金属イオンの還
元に触媒効果を示す。組織中のコロイド状金金属も物理
的現像剤で現像でき、またこれは元来の免疫金着色法よ
りも非常に優れた感度をもたらす免疫金／銀着色法の導
入に対する Holgate ら（J．Histochem．Cytochem．３
１，９３８〜９４４（１９８３））によつて開発された
ものである。
【００２８】本発明の随意の特徴の主たる利点は、ブロ
ツト・オーバレイ分析に対して存在するいずれか他の検
知法よりも優れた多大の感度を示すということにある。
これは、使用者が用いる試薬量を経済的にしたい時或い
は受体基質及び／又は特異的結合剤が非常に低量でしか
存在しない場合に使用することができる。
【００２９】本発明の更なる随意の特徴は、バツクグラ
ンドを減じ及び物理的現像剤の反応生成物の安定性を改
良する写真の定着剤を使用することである。
【００３０】次の実施例は本発明を例示するが、その範
囲を限定するものではない。
【００３１】
【実施例】実施例Ｉ 犬の脳のツブリン（tubulin）及びカルモジユリン（cal
modulin）に対する抗体を、免疫にしたウサギの血清中
の金で標識された２次抗体で間接的に示すための簡単な
スポツト・ブロツト・オーバレイ免疫分析。
【００３２】Ｉ．１．抗血清の製造 １.１．抗血清の増殖 緩衝剤（０.１Ｍ Pipes，ｐＨ６.９）１.０ｍｌ中の犬
の脳のツブリン（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから
抽出）１ｍｇ或いは電気泳動的に純粋な犬の脳のカルモ
ジユリン１ｍｇ（Ｈ2Ｏ中）を、完全なフロインド佐剤
（ＤＩＦＣＯ）１.０ｍｌと混合した。均一にした後、
白ウサギの背骨に沿つて５ケ所に抗原を皮下注射した。
４週間毎にブースター注射をした。不完全なフロインド
佐剤を用いる以外同一の方法で抗原を調製した。各ブー
スターから１週間後に、ウサギから採血し（±６０ｍｌ
の血液を採集）、血清を準備し、使用まで−２０℃下に
一部ずつ貯蔵した。
【００３３】１.２．コロイド状金で標識された２次抗
体 これは Janssen Life Science Products（２３４０ Bee
rse，Belgium）から購入した。コード番号：ＧＡＲ Ｇ
２０。これは２０ｎｍのコロイド状金粒子で標識された
ウサギのＩｇＧに対する親和性精製したヤギの抗体であ
る。
【００３４】抗原を含むスポツトを有するニトロセルロ
ース紙ストリツプの調製 ０.１Ｍ Pipes，１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2
（ｐＨ６.７５）中の純粋なツブリン或いはＨ2Ｏ中の純
粋なカルモジユリンの４倍の血清希釈物（初め２５０ｎ
ｇ／μｌ）の１０個の１μｌ小滴を、乾いたニトロセル
ロース・ストリツプ（６ｃｍ×０.６ｃｍ）上に１列に
スポツトした。このスポツトが乾燥した時（約５分
間）、ストリツプ上の残存する蛋白結合部位を、２０ｍ
Ｍ Tris 緩衝食塩水（ｐＨ８.２）中の５％の牛の血清
アルブミン（ＢＳＡ）の溶液と共に３０℃で３０分間保
温することによつて消去した。
【００３５】１.３．ツブリン及びカルモジユリン抗体
の検知のための試験法。金で標識された抗体を用いるこ
との、ＡＢＣ−ペルオキシダーゼ検知法との比較 工程で用いる緩衝剤は断らない限り０.１％ＢＳＡ Tris
（２０ｍＭ Tris−ＨＣｌ，０.９％ＮａＣｌ ｐＨ８.
２，２０ｍＭ ＮａＮ3中０.１％ＢＳＡ）であつた。
【００３６】ａ．１次抗血清を用いる培養 ─ ２つのストリツプを、栓つきの５ｍｌのプラスチツ
ク管内において、０.１％ＢＳＡ−Tris 中で１：１００
０に希釈したウサギの抗ツブリン血清１ｍｌと共に室温
で２時間保温した。
【００３７】─ ２つのストリツプを、抗原の特異性に
対する対照として役立つ Sepharose−４Ｂに共有結合さ
せたツブリンに吸着された同一の抗血清と共に、上述の
如く保温した。
【００３８】─ ２つのストリツプを、０.１％ＢＳＡ−
Tris 中で１：１０００で希釈したウサギの抗カルモジ
ユリン血清１ｍｌと共に、室温で２時間保温した。
【００３９】─ ２つのストリツプを、Sepharose−４Ｂ
に共有結合させたカルモジユリンに吸着された同一のも
のと共に上述の如く保温した。吸着された及び吸着され
てない１次抗血清との保温後、ストリツプを０.１％Ｂ
ＳＡ−Tris 中で３×１０分間洗浄した。各対の１つの
ストリツプを、ＧＡＲ Ｇ２０（参照、１.３．ｂ）を用
いて更に保温した。他のものを、Vector Laboratories
から購入し且つ製造業者の指示に従つて使用される非常
に敏感な Vectastain ＡＢＣ免疫ペルオキシダーゼ・キ
ツトと共に保温した（参照、１.３．ｃ）。
【００４０】ｂ．金で標識された２次抗体：ＧＡＲ Ｇ
２０を用いる培養 したＧＡＲ Ｇ２０を用い、洗浄したストリツプ（参
照、１.３．ａ）を２時間保温した。この保温後、スト
リツプを０.１％ＢＳＡ−Tris で２×１０分間洗浄し、
空気乾燥した。
【００４１】ｃ．Vectastain キツトを用いる培養 洗浄したストリツプ（参照、１.３．ａ）を、２次ビオ
チニル化抗体溶液（０.１％ＢＳＡ−Tris 中１：２０
０）と共に１時間保温した。このストリツプを過剰量の
０.１％ＢＳＡ−Tris 中において３×１０分間洗浄し、
次いでアビジン−ピオチニル・ペルオキシダーゼ複合体
中で１時間保温した。この複合体は、製造業者の指示に
従つて準備した：試薬Ａ（アビジンＤＨ）１００μｌを
ＰＢＳ（Pulbecco 液、Ｍｇ2+及びＣａ2+なし）１０ｍ
ｌに添加した。試薬Ｂ（ビオチニル化西洋ワサビのペル
オキシダーゼ）１００μｌを連続的に撹拌しながら添加
した。５分後に複合体を用いた。ストリツプを０.１％
ＢＳＡ−Tris（２×１０分間）中で、続いて Tris−Ｈ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７.６）中で洗浄した。次いで固定化
したペルオキシダーゼを、基質としての４−クロル−１
−ナフトールで見えるようにした：４−クロル−１−ナ
フトール２０ｍｇを、エタノール１ｍｌに溶解し、更に
１００ｍＭ Tris−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.６）２０ｍｌ
で希釈し、約５０℃まで暖めた。１％Ｈ2Ｏ２２００μ
ｌを添加し、基質溶液を注射器に取りつけたミクロフイ
ルター（０.２μ、ミリポア）を通してストリツプにつ
けた。反応を５分間進行させ、次いでストリツプをＨ2
Ｏで洗浄することによつて反応を停止させ、空気乾燥し
た。
【００４２】１.４．評 価 ＡＢＣ法において、正（positivity）は青色として検知
される。コロイド状金を用いる場合、用いる金の寸法に
対して正は桃赤色である（大きい、例えば４０ｎｍの金
の粒子は紫色がかつた色を示す）。両方法に対する感度
は全く対比でき、用いる条件下にツブリンに対して５ｎ
ｇ／μｌ及びカルモジユリンに対して３０ｎｇ／μｌの
程度である。特異性は、抗血清をそのそれぞれの抗原と
共に吸着させた時、負の反応によつて示される。
【００４３】実施例ＩＩ 金で標識したヤギの抗体をマウスのＩｇＧに対して用い
ることによる、生育ヒブリドマ（hybridomas）の培養上
澄液中の微小管と関連した蛋白に対するマウスのモノク
ローナル抗体の存在の選別。
【００４４】２.１. マウスの免疫化 ラツトの脳の微小管蛋白（１００μｇ／マウス）（温度
依存性の重合−解重合のサイクル２回で調製）及び完全
なフロインド佐薬の均一な混合物（参照、実施例 １.
１.）をマウス（Balb／C）に注射した。この注射は背中
に５点、皮下的に行なつた。不完全なフロインド佐薬を
用いて調製した抗原（１００μｇ）のブースター注射を
隔週に３回行なつた脾臓細胞の骨髄腫細胞腺との融合
（fusion）の３日前に、マウスにＰＢＳ−緩衝液１００
μｌ中５０μｌ抗原／マウスを静脈内ブースター注射し
た。
【００４５】２.２．脾臓細胞の、ＮＳ−１骨髄腫細胞
との融合 技術的に公知の方法に従つてＮＳ−１細胞を２匹の免疫
にしたマウスの脾臓細胞と融合させ、得られたヒブリド
マ（hybridomas）を、７％のＣＯ2を含む水蒸気飽和雰
囲気中、３７℃下に、５つの９６井戸のプレート（Nun
c）中で培養した。約２週間の生長後、生長するヒブリ
ドマを含む井戸の培養上澄液１００μｌをとり、分泌さ
れたモノクローナル抗体の存在に対して試験した（参
照、２.４.）。
【００４６】２.３．ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
からある種類の蛋白を電気的にブロツテイングしたニト
ロセルロース紙ストリツプの調製 抗原（２回重合させた微小管蛋白）のＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲルの電気泳動を、Laemmli に従い、７.５
％ゲルについて行なつた。試料緩衝液に溶解し且つ沸と
うさせた抗原を、連続層として積層のゲルの上に３００
μｇ／ゲルの量でつけた。染料の先端が分離するゲル中
に３ｃｍ移動した時、電気泳動を止めた。ゲルの小さい
垂直のストリツプをクーマシー（coomassie）青での染
色のために切り取り、残りをニトロセルロース紙上に電
気的にブロツテイングするために使用した。ゲルを移転
緩衝液（２５ｍＭ Tris−１９２ｍＭグリシン／２０％
（容量／容量）メタノール、ｐＨ８.３）中において室
温で３０分間平衡させた。このゲルをニトロセルロース
のシート（予じめ緩衝液中に浸漬）上に置き、いずれか
捕捉される空気泡を避け或いは除去するように注意し
た。これを２つの予じめ浸漬した濾紙及び２つのナイロ
ン・スクリーンクツシヨン間にサンドウイツチにした。
この結果ＥＣ−電気ブロツテイング装置に密閉される電
極グリツドにぴつたりはまつた。次いで室温４００ｍＡ
において電極ブロツテイングを夜通し行なつた。電気泳
動移転後、ニトロセルロース紙シート上に残る蛋白結合
部位を、２０ｍＭ Tris で緩衝された食塩水中５％ＢＳ
Ａ（ｐＨ８.２）に３７℃で３０分間浸することにより
消滅させた。続いてニトロセルロースシートを、電気泳
動の方向に対して平行に巾３ｍｍストリツプに切断し
た。これらのストリツプを用いてヒブリドマ細胞の上澄
液を選別した。
【００４７】２.４．モノクローナル抗体の検知 各ヒブリドマ培養上澄液１００μｌを、長３.５ｃｍの
０.５ｍｌの Eppendorfチツプに移し、０.１％ＢＳＡ−
Tris の０.４ｍｌで１：５に希釈した。このチツプ及び
ストリツプをコートｎｒ．とした。各チツプには１つの
ストリツプを与え、これらを２時間保温した。各ストリ
ツプを過剰量の０.１％ＢＳＡ−Tris 中においてバツチ
式で洗浄し、また Janssen Life Science Products（２
３４０ Beerse, Belgium）から購入したＧＡＭ Ｇ２０
（２０ｎｍのコロイド状金粒子で標識されたヤギの抗マ
ウスＩｇＧ）と共にバツチ式で培養した。ＧＡＭ Ｇ２
０ 釈し、夜通し反応させた。次いでストリツプを０.１％
ＢＳＡ−Tris 及びＨ2Ｏで洗浄し、空気乾燥した。
【００４８】与えられた分子物質を含む蛋白バンドに相
当して、正は桃色ないし赤色がかつたバンドとしてはつ
きり見ることができた（参照、他の実施例）。この非常
に簡単な選別法は、抗体を分泌するヒブリドマを同定す
るばかりでなく、関連する抗体の特異性に関する直接的
な情報を与え、それ故に興味ある抗体分泌のヒブリドマ
の選別の多大な助けとなる。
【００４９】実施例ＩＩＩ 水性試験試料における抗原の検知のためのサンドウイツ
チ式免疫ブロツト・オーバレイ分析：水性試験試料中の
ＩｇＧの検知。
【００５０】３.１．分析法 決定すべき抗原に対してモノ特異的な精製された又は富
んだ抗体の小滴（±１μｌ）を、ニトロセルロース紙
（又はいずれか簡便なブロツテイング媒体）のストリツ
プ上にブロツテイングし、乾燥し、遊離の蛋白結合部位
を消滅させた（参照、実施例１.３.）。随時これらの抗
体を含む消滅させたストリツプを水中で洗浄し、空気乾
燥し、貯蔵した。次いでこのストリツプを一定の期間に
亘り、抗原を含む試験溶液のある容量と共に保温した。
結合してない基質を洗い落した後、更にブロツテイング
媒体上へ吸着されたものと同様に、ストリツプを適当に
希釈されたコロイド状金属粒子（例えば金又は銀のゾ
ル）で標識された抗体と共に保温した。随時、それぞれ
が異なる抗原エピトープ（epitope）を認識する２つの
モノクローナル抗体を使用することができた。この時１
つをブロツテイング媒体に付着させ、他をコロイド状金
属粒子に付着させた。一定の条件下に、予じめ決められ
た最小濃度の抗原を検知でき、また与えられた試験溶液
中に最小の必要な濃度を検出しうる場合には定性的な診
断試験として使用することができた。
【００５１】３.２. 分析例：公知の濃度のウサギのＩ
ｇＧを含む緩衝された溶液におけるウサギのＩｇＧの検
知 本発明の新規なサンドウイツチ式分析法の実用性を試験
するために次の実験を行なつた： ─ ６×０.６ｃｍのニトロセルロース紙の６つのストリ
ツプに、実施例１.２.に記述したようにウサギのＩｇＧ
（ＧＡＲ ＩｇＧ）に対する親和性精製したヤギの抗体
を漸減量（１２５ｎｇ／μｌから始めて１／２希釈の一
連の希釈物）で含有する小滴（１μｌ）を付けた。
【００５２】─ 残存する蛋白結合部位を実施例１.２.
に記述したように消滅させた。1つのストリツプ（第６
番）を２０ｍＭ Tris−緩衝の食塩水中で洗浄し、濾紙
上に乾式ブロツテイング処理し、空気乾燥し、室温で乾
燥下に夜通し貯蔵した後使用した。
【００５３】─ 残りの５つのストリツプを、次のよう
に室温下に３０分間、栓つきのプラスチツク管中で保温
した： 第１番：ＲＩｇＧ、１ｍｌ、１μｇ／ｍｌ 第２番：ＲＩｇＧ、１ｍｌ、０.２５μｇ／ｍｌ 第３番：ＲＩｇＧ、１ｍｌ、０.０６３μｇ／ｍｌ 第４番：ＲＩｇＧ、１ｍｌ、０.０１５μｇ／ｍｌ 第５番：ＲＩｇＧ、１ｍｌ、０μｇ／ｍｌ ウサギのＩｇＧを０.１％ＢＳＡ−Tris 中で希釈した。
第６番のストリツプをＲＩｇＧ ０.２５μｇ／ｍｌと共
に保温した。
【００５４】─ ストリツプを０.１％ＢＳＡ−Tris 中
で２×１０分間洗浄した。
【００５５】─ すべてのストリツプを、Janssen Life
Sciences Products（Ｂ−２３４０ Beerse, Belgium）
から購入したＧＡＲ Ｇ２０（直径２０ｎｍのコロイド
状金粒子で標識されたウサギのＩｇＧに対するヤギの抗
体）中で室温下に正確に１時間培養した。ＧＡＲ Ｇ２
０を０.１％ＢＳＡ − Tris ＋０.４％ゼラチンでＯ.
Ｄ.
【００５６】 ─ ストリツプを０.１％ＢＳＡ−Tris で、次いで水で
洗浄し、空気乾燥した。
【００５７】３.３. 評 価 １５ｎｇ程度の少量のＧＡＲ ＩｇＧを吸着させたスポ
ツトは、ＲＩｇＧ １５ｎｇ／ｍｌを含有する溶液１ｍ
ｌ中で３０分間だけ培養し、続いてＧＡＲ Ｇ２０（０.
０５２０ｎｍ＝０.２）１ｍｌと共に１時間培養した後
桃色の点として見えるようになつた。少くともこの量の
ＲＩｇＧを含有する溶液は正と判定されるであろう。第
６番のストリツプの結果は、第２番のストリツプのそれ
と同一であり、ストリツプは消滅工程に乾燥しても抗体
活性を保持しうるということを示す。
【００５８】実施例ＩＶ コロイド状銀で標識された１次抗体を有するＮＣ紙に付
着させた抗原の直接的検知：コロイド状銀で標識した、
マウスのＩｇＧに対するヤギの抗体を用いるマウスのＩ
ｇＧのスポツトの検知。
【００５９】─ ＮＣ紙のストリツプ（６ｃｍ×０.６ｃ
ｍ）に、実施例１.２.に記述した如く、２５０〜０.４
ｎｇ／μｌの一連の２倍希釈のマウスＩｇＧのスポツト
（１μｌ）をつけた。
【００６０】─ 残存する蛋白結合部位を実施例１.２.
における如く消滅させた。
【００６１】─ ストリツプを、０.１％ＢＳＡ−Tris
で１：１００に希釈したマウスのＩｇＧ（E. Y. Labora
tories から購入、ＳＰ−００１１）に対するコロイド
状銀で標識したヤギの抗体と共に培養した。
【００６２】─ ストリツプを０.１％ＢＳＡ−Tris Ｈ2
Ｏで２×１０分間洗浄し、空気乾燥した。
【００６３】─ 正のスポツトは黄色であつた。これら
の条件下に１μｌ中±３０ｎｇのスポツトが検知でき
た。
【００６４】実施例Ｖ ブロツト・オーバレイ免疫分析及び金で標識された２次
抗体、続く銀増感を用いることによる、ヒヨコの未成熟
の肺の上皮細胞の２次培養における全細胞溶解物中に産
するアクチンのための、親和性精製したウサギの抗体の
ヒヨコの砂袋アクチンに対する特異性の試験。
【００６５】５.１. 抗アクチン抗血清の調製 電気泳動的に純粋なヒヨコの砂袋アクチンを均一にし、
実施例１.１.においてツブリン及びカルモジユリンに対
して記述したようにウサギに注射した。次いで血清を実
施例１.１.に記述したように調製し、貯蔵した。
【００６６】５.２. アクチンに対する抗体の親和性精
製 製造業者の指示に従つてアクチンを Sepharose −４Ｂ
−ＣＮＢｒ（Pharmacia）に結合させた。抗体を血清か
ら直接精製した。後者を抗原を含むゲルと一緒に培養し
た。１０ｍｇの結合した抗原に対して血清２０ｍｌを用
いた。培養２時間後に、ゲルをカラム中に注ぎ、２８０
ｎｍにおけるＯ.Ｄ.が殆んど０になるまで１０ｍＭ Tri
s で緩衝させた食塩水（ＴＢＳ）で洗浄した。非特異的
吸着物質を、１Ｍ ＮａＣｌを含むＴＢＳで流出させ、
次いでＴＢＳで洗浄した。特異的抗体をｐＨ２.８の０.
１Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝液で流出させた。１ｍｌずつ
の画分を、１Ｍ Tris−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.５）で直
ぐに中和した。抗体の濃度を、Ｅ1％＝１４.３を用いて
２８０ｎｍで測定した。流出した抗体の画分を更に処理
しないで−２０℃下に貯蔵した。
【００６７】５.３. 未成熟なヒヨコの肺の上皮細胞の
培養 未成熟なヒヨコの肺の上肺細胞を日令１４日のヒヨコの
未成熟な肺から分離した。この組織を手で裂き、Ｃａ2+
及びＭｇ2+を含まない Hanks の平衡化塩溶液中０.２５
％トリプシンを用いて、３７℃で３０分間トリプシン化
した。この反応を媒体及び１０％ＦＣＳで停止させた。
遠心分離及び再懸濁後、細胞を７５ｃｍ2のＴ−フラス
コに移し、１２〜２４時間に亘つて付着させ、次いで媒
体を変えた。培養３〜５日後、細胞を短期間（２〜３分
間）、（０.２５％トリプシン溶液中で）トリプシン化
し、９ｃｍφのペトリ皿の上に置き、細胞が接合する培
養３〜５日後に使用された。細胞は、非必須アミノ酸及
び１０％胎牛血清の補充された Eagle の最小必須培地
において、有湿の５％ＣＯ2／空気の雰囲気中で３７℃
下に生長させた。
【００６８】５.４. 未成熟なヒヨコの肺の上皮細胞の
全細胞ＳＤＳ溶解物の調製 ９ｃｍφのペトリ皿で生長させた細胞をＣａ2+、Ｍｇ2+
を含まないＰＢＳ（Dulbecco）中で洗浄し、ゴム製ポリ
スマンで集め、Eppendorf チツプ（１.５ｍｌ）中の無
水アセトン中に−２０℃で浸した。このアセトンを蒸発
させ、乾燥した細胞残渣を、１ｍＭ ＴＡＭＥ（プロテ
アーゼ禁止剤）を含む沸とうＳＤＳ−試料緩衝液中に溶
解した。遠心分離後、不溶性の残渣を捨てた。試料緩衝
液で連続的に希釈し且つクーマシー青で着色したこの溶
解物のＳＤＳゲル（Laemmli による）を用いて試料の最
も適当な希釈度を見積つた。続く遺伝子選別膜（ＮＥＮ
から購入）への電気泳動的転移に対して１：１６の希釈
を使用した。１つの転移単位は、１列のそのような希釈
した溶解物及び１列の精製した対照蛋白の混合物：１列
当りＣｈ.ｇ.フイラミン、Ｃｈ.ｇ.ミオシン（Ｈ＋Ｌ
鎖）、Ｃｈ.ｇ.α−アクチニン、ＢＳＡ、ラツトの脳の
ツブリン、豚の胃のトロポミオシン各０.０６μｇ、か
らなつた。
【００６９】緩衝液の先端をゲルの底部に達しせしめ、
遺伝子選別膜への電気泳動的移動を実施例２.３.と正確
に同じにして行なつた。ブロツト単位を切り取り、残存
する蛋白結合部位を実施例１.２.及び２.３.に記述した
ように消滅させた。アクチンに対する抗体（０.５μｇ
／ｍｌ）及びＧＡＲ Ｇ２０（Ｏ.Ｄ.５２０ｎｍ＝０.
２）との培養及びＧＡＲ Ｇ２０の、０.１％ＢＳＡ−Tr
is ＋ ０.４％ゼラチンでの希釈は、実施例２.４.に記
述したものと同一の方法に従い、シートの寸法の±の密
閉されたプラスチツク製バツク中において、それぞれ２
時間行なつた。
【００７０】ＧＡＲ Ｇ２０との２時間の保温後、シー
トを０.１％ＢＳＡ−Tris で洗浄し、銀での増感にそな
えた。この時点において、溶解物におけるアクチンの移
動及び蛋白混合物中のアクチンとの対応に基づき、桃赤
色のバンドがすでに見られた。
【００７１】５.５. 銀での増感 ─ シートを１：１０で希釈したクエン酸塩原料緩衝液
中において２分間洗浄した。この緩衝液は１００ｍｌに
対してクエン酸三ナトリウム２５.５ｇ及びクエン酸２
３.５ｇを含有した（ｐＨ４）。
【００７２】─ 次いでシートを、次のものを含む物理
学的現象剤中において、注意深く光から保護しつつ１５
分間培養した： 脱イオン水 ６０ｍｌ 脱イオン水１５.０ｍｌ中ハイドロキノン０.８５ｇ クエン酸塩緩衝液（ｐＨ４）１０ｍｌ 脱イオン水１５.０ｍｌ中乳酸銀０.１１ｇ。
【００７３】乳酸銀を注意深く光から保護し、使用直前
に他の成分に添加した。
【００７４】─ 反応時間後、シートを過剰のＨ2Ｏで洗
浄し、Agetix（水中１：４）写真定着剤で処理した。
【００７５】─ このシートを再び過剰のＨ2Ｏ中で洗浄
し、空気乾燥した。
【００７６】５.６. 結 果 初めに桃赤色のバンドとして見えていたバンドは今や深
い黒色になつた。アクチンに対する抗体は、非常に特異
的と考えられ、培養細胞中におけるアクチン含有物の免
疫細胞化学的な着色に対して満足しうる結果を与えた。
【００７７】５.７. 結 論 上述の銀増感は、検知法のコントラスト及び感度を強く
増大させた。例えば実施例ＩＶにおいて、コロイド状銀
で標識された抗体で着色したものを更に現像し、そして
反応の僅か５分後に検出限界が３０ｎｇ／スポツトの代
りに３ｎｇ／スポツトとなつた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 グイド・フランシスクス・テオフイリ ス・ダネールス ベルギー国ビー−2452−ギールレ・ドー ルストラート57 (72)発明者 ヤン・ラオウル・デ・メイ ベルギー国ビー−2300−トウルンホウ ト・ブスジエイ・コレーゲストラート56 (56)参考文献 特開 昭55−15100（ＪＰ，Ａ) 国際公開81／2790（ＷＯ，Ａ１) Ｔｈｅ Ｊｏｗｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓ ｔｏｓｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｙ ｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 31［７ ］（1983）Ｐ．938−944 Ｈｉｓｔｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 71 （1981）Ｐ．１−16

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 特異的結合剤と対応する受体基質との間
    で形成する集塊における成分の１種を、直接又は間接的
    に測定するためのブロツト・オーバーレイ分析の一般的
    方法に従って使用する試験キツトであって、 コロイド状金属粒子で標識した特異的結合剤又は前記集
    塊を間接的に検出するのに使用し、かつコロイド状金属
    粒子で標識した特異的結合剤、ならびに 物理的現像剤、 を含んでなるキツト。
  2. 【請求項２】 （ｉ）緩衝液又は（ｉｉ）間接的に検出
    される集塊を形成するための未標識結合剤を、さらに含
    んでなる請求項１記載のキツト。
  3. 【請求項３】 物理的現像剤が銀含有化合物である請求
    項１記載のキツト。
JP5081149A 1983-11-25 1993-03-17 試験キツト Expired - Lifetime JP2601616B2 (ja)

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